UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

FRANCISCO DE MIRANDA
REA DE TECNOLOGA
NCLEO EL SABINO
PASANTAS INDUSTRIALES II

DISEO DE UN MANUAL DE CURVAS DE CALIBRACIN DE

DIFERENTES MTODOS POR ESPECTROFOTOMETRA APLICADOS EN
LOS LABORATORIOS DE QUMICA DE LA UNEFM SABINO

Miquilena nava, Sugey

Ramrez Quesada, Jorge

Gutirrez Barbuena, Julio

Autor

Tutor Acadmico

Tutor Industrial

C.I.: 21.158.385

C.I.: 13.554.159

C.I.: 13.106.111

miquilenanava@gmail.com

jramirezcascabel9@gmail.com

PUNTO FIJO, JULIO 2015

jcgutierrez644@gmail.com

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

FRANCISCO DE MIRANDA
REA DE TECNOLOGA
NCLEO EL SABINO
PASANTAS INDUSTRIALES II

DISEO DE UN MANUAL DE CURVAS DE CALIBRACIN DE DIFERENTES

MTODOS POR ESPECTROFOTOMETRA APLICADOS EN LOS
LABORATORIOS DE QUMICA DE LA UNEFM SABINO

LUGAR: LABORATORIO DE QUIMICA C 4

FECHA DE INICIO: 26/05/2015 20/07/2015
DURACIN: 8 SEMANAS

INDICE GENERAL

ndice General
ndice de Figuras
ndice de Tablas

p.p
i
ii
iii

ndice de Graficas
Introduccin
Planteamiento del Problema
Objetivo General
Objetivos Especficos
Justificacin del Problema
Fases de la Investigacin
Resultados y Anlisis de resultados
Conclusiones
Recomendaciones
Referencias Bibliogrficas
Apndice
Anexos

NDICE DE FIGURAS

Figura
1

p.p
Solucin de Nitritos en frasco mbar

Spectronic 20 D en reposo.

INDICE DE TABLAS
Tablas
1
1.1

Valores obtenidos de patrones para mtodo Nitrito

Absorbancias Calculadas para nitritos

p.p

Valores obtenidos de patrones para mtodo Cromo

2.1

Absorbancias calculadas para cromo

Valores obtenidos de patrones para mtodo Sulfato

Muestra problema analizada

Valores obtenidos de patrones para mtodo Hierro

5.1

Absorbancias calculadas para hierro

Valores obtenidos de patrones para mtodo Fosfato

6.1

Absorbancias calculadas para fosfato

INDICE DE GRAFICAS
Tablas
1
2

Curva de Calibracin para Nitritos

Curva de Calibracin para Cromo

p.p

Curva de Calibracin para Sulfato

Curva de Calibracin para Hierro

Curva de Calibracin para Fosfato

INTRODUCCIN

Desde hace muchos aos se ha usado el color como ayuda para

reconocer las sustancias qumicas; al reemplazar el ojo humano por otros
detectores de radiacin se puede estudiar la absorcin de sustancias, no

solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en ultravioleta e

infrarrojo.
Se denomina espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa
radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de la longitud de onda de
la radiacin, y a las mediciones a una determinada longitud de onda.
Para realizar estudios de espectrofotometra se da el uso de las curvas
de calibracin generadas por los patrones ledos en el equipo especfico, este
tipo de anlisis genera mayor precisin en los ensayos a distintas sustancias.
Actualmente en el componente prctico no se dispone de las curvas
correspondientes para los distintos anlisis relacionados a la medicin de las
concentraciones de un soluto en sustancias problema.
Es por ello que el principal motivo por el cual se requiere solventar esta
problemtica, recae en la simplificacin del trabajo dentro del laboratorio, el
diseo de un manual que contenga las respectivas curvas de calibracin
generadas por el equipo, facilitara a los estudiantes de ingeniera qumica, la
realizacin de estudios correspondientes a trabajos de grados o pasantas. Los
resultados se obtienen a travs del espectrofotmetro marca Spectronic 20 D.
Este trabajo surgi con la finalidad de fortalecer el complemento prctico
del laboratorio por medio de la propuesta de la realizacin de un manual que
ser de gran utilidad y ayudara a la ejecucin exacta de los ensayos que
requieren de este material para su estudio.
Para dar a conocer los aspectos desarrollados durante la ejecucin de la
Pasanta Industrial II, que lleva por ttuloDiseo de un manual de curvas de
calibracin de diferentes mtodos por espectrofotometra aplicados en los
laboratorios de qumica de la Unefm sabino se emple la siguiente estructura
para la elaboracin del informe:

Planteamiento del problema, el cual describe de forma amplia la

situacin de estudio de la investigacin, la situacin actual que caracteriza al

objeto de estudio y la presentacin de alternativas para dar solucin a dicha

problemtica.
Objetivo general, para ofrecer resultados amplios relacionados con el
ttulo de la investigacin, y objetivos especficos que se refieren a situaciones
particulares que se llevaron a cabo para el cumplimiento del objetivo general.
Justificacin del problema, con la finalidad de dar a conocer las razones por
las cuales se realiza la investigacin y los aportes tericos o prcticos que
ofrece; Fases de la Investigacin, en las cuales se desglosan las normas,
procedimientos y/o actividades que fueron ejecutadas en cada uno de los
objetivos especficos de la investigacin
Resultados y Anlisis de Resultados, aqu se presentan todos los resultados
obtenidos durante los procedimientos ejecutados en cada una de las
actividades de la investigacin, establecindose una comparacin con valores
tericos o estudios previos realizados.
Conclusiones, las cuales presentan en forma clara y sinttica, todo el
conjunto de resultados obtenidos a lo largo de la investigacin, demostrndose
que se han cumplido, o no, los objetivos propuestos; Recomendaciones, es
decir, las posibles mejoras que durante el estudio se observaron pero no se
llevaron a cabo y referencias bibliogrficas, la cual contiene el listado de cada
obra consultada durante la investigacin y citada a lo largo del trabajo.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los Laboratorios de Qumica representan los componentes prcticos de

las distintas unidades curriculares, impartidas en el programa de Ingeniera

Qumica, cuyo objetivo es que el estudiante compruebe experimentalmente los

distintos mtodos previamente estudiados en la parte terica, a travs de la
aplicacin de tcnicas bsicas de laboratorio.
Los estudios que se ejecutan dentro del laboratorio, usualmente
corresponden a las prcticas que se encuentran a disposicin del estudiante,
as como los mtodos o guas que le permitirn resolver un problema en
estudio que depender de alcance del mismo.
En la actualidad el componente practico no posee un manual o gua para
los estudios que se aplican a determinadas soluciones problemas (aguas
residuales o slidos en cuestin) con respecto a su evaluacin en el rea de
espectrofotometra,

es

decir, no

se

encuentran

copilados

los

datos

correspondientes a las curvas de calibracin de compuestos disueltos en

dichas soluciones.
Esto genera una fuerte problemtica, ya que en el anlisis de aguas este
tipo de estudio resulta ser fundamental al momento de caracterizar una
muestra, lo cual forma parte de anlisis de mayor importancia, como lo es, un
trabajo de grado o pasanta.
Es por ello, que la finalidad de sta pasanta industrial es el Diseo de
un manual de espectrometra correspondiente a distintos mtodos de anlisis
de muestras problema por medio del uso de curvas de calibracin y contribuir
as con el laboratorio de qumica de la UNEFM y facilitar la ejecucin de los
ensayos correspondientes.

OBJETIVO GENERAL

 Disear un manual de curvas de calibracin de diferentes mtodos por

espectrofotometra aplicados en

los laboratorios de qumica de la

UNEFM Sabino

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes

mtodos de espectrofotometra
Verificar la calibracin y funcionamiento del Spectronic 20 D.

Elaborar el manual de curvas de calibracin de los diferentes mtodos

de espectrofotometra con sus respectivas graficas aplicando la ley de
Lambert Beer.

JUSTIFICACION DEL PROBLEMA

El propsito fundamental de este trabajo es que el estudiante tenga a

disposicin un manual que le ayude a la ejecucin de estudios en muestras
problema, y facilite su labor, adems de aportar al componente practico dicho
complemento el cual permanecer en el rea para los futuros estudios que se
realicen.
A su vez, disminuir el uso de las sustancias necesarias para el anlisis
de las muestras, ya que, al copilar los resultados obtenidos en dicho manual,
evitara que

gran cantidad de reactivos se desperdicien debido a las

repeticiones de los ensayos.

FASES DE LA INVESTIGACIN

1 Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes

mtodos de espectrofotometra
En esta fase se llev a cabo la evaluacin de los reactivos a utilizar en
los diferentes mtodos, los cuales son:
Anlisis colorimtrico de:
-

Sulfatos
Nitritos
Cromo
Fosfato
Hierro
La cantidad de reactivos a utilizar fueron aportados por el almacn del

laboratorio C4-A, fundamentalmente se dispone de la realizacin de tres

sustancias en especfico en cada uno de los mtodos.
Corresponden bsicamente a la solucin madre del reactivo, a la
solucin patrn y a solucin intermedia.
La solucin madre del reactivo se deriva de la combinacin de la
sustancia correspondiente al mtodo en conjunto a su disolucin en agua
destilada, de esta muestra se tomara una alcuota de cierta cantidad del
reactivo, el cual se diluir hasta un aforo comprendido en el rango de 25 a
100ml, seguidamente la solucin patrn, conocida como aquella que dar el
color a la muestra, se combinara con la solucin intermedia y se obtendrn los
patrones correspondientes para el respectivo anlisis.
En base a esto se determino que la cantidad de reactivos necesarios
para los estudios se encuentra disponible.

2 -Verificar la calibracin y funcionamiento del Spectronic 20 D.

Se verifico la calibracin mediante el uso de un blanco o sustancia pura,

principalmente agua destilada, en donde deben observarse los valores de
absorbancia, concentracin y tramitancia, para una muestra blanco la
tramitancia debe estar en un rango de 100% respecto a la longitud de onda a
la cual el equipo quiere ser utilizado.
3 - Elaborar el manual de curvas de calibracin de los diferentes mtodos
de espectrofotometra con sus respectivas graficas aplicando la ley de
Lambert Beer.
El procedimiento de elaboracin del manual, consiste en la generacin
de las curvas de calibracin correspondientes para cada mtodo, de acuerdo a
los utilizados, se obtuvieron 5 graficas, generadas por medio de 5 a 6 patrones
previamente preparados, estos, fueron ledos en el Spectronic 20 D a la
longitud onda correspondiente, obtenindose los datos de absorbancia,
concentracin y tramitancia.
Se utilizaron los valores de los ppm para los patrones, y se graficaron
con respecto a la absorbancia obtenida. La curva debe representarse en forma
de recta, lo cual se comprueba con la ley de Lambert - Beer en donde mediante
una formula se permiti conocer si la precisin del espectrofotmetro era
exacta.

RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS

Evaluar las condiciones de los reactivos a preparar para los diferentes

mtodos de espectrofotometra.
Se realizaron las soluciones madres, intermedias y patrn para cada mtodo.
Para el mtodo Sulfato se prepararon las siguientes soluciones:
-Solucin patrn de sulfatos
-Solucin acondicionadora o intermedia de sulfatos
-Cloruro de bario.
Para mtodo Nitritos:
-

Reactivo de Zambelli
Solucin Madre de Nitritos
Solucin intermedia de Nitritos
SolucinPatrn de Nitritos
Amoniaco Concentrado.

Para mtodo Hierro:

-

Solucin estndar de hierro

Agua oxigenada
Solucin intermedia de tiocionato

Para mtodo Cromo:

-

Solucin de Difenilhidrazina
Solucin Intermedia y Madre de Cromo
Solucin de cido Sulfrico

Para mtodo Fosfato:

-

Reactivo Vanado molibdico

Solucin patrn de ortofosfatos
Solucin intermedia de ortofosfatos

Los reactivos utilizados fueron evaluados para cada uno de los mtodos,
de acuerdo a su preparacin, todos ellos, se almacenaron en frascos mbar,
para de esta manera poder conservarlos y as estos se encuentren disponibles
para su uso en los prximos estudios.

Figura 1. Solucin de Nitritos en frasco mbar

Verificar la calibracin y funcionamiento del Spectronic 20 D.

Al

encender

el

espectrofotmetro

se

coloc

la

longitud

onda

correspondiente y se llev el valor de tramitancia a 0.0 en este instante el haz

de luz para una muestra se encuentra cerrado.

Se calibro utilizando un blanco o sustancia pura sin slidos,

generalmente agua destilada, esta muestra debe leerse a la longitud de onda
en la cual se desea realizar el estudio, es por ello que en estas condiciones el
valor de la tramitancia debe estar en el rango de 100%, los valores de
absorbancia y la concentracin se comprende en rangos de 0,01 a 0,09.
Para su funcionamiento el espectrofotmetro debi dejarse en reposo,
encendido y calibrado en un tiempo de 30 min a 1 hora, ya que su sensibilidad
al movimiento normalmente puede afectar los anlisis posteriores. Una vez
pasado este tiempo, el equipo se encontraba listo para la lectura de patrones.
Las celdas o tubos de ensayos, debieron limpiarse con el fin de remover
tanto suciedad como huellas digitales, ya que estas afectan la lectura de los
patrones correspondientes.

Figura 2. Spectronic 20 D en reposo.

Elaborar el manual de curvas de calibracin de los diferentes mtodos de

espectrofotometra con sus respectivas graficas aplicando la ley de
Lambert Beer.

Para la elaboracin del manual de curvas de calibracin, se obtuvieron

los datos de cada uno de los patrones ledos por el espectrofotmetro, los
siguientes fueron resumidos en tablas para mayor apreciacin.

Para Mtodo Nitritos:

Para 0 - 0,200 ppm

Longitud de Onda: 425 mn
Ppm

Absorbancia
0,01
0,030
0,043
0,064
0,157
0,200

0
0,025
0,050
0,100
0,150
0,200

Concentracin
0
0,06
0,09
0,14
0,33
0,42

Tramitancia
100
93,6
90,4
86,2
69,8
63,0

Tabla 1. Valores obtenidos de patrones para mtodo Nitrito

Ahora se procedi a realizar la curva de calibracin con los valores de

ppm vs absorbancia, como se ven subrayados en la tabla 1.

Nitritos
0.250
0.200
f(x) = 0.97x - 0
R = 0.95

0.150
Absorbancia

0.100
0.050
0.000
0

0.05

0.1

0.15

Ppm

Grafica 1. Curva de Calibracin para Nitritos

0.2

0.25

Se realiz una regresin lineal a la curva para ver el rango de desviacin

de la misma, para la comprobacin de su tendencia, se utiliz la ecuacin de
Lambert beer, la cual plantea la comparacin entre el valor de absorbancia
arrojado por el equipo y el calculado mediante una formula emprica, esto con
el fin de saber cunta fue la precisin del equipo en el momento del estudio.
Tomando como ejemplo las absorbancias de la curva nitritos reflejadas en la
tabla 1, se aplic la siguiente formula:
Abs: 2 Log (T)
En donde:
Abs: absorbancia
T: Tramitancia experimental arrojada por el espectrofotmetro
Sustituyendo tenemos:
Abs: 2 Log (93,6) = 0,029
El resultado describe que la precisin del equipo era exacta, debido a la
similitud entre los valores ya tabulados. Esto se realiz para todas las dems
absorbancias de cada uno de los mtodos.

Abs. Experimental
Abs. Calculada
Nitritos
0,01
0
0,030
0,029
0,043
0,044
0,064
0,064
0,157
0,156
0,200
0,201
Tabla 1.1 Absorbancias Calculadas para nitritos

Para Mtodo Cromo:

Para 0 - 0,200ppm
Longitud de Onda: 540mn
Ppm

Absorbancia

Concentracin

Tramitancia

0,089

0,19

81,4

0,030

0,159

0,33

69,6

0,050

0,173

0,36

67

0,100

0,245

0,51

56,8

0,150

0,260

0,54

55

0,200

0,292

0,61

50,8

Tabla 2. Valores obtenidos de patrones para mtodo Cromo

Graficando:

Cromo
0.35
0.3

f(x) = 0.95x + 0.12

R = 0.92

0.25
0.2
Absorbancia

0.15
0.1
0.05
0
0

0.05

0.1
Ppm

0.15

0.2

0.25

Grafica 2. Curva de Calibracin para Cromo

La desviacin de esta curva es significativa debido a distintos factores
que pudieron afectar la lectura de algunos patrones, aun as, la regresin lineal
de la misma, demuestra un alejamiento mnimo entre los puntos a la recta.

Abs Experimental
Abs. Calculada
Cromo
0,089
0,089
0,159
0,157
0,173
0,174
0,245
0,246
0,260
0,260
0,292
0,294
Tabla 2.1 Absorbancias calculadas para cromo

Para Mtodo Sulfato:

Para 0 - 80 ppm
Longitud de Onda: 420mn
Ppm
Absorbancia
0
5
10
20
30
40
50
60
70
80

0,03
0,079
0,084
0,233
0,325
0,392
0,542
0,638
0,704
0,726

Tabla 3. Valores obtenidos de patrones para mtodo Sulfato

Graficando:
0.8
f(x) = 0.01x + 0.03
R = 0.99

0.7
0.6
0.5
Absorbancia

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Ppm

Grafica 3. Curva de Calibracin para Sulfatos

La tabla 3. No posee valores de concentracin y tramitancia debido a

que estos patrones fueron realizados por un equipo de trabajo en el laboratorio,
es por ello, que se tomo una muestra problema y se analizo con las soluciones
patrones y madres. Se obtuvo los siguientes datos:

Ppm
Muestra 1

Concentraci
Absorbancia n

28,5
0,314
0,66
Tabla 4. Muestra problema analizada

Tramitanci
a
48,4

Utilizando la Grafica 3. Se grafico el valor de absorbancia para obtener

los ppm de sulfato en la muestra problema, como se observa:

0.8
f(x) = 0.01x + 0.03
R = 0.99

0.7
0.6
0.5
0.4

Absorbancia

0.3
0.2
0.1
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Ppm

Grafica 3.1 Curva de Calibracin para Sulfatos con punto en absorbancia.

Para la muestra 1 el resultado fue de 28,5 ppm en concentracin de sulfatos.

Para Mtodo Hierro:

Para 0 - 0,0020ppm
Longitud de Onda: 480mn
Ppm

Absorbancia

Concentracin

Tramitancia

0,018

0,04

95,8

0,0005

0,152

0,32

82

0,0010

0,245

0,4

65

0,0015

0,362

0,76

43,4

0,0020
0,390
0,82
40,6
Tabla 5. Valores obtenidos de patrones para mtodo Hierro
Graficando:

Hierro
0.45
0.4

f(x) = 190.8x + 0.04

R = 0.97

0.35
0.3
0.25
Absorbancia

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

Ppm

Grafica 4. Curva de Calibracin para Hierro

Aplicando ley de Lambert Beer a las Absorbancias:

Abs
Abs.
Experimental
Calculada
Hierro
0,018
0,019
0,152
0,086
0,245
0,187
0,362
0,363
0,390
0,391
Tabla 5.1 Absorbancias calculadas para hierro
Para Mtodo Fosfato:

Para 0 - 20ppm
Longitud de Onda: 420mn
Ppm

Absorbancia

Concentracin

Tramitancia

0,027

0,06

93,8

0,132

0,28

73,6

0,179

0,37

66,2

10

0,307

0,64

49,2

15

0,406

0,85

39,2

20
0,564
1,18
27,4
Tabla 6. Valores obtenidos de patrones para mtodo Fosfato

Graficando:

Fosfato
0.6
f(x) = 0.03x + 0.04
R = 0.99

0.5
0.4
Absorbancia

0.3
0.2
0.1
0
0

10

15

20

25

Ppm

Grafica 5. Curva de Calibracin para Fosfatos

Aplicando ley de Lambert Beer a las Absorbancias:

Abs
Abs.
Experimental
Calculada
Fosfato
0,027
0,028
0,132
0,133
0,179
0,179
0,307
0,308
0,406
0,407
0,564
0,562
Tabla 6.1 Absorbancias calculadas para fosfato

De esta forma, todas las graficas fueron construidas con sus respectivos datos,
se comprob la precisin del equipo mediante el anlisis de las absorbancias
por la Ley de Lambert Beer, determinando que los estudios realizados fueron
exactos para cada uno de los mtodos.

CONCLUSIONES

Se evalu la condicin de los reactivos para los respectivos estudios

Se llevo a cado la verificacin de la calibracin del Spectronic 20 D a su
vez se comprob su correcto funcionamiento.
Se obtuvieron los datos correspondientes para cada uno de los mtodos
de espectrofotometra
Se graficaron las curvas de calibracin de cada mtodo de
espectrofotometra
Se comprob la precisin del equipo y de los datos obtenidos mediante
la ley de Lambert Beer
Se diseo el manual con sus curvas de calibracin para los mtodos
analizados.

RECOMENDACIONES

 Mantenimiento adecuado al espectrofotmetro, para futuros anlisis

Revisin del tiempo de duracin de las soluciones madres e intermedias
para evitar la prdida de las mismas

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Severriche, C., Castillo, M. y Acevedo, R. (2013). Manual de Mtodos

Analticos para la Determinacin de Parmetros Fisicoqumicos Bsicos
en Aguas. [Versin Electrnica]. Colombia. Recuperado el 22 de mayo
de 2015 de http://www.eumed.net/librosgratis/2013/1326/index.htm

Tierra, P. (2008). Trabajos prcticos de qumica analtica cuntica. .

[Versin Electrnica]. Mxico. Recuperado el 4 de junio de 2015 de:
http://www.etpcba.com.ar/Documentos/Nivel_Medio/Especialidades/Qui
mica/Anexo/guia_de_analitica_instrumental.pdf

Harris, C. (2003). Tcnicas avanzadas en qumica. Mxico. [Versin

Electrnica].

Recuperado

el

de

junio

de

2015

de:

http://ecovi.tripod.com/sitebuildercontent/sitebuilderfiles/fosfatos.pdf

Brunatti, C. (2008). Introduccin a la Espectroscopia de Absorcin

Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano. Mxico. [Versin
Electrnica].

Recuperado

el

16

de

julio

de

2015

http://materias.fi.uba.ar/6305/download/Espectrofotometria.pdf

de:

Apndice:
Diseo de un manual de curvas de calibracin de diferentes mtodos por
espectrofotometra aplicados en los laboratorios de qumica

UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

FRANCISCO DE MIRANDA
AREA DE TECNOLOGIA

NUCLEO EL SABINO
DEPARTAMENTO DE QUIMICA

MANUAL DE CURVAS DE
CALIBRACIN POR
ESPECTROFOMETRA

AUTOR:
MIQUILENA, SUGEY

P.P
JULIO 2015

INDICE GENERAL

INTRODUCCIN

FUNDAMENTO TERICO
CURVAS DE CALIBRACION DE:
NITRITOS
CROMO
HIERRO
SULFATO
FOSFATO

INTRODUCCION

El siguiente manual tiene como finalidad ayudar al estudiante de

ingeniera qumica a realizar los anlisis a muestras problemas, que necesiten
de pruebas de espectrofotometra y as obtener los resultados deseados.

La espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms

utilizadas para la deteccin especfica de molculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomolculas, etc.) y estado de agregacin (slido, lquido,
gas). El fundamento fsico-qumico de la espectrofotometra est relacionado
con la capacidad de las molculas de absorber energa luminosa y almacenarla
en forma de energa interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de
muchos organismos, entre ellos el de la fotosntesis en plantas y bacterias.

A continuacin se muestra de manera ordenada el procedimiento a

seguir para el anlisis de muestras y la correcta interpretacin de los datos
obtenidos.

FUNDAMENTO TERICO
La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y se
basa en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de un
compuesto y su concentracin. Cuando se hace incidir luz monocromtica (de
una sola longitud de onda) sobre un medio homogneo, una parte de la luz
incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de
la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la
intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.
Dependiendo del compuesto y el tipo de absorcin a medir, la muestra puede
estar en fase lquida, slida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta
del espectro electromagntico, la muestra es generalmente disuelta para
formar una solucin.

Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual es una curva que
muestra la cantidad de energa radiante absorbida, Absorbancia, por la
sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagntico, es decir, a
una determinada longitud de onda de la energa radiante, cada sustancia
absorbe una cantidad de radiacin que es distinta a la que absorbe otro
compuesto. (Fig. 1)

El mtodo espectrofotomtrico se rige por dos leyes fundamentales: Ley de

Lambert y Ley de Beer.

1.- Ley de Lambert. :

Esta ley establece que cuando pasa luz monocromtica por un medio
homogneo, la disminucin de la intensidad del haz de luz incidente es
proporcional al espesor del medio, lo que equivale a decir que la intensidad de
la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritmticamente el
espesor del medio absorbente (Fig. 2)

La siguiente relacin matemtica da cuenta de esta ley: P / P0 = e kb

Po: Intensidad de la luz incidente

P: Intensidad de la luz transmitida
b : Espesor del medio absorbente
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de
onda de la luz incidente, del espesor del medio absorbente y de la naturaleza
del medio.

2.- Ley de Beer:

La intensidad de un haz de luz monocromtica disminuye exponencialmente al

aumentar aritmticamente la concentracin de la sustancia absorbente, cuando
este haz pasa a travs de un medio homogneo (Fig. 3).

La relacin matemtica que da cuenta de esta ley se muestra a continuacin:

P / P0 = e -kc

Donde:
Po: Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida
c : Concentracin de la solucin
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de
onda de la luz incidente, de la concentracin de la solucin, y frecuentemente,
de la naturaleza del medio.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer

log P0 / P = a b c A = a b c

A = log P0 / P = - log T

Donde:
a : Absortividad
b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentracin de la solucin P/Po= T : Transmitancia

Los trminos absorbancia y Transmitancia son definidos a continuacin

Transmitancia (T): Es la razn entre la luz monocromtica transmitida (P) por

una muestra y la energa o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energa
radiante incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud
de onda.

T = P / P0 = 10-abc %T = 100 P / P0

Se acostumbra a considerar la transmitida como la razn de la luz transmitida

por la muestra y la luz transmitida por un estndar arbitrario. Este estndar
puede ser el liquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco
analtico (solucin que contiene todos los componentes de la solucin problema
menos la sustancia problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente.

Debido a que la transmitancia de este estndar no es necesariamente 100%,

es necesario especificar el estndar con el cual la muestra es comparada.

Absorbancia(A): Se define como la cantidad de energa radiante absorbida

por una sustancia pura o en solucin. Matemticamente, corresponde al
logaritmo negativo de la transmitancia. T, transmitancia expresada como
fraccin decimal %T, Transmitancia expresada como porcentaje.

A = - log T = 2 log %T

Pero.
T = P / P0 = 10-abc
Luego
A = - log ( P / P0 ) = - log 10-abc

A=abc
Esta ecuacin indica que la absorbancia es una funcin lineal de la
concentracin, donde a es una constante de proporcionalidad llamada
absortividad. La magnitud de a depende de las unidades de b y c. Si la
concentracin c est expresada en moles por litro y la longitud de la cubeta b
en centmetros, la constante a recibe el nombre de absortividad molar( ) .

Luego
A=bc

Mediciones de transmitancia y absorbancia.

Las mediciones de absorbancia o transmitancia se hacen por comparacin
entre la muestra problema y un estndar arbitrario o referencia. Como la
referencia debe poseer un porcentaje de transmitancia de 100%, esta es
llamada referencia de 100%., o una absorbancia de cero.
Seleccin de longitud de onda de trabajo.
La longitud de onda de trabajo corresponde, generalmente, a la longitud de
onda en la cual la absorbancia del analito (sustancia a analizar) es mxima, y
recibe la denominacin de Lambda mximo (max). Para seleccionar el max.,
se hace un espectro de absorcin o curva espectral, y que consiste en una
grfica de la absorbancia de una solucin de la sustancia absorbente de
concentracin adecuada, medida a distintas longitudes de onda y en ella se
determina el max. (Fig.4).

Las mediciones de absorbancia se hacen en la zona de longitudes de onda

donde se espera que absorba la sustancia problema. Si se trata de sustancias
coloreadas, las mediciones se realizan en la zona visible del espectro
electromagntico (380 a 800nm). En el caso de sustancias no coloreadas, las
mediciones se realizan en la regin ultravioleta del espectro electromagntico
(200 a 380nm).

Curva de Calibracin.
Uno de los mtodos ms utilizados para determinar la concentracin de una
muestra problema, es el mtodo de la curva de calibracin. Esta curva de
calibracin es una grfica que relaciona la concentracin de al menos cinco
soluciones de estndar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de
cada uno de ellos a la longitud de onda mxima ( max) (Fig. 5).

Una vez obtenida la grfica se determina la funcin matemtica que presenta

dicha recta a travs del tratamiento estadstico de regresin de los mnimos
cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentracin de un analito.
Al hacer la curva de calibracin, se debe emplear la longitud de onda de
mxima absorbancia (max.), para obtener una recta con la mxima pendiente
y as tener mayor sensibilidad y precisin al hacer las mediciones. La medicin
de la absorbancia de la solucin problema debe hacerse a la misma longitud de
onda que fue hecha la curva de calibracin.
Las siguientes curvas de calibracin estn diseadas por los datos obtenidos
por el Spectronic 20 D, equipo espectrgrafo que se encuentra en los
Laboratorios de Qumica de UNEFM SABINO.

Una vez analizado el fundamento terico de espectrofotometra, procedemos a

la muestra de las curvas realizadas y la breve explicacin de cmo aplicar los
mtodos a las muestras problemas.

RECOMENDACIN ESPECIAL: PARA EL USO DEL SPECTRONIC 20 D, SE

RECOMIENDA

EL

ENCENDIDO

DEL

EQUIPO

ANTES

DE

LA

PREPARACION DE MUESTRAS POR UN TIEMPO DE 30 MIN. DE ESTA

FORMA SE ASEGURA LA PRECISION DEL MISMO

PARA OBTENER EL VALOR DE PPM EN LA MUESTRA PROBLEMA, DEBE

BUSCARSE EN LA GRFICA EL VALOR DE LA ABSORBANCIA
OBTENIDO, SEGUIDAMENTE CHOCAR CON LA CURVA Y LEER HACIA
ABAJO LA CONCENTRACIN DE LA MUESTRA.

CURVAS DE
CALIBRACIN

CURVA DE
CALIBRACIN PARA
NITRITOS

SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacn de reactivos):
-

Reactivo de Zambelli.
Solucin Madre de Nitritos
Solucin Intermedia de Nitritos
Solucin Patrn de Nitritos

Equipos:
-

Spectronic 20 D
Cubetas de paso ptico de 1 cm

Nota: Longitud de onda de este mtodo: 425nm

PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA

-

Transferir 50 mL de muestra (previamente filtrada por membrana de 0.45

mm o sometida a centrifugacin, en caso de ser necesario por presentar
alta turbiedad), a un vaso de precipitados de 100 mL, adicionarle 2 mL
de reactivo de Zambelli. Agitar para mezclar bien y esperar 2 minutos.

Aadir 2 mL de amonaco, agitar y esperar 5 minutos.

Preparar y analizar un blanco de reactivos con agua destilada.

Leer en espectrofotmetro a 425 nm con cubetas de paso ptico de 1cm

respecto a la curva de calibracin de nitritos.

Nitritos
0.250

0.200
f(x) = 0.97x - 0
R = 0.95
0.150
Absorbancia
0.100

0.050

0.000
0

0.05

0.1

0.15
Ppm

0.2

0.25

CURVA DE
CALIBRACIN PARA
CROMO

SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacn de reactivos):

Solucin de Difenilhidrazina: esta solucin debe prepararse al momento

de uso: Habitualmente 10 mL son suficientes, lo que implica pesar 50 mg
de 1,5-difenilcarbazida (difenilcarbohidrazida) y disolverlos en 10 mL de

acetona.
Solucin de Acido Sulfrico 1:1
Solucin madre de cromos
Solucin intermedia de cromos

Equipos:
-

Spectronic 20 D
Cubetas de paso ptico de 1 cm

Nota: Longitud de onda de este mtodo: 540 nm

PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
-

Transferir 50 mL de muestra (previamente filtrada si la muestra lo

amerita), aun vaso de precipitados de 100 mL, adicionarle 0.5 mL de
cido sulfrico 1:1.
Agitar para mezclar bien.

Aadir 1 mL de solucin de difenilcarbazida, agitar y dejar reposar 5 a 10

minutos para desarrollar color.

Preparar y analizar un blanco de reactivos con agua.

Leer en espectrofotmetro a 540 nm con cubetas de 5 cm de paso

ptico.

Cromo
0.35

0.3

f(x) = 0.95x + 0.12

R = 0.92

0.25

0.2
Absorbancia
0.15

0.1

0.05

0
0

0.05

0.1

0.15
Ppm

0.2

0.25

CURVA DE
CALIBRACIN PARA
HIERRO

SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacn de reactivos):

Solucin estndar de hierro

Agua oxigenada 30%
Solucin de Tiocianato de Amonio

Equipos:
-

Spectronic 20 D
Cubetas de paso ptico de 1 cm

Nota: Longitud de onda de este mtodo: 480 nm

PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
-

Transferir 1ml de solucin problema a un matraz de100ml, agregar

suficiente ntrico (1: 1) asegurando un contenido total de 5ml. Diluir hasta

60ml con agua destilada.

Agregar 1ml de agua oxigenada y mezclar.
Agregar 20ml de tiocianato de amonio, diluir a la marca y mezclar.
Transferir una porcin adecuada al tubo de lectura y medir la
absorbancia a 480nm. Con el valor obtenido buscar en la curva de
calibracin los miligramos de hierro presentes en la solucin incgnita.

Hierro
0.45
f(x) = 190.8x + 0.04
R = 0.97

0.4
0.35
0.3
0.25
Absorbancia

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

0
Ppm

CURVA DE
CALIBRACIN PARA
SULFATO

SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacn de reactivos):

Solucin patrn de sulfato

Solucin acondicionadora de sulfato
Cloruro de Bario concentrado

Equipos:
-

Spectronic 20 D
Cubetas de paso ptico de 1 cm

Nota: Longitud de onda de este mtodo: 420 nm

PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
-

Transferir 50 mL de muestra (en caso de turbiedad evidente,

centrifugarla o filtrarla) a un vaso de precipitados de 100 mL, adicionar
2.5 mL de solucin acondicionadora y agitar; adicionar una cucharilla de
cristales de cloruro de bario y agitar nuevamente en forma vigorosa.

Leer antes de 5 minutos en espectrofotmetro a 420 nm con celdas de 1

cm de paso ptico respecto a la curva de calibracin de sulfato. Si la
absorbancia de la muestra resultase mayor que la del mayor patrn, es
necesario repetir el proceso mediante la lectura de diluciones de la
muestra. Para esto, debe realizarse como mnimo dos diluciones, se
calcular el coeficiente de variacin y si ste no supera 10 %, se
informar el valor promedio; en estos casos, es necesario multiplicar
previamente por el factor de dilucin.

0.8
f(x) = 0.01x + 0.03
R = 0.99
0.7

0.6

0.5

Absorbancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0

10

20

30

40

50
Ppm

60

70

80

90

CURVA DE
CALIBRACIN PARA
FOSFATO

SOLUCIONES A UTILIZAR:
(Disponibles en el almacn de reactivos):
-

Reactivo de vanado-molibdico
Solucin patrn de ortofosfato

Equipos:
-

Spectronic 20 D
Cubetas de paso ptico de 1 cm

Nota: Longitud de onda de este mtodo: 420 nm

PREPARACION DE MUESTRA PROBLEMA
-

Pipetear 5 ml de la disolucin problema y pasarlos a un matraz aforado

de 25 ml.
Aadir 10 ml de la disolucin vanado-molibdato y enrasar con agua

destilada.
Repetir este procedimiento otras 2 veces ms para tener 3 muestras

problema.
Dejar reposar 10 minutos

Fosfato
0.6
f(x) = 0.03x + 0.04
R = 0.99

0.5

0.4

Absorbancia

0.3

0.2

0.1

0
0

10

15
Ppm

20

25

ANEXOS

Patrones preparados

Lecturas en espectrofotmetro.