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Teste de Ames:
Ensaio de Mutao Reversa Bacteriana.
PRINCPIO DO MTODO
o Clulas bacterianas auxotrficas (Salmonella typhimurium mutaes no operon his);
tetraciclina
(antibacteriano), sendo
o marcador de sua
presena.
pKM101. aumento do
sistema
de
reparo
passvel de erro, cuja
presena aumenta a
mutagnese espontnea
e a induzida
Deleo uvrB. Um dos
responsveis
pelo
reparo de exciso,
levando a um maior
nmero
de
leses
reparadas
por
mecanismos sujeitos a
erros
FONTE: YOSHIDA, E. Segurana de Fitoqumicos Isolados de Dipteryx Alata Vogel sob o Parmetro da
Mutagenicidade pelo Teste de Ames. In: UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com
Salmonella typhimurium (teste de Ames) como indicador de carcinogenicidade em potencial para mamferos, 2003.
PRINCPIO DO MTODO
o Realizado na presena e na ausncia de enzimas de metabolizao (S9);
DESCRIO DO MTODO
o Guia de Orientao para Teste de Produtos Qumicos (Guideline For Testing Of
Chemicals);
o Organizao para a Cooperao Econmica e Desenvolvimento (OECD).
PREPARAO
Bactrias:
PREPARAO
o Cinco cepas devem ser utilizadas;
PREPARAO
1. S. typhimurium TA1535, e
4. S. typhimurium TA100, e
5. E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.
PREPARAO
o Aminocidos especficos: S. typhimurium (his) e E. coli (trip);
PREPARAO
Ativao Metablica:
PREPARAO
o Substncias slidas: dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes da exposio das bactrias;
o Substncias lquidas: adicionadas diretamente aos sistemas de ensaio e/ou diludas
antes do tratamento.
CONDIES DO TESTE
Solvente/Veculo:
CONDIES DO TESTE
Concentraes de Exposio:
Cepas
TA1535 e TA100
TA98
TA102
(f) N-etil-N-nitro-N-nitrosoguanidina [CAS. 70-25-7] WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)
ou
PROCEDIMENTO
Processamento da Substncia Teste:
Mtodo de incorporao em placas sem ativao metablica:
0,05 ml ou 0,1 ml das solues de ensaio;
0,1 ml de cultura bacteriana fresca (contendo aproximadamente 108 clulas viveis);
0,5 ml de tampo estril;
2,0 ml de gar de superfcie.
Os contedos de cada tubo so misturados em placas de gar mnimo e vertidos sobre o gar de
superfcie. O gar de superfcie deve solidificar antes da incubao.
PROCEDIMENTO
Processamento da Substncia Teste:
Mtodo de incorporao em placas com ativao metablica:
0,5 ml de mistura de ativao metablica com frao ps-mitocondrial;
2,0 mL de gar de superfcie;
Bactrias;
Soluo/substncia teste.
Os contedos de cada tubo so misturados em placas de gar mnimo e vertidos sobre o gar de
superfcie. O gar de superfcie deve solidificar antes da incubao.
PROCEDIMENTO
Processamento da Substncia Teste:
Mtodo de pr-incubao:
0,05 ou 0,1 ml Soluo/substncia teste
PROCEDIMENTO
Incubao:
o Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37C durante 48-72 horas;
o Aps perodo de incubao: contagem do nmero de colnias com mutao reversa
em cada placa.
DADOS E RELATRIO
Processamento dos Resultados:
DADOS E RELATRIO
o Resultados ambguos: devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com
modificao das condies experimentais;
o Resultados negativos: precisam ser confirmados caso-a-caso.
DADOS E RELATRIO
Avaliao da Interpretao dos Resultados:
DADOS E RELATRIO
Relatrio:
o Substncia Teste;
o Solvente/ Veculo;
o Cepas;
o Condies de Ensaio;
o Resultados;
MATERIAIS E MTODOS
Material Vegetal:
A planta utilizada foi coletada na Serra do Cip, Minas Gerais, e identificada pelo
Prof. Dr. Paulo Takeo Sano, do Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo.
MATERIAIS E MTODOS
Preparo do Extrato:
Solvente
Evaporado
60C
Temp. Amb.
1 semana
Etanol 96%
MATERIAIS E MTODOS
Fracionamento do Extrato para Obteno e Isolamento dos Flavonides:
Extrato etanlico 96% de P. latipes por permeao em gel;
Coluna utilizando Sephadex LH-20 e metanol (eluente);
Cromatografia em camada delgada comparativa;
Visualizao sob luz ultravioleta;
Obteno de espectros de RMN e espectrometria de massas.
MATERIAIS E MTODOS
Diluio das Amostras:
7 metilquercetagetina
1 mL
5 mg
7 metilquercetagetina-4-O-D-glicopiranosdeo
Dimetilsufxido (DMSO)
MATERIAIS E MTODOS
Linhagens Utilizadas:
TA100
Salmonella
typhimurium
TA98
MATERIAIS E MTODOS
Manuteno e Estoque das Cepas:
0,9 mL de cultura
0,1 mL de DMSO
crioprotetora
- 70C
Salmonella
typhimurium
1,5 mL
Manter as caractersticas
genticas inalteradas
MATERIAIS E MTODOS
Verificao das Caractersticas Genticas das Cepas:
As caractersticas genticas das cepas de S. typhimurium foram checadas antes do preparo
para congelamento;
Verificou-se a dependncia de histidina, a presena de mutao rfa, a presena de deleo
uvrB e a presena de plasmdeos de resistncia.
MATERIAIS E MTODOS
Taxa de Reverso Espontnea:
A frequncia de reverso foi observada em cada cepa;
Colnias revertentes prototrficas para a histidina: facilmente visveis em gar mnimo
glicosado;
Colnias auxotrficas: formam uma fina camada de crescimento (background).
MATERIAIS E MTODOS
Preparo dos Inculos de S. typhimurium Utilizados no Ensaio:
Cultura estoque
congelada
Caldo Nutriente
30 mL
37C
12 16h
1,2 x 109 bac/mL
MATERIAIS E MTODOS
Preparo da Mistura da Frao Microssomal S9:
Revela se o material
testado mutagnico
em sua forma original
ou metabolizado
Agente indutor
enzimtico
Frao microssomal
S9 (fgado)
Mistura S9:
Cloreto de Magnsio
Cloreto de Potssio
Glicose-6-fosfato
nicotinamida
Tampo fosfato
gua destilada
Frao S9 + H2O
MATERIAIS E MTODOS
Controles:
Negativo: DMSO solvente das amostras;
Positivo: TA98 4-nitrofenilenodiamida dissolvida em DMSO;
TA100 azida sdica dissolvida em gua bidestilada (sem ativao)
2-antramina (com ativao metablica)
MATERIAIS E MTODOS
Ensaios de Mutagenicidade:
Sem
ativao
Flavonides
+
Extrato etanlico bruto
+
Cultura de bactrias
+
Top gar
Flavonides
+
Extrato etanlico bruto
+
Cultura de bactrias
+
Top gar
+
0,5 mL da mistura S9
Com
ativao
Contagem
colnias
revertentes
37C
48h
MATERIAIS E MTODOS
Anlise Estatstica:
Salanal;
ANOVA-teste F
RESULTADOS E DISCUSSO
o um mtodo adequado para demonstrar a exposio de usurios compostos
mutagnicos, que fazem parte da composio qumica de plantas de uso popular;
o Wall et. Al, 1998: flavonides (quercetina, 3-metilquercetina) apresentam ao
mutagnica sem ativao metablica e potencializao com ativao metablica;
Hidroxilas livres no anel B;
Hidroxila livre em C3.
Mdia de desvio
padro do nmero
de
revertentes
his+/placa para o
grupo controle e
extrato etanlico
bruto.
Mdia
de
desvio
padro do nmero de
revertentes his+/placa
para o grupo controle e
7-metilquercetagetina4
No ocorreu aumento da
frequncia de mutantes
revertentes com o aumento
da concentrao.
As
razes
de
mutagenicidade foram
menores que 2.
Ausncia de
Atividade
Mutagnica!
CONCLUSO
o Os resultados obtidos foram diferentes dos apresentados por Wall et. Al (1998) e
MacGREGOR e JURD (1978);
o Os flavonoides testados apresentaram:
Posio metoxilada (no livre);
Posio 6 oxigenada;
7-metilquercetagetina apresenta duas hidroxilas livres em C3 e C4.
REFERNCIAS
AMBROSIO, J. B. (2012). Avaliao dos Efeitos Citotxicos, Genotxicos e Mutagnicos de 2 Classes de Agrotxicos
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AMES, B.N., MCCANN, J. and YAMASAKI, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
CETESB. Companhia Ambiental do Estado de So Paulo, 1996-2013. Disponvel em: www.cetesb.sp.gov.br. Acesso
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GATEHOUSE, D., HAWORTH, S., CEBULA, T., GOCKE, E., KIER, L., MATSUSHIMA, T., MELCION, C., NOHMI, T., VENITT,
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MARON, D.M. and AMES, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113,
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REFERNCIAS
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Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, 343-350.
MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat. Res. 2009, 455, 2936.
MOREIRA, R.; SANTOS, L.; VARELLA, S.; VARANDA, E.; VILEGAS, W. (2002). Avaliao da atividade mutagnica do
extrato etanlico bruto de Paepalanthus latipes e dos compostos flavonidicos 7-metoxilados Relacionados. Rev. Bra.
Farm., V.12, n.1, p. 11-19.
OECD Guideline for Testing of Chemicals. Bacterial Reverse Mutation Test. Postado: 21st July 1997. Disponvel em:
www.oecd.org. Acesso em: 10 Abril 2015.
UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (teste de Ames) como
indicador de carcinogenicidade em potencial para mamferos. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K.
Mutagnese Ambiental. Canoas: ULBRA, 2003. p. 81-112.
YOSHIDA, E. H. Segurana de Fitoqumicos Isolados de Dipteryx Alata Vogel sob o Parmetro da Mutagenicidade
pelo Teste de Ames. Sorocaba: UNISO, 2014. p. 20-27.
OBRIGADA!