USO HERRAMIENTAS BIOINFORMATICAS PARA EL ANALISIS DE UNA

SECUENCIA DE UN GEN

EDER DURANGO BALLESTEROS

INSTITUTO NACIONAL DEINVESTIGACIONES AGRICOLA

ESCUELA SOCIALISTA DE AGRICULTURA TROPICAL
MARACAY, 2009

INTRODUCCION

Los carotenoides son una importante familia de pigmentos isoprenoides,

responsables de la coloracin caracterstica de muchas flores y frutos
(goodwin, 1980). La coloracin de los frutos ctricos ha sido ampliamente
estudiada, determinndose que se debe fundamentalmente a los carotenoides,
cuya distribucin cambia cualitativa y cuantitativamente entre las diferentes
especies y variedades y a lo largo del desarrollo y maduracin del fruto (gross,
1987), Sin embargo, los trabajos relativos a la regulacin de la biosntesis de
estos pigmentos son escasos (kato et al., 2004; rodrigo et al., 2004).

La ruta de biosntesis de carotenoides en plantas superiores est bien

establecida.

El primer paso especfico de la ruta de biosntesis de

carotenoides, est mediado por la fitoeno sintasa (PSY) y consiste en la

produccin de fitoeno, que correlaciona los cambios en la expresin de los
genes de biosntesis de carotenoides con la evolucin del contenido y
composicin en carotenoides. Las posibles bases moleculares que determinan
las diferentes coloraciones de los frutos ctricos, est determinada por
fragmentos de DNA correspondientes a genes de inters como son: PSY, PDS,
ZDS, -LCY, -LCY, -CHX, -CHX, ZEP, genes implicados en la biosntesis de
carotenoides (Figura 1)

El color de la corteza en los ctricos, es una de las caractersticas principales

que afectan la calidad de los ctricos, estos parmetros, de coloracin y los
organolpticos se alcanzan durante la maduracin, y son afectadas la
concentracin de etileno y las temperatura que se manejan en postcosecha, la
cual a temperaturas mayores de 20 C y ambiente libre de etileno, en el
almacenamiento, el contenido de carotenoides aumentar rpidamente,
deteriorando la calidad de las frutas

Figura 1. Biosntesis de carotenoides

.
La Aplicacin de las tcnicas de genmica funcional ser til para recopilar y
analizar informacin sobre los procesos fisiolgicos que regulan la maduracin,
tanto externa como interna, y determinan la calidad del fruto en los ctricos.

El gen psy, que regula la concentracin de carotenoides, de acuerdo con las

bases de datos de NCBI, se encuentra reportado en 26 especies disperso en
muchos organismos, desde vegetales, hasta hongos y bacterias.

La secuencia del gen psy que codifica para una protena (YPS) de 299 aa
perteneciente a la superfamilia de las Trans-Isoprenil Difosfatasa Sintasa
(figura 2 y 3) (Trans_IPPS_HH), cuya secuencia de aminocidos es:
1 dlrhpcssgi dlpeiscmva stagevamss eemvynvvlk qaalvnkqps gvtrdldvnp
61 dialpgtlsl lseaydrcge vcaeyaktfy lgtllmtser rraiwaiyvw crrtdelvdg
121 pnashitpta ldrwesrled lfrgrpfdml daalsdtvtk fpvdiqpfrd miegmrmdlr
181 ksryknfdel ylycyyvagt vglmsvpvmg iapdsqatte svynaalalg ianqltnilr
241 dvgedarrgr vylpqdelaq aglsdddifa gevtikwrnf mknqikrarm ffdmaengv

Figura 2. Superfamila de Trans_IPPS_HH.

Figura 3 Composicin de la Superfamilia de las Isoprenoides

Realizando una

bsqueda de homologa

de esta protena en

otros

organismos, se encontr que esta protena est presente en la familia de los

ctricos, as como en las musceas, caf, Arabidopsis, papaya, etc.,
algunas otras especies como se muestra e la figura 4.

y en

Figura 4. Presencia de la protena PSY en diversos organismos

Realizando un alineamiento en Clustalw de algunas de las secuencias

protenicas seleccionadas al azar de Citrus sinensis (gb: AAF33237.1), Musa
acuminata (gb: ACT83530.1), Cucumis melo (gb: ACC95430.1), Carica Papaya
(gb: ABG72805.1) y Momordica charantia (gb:AAR86104.1), se puede observar
que la mayor alineacin se da entre

Momordica y Cucumis, con un 90

porciento de similitud.

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

-------------------------------------------------MSFASSLVVSLNVEVSLSFGFLDSVRDGTQFPDSSRFFF-SRNRTNQMSK 49
MSVALFWVASTSSELSNSFGFFDSLRDGNRLFDSSRLG--SRDRSLFFSS 48
MSVTLLWVVSPNSQLSNCFGFVDSVREENRLFYSSRFLYQHQTRTAVFNS 50
--------------------------------------------------

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

-------------------------------------------------RQK---------WSNNSLSTELKY---------PFLIAASMVANPAGEMA 81
RAKK---GRSQRLNPGSICTDLRLGCSNFDGQSNMPLTSSMVVSPAGEMA 95
RPKQFNNSNKQRRNSYPLDTDLRHPCSSG---IDLPEISCMVASTAGEVA 97
--------------------------------------------------

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

-------------------------------------------------ISSEQKVYNVVMKQAALVKRQLR-TAGELDVKPDIVLPGTLSLLNEAYDR 130
ISSEEKVYNVVLRQAALVKRQLRSSSGELDVKPDIVLPGTLSLMTEAYDR 145
MSSEEMVYNVVLKQAALVNKQPSGVTRDLDVNPDIALPGTLSLLSEAYDR 147
--------------------------------------------------

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

-------------------------------------------------CGEVCAEYAKTFYLGTMLMTPERQKAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASHIT 180
CGEVCAEYAKTFYLGTLLMTPERRKAIWAIYVWWRRTEELVDGPNASHIT 195
CGEVCAEYAKTFYLGTLLMTSERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASHIT 197
--------------------------------------------------

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|

-------------------------------------------------PTALDRWEARLEELFQGRPFDMLDAALADTVTKFPVEIQPFKDMIEGMRT 230
PTALDRWEARLEDLFQGRPFDMLDAALSDTVAKFPVDIQPFIDMIEGMRM 245

gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

PTALDRWESRLEDLFRGRPFDMLDAALSDTVTKFPVDIQPFRDMIEGMRM 247
--------------------------------------------------

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

------------FISTGYYVAGTVGLMSVPVMGIAPESQASTESVYNAAL
DLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPDSEASTESVYNAAL
DLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPIMGIAPESQATTESVYNAAL
DLRKSRYKNFDELYLYCYYVAGTVGLMSVPVMGIAPDSQATTESVYNAAL
--------------------------------------------------

38
280
295
297

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

ALGIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKW
ALGIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGISEEDIFGGRVTDKW
ALGIANQLTNILRDVGEDARRGRIYLPQDELAQAGLSDDDIFAGTVTDKW
ALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLPQDELAQAGLSDDDIFAGEVTIKW
------------------ARRGRIYLPQDELAQAGLSDEDIFDGKVTEKW
*****:***********:*::*** * ** **

88
330
345
347
32

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|

RNFMKNQIKRARMFFDEAEKGVLELNKASRWP-----------------RNFMKNQIKRARMFFDDAEKGVLELNKASRWPVWASLLLYRQILDEIEAN
RNFMKKQIKRARMFFDEAEKGVTELSAASRWPVWASLLLYRKILDEIEAN
RNFMKNQIKRARMFFDMAENGVTELSEASRWPVWASLLLYRQILDEIEAN
RSFMKNQIKRARMFFQQAEAGVTELNRASRWP------------------

120
380
395
397
64

*.***:*********: ** ** **. *****

gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|
SeqA Name

------------------------------------------DYNNFTKRAYVSKAKKLMALPMAYARSLMGPS----------- 412
DYNNFTKRAYVSKAKKILALPISYARSLIGPSRTSSSANKIQI 438
DYNNFTKRAYVSKAKKIAALPIAYAKSLLRPSRIYTSKA---- 436
------------------------------------------Len(aa)

SeqB Name

Len(aa)

Score

====================================================================================================================

1
1
1
1
2
2
2
3
3
4

gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|6959860|gb|AAF33237.1|AF220
gi|254839967|gb|ACT83530.1|
gi|254839967|gb|ACT83530.1|
gi|254839967|gb|ACT83530.1|
gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|

436
436
436
436
64
64
64
120
120
438

2
3
4
5
3
4
5
4
5
5

gi|254839967|gb|ACT83530.1|
gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|186920350|gb|ACC95430.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|110348215|gb|ABG72805.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|
gi|40456029|gb|AAR86104.1|

64
120
438
412
120
438
412
438
412
412

82
86
78
77
85
82
82
89
90
79

Esta superfamilia presenta un dominio funcional Figura 3, con sitio activo en

color amarillo constituido por los siguientes aminocidos TSRSFAKIR, El sitio
cataltico, constituido por15 aminocidos FYDDYVLLRDDRFCQ; consta de una
cavidad central grande en su mayora conformada por las alfa hlices
antiparalelas con dos regiones ricas en aspartato (DXXXD), ubicado en
paredes opuestas. Estos residuos median la unin de los prenil fosfatos. La
enzima de la biosntesis de los carotenoides, fitoeno sintasa (CRTB), cataliza la
reaccin de condensacin de dos molculas de difosfato geranilgeranil para
producir fitoeno, un precursor de la beta-caroteno. Esta enzima produce los
triterpenos y precursores tetraterpene para muchos diversos productos finales
de los esteroles y carotenoides y se distribuyen ampliamente entre diversos
organismos.

Figura 5 Estructura tridimensional de la fitoeno sintasa.

CONSIDERACIONES FINALES
Los genesYSP han sido identificados en bacterias (Erwinia uredovora),
levaduras (Phaffia rhodozima) algas (Haematococcus pluvialis), plantas
superiores (tomate, naranja, pimiento, A. thaliana, Brassica napus, D.
carota,etc.). En eucariontes todos los genes carotenognicos son nucleares y
las protenas generadas, poseen pptido de destinacin a cloroplasto. Muchos

genes carotenognicos en rganos fotosintticos y en frutos son regulados

positivamente por la luz y preferentemente a nivel transcripcional.

En algunas plantas existe ms de un gen para una misma actividad enzimtica

y su expresin se vincula a un rgano especfico. En A. thaliana: 6GGPPs,
tomate: Psy1 y 2, lycb1 y 2; D. carota zcds 1 y 2, lycb1, 2 3.

El conocimiento de los genes implicados en la maduracin de los frutos y del

control de su expresin nos permitir identificar aquellos procesos fisiolgicos
susceptibles de ser manipulados exgenamente con el objeto de mejorar la
calidad de la fruta.

El organismo modelo seleccionado son los ctricos debido a que los problemas
de poscosecha generan altos porcentajes de prdida econmicas por deterioro
en la calidad de los frutos. El color de la piel y la pulpa en los frutos de naranjas
y mandarinas se debe principalmente a la acumulacin de mezclas complejas
de diferentes tipos de carotenoides. Los carotenoides son una amplia familia de
compuestos, derivados de los isoprenoides, que adems de sus caractersticas
como pigmentos tienen propiedades nutricionales, como actividad provitamina
A y antioxidante, lo que les confiere un importante papel en la prevencin de
diferentes enfermedades. Por ello, el contenido y la composicin de
carotenoides tiene una gran importancia tanto en la calidad comercial como
nutricional de los frutos ctricos.
La conservacin de frutos de diferentes variedades de naranjas y mandarinas a
12 C produce un aumento significativo del color y del contenido de
carotenoides, tanto en la pulpa como en la piel, mientras que estos parmetros
no se alteran de forma notable durante la conservacin a 2 C. Este efecto de
la temperatura de conservacin en el contenido y la composicin de
carotenoides depende del estado de maduracin de los frutos en el momento
de la cosecha. Con objeto de profundizar en las bases moleculares que regulan
el efecto de la temperatura de conservacin en estas variaciones en el color y
en la sntesis y acumulacin de carotenoides, que pueden tener importantes

repercusiones comerciales, se estudiaran los cambios en la expresin de

genes que intervienen en la biosntesis de carotenoides
Se har un solapamiento de cada una de las expresiones obtenidas en
diferentes tiempos y temperaturas, observando la intensidad de los spot, as
como los spot que no se solapan
Mediante RT-PCR a tiempo real, se estudia la acumulacin de cuatro mRNAs
correspondientes a una

fitoenosintasa, dos licopeno

-ciclasas y una

caroteno hidroxilasa, que cubren las fases de sntesis, ciclacin e hidroxilacin

de carotenoides, en la piel y la pulpa de frutos de la naranja, en dos estadios de
maduracin, durante la conservacin refrigerada a 2 C y 12 C. Se discutirn
las variaciones en el perfil de expresin de los genes seleccionados y se
correlacionarn con los cambios en la composicin de carotenoides, as como
la posible influencia del estadio de maduracin del fruto. Por ello, el efecto de la
temperatura de conservacin en el perfil protemico de naranjas, identificando
polipptidos que muestren acumulacin diferencial en las condiciones de
conservacin ensayadas. La identificacin de dichas protenas y la posible
asociacin con los cambios en la expresin pueden proporcionar una
informacin relevante sobre los procesos asociados al cambio de coloracin en
los frutos ctricos y al incremento en carotenoides que tiene lugar durante la
conservacin.
Una posible limitante sera establecer el estado fisiolgico ptimo de las frutas
para la toma de la muestra, por ello la necesidad de hacer un seguimiento a los
frutos que se muestrearan. Seguimiento desde el cultivo, marcando en los
cultivares de ctricos las flores una vez fecundadas y llevando un registro
semanal del desarrollo de los frutos. La otra limitacin pero ya econmica, el
numero de ensayos para determinar las fases sntesis, hidroxilacin y ciclacin
de los carotenoides. Las cargas microbianas en las

muestras, dado que

algunos microorganismos poseen los genes y las protenas de sntesis de

carotenoides, otras posibles limitantes serian:

Eleccin de la muestra ms apropiada

Sensibilidad deseada del ensayo

Volumen requerido de muestra para procesar

Nmero de ensayos diferentes a realizar sobre la misma muestra procesada

Estabilidad de la diana durante la recogida y procesamiento de la muestra

(inactivacin de nucleasas)

El parmetro ms importante es el Threshold Cycle (CT) o Crossing point (CP),

la realizacin de la curva patrn para una buena cuantificacin del ADN y los
controles de normalizacin y validar las pruebas
Caracterizar el transcriptoma de los ctricos usando microarreglo de
cDNA construido
Experimentos de anlisis del transcriptoma para diferentes estados de
maduracin, sometidos a temperaturas de conservacin