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EJERCICIOS SOBRE ACTIVIDAD, CINTICA ENZIMTICA E INHIBICIN

1. -galactosidasa cataliza la hidrlisis de lactosa en Glc y Gal y es ampliamente usada en la industria lechera. Una preparacin
comercial lquida de -galactosidasa de Kluyveromyces marxianus var lactis est siendo usada en la produccin de leche baja en
lactosa. Se conoce que se requiere 500 IU de -galactosidasa por litro de leche para reducir el contenido de lactosa en 80%
durante el almacenamiento (considerado satisfactorio). Ud debe calcular la dosis de enzima requerida (mL de la preparacin
enzimtica a ser aadida por litro de leche). Se determin la actividad de la enzima mediante un ensayo basado en cuantificar Glc
por HPLC con un detector de ndice de refraccin. El procedimiento analtico consisti en aadir 0.3 mL de la preparacin
enzimtica, diluida 3 veces a 1.2 mL de solucin de lactosa de 150 g L -1 e incubar la mezcla a 35 C y pH 6.4. Se tomaron
muestras a diferentes tiempos de reaccin y se inactiv la enzima con ebullicin previa la filtracin y el anlisis por HPLC. Se
obtuvieron de esta manera los siguientes resultados:

Donde t es el tiempo de reaccin y g la concentracin de glucosa.

2. La actividad de una esterasa recombinante de Pseudomonas fluorescens (etil acetato + H2O cido actico + etanol) se
determina midiendo etanol usando cromatografa de gases. Una muestra de 1 L de la esterasa purificada se incubada con
10 mL de solucin saturante de acetato de etilo (500 mM) a pH 7.5 y 25 C y se midi la liberacin de etanol en funcin del
tiempo. La muestra de enzima purificada se diluy 1:4 y 1:8 previo el ensayo y se obtuvieron los siguientes resultados:

Calcule la actividad volumtrica de la enzima purificada, su mxima velocidad de reaccin y su constante de Michaelis para el
acetato de etilo. Explique las simplificaciones asumidas.
3. Dibuje el perfil de la concentracin de sacarosa en funcin del tiempo cuando se aade la -fructofuranosidasa (Ec 3.2.1.26) a un
nivel de 1 g/L a una solucin 50 mM de sacarosa. Los parmetros cinticos de la enzima bajo las condiciones de reaccin son:
KM = 10 mM y Vmx = 1000 moles min-1g-1. Justifique las simplicaciones realizadas.
4. La -L-fucosidasa cataliza la hidrlisis de -L-fucsidos en L-fucosa y alcohol. La actividad de la enzima se determin midiendo
las velocidades iniciales de hidrlisis del sustrato sinttico p-nifenil -1-fucopiransido. Se obtuvieron los siguientes resultados
con una preparacin purificada de -L-fucosidasa del molusco marino Pecten maximus a pH 4.5 y 50 C.

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A. Determinar los parmetros cinticos de la enzima usando los mtodos de linealizacin de Lineweaver-Burk, Eaddie-Hofstee y
Hanes-Wolf y la regresin no lineal de Michaelis-Menten.
B. Qu tipo de enzima es sta y cul la clasificacin que le corresponde segn la Comisin de Enzimas?.
C. Presentar la estructura qumica de la D y L-fucosa.
5. Una cierta arilesterasa (EC 3.1.1.29) cataliza la hidrlisis de acetato de fenilo (S) en fenol (O) y cido actico (A). El fenol es un
inhibidor competitivo total pero tambin ejerce inhibicin incompetitiva total. Se han obtenido los siguientes resultados con una
preparacin de arilesterasa, donde v es la velocidad inicial de hidrlisis del fenil acetato:

Determine la expresin cintica para la velocidad inicial de hidrlisis del fenil acetato, calcule los parmetros cinticos
correspondientes y discuta la exactitud de los resultados obtenidos (si cumplen con las reglas definidas para el clculo de estos
parmetros).
6. La hidrlisis de maltosa puede ser catalizada bien sea por cidos minerales o enzimticamente con glucoamilasa. La hidrlisis
cida puede describirse mediante una cintica de segundo orden con respecto a la concentracin de maltosa [M], y la hidrlisis
enzimtica mediante una cintica de primer orden con respecto a dicho sustrato. Se obtuvieron los siguientes resultados en el
curso de los dos procesos:

Los sufijos C y E se refieren a las reacciones qumica (Chemical) y enzimtica, respectivamente. Determine:
a. Las constantes cinticas de la reaccin hidrlisis qumica y enzimtica.
b. A que tiempo es la concentracin residual de maltosa la misma en los dos procesos?.
7. Los siguientes resultados se obtuvieron en la reaccin de hidrlisis de rafinosa (30 mM) con 100 mg L-1 de -galactosidasa,
EC 3, a partir de Gibberella fujikuroi a 55 C y pH 5,8:

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A partir de estos datos, determinar los parmetros cinticos de la enzima KM (mM) y Vmx (mol min-1 genzima-1). Especifique la
informacin usada y discuta la validez de los resultados obtenidos. Complete el nmero de clasificacin que le corresponde a esta
enzima.
8. Las lipasas se usan para permitir la separacin de mezclas racmicas mediante hidrlisis selectiva de uno de los steres del
sustrato racmico. Una lipasa de Candida cylindracea se us para la hidrlisis del ster racmico R-S ibuprofeno trifluoroetlico
(TFEE). La enzima acta selectivamente sobre el enantimero S de modo que se produce S-ibuprofeno con trifluoro etanol (TFE)
como producto de la hidrlisis. Los siguientes datos de velocidad inicial de reaccin se obtuvieron con tal enzima:

a. Identifique el mecanismo de inhibicin ejercido por el TFE sobre la lipasa de Candida cylindracea,
b. calcule los parmetros cinticos correspondientes y
c. determine la ecuacin de velocidad.
NOTA:

Discuta la exactitud de los parmetros cinticos determinados.

9. La enzima naringinasa (una -L-ramnosidasa, Ec 3..) es inhibida mediante la 5-epi-desoxiramnojirimicina (LRJ). Se

obtuvieron los siguientes resultados con una preparacin de naringinasa de Penicillium decumbens usando p-nitrofenil--Lramnopiransido (pNR) como sustrato artificial:

Determine:
a. El tipo de inhibicin (competitiva, no competitiva o mezclada; total o parcial) de LRJ sobre la naringinasa
b. Evale los parmetros cinticos.
c. Complete los cuatro dgitos que identifican a esta enzima.