PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y MTODOS DE SIEMBRA

(INFORME)

2004

INTRODUCCIN

Se entiende por medios de cultivos a los alimentos o nutrientes en el que crecen

los microorganismos, en este caso bacterias. Para conseguir un medio de cultivo
ptimo es necesario tener condiciones adecuadas de temperatura, grados de
humedad, presin de oxigeno, grados de acidez o alcalinidad. Debe tener como
mnimo carbono, hidrgeno, oxigeno y sales inorgnicas.
Los medios de cultivos se pueden clasificar de acuerdo a su consistencia en
lquidos, slidos y semislidos, y segn su composicin
nutricional en
enriquecidos, de enriquecimiento, sintticos, generales, entre otros. Los medios de
cultivos, adems deben de tener ciertos requisitos o condiciones para poder
permitirle a los microorganismos su desarrollo, de ah que la constitucin de estos
deben tener los suficientes nutrientes y sustratos que le brinden condiciones para
realizar sus funciones metablicas
Las tcnicas de cultivos bacterianos, nos permiten aislar un tipo de bacteria
especfico de una fuente natural, incrementar su numero de poblaciones o
mantener en condiciones estables el cultivo, as como cuantificar el numero de
bacterias que se encuentran en el material de estudio.

OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL

Preparar medios de cultivo mediante diferentes mtodos de siembra.

OBJETIVOS ESPECFICOS
Preparar los diferentes medios de cultivos indicados.
Realizar siembras aplicando las diferentes tcnicas de cultivo microbianos.
Analizar el desarrollo y crecimiento microbiano en cada una de las siembras
realizadas.

1. TEORA RELACIONADA
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: consistencia adecuada del medio, luz
ambiental, esterilidad del medio, temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La clasificacin de los medios es:
a. Segn su consistencia:
Slidos: que llevan una sustancia que se llama agar, que es un polisacrido
acdico producido por ciertas algas rojas que gelifica por debajo de 45 C. Se usa
a una concentracin del 1,5%, da consistencia slida y va a ser el soporte de los
compuestos necesarios en la nutricin de las bacterias.
Semislidos: tienen menos agar, una proporcin de 0.1% a 0.5%.
Lquidos: se llaman caldos.
b. Segn su composicin:
Medios sintticos o qumicamente definidos: que son medios de cultivo de
composicin conocida o definida, llevan fuente de carbono, fuente de nitrgeno,
sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus), se utilizan muy poco
y suelen hacerse para cultivar una especie de bacterias determinada.
Medios generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de
organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales
como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios
para el crecimiento de las bacterias, tienen una composicin en la que crecen la
mayor parte de los microorganismos. (Agar Sangre, Schaeadler, PCA, APHA, etc)
Medios enriquecidos: son medios generales a los que se les aade sustancias que
aumentan su poder nutritivo, adems enlentecen/suprimen el crecimiento de la
flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito,
medio con Vitamina K).

 Medios selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se le adicionan

al agar nutritivo, sustancias que inhiben el crecimiento de un grupo de
microorganismos, sin aceptar el desarrollo de otras. Es de gran utilidad para el
aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta.
Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac
Conkey, Kanamicina-Vancomicina)
Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que
el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas.
Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos,
acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios
de mantenimiento
Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan ingredientes
como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc.
que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la
composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.
Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos
adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente hetertrofos exigentes). Ejemplo: adiccin de sangre, suero o
extractos de tejidos de animales y plantas.
c. Medios para identificacin:
Medios diferenciales: Formulaciones especiales en las que se estudian las
peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las
bacterias. Seleccionando los medios adecuados y por medio de los reactivos que
llevan nos permiten diferenciar entre todos las bacterias crecidas unas de otras.
(Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia
lactosa + de lactosa -)
Medios de caracterizacin: se utilizan para identificar bacterias, dan lugar a una
respuesta concreta al metabolismo bacteriano.
Medios aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que
satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su
identificacin (Lowenstein).
La composicin de los medios y caldos:
Todos los medios llevan agua, peptonas (que son compuestos intermedios de hidrlisis de
las protenas), extracto de carne (se prepara a partir de carne de vaca troceada y
macerada, suministra componentes nitrogenados, tambin no nitrogenados y alguna
vitamina), extracto de levadura (se somete la levadura a una extraccin con agua y se
evapora, luego a sequedad y tiene la misma funcin que el extracto de carne pero es
mucho ms barata), gelatina (agente solidificante, se prepara hidrolizando colgeno en
agua hirviendo, se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su
licuacin), agar (componente para dar consistencia a los medios, se extrae de esta alga,
la Gelidium corneum. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l), cloruro sdico (para
mantener la presin osmtica), sustancias inorgnicas (Na, K, Ca, etc.). En los diferentes
medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos

de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por
dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero
y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes, productos fermentables (monosacridos, disacridos y tienen dos
funciones: producir energa y para la identificacin y clasificacin de los
microorganismos). Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para
detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico
y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el
crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).
Inoculacin de los medios de cultivo
En microbiologa se entiende por "siembra" la operacin que consiste en depositar un
germen aspticamente en un medio de cultivo.
Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales:
1 . Practicarla en medios de cultivo favorables y previamente esterilizados.
2. Emplear instrumentos aspticos.
3. No contaminar ni destruir el inculo,
4. Depositarla aspticamente en los medios elegidos.
5. Esterilizar los instrumentos empleados antes y despus de cada operacin.
Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser slidos, semislidos o lquidos, y
estar contenidos en tubos, placas o frascos.
La tcnica general de las siembras variar segn el estado fsico del material a sembrar y
del medio de cultivo.
Mtodos de cultivo de uso rutinario

Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.), o,
en el ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente
de aire que va por la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras
partculas con el aire hacia arriba, o hacia afuera; impidiendo la contaminacin del medio
de cultivo.
El asa o pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el
inculo, o el medio de cultivo.
1. Siembra en placas
2. Siembra en tubos de agar tendido
3. Siembra por picadura
4. Siembra en superficie y picadura
5. Siembra en profundidad

6. INCUBACION: Los medios de cultivo pueden ser: inoculados en estufa a 35C en

aerobiosis, anaerobiosis o en atmsfera de C02.
Para aerobiosis se incuban las placas y tubos en estufa de cultivo a 35C.
Para anaerobiosis se colocan las placas y tubos dentro de una jarra Anaerobia y luego
sta se coloca en estufa de cultivo a 35C. con un sobre productor de atmsfera
anaerobia. Para incubar en atmsfera de C02 se colocan las placas y tubos dentro de la
Jarra de C02 y sta se coloca en la estufa de cultivo a 35C con un sobre productor de
atmsfera microaerfila.

2. FLUJOGRAM AS
Preparacin de medios de cultivo
Medios de cultivo slidos

1. verificar materiales
2. leer etiqueta
3. pesar la cantidad
4. medir agua
5. adicionar la mitad
6. agitar
7. adicionar la otra mitad
8. terminar la disolucin
9. homogenizar a calor
10. agitar
esterilizar
enfriar
verter en cajas de petri

Hasta disolver

solidificar
prueba de esterilidad
refrigerar
Medios de cultivo lquidos

seguir los pasos del 1-8 del 2.1.1

servir en tubos
esterilizar
enfriar
refrigerar
Medios de cultivo semislido
seguir los pasos del 1-8 del 2.1.1
verter en tubos
esterilizar
enfriar
solidificar
refrigerar

3 ml de caldo

Mtodos de siembra de microorganismos

Inoculacin de un caldo a otro

1. rotular los tubos

2. encender el mechero
3. flamear asa
4. tomar un inoculo de cepa
5. introducirla en el caldo
6. flamear la boca del tubo
7. flamear el asa
8. incubar
Siembra de medio slido a lquido, semislido e inclinado

rotular los tubos

encender el mechero
flamear asa
enfriar
tomar una colonia
introducirla en el tubo

girar 180
en caso de

Semislido

Inclinados

realizar picadura

realizar por mtodo de estras.

Seguir con pasos 6-8 del 2.2.1

Siembra de medio lquido a slido
1. Siembra masiva o mtodo clsico

1. rotular los tubos

2. encender el mechero
3. flamear asa
4. extraer un inoculo
5. colocarlo en extremos de la caja
6. extender la muestra
7. flamear el asa
8. incubar

En zigzag

2. Siembra por agotamiento o mtodo francs

seguir los pasos del 1-5 del 2.2.3.1

extender la muestra
flamear el asa y enfriarlo
hacer 4 o 5 estras
incubar

3. CLCULOS
Para la preparacin del SIM el frasco pone una concentracin 30g/1000ml, como
nos pidieron preparar 50ml, entonces:
30g
x

1000ml
50ml
x = 1.5g de SIM que se utiliz para preparar el medio.

Para la preparacin del LIA el frasco pone una concentracin 32g/1000ml, como
nos pidieron preparar 40ml, entonces:
32g
x

1000ml
40ml
x = 1.28g de LIA que se utiliz para preparar el medio.

Para la preparacin del ASM el frasco pone una concentracin 111g/1000ml, como
nos pidieron preparar 100ml, entonces:
111g
x

1000ml
100ml
x = 11.1g de ASM que se utiliz para preparar el medio.

Para la preparacin del caldo nutritivo el frasco pone una concentracin

8g/1000ml, como nos pidieron preparar 30ml, entonces:
8g
x

1000ml
30ml
x = 0.24g de ASM que se utiliz para preparar el medio.

4. RESULTADOS
4.1 Preparacin de medios de cultivo

Se observ la perfecta gelificacin de las placas y tubos sin la formacin de grumos,

burbujas o fisuras en el gel.
4.2 Mtodos de siembra de microorganismos
4.2.1 Desarrollo de un medio de cultivo lquido

Utilizando el medio de cultivo SIM y por medio de la siembra del Bacillus subtillis, despus
de las 24h presentaron las siguientes caractersticas:
Para los tubo 1y 2. se vi una coloracin amarillo claro con un precipitado de color blanco
en el fondo, adems se not un poco espeso.
Con la misma siembra y con la bacteria Proteus sp, despus de las 24h las caractersticas
vistas fueron:
Para los tubos 3 y 4. Present turbidez, con una coloracin amarilla y un precipitado en el
fondo de color blanco.
Despus de las 48h todas las muestras presentaron un precipitado en la parte inferior del
tubo.(ver anexo 1)
4.2.2

Desarrollo de un medio de cultivo semislido

Utilizando el medio de cultivo SIM y por medio de la siembra del S. faecium las
caractersticas que presentaron a las 24h son:
Para el tubo 1. coloracin amarillo claro, con turbidez y con una capa superficial blanca.
Para el tubo 2 y 3. coloracin amarillo claro, formacin de un pequeo precipitado blanco
en la parte inferior y de una capa superficial blanca, y presencia de unas gotas
gelatinosas adheridas en las paredes del tubo.

Para el tubo 4. coloracin amarillo claro, presencia de una capa superficial de color
blanco, un anillo por debajo de la mitad, de un color amarillo opaco, con una mayor
turbidez en esta parte.
Despus de las 48h, los cambios que presentaron algunos tubos son:
Para el tubo 1. hubo cambio de color de amarillo a verde con negro, en la parte superior
se vi una capa superficial, hubo formacin de precipitado.
Para el tubo 4. la parte inferior se encontr ms blanca, en esta hay una pequea nata.
Despus de 5 das, los cambios que se vieron son:
Para el tubo 3. color amarillo, formacin de anillo en la parte inferior, con precipitado
blanco.(ver anexo2)
4.2.3

Desarrollo de un medio de cultivo inclinado

Utilizando el medio de cultivo LIA y por medio de la siembra del S. faecium las
caractersticas que presentaron a las 24h son:
Para los tubos 1 y 2. Presencia de dos fases: en la parte inferior present un color
amarillo transparente, mientras que en la superior un morado transparente. En la parte
superior presenta una capa superficial, en las paredes del tubo hay como especie de
humedad.
Para los tubos 3 y 4. tiene una coloracin miel, formacin de capa superficial y presencia
de humedad. Para el 4 tenia un color ms fuerte y menos humedad.
Despus de las 48h presentaron los siguientes cambios:
Para los tubos 3 y 4. hubo cambio de color, se vieron de color naranja fuerte, hay un
precipitado donde empieza la inclinacin, los otros tubos no presentaron cambio.
Despus de 5 das se observaron otros cambios:
Para los tubos 1 y 2 color prpura totalmente.
Para los tubos 3 y 4 color naranja totalmente. (ver anexo 3)
4.2.4

Desarrollo de un medio de cultivo slido

Utilizando el medio de cultivo EMB y ASM, y por medio de la siembra del Bacillus subtillis
las caractersticas que presentaron a las 24h son:
Para la caja 1. con EMB, Bacillus subtillis y el mtodo de estras, algunas colonias estn
de color morado y rosado.

Para la caja 2. con ASM, Bacillus subtillis y mtodo francs, no hubo ningn cambio.
Para la caja 3. con EMB, Bacillus subtillis y mtodo de estras las colonias tornaron de
color rosado.
Para la caja 4. con ASM, Proteus sp y mtodo francs las colonias se vieron amarillas.
Para la caja 5. con EMB, Proteus sp y mtodo de estras las colonias se vieron rosadas.
Para la caja 6. con EMB y Bacillus subtillis y mtodo francs color rosado.
Para la caja 7 y 8 . con ASM, Bacillus subtillis no hubo cambio alguno.
Despus de 5 das los cambios dados fueron los siguientes:
Para la caja 1 y 3. colonia morada-azul.
Para la caja 2 colonias blancas-amarillas.
Para la caja 4: colonias blancas-amarillas.
Para la caja 5: colonias morada-rosada-azul.
Para la caja 6: colonia azul-moradas-rosadas.
Para la caja 7 y 8: colonia blancas amarillas.(ver anexo 4)

ANLISIS DE RESULTADOS

5.1 Preparacin de medios de cultivo

Se realiz el procedimiento de acuerdo como lo indic la gua de laboratorio, lo cual arroj

resultados positivos ya que no se present el crecimiento de ningn tipo de
microorganismos, lo cual nos di a entender que los medios estaban completamente
estriles.
5.2 Mtodos de siembra de microorganismos
5.2.1

Desarrollo de un medio de cultivo lquido

Para este tipo de siembra los resultados fueron satisfactorios ya que se observ un
crecimiento con base a la cantidad de desarrollo moderado; se di la formacin de
turbidez, de pelculas membranosas y formacin de floculos, anillos y sedimentos.
5.2.2

Desarrollo de un medio de cultivo semislido

Hubo movilidad a lo largo de la lnea de inoculacin, lo cual nos indica que hubo
crecimiento bacteriano.
5.2.3

Desarrollo de un medio de cultivo inclinado

Se da un crecimiento bacteriano lo cual se puedo percibir a travs del cambio de color del
medio. El desarrollo del medio de cultivo se di en forma de rizoide.
5.2.4

Desarrollo de un medio de cultivo slido

Hubo formacin de spreaders, es decir colonias esparcidas incontables las cuales se

debieron a la mucha presencia de humedad o, a demasiada cepa bacteriana.
El desarrollo de las colonias en las cajas petri se di de forma puntiforme, segn la
elevacin eran convexas.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

6.1 Fundamento de las cepas de microorganismos sembradas y de los medios de

cultivo preparados
El Proteus
Son bacilos Gram negativos, mviles, aerobios, anaerobios facultativos, con catalasa
positiva, fermentadores positivos, producen gases, hidrlisis de la urea en ocasiones, son
oxidasas negativos y ureasas positivos, licuan la gelatina, son sulfhdricos positivos
excepto el morgagnii.
Bacillus subtilis
El Bacillus subtilis , una bacteria inofensiva gram-positiva, que es capaz de producir los
endosporas resistentes a las condiciones ambientales adversas tales como calor y
desecacin, y se utiliza extensamente para la produccin de enzimas y de productos
qumicos de la especialidad.
Medio de cultivo SIM
Medio de cultivo de ensayo, para comprobar la formacin del sulfuro, la produccin de
indol y la motilidad en el marco del diagnostico del Enterobacteriaseas.
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor
del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido
exclusivamente a lo largo de dicho canal. La produccin de H2S se reconoce por el
ennegrecimiento de la zona de crecimiento.
Agar Lisina Hierro
Agar de ensayo para la demostracin simultanea de lisina-descarbioxilasa(L-D) y de la
produccin de cido sulfhdrico(H2S) para la identificacin de Enterobacteriaseas, sobre
todo de salmonella y arizona.
Los microorganismos L-D negativos, pero fermentadores de la glucosa producen un viraje
amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar
una alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y, en consecuencia se
produce un viraje al violeta.
La produccin de H2S da coloracin negra debida al sulfuro de hierro que se forma.

La cepa del grupo Proteus providencia, con excepcin de algunas cepas de Proteus
morganii, desaniman a la lisina a cido alfa cetocarbonico. Este ltimo, con la sal de hierro
y con la influencia del oxgeno forma combinaciones pardo rojizas en la regin superficial
del medio de cultivo.
CALDO NUTRITIVO
Se basa en contar el nmero de colonias desarrolladas en una placa de medio de cultivo
slido, donde se ha sembrado un volumen conocido de agua, transcurrido un tiempo y a
una temperatura de incubacin determinados.
Transcurridas las 72 h ( 3 h) o las 48 h, segn proceda en cada caso, contar todas las
colonias desarrolladas en cada placa. Si se ha sembrado ms de una dilucin se
seleccionar la que contenga entre 30 y 300 colonias, descartando las dems. El
recuento no se efectuar en placas que contengan menos de 30 colonias, excepto en
aquellas sembradas con agua sin diluir. El resultado se expresa como nmero de
bacterias aerobias totales en 1ml en 72 h a 22C o en 48 h a 37C
AGAR SALADO DE MANITOL
Es un medio selectivo y diferencial. AMS es selectivo porque contiene 7.5% de sal. Una
alta concentracin de sal promueve el crecimiento de algunos organismos mientras inhibe
el crecimiento de otros. AMS es un medio diferencial porque contiene el azcar manitol y
el indicador de pH rojo de fenol. Los organismos que pueden fermentar el manitol liberan
subproductos cidos, que causan un cambio de color. El rojo de fenol presenta un color
rojo cereza por arriba de pH 8.5, un color amarillo rojizo desde un pH 6.9 a 8.5, y un
amarillo brillante por debajo de un pH de 6.9. Aunque tanto el Staphylococcus epidermidis
y Staphylococcus aureus puede tolerar el alto contenido de sal en el AMS, solamente S.
aureus puede fermentar el manitol, causando que el rojo de fenol vire al amarillo.

6.2 Cul de los mtodos de siembra en caja de petri, considera el mejor y porque?
Se considera como el mejor de los mtodos al mtodo francs o siembra por agotamiento,
ya que esto nos permite observar el crecimiento de los microorganismos en colonia y
tambin de forma aislada debido a la distribucin que se hace de los mismos al momento
de realizar la siembra en el medio slido.

CONCLUSIN
A partir del anterior laboratorio y a travs de la bibliografa citada podemos concluir los
siguientes puntos:
La utilizacin de medios de cultivos es de gran importancia en la industria de
alimentos, nos permite conocer las condiciones en las cuales se desarrolla los
microorganismos tales como bacterias, hongos, algas, levaduras, etc.
La esterilidad es uno de los requisitos necesarios que deben cumplir los medios de
cultivos para que se de el crecimiento adecuado de las bacterias.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin
de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa
se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos
resistentes.

BIBLIOGRAFA
http://html.rincondelvago.com/microbiologia_15.html
http://www.geocities.com/lorigardeweg/page14.html
http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html
http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema06.html
Manual De Microbiologia. Ed Merck