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Materia: Microbiologa
Grado: 3 grupo: B
MICROBIOLOG
A
Profesor: Vicente Morales Carbajal
Fecha: 04/12/2012
Indice
Parcial 1
Bacterias
Levaduras
Hongos
Parcial 2
Microscopa
Pruebas bioqumicas
Tincin de Gram
Medio de cultivo
Parcial 3
Recuento en placa
Dosoluciones
Glosario
Parcial 1
Tema: BACTERIAS
Historia de la bacteriologa
La existencia de microorganismos fue conjeturada a finales de la Edad Media.
En el Canon de medicina (1020), Ab Al ibn Sn (Avicenna) planteaba que las
secreciones corporales estaban contaminadas por multitud de cuerpos
extraos infecciosos antes de que una persona cayera enferma, pero no lleg a
identificar a estos cuerpos como la primera causa de las enfermedades.
Cuando la peste negra (peste bubnica) alcanz al-ndalus en el siglo XIV, Ibn
Khatima e Ibn al-Jatib escribieron que las enfermedades infecciosas eran
causadas por entidades contagiosas que penetraban en el cuerpo humano.8 9
Estas ideas sobre el contagio como causa de algunas enfermedades se volvi
muy popular durante el Renacimiento, sobre todo a travs de los escritos de
Girolamo Fracastoro.10
Las primeras bacterias fueron observadas por Anton van Leeuwenhoek en 1683
usando un microscopio de lente simple diseado por l mismo.11 Inicialmente
las denomin animalculos y public sus observaciones en una serie de cartas
que envi a la Royal Society.12 13 14 El nombre de bacteria fue introducido
ms tarde, en 1828, por Ehrenberg. Deriva del griego -, bacterion
-a, que significa bastn pequeo. Louis Pasteur demostr en 1859 que los
procesos de fermentacin eran causados por el crecimiento de
microorganismos, y que dicho crecimiento no era debido a la generacin
espontnea, como se supona hasta entonces. (Ni las levaduras, ni los mohos,
ni los hongos, organismos normalmente asociados a estos procesos de
fermentacin, son bacterias). Pasteur, al igual que su contemporneo y colega
Robert Koch, fue uno de los primeros defensores de la teora germinal de las
enfermedades infecciosas.16 Robert Koch fue pionero en la microbiologa
mdica, trabajando con diferentes enfermedades infecciosas, como el clera, el
ntrax y la tuberculosis. Koch logr probar la teora germinal de las
enfermedades infecciosas tras sus investigaciones en tuberculosis, siendo por
ello galardonado con el premio Nobel en Medicina y Fisiologa, en el ao
1905.17 Estableci lo que se ha denominado desde entonces los postulados de
Koch, mediante los cuales se estandarizaban una serie de criterios
experimentales para demostrar si un organismo era o no el causante de una
determinada enfermedad. Estos postulados se siguen utilizando hoy en da.18
Aunque a finales del siglo XIX ya se saba que las bacterias eran causa de
multitud de enfermedades, no existan tratamientos antibacterianos para
combatirlas.19 Fue ya en 1910 cuando Paul Ehrlich desarroll el primer
antibitico, por medio de unos colorantes capaces de teir y matar
selectivamente a las espiroquetas de la especie Treponema pallidum, la
bacteria causante de la sfilis.
Un gran avance en el estudio de las bacterias fue el descubrimiento realizado
por Carl Woese en 1977, de que las arqueas presentan una lnea evolutiva
diferente a la de las bacterias.22 Esta nueva taxonoma filogentica se basaba
en la secuenciacin del ARN ribosmico 16S y divida a los procariotas en dos
grupos evolutivos diferentes, en un sistema de tres dominios: Arquea, Bacteria
y Eukarya. Se recomienda leer Cazadores de microbios para informacin ms
extensa.
Las bacterias son los organismos ms abundantes del planeta. Son ubicuas, se
encuentran en todos los hbitats terrestres y acuticos; crecen hasta en los
ms extremos como en los manantiales de aguas calientes y cidas, en
desechos radioactivos, en las profundidades tanto del mar como de la corteza
terrestre. Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las condiciones
extremas del espacio exterior. Se estima que se pueden encontrar en torno a
40 millones de clulas bacterianas en un gramo de tierra y un milln de clulas
bacterianas en un mililitro de agua dulce. En total, se calcula que hay
aproximadamente 51030 bacterias en el mundo.
En el cuerpo humano hay aproximadamente diez veces tantas clulas
bacterianas como clulas humanas, con una gran cantidad de bacterias en la
piel y en el tracto digestivo.
MEMBRANA CITOPLASMATICA
Esta formada por fosfolipidos y proteinas, y a
diferencia de las eucariotas, no contiene esteroles
(excepto el mycoplasma).
Cmo se reproducen?
En las bacterias, el aumento en el tamao de las clulas (crecimiento) y la
reproduccin por divisin celular estn ntimamente ligados, como en la mayor
parte de los organismos unicelulares. Las bacterias crecen hasta un tamao fijo
y despus se reproducen por fisin binaria, una forma de reproduccin
asexual.102 En condiciones apropiadas, una bacteria Gram-positiva puede
dividirse cada 2030 minutos y una Gram-negativa cada 1520 minutos, y en
alrededor de 16 horas su nmero puede ascender a unos 5.000 millones
(aproximadamente el nmero de personas que habitan la Tierra). Bajo
condiciones ptimas, algunas bacterias pueden crecer y dividirse muy rpido,
tanto como cada 9,8 minutos.103 En la divisin celular se producen dos clulas
hijas idnticas. Algunas bacterias, todava reproducindose asexualmente,
forman estructuras reproductivas ms complejas que facilitan la dispersin de
las clulas hijas recin formadas. Ejemplos incluyen la formacin de cuerpos
fructferos (esporangios) en las mixobacterias, la formacin de hifas en
Cmo es su crecimiento?
Las bacterias necesitan de un aporte energtico para desarollarse.
Se distinguen distintos tipos nutricionales segn la fuente de energa
utilizada: las bacterias que utilizan la luz son fottrofas y las que utilizan los
procesos de oxirreduccin son quimitrofas. Las bacterias pueden utilizar un
sustrato mineral (littrofas) u orgnico (organtrofas). Las bacterias patgenas
que viven a expensas de la materia orgnica son quimioorgantrofas.
La energa en un sustrato orgnico es liberada en la oxidacin del mismo
mediante sucesivas deshidrogenaciones. El aceptor final del hidrgeno puede
ser el oxgeno: se trata entonces de una respiracin. Cuando el aceptor de
hidrgeno es una sustancia orgnica (fermentacin) o una sustancia
inorgnica, estamos frente a una anaerobiosis.
Adems de los elementos indispensables para la sntesis de sus
constituyentes y de una fuente de energa, ciertas bacterias precisan de unas
sustancias especficas: los factores de crecimiento. Son stos unos elementos
indispensables para el crecimiento de un organismo incapaz de llevar a cabo su
sntesis. Las bacterias que precisan de factores de crecimiento se llaman
"auttrofas". Las que pueden sintetizar todos sus metabolitos se llaman
"prottrofas". Ciertos factores son especficos, tal como la nicotinamida
(vitamina B,) en Proteus. Existen unos niveles en la exigencia de las bacterias.
Segn Andr Lwoff, se pueden distinguir verdaderos factores de crecimiento,
absolutamente indispensables, factores de partida, necesarios al principio del
crecimiento y factores estimulantes. El crecimiento bacteriano es proporcional
a la concentracin de los factores de crecimiento. As, las vitaminas, que
constituyen factores de crecimiento para ciertas bacterias, pueden ser
dosificadas por mtodos microbiolgicos (B12 y Lactobacillus lactis Doraren).
Clasificacin e identificacin
La clasificacin taxonmica busca describir y diferenciar la amplia diversidad
de especies bacterianas poniendo nombres y agrupando organismos segn sus
similitudes. Las bacterias pueden clasificarse con base en diferentes criterios,
como estructura celular, metabolismo o con base en diferencias en
determinados componentes como ADN, cidos grasos, pigmentos, antgenos o
quinonas.
Un ejemplo de clasificacin:
La identificacin de las bacterias es tanto ms precisa cuanto mayor es el
nmero de criterios utilizados. Esta identificacin se realiza a base de modelos,
agrupados en familias y especies en la clasificacin bacteriolgica. Las
bacterias se renen en 11 rdenes:
- Las eubacteriales, esfricas o bacilares, que comprenden casi todas las
bacterias patgenas y las formas fottrofas.
- Las pseudomonadales, orden dividido en 10 familias entre las que cabe citar
las Pseudomonae y las Spirillacae.
- Las espiroquetales (treponemas, leptospiras).
- Las actinomicetales (micobacterias, actinomicetes).
- Las rickettsiales.
- Las micoplasmales.
- Las clamidobacteriales.
- Las hifomicrobiales.
- Las beggiatoales.
- Las cariofanales.
- Las mixobacteriales.
La tcnica de tincin de membranas de bacterias de Gram, desarrollada
por Hans Christian Gram en 1884,137 ha supuesto un antes y un despus en el
campo de la medicina, y consiste en teir con tintes especficos diversas
muestras de bacterias en un portaobjetos para saber si se han teido o no con
dicho tinte.
http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria#Historia_de_la_bacteriolog.C3.ADa
http://www.misrespuestas.com/que-son-las-bacterias.html
http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml
http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/estructura%20bacteriana.html
http://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080511104326AAxYZWr
Tema: LEVADURAS
Qu es una levadura?
Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos
microscpicos unicelulares que son importantes por su
capacidad para realizar la descomposicin mediante
fermentacin de diversos cuerpos orgnicos, principalmente
los azcares o hidratos de carbono, produciendo distintas
sustancias.
Aunque en algunos textos de botnica se considera que las
levaduras "verdaderas" pertenecen slo a la clase
Ascomycota, desde una perspectiva microbiolgica se ha
denominado levadura a todos los hongos con predominio de
una fase unicelular en su ciclo de vida, incluyendo a los
hongos basidiomicetes.
Las levaduras son organismos aerobios y aunque muchas
especies son fermentadoras, otras no lo son, como los
gneros
Cryptococcus y Rhodotorula. Las levaduras suelen fermentar
unos pocos glcidos, principalmente hexosas y disacridos
Tiempo de reproduccin
La levadura es la primera clula eucariota en la que se ha
intentado expresar protenas recombinantes debido a que es
de fcil uso industrial: es barata, cultivarla es sencillo y se
duplica cada 90 minutos en condiciones nutritivas favorables.
Adems, es un organismo fcil de modificar genticamente lo
que permite realizar experimentos en varios das o semanas.
Sin embargo, las levaduras poseen un mecanismo de
glicosilacin diferente al que se encuentra en clulas
humanas, por lo que los productos son inmunognicos.
CARACTERSTICAS MORFOLGICAS
Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan
mediante su observacin microscpica. Adems, los criterios
morfolgicos se basan en el modo de reproduccin vegetativa
de la morfologa celular, de la formacin de pseudomicelio y
de micelio. La forma de la levadura puede ser desde esfrica a
ovoide, en forma de limn, piriforme, cilndrica, triangular, e
incluso alargada formando un verdadero micelio o un falso
micelio. Tambin se diferencan en cuanto a su tamao, miden
de 1-10 um ancho por 2-3 um de longitud. Son partes
observables de su estructura, la pared celular, el citoplasma,
las vacuolas, los glbulos de grasa, y los grnulos, los cuales
pueden ser metacromticos, de albmina o de almidn. Para
poder observar el ncleo es preciso utilizar tinciones
especiales. La estructura celular es de tipo eucaritico, pero
sin sistema fotosinttico. La pared rgida, se caracteriza por la
presencia, en su composicin, de dos polisacridos: manano y
glucano. Algunas levaduras producen una cpsula constituida
por fosfomanos. El ncleo est rodeado de una membrana
que persiste durante la divisin celular. El nmero de
http://es.wikipedia.org/wiki/Levadura
http://www.unsa.edu.ar/biblio/repositorio/malim2007/4%20lev
aduras.pdf
http://alezamora.galeon.com/aficiones1893538.html
http://www.google.com.mx/imgres?
q=partes+de+una+levadura&num=10&hl=es419&tbo=d&biw=1024&bih=499&tbm=isch&tbnid=sIapPh9X
evR9GM:&imgrefurl=http://edgardopedullarodriguez.wordpres
s.com/2012/07/03/industria-alimentaria-laslevaduras/&docid=dp12XqF8GSJ0M&imgurl=http://edgardopedullarodriguez.files.
wordpress.com/2012/07/levaduras8.gif&w=500&h=362&ei=sv8UIq1G_Gk2gXGn4Bg&zoom=1&iact=hc&vpx=4&vpy=126&d
ur=3004&hovh=191&hovw=264&tx=130&ty=112&sig=1171
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0&ndsp=15&ved=1t:429,r:0,s:0,i:81
Tema: HONGOS
Qu es un hongo?
En biologa, el trmino Fungi (latn, literalmente "hongos")
designa a un grupo de organismos eucariotas entre los que se
encuentran los mohos, las levaduras y las setas. Se clasifican
en un reino distinto al de las plantas, animales y bacterias.
Esta diferenciacin se debe, entre otras cosas, a que poseen
paredes celulares compuestas por quitina, a diferencia de las
plantas, que contienen celulosa y debido a que algunos
crecen y/o actan como parsitos de otras especies.
Actualmente se consideran como un grupo heterogneo,
Cmo se reproducen?
Esporotrix
Histoplasma
Blastomyces
Paracoccidiodes
Cryptococcus
Ejemplo 1
Ejemplo 2
Ejemplo 3
http://claudiazambrano.wordpress.com/2010/08/26/diferencias-entre-hongos-ybacterias/
Parcial 2
Tema: MICROSCOPA
Qu es microscopa?
Microscopa (o tambin sin tilde microscopia)1 es el
conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango
de resolucin del ojo normal.
Si bien el microscopio es el elemento central de la
microscopa, el uso del mismo se requiere para producir las
imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y
tcnicas afines pero extrnsecas al aparato. Algunas de ellas
son, tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de
estudio, tcnicas de salida, procesamiento, interpretacin y
registro de imgenes, etc.
Exceptuando tcnicas especiales como las utilizadas en
microscopio de fuerza atmica, microscopio de iones en
campo y microscopio de efecto tnel, la microscopa
generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de
algn tipo de radiacin incidente en el sujeto de estudio.
Indol
La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el
triptfano con produccin de Indol y metabolitos indlicos.
Rojo de Metilo
Estudia la fermentacin cido mixta con produccin de cidos
estables en el tiempo.
Voges Proskauer
Estudia la fermentacin butanodilica con formacin de un
metabolito intermediario neutro.
Tcnica: Sembrar el medio e incubar de 24 a 48h a 37 C.
Segn el volumen del medio aadir volumen de los reactivos,
agitar para exponer el medio al O2. VP POSITIVO: Color rojorojizo en menos de 1h. VP NEGATIVO: Amarillo en superficie.
Citrato
Estudia la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente
de carbono.
Enzimaticas
Oxidasa
La oxidasa estudia la presencia del enzima citocromo c
oxidasa que acta en la cadena respiratoria del organismo.
Catalasa
Estudia si el microorganismo posee el enzima catalasa que
acta descomponiendo el perxido de hidrgeno.
Coagulasa
Cogulos formados por la reaccin de la coagulasa en un tubo
de ensayo.
Estudia la produccin del enzima coagulasa, capaz de
coagular el plasma. Diferencia Staphylococcus aureus de otras
especies.
Ureasa
Azul Nilo
El Nile blue (o Nile blue A), es decir azul Nilo, tie a los ncleos de color
azul. Tambin puede ser utilizado para teir clulas vivas.
Bismarck brown
Bismarck brown, Marrn Bismarck, (tambin conocido como Bismarck
brown Y o Manchester brown) le imparte un color amarillo a las mucinas
cidas. Se puede utilizar con clulas vivas.
Bromuro de etidio
El bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo
naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teir clulas vivas
ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para
identificar clulas que se encuentran en las etapas finales de la
apoptosis, ya que tales clulas poseen unas membranas mucho ms
permeables. Por el mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como
un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar las
bandas de ADN en una corrida en electroforesis en gel. Este colorante
puede ser utilizado en combinacin con naranja de acridina (NA) en el
conteo de clulas viables. Esta tincin combinada BE/NA le otorga a las
clulas vivas un color verde fluorescente mientras que las clulas
apoptticas aparecen con la distintiva fluorescencia rojo-naranja.
Carmn
El carmn es un colorante de un intenso color rojo que puede ser
utilizado como sal de litio para teir glicgeno, mientras que las sales de
alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al ncleo. Las tinciones
con carmn requieren del uso de un mordiente, que usualmente es
aluminio o alumbre.
Cristal violeta
El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tie las
paredes celulares de color prpura. El cristal violeta es un componente
importante en la coloracin de Gram.
DAPI
El DAPI es un colorante nuclear (tie el ncleo) fluorescente, se excita
con luz ultravioleta para producir una fuerte fluorescencia azul cuando
se encuentra unido al ADN. El DAPI se une a las regiones de alta
repeticin A=T en los cromosomas. Adems no es visible cuando se
utiliza con un microscopio de transmisin corriente. Puede ser utilizado
en clulas vivas o fijadas. La tcnica de tincin con DAPI es
especialmente adecuada para el recuento celular.6
Eosina
La eosina se utiliza ms frecuentemente como contracoloracin de la
hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material
Tincin de
Gram
Tincin de
ZiehlNeelsen
Tincin de
SchaefferFulton
Tie endosporas
de verde y
bacterias en rojo
Tincin de
Conklin
Tie endosporas
de verde, similar a
Schaeffer-Fulton
Tincin de
Grocott
Deteccin de
microorganismos, en especial
fngicos.
Tincin de
Dieterle
Bsqueda de
microorganismos,
ej., Treponema pallidum
Tincin
negativa
Es muy utilizada en
Tie el exterior,
microscopa electrnica. En
pero no el interior
microscopa ptica para
de clulas y
identificar microorganismos
estructuras
encapsulados.
Tincin con
mucicarmin
a
Tincin de Gram
Qu es la tincin de gram?
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin
diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de
bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al
bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica
en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa
celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose
Fijar un frotis
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y
esperar que enfre un poco.
Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un
poco de muestra.
Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el
asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina
portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra
contenida en el asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina
portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra
en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar
vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al
terminar la extensin, tengamos como producto una espiral
en la parte media de la lmina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un
mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor
no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el
calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las
bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el
portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser
colocado sobre el dorso de la mano.
Tincin
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en
todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de
dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla
por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta
tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una
temperatura ambiente de 25 C.
Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina
conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el
lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO
debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer
sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra.
El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de
medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se
debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin
inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se
recomienda sea al 1% .
Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente
yodo o lugol durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier
sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y
determina su fijacin en las bacterias..
Decoloracin (paso critico)
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se
decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o
Recoger muestras.
Disoluciones
3.4.1.1 Fundamento
En general los recuentos bacterianos bajos estn asociados
con alimentos seguros. La mayora de los alimentos
industrializados (excepto, por ejemplo, los productos
fermentados) deben ser considerados como inadecuados para
el consumo cuando contienen un gran nmero de
microorganismos aun cuando estos microorganismos no sean
3.4.1.2 Material
El necesario para hacer disoluciones de la muestra (ver
protocolo de disoluciones).
Placas de Petri y pipetas de 10 mL y 1 mL, estriles.
Agar triptosa-glucosa-extracto de levadura (Plate count agar)
fundido, en el bao termosttico a 45C, estril.
Glosario
Metablosimo
El metabolismo es el conjunto de reacciones bioqumicas y procesos fsicoqumicos que ocurren en una clula y en el organismo.1 Estos complejos
procesos interrelacionados son la base de la vida a escala molecular, y
permiten las diversas actividades de las clulas: crecer, reproducirse, mantener
sus estructuras, responder a estmulos, etc
Glucosa
La glucosa es un monosacrido con frmula molecular C6H12O6. Es una
hexosa, es decir, que contiene 6 tomos de carbono, y es una aldosa, esto es,
el grupo carbonilo est en el extremo de la molcula. Es una forma de azcar
que se encuentra libre en las frutas y en la miel. Su rendimiento energtico es
de 3,75 kilocaloras por cada gramo en condiciones estndar. Es un ismero
que la fructosa, con diferente posicin relativa de los grupos -OH y =O
Ciclo de krebs
El ciclo de Krebs (tambin llamado ciclo del cido ctrico o ciclo de los cidos
tricarboxlicos) es una ruta metablica, es decir, una sucesin de reacciones
qumicas, que forma parte de la respiracin celular en todas las clulas
aerbicas. En clulas eucariotas se realiza en la mitocondria. En las procariotas,
el ciclo de Krebs se realiza en el citoplasma, especficamente en el citosol.
Enizmas
Las enzimas1 son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones
qumicas, siempre que sean termodinmicamente posibles: una enzima hace
que una reaccin qumica que es energticamente posible (ver Energa libre de
Gibbs), pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente
favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la
enzima.2 3 En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas
denominadas sustratos, las cuales se convierten en molculas diferentes
http://www.a14.san.gva.es/laboratorio/Web/gram.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_bioqu%C3%ADmica
http://www.monografias.com/trabajos911/pruebas-bioquimicas/pruebasbioquimicas.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n#Tinci.C3.B3n_directa
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci
%C3%B3n_de_Gram#T.C3.A9cnica_de_la_coloraci.C3.B3n_gram