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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAP

PR REITORIA DE PESQUISA E PS-GRADUAO


PROGRAMA DE PS DE GRADUAO EM INOVAO FARMACUTICA

Teste de Ames:
Ensaio de Mutao Reversa Bacteriana.

Prof. Dr. Moacir de Azevedo Bentes Monteiro Neto


Discente: Raphaelle Sousa Borges

ENSAIO DE MUTAO REVERSA BACTERIANA


o Identificar substncias que causem danos genticos e que possam evoluir a
mutaes;
o Correlao: carcinognese e mutagnese;
o Medida das taxas de mutao nos sistemas bacterianos;
o Alguns metablitos produzidos no corpo (fgado) so de fato agentes mutagnicos;
o As 21 reaes enzimticas que convertem carcingenos em metablitos bioativos
no ocorrem em bactrias.

ENSAIO DE MUTAO REVERSA BACTERIANA


o Clulas procariotas;

o Avaliao da atividade genotxica e mutao;


o A correlao no absoluta (depende da classe qumica);

o Substncias cancergenas no detectadas - mecanismos no genotxicos ausentes


em clulas bacterianas.

PRINCPIO DO MTODO
o Clulas bacterianas auxotrficas (Salmonella typhimurium mutaes no operon his);

o Mutaes por deslocamento do quadro de leitura ou substituio de pares de base;


o Novas mutaes reverso;

o Ausncia de enzimas de metabolizao;


o Enzimas de metabolizao (frao S9 fgado de ratos);
o S9: compostos mutagnicos indiretos e diretos.

Caractersticas genticas das linhagens de Salmonella typhimurium que lhes conferem


maior sensibilidade e versatilidade na deteco de diversos tipos de mutgenos.
Parental LT2
pAQ1. introduzido em
TA102
o plasmdio
multicpia que confere
resistncia

tetraciclina
(antibacteriano), sendo
o marcador de sua
presena.

pKM101. aumento do
sistema
de
reparo
passvel de erro, cuja
presena aumenta a
mutagnese espontnea
e a induzida
Deleo uvrB. Um dos
responsveis
pelo
reparo de exciso,
levando a um maior
nmero
de
leses
reparadas
por
mecanismos sujeitos a
erros

Mutao rfa. perda


parcial da barreira de
lipopolissacrides da
parede bacteriana.

FONTE: YOSHIDA, E. Segurana de Fitoqumicos Isolados de Dipteryx Alata Vogel sob o Parmetro da
Mutagenicidade pelo Teste de Ames. In: UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com
Salmonella typhimurium (teste de Ames) como indicador de carcinogenicidade em potencial para mamferos, 2003.

PRINCPIO DO MTODO
o Realizado na presena e na ausncia de enzimas de metabolizao (S9);

o Incorporao em placas: gar de superfcie + meio mnimo (ausncia de his);


o Pr-incubao: mistura incubada com gar de superfcie + placas com meio mnimo;

o Contagem de colnias revertentes.

DESCRIO DO MTODO
o Guia de Orientao para Teste de Produtos Qumicos (Guideline For Testing Of
Chemicals);
o Organizao para a Cooperao Econmica e Desenvolvimento (OECD).

PREPARAO
Bactrias:

o Culturas frescas de bactrias cultivadas at a fase exponencial (109 cel/ml);


o Culturas em fase estacionria no deve ser utilizadas;

o As culturas utilizadas no teste devem conter um ttulo elevado de clulas viveis;


o A temperatura recomendada para a cultura de 37C.

PREPARAO
o Cinco cepas devem ser utilizadas;

o Quatro cepas de S. typhimurium (TA1535; TA1537 ou TA97 ou TA97a; TA98; e


TA100): viveis e reprodutveis em laboratrio (par de base GC no local da inverso
primria);
o Cepa de E. coli WP2 ou S. typhimurium TA102: par de base AT no local da inverso
primria.

PREPARAO
1. S. typhimurium TA1535, e

2. S. typhimurium ou TA97a TA1537 ou TA97, e


3. S. typhimurium TA98, e

4. S. typhimurium TA100, e
5. E. coli WP2 uvrA, ou E. coli WP2 uvrA (pKM101), ou S. typhimurium TA102.

PREPARAO
o Aminocidos especficos: S. typhimurium (his) e E. coli (trip);

o Contagens de revertentes espontneas: dados histricos de controle e literatura;


o gar mnimo adequado: meio mnimo Vogel-Bonner E e glicose;

o gar com histidina e biotina ou triptofano (viabilizar as divises celulares).

PREPARAO
Ativao Metablica:

o As bactrias: presena e ausncia de um sistema de ativao metablica;


o Co-fator suplementado da frao ps-mitocondrial (S9): fgado de roedores
tratados com agentes indutores de enzimas (Aroclor 1254 ou fenobarbital + naftoflavona);
o Frao ps-mitocondrial: concentraes de 5 a 30% v/v na mistura S9.

PREPARAO
o Substncias slidas: dissolvidas ou suspensas em solventes ou veculos adequados e,
se necessrio, diludas antes da exposio das bactrias;
o Substncias lquidas: adicionadas diretamente aos sistemas de ensaio e/ou diludas
antes do tratamento.

CONDIES DO TESTE
Solvente/Veculo:

o Solvente/veculo: no deve reagir com a substncia em teste e dever ser


compatvel com a sobrevivncia das bactrias e a atividade da mistura S9;
o Solventes/veculos desconhecidos: a sua incluso deve ser apoiada por dados que
indiquem a sua compatibilidade;
o Recomendao: priorizar o uso de um solvente/veculo aquoso;
o Teste com substncias instveis em gua: os solventes orgnicos utilizados devem ser
livres de gua.

CONDIES DO TESTE
Concentraes de Exposio:

o Citotoxicidade: reduo do nmero de colnias revertentes ou grau de


sobrevivncia das culturas tratadas (pode ser alterada na presena de sistemas de
ativao metablica);
o Insolubilidade: precipitao na mistura final nas condies reais de ensaio e
evidenciadas a olho nu (5 mg/placa ou 5 ml/placa).

Controles positivos para ensaios com ativao metablica:


Substncia qumica e N CAS (registro)

9,10-dimetilantraceno [CAS. 781-43-1]


7,12-dimetilbenzantraceno [CAS no. 57-97-6]

Vermelho do Congo [CAS. 573-58-0] (para o mtodo de ativao metablica redutor)

Benzo (a) pireno [CAS no. 50-32-8]

Ciclofosfamida (mono-hidrato) [CAS. 50-18-0 (CAS no. 6055-19-2)]


2-aminoantraceno [CAS no. 613-13-8]

Controles positivos para ensaios sem ativao metablica:


Qumica e CAS No.

Cepas

(a) Azida de sdio [CAS no. 26628-22-8]

TA1535 e TA100

(b) 2-nitrofluoreno [CAS. 607-57-8]

TA98

(c) 9-aminoacridina [CAS no. 90-45-9] ou ICR

TA1537, TA97a e TA97

191[CAS no. 17070-45-0]


(d) Hidroperxido de cumeno [CAS no. 80-15-9]

TA102

(e) Mitomicina C [CAS. 50-07-7]

WP2 uvrA e TA102

(f) N-etil-N-nitro-N-nitrosoguanidina [CAS. 70-25-7] WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA (pKM101)
ou

4-nitroquinolina 1-xido [CAS. 56-57-5]

(g) Furilfuramida (AF-2) [CAS no. 3688-53-7]

Cepas contendo plasmdeo

PROCEDIMENTO
Processamento da Substncia Teste:
Mtodo de incorporao em placas sem ativao metablica:
0,05 ml ou 0,1 ml das solues de ensaio;
0,1 ml de cultura bacteriana fresca (contendo aproximadamente 108 clulas viveis);
0,5 ml de tampo estril;
2,0 ml de gar de superfcie.
Os contedos de cada tubo so misturados em placas de gar mnimo e vertidos sobre o gar de
superfcie. O gar de superfcie deve solidificar antes da incubao.

PROCEDIMENTO
Processamento da Substncia Teste:
Mtodo de incorporao em placas com ativao metablica:
0,5 ml de mistura de ativao metablica com frao ps-mitocondrial;
2,0 mL de gar de superfcie;
Bactrias;
Soluo/substncia teste.
Os contedos de cada tubo so misturados em placas de gar mnimo e vertidos sobre o gar de
superfcie. O gar de superfcie deve solidificar antes da incubao.

PROCEDIMENTO
Processamento da Substncia Teste:
Mtodo de pr-incubao:
0,05 ou 0,1 ml Soluo/substncia teste

0,1 ml de cepas (aproximadamente 108 clulas viveis)


Tampo estril ou sistema de ativao metablica (0,5 ml)

2,0 ml de gar de superfcie;


20 minutos ou mais a 30- 37C.

PROCEDIMENTO
Incubao:

o Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37C durante 48-72 horas;
o Aps perodo de incubao: contagem do nmero de colnias com mutao reversa
em cada placa.

DADOS E RELATRIO
Processamento dos Resultados:

o Contagem individual das placas;


o Nmero mdio de colnias com mutao reversa por placa;

o Desvio padro da substncia teste;


o Controle positivo e controle negativo (no tratado e/ou solvente).

DADOS E RELATRIO
o Resultados ambguos: devem ser melhor esclarecidos, de preferncia com
modificao das condies experimentais;
o Resultados negativos: precisam ser confirmados caso-a-caso.

DADOS E RELATRIO
Avaliao da Interpretao dos Resultados:

o Resultados Positivos: aumento da concentrao ao longo do ensaio e/ou aumento no


nmero de colnias com mutao reversa por placa em pelo menos uma cepa, com
ou sem ativao metablica;
o Os resultados positivos indicam que a substncia induz mutaes pontuais por
substituio de bases ou deslocamento no quadro de leitura do genoma de
Salmonella typhimurium e/ou Escherichia coli.
o Os resultados negativos sugerem que, sob as condies do ensaio, a substncia
teste no mutagnica para as espcies testadas.

DADOS E RELATRIO
Relatrio:

o Substncia Teste;
o Solvente/ Veculo;

o Cepas;
o Condies de Ensaio;
o Resultados;

o Discusso dos Resultados;


o Concluso.

UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com Salmonella


typhimurium (teste de Ames) como indicador de carcinogenicidade em potencial para
mamferos. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K. Mutagnese
Ambiental. Canoas: ULBRA, 2003. p. 81-112.

MATERIAIS E MTODOS
Material Vegetal:

A planta utilizada foi coletada na Serra do Cip, Minas Gerais, e identificada pelo
Prof. Dr. Paulo Takeo Sano, do Instituto de Biocincias da Universidade de So Paulo.

MATERIAIS E MTODOS
Preparo do Extrato:

Solvente
Evaporado
60C

Temp. Amb.

1 semana

Etanol 96%

MATERIAIS E MTODOS
Fracionamento do Extrato para Obteno e Isolamento dos Flavonides:
Extrato etanlico 96% de P. latipes por permeao em gel;
Coluna utilizando Sephadex LH-20 e metanol (eluente);
Cromatografia em camada delgada comparativa;
Visualizao sob luz ultravioleta;
Obteno de espectros de RMN e espectrometria de massas.

MATERIAIS E MTODOS
Diluio das Amostras:

7 metilquercetagetina

1 mL
5 mg

Extrato Etanlico Bruto

7 metilquercetagetina-4-O-D-glicopiranosdeo

Dimetilsufxido (DMSO)

MATERIAIS E MTODOS
Linhagens Utilizadas:

TA100

Detecta mutgenos causadores da substituio de pares de bases do DNA


Mutao no gene hisG (hisG46) - codifica para a histidina
Ponto para a reverso: GC (troca para AT)

Salmonella
typhimurium
TA98

Detecta mutgenos causadores do deslocamento do quadro de leitura

Mutao no gene hisD (hisD3052) - codifica para a histidinol desidrogenase


(direciona a enzima ao citosol)
Ponto para a reverso: oito resduos repetitivos de GC

MATERIAIS E MTODOS
Manuteno e Estoque das Cepas:
0,9 mL de cultura

0,1 mL de DMSO
crioprotetora

- 70C
Salmonella
typhimurium
1,5 mL

Manter as caractersticas
genticas inalteradas

MATERIAIS E MTODOS
Verificao das Caractersticas Genticas das Cepas:
As caractersticas genticas das cepas de S. typhimurium foram checadas antes do preparo
para congelamento;
Verificou-se a dependncia de histidina, a presena de mutao rfa, a presena de deleo
uvrB e a presena de plasmdeos de resistncia.

MATERIAIS E MTODOS
Taxa de Reverso Espontnea:
A frequncia de reverso foi observada em cada cepa;
Colnias revertentes prototrficas para a histidina: facilmente visveis em gar mnimo
glicosado;
Colnias auxotrficas: formam uma fina camada de crescimento (background).

MATERIAIS E MTODOS
Preparo dos Inculos de S. typhimurium Utilizados no Ensaio:

Cultura estoque
congelada

Caldo Nutriente
30 mL

37C
12 16h
1,2 x 109 bac/mL

MATERIAIS E MTODOS
Preparo da Mistura da Frao Microssomal S9:

Revela se o material
testado mutagnico
em sua forma original
ou metabolizado

Agente indutor
enzimtico

Frao microssomal
S9 (fgado)

Mistura S9:
Cloreto de Magnsio
Cloreto de Potssio
Glicose-6-fosfato
nicotinamida
Tampo fosfato
gua destilada
Frao S9 + H2O

MATERIAIS E MTODOS
Controles:
Negativo: DMSO solvente das amostras;
Positivo: TA98 4-nitrofenilenodiamida dissolvida em DMSO;
TA100 azida sdica dissolvida em gua bidestilada (sem ativao)
2-antramina (com ativao metablica)

MATERIAIS E MTODOS
Ensaios de Mutagenicidade:

Sem
ativao

Flavonides
+
Extrato etanlico bruto
+
Cultura de bactrias
+
Top gar

gar mnimo glicosado


triplicata

Flavonides
+
Extrato etanlico bruto
+
Cultura de bactrias
+
Top gar
+
0,5 mL da mistura S9

gar mnimo glicosado


triplicata

Com
ativao
Contagem
colnias
revertentes

37C
48h

MATERIAIS E MTODOS
Anlise Estatstica:
Salanal;
ANOVA-teste F

RESULTADOS E DISCUSSO
o um mtodo adequado para demonstrar a exposio de usurios compostos
mutagnicos, que fazem parte da composio qumica de plantas de uso popular;
o Wall et. Al, 1998: flavonides (quercetina, 3-metilquercetina) apresentam ao
mutagnica sem ativao metablica e potencializao com ativao metablica;
Hidroxilas livres no anel B;
Hidroxila livre em C3.

o MacGREGOR e JURD, 1978: flavonides (quercetina, 3-metilquercetina);


Hidroxilas livres em C3 e C4 no anel B;
Hidroxila livre em C3;
Dupla ligao em C2 e C3.

Mdia de desvio
padro do nmero
de
revertentes
his+/placa para o
grupo controle e
extrato etanlico
bruto.

Mdia de desvio padro


do
nmero
de
revertentes his+/placa
para o grupo controle e
7-metilquercetagetina.

Mdia
de
desvio
padro do nmero de
revertentes his+/placa
para o grupo controle e
7-metilquercetagetina4

No ocorreu aumento da
frequncia de mutantes
revertentes com o aumento
da concentrao.

As
razes
de
mutagenicidade foram
menores que 2.

Ausncia de
Atividade
Mutagnica!

CONCLUSO
o Os resultados obtidos foram diferentes dos apresentados por Wall et. Al (1998) e
MacGREGOR e JURD (1978);
o Os flavonoides testados apresentaram:
Posio metoxilada (no livre);
Posio 6 oxigenada;
7-metilquercetagetina apresenta duas hidroxilas livres em C3 e C4.

o Os flavonoides testados neste estudo no apresentaram atividade mutagnica,


sugerindo segurana na utilizao em humanos.

REFERNCIAS
AMBROSIO, J. B. (2012). Avaliao dos Efeitos Citotxicos, Genotxicos e Mutagnicos de 2 Classes de Agrotxicos
Utilizados em Cultura de Cana-De-Acar no Estado de So Paulo Brasil. 50-57.
AMES, B.N., MCCANN, J. and YAMASAKI, E. (1975). Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the
Salmonella/Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 347-364.
CETESB. Companhia Ambiental do Estado de So Paulo, 1996-2013. Disponvel em: www.cetesb.sp.gov.br. Acesso
em: 10 de Abril de 2015.
DE ROBERTS, E.D.P.; DE ROBERTS, Jr., E.M.F. Bases da biologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Guanabara, 1981.
332p.
GATEHOUSE, D., HAWORTH, S., CEBULA, T., GOCKE, E., KIER, L., MATSUSHIMA, T., MELCION, C., NOHMI, T., VENITT,
S. and ZEIGER, E. (1994). Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312,
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MARON, D.M. and AMES, B.N. (1983). Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113,
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REFERNCIAS
MARON, D., KATZENELLENBOGEN, J., and AMES, B.N. (1981). Compatibility of Organic Solvents with the
Salmonella/Microsome Test. Mutation Res., 88, 343-350.
MORTELMANS, K.; ZEIGER, E. The Ames Salmonella/microsome mutagenicity assay. Mutat. Res. 2009, 455, 2936.
MOREIRA, R.; SANTOS, L.; VARELLA, S.; VARANDA, E.; VILEGAS, W. (2002). Avaliao da atividade mutagnica do
extrato etanlico bruto de Paepalanthus latipes e dos compostos flavonidicos 7-metoxilados Relacionados. Rev. Bra.
Farm., V.12, n.1, p. 11-19.
OECD Guideline for Testing of Chemicals. Bacterial Reverse Mutation Test. Postado: 21st July 1997. Disponvel em:
www.oecd.org. Acesso em: 10 Abril 2015.
UMBUZEIRO, G. A.; VARGAS, V. M. F. Teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium (teste de Ames) como
indicador de carcinogenicidade em potencial para mamferos. In: RIBEIRO, L. R.; SALVADORI, D. M. F.; MARQUES, E. K.
Mutagnese Ambiental. Canoas: ULBRA, 2003. p. 81-112.
YOSHIDA, E. H. Segurana de Fitoqumicos Isolados de Dipteryx Alata Vogel sob o Parmetro da Mutagenicidade
pelo Teste de Ames. Sorocaba: UNISO, 2014. p. 20-27.

OBRIGADA!

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