ICIDCA.

Sobre los Derivados de la Caa de

Azcar
ISSN: 0138-6204
revista@icidca.edu.cu
Instituto Cubano de Investigaciones de los
Derivados de la Caa de Azcar
Cuba
Castillo-Portela, Grolamys; Villar-Delgado, Jos; Montano-Martnez, Ramn; Martnez, Cristina; PrezAlfocea, Francisco; Albacete, Alfonso; Snchez-Bravo, Jos; Acosta-Echeverra, Manuel
Cuantificacin por HPLC del contenido de aminocidos presentes en el FITOMAS-E
ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, vol. 45, nm. 1, enero-abril, 2011, pp. 64-67
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar
Ciudad de La Habana, Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223122251008

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Red de Revistas Cientficas de Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal
Proyecto acadmico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto

Grolamys Castillo-Portela1, Jos Villar-Delgado1, Ramn Montano-Martnez1,

Cristina Martnez2, Francisco Prez-Alfocea2, Alfonso Albacete2,
Jos Snchez-Bravo3, Manuel Acosta-Echeverra3
1. Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA)
Va Blanca No. 804 y Carretera Central. San Miguel del Padrn. La Habana. Cuba.
grolamys.castillo@icidca.edu.cu
2. Centro de Edafologa y Biologa Aplicada del Segura (CEBAS), Murcia, Espaa.
3. Universidad de Murcia. Facultad de Biologa, Espaa.

RESUMEN
Se muestra el estudio realizado para identificar y cuantificar los aminocidos presentes
en el hidrolizado de la fuente proteica empleada para la produccin de un bionutriente
natural de aplicacin foliar (FitoMas-E), estimulador del crecimiento, el cual incrementa la capacidad de autodefensa, los rendimientos y la calidad de las cosechas de los cultivos tratados, mediante la tcnica cromatogrfica de HPLC y la derivatizacin precolumna con o-ftalaldehdo (OPA) con una modificacin. Se utiliz una columna
Lichrospher 100 RP-18 (5 m) y Deteccin por UV a 338 nm a una temperatura entre 30
y 35 C. En la composicin de aminocidos encontrada en el producto, se destacaron
como mayoritarios los aminocidos: alanina, glutamina, fenilalanina, triptfano, valina,
leucina y lisina. Se puede concluir que la tcnica empleada result adecuada por la rapidez y sensibilidad para la determinacin del perfil aminoacdico en el hidrolizado estudiado.
Palabras clave: aminocidos, FitoMas-E, HPLC, derivatizacin, o-ftalaldehdo.
ABSTRACT
Present paper shows a study to identify and quantify the amino acids in a protein
hydrolyzate obtained in the production of Fitomas-E, a natural foliar bionutrient, growth
promoter, which increases the capacity of self-defense, yields and crop quality of treated
cultures, using the HPLC chromatographic technique and pre-column derivatization with
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o-phthalaldehyde (OPA) with one modification. The column was a Lichrospher 100 RP-18
(5 m) and UV detection at 338 nm at a temperature between 30 and 35 C. In the amino
acid composition found in the product, were highlighted as major amino acids: alanine,
glutamine, phenylalanine, tryptophan, valine, leucine and lysine. It can be concluded
that this technique was appropriate to accelerate and improve sensitivity for the determination of amino acids profile in the studied hydrolyzate.
Keywords: amino acids, Fitomas E, HPLC, derivatization, o-phthalaldehyde.

INTRODUCCIN
El FitoMas-E, producto registrado por el
ICIDCA, es un bionutriente natural de aplicacin foliar, que est compuesto por un
hidrolizado de sustancias biolgicas de alta
energa, comunes al metabolismo de los
vegetales y de sales minerales portadoras de
nitrgeno, fsforo y potasio. Sus principales
ventajas son estimular el crecimiento de las
plantas y equilibrar el metabolismo de las
mismas, sometidas a cualquier tipo de
estrs. Su utilizacin reporta el incremento
de la capacidad de autodefensa, la mejora
en la interrelacin con el suelo, el aumento
de los rendimientos y la calidad de las cosechas de los cultivos tratados (1).
En la composicin del producto que es
de inters caracterizar, se encuentran los
aminocidos. Estas sustancias son componentes esenciales de un sinnmero de preparados con fines industriales, farmacuticos y agrcolas. Entre los diversos mtodos
analticos utilizados para este tipo de compuestos, la determinacin por HPLC se
encuentra como uno de los ms empleados.
Esta determinacin puede requerir derivatizacin o no, en dependencia del tipo de
aminocido a analizar.
El HPLC se ha convertido en un procedimiento estndar para la separacin de aminocidos, aunque la mayora de ellos no se
detectan fcilmente sin utilizar alguna
modificacin qumica. En la mayora de las
primeras separaciones de aminocidos por
cromatografa de intercambio inico, se
empleaba una reaccin post-columna con
ninhidrina. Actualmente, se han desarrollado sistemas en los cuales los aminocidos se
derivatizan antes de separarse en una
columna de fase reversa, con la ventaja de
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que la derivatizacin pre-columna permite

un anlisis ms rpido y con ms alta sensibilidad (2).
La determinacin de aminocidos utilizada estar en dependencia del tipo a analizar. Los aminocidos alifticos requieren
una derivatizacin pre-columna o postcolumna que permita la deteccin por UV o
por fluorescencia de los mismos. Los aminocidos aromticos como la histidina, triptfano y tirosina, pueden determinarse por
UV sin derivatizacin a una baja longitud
de onda (3).
Las ventajas relativas de la derivatizacin
antes o despus del HPLC, estn determinadas por los requerimientos de la aplicacin
especfica. Factores como la sensibilidad
requerida en la deteccin, cantidad de muestra disponible, tipo de muestra y procedencia
de la misma, velocidad de anlisis y reproducibilidad, e incluso consideraciones econmicas influirn en la eleccin entre la derivatizacin pre- o post-columna en la cuantificacin analtica de aminocidos.
De los cuatro procedimientos principales de derivatizacin pre-columna conocidos, que utilizan el isotiocianato de fenilo
(PITC) (4), el cloruro de 4-(4-dimetilaminoazofenil) sulfonilbenceno (cloruro de
Dabsilo) (5), el o-ftalaldehdo (OPA) (6-10) y
el cloruro de 9-fluoroenilmetil cloroformato
(FMOC-CI) (11), ninguno ofrece la solucin
ideal.
El objetivo de este trabajo es cuantificar
el contenido de aminocidos y determinar
el perfil aminoacdico presente en el hidrolizado FitoMas-E, mediante un procedimiento cromatogrfico con columna reversa
y que utiliza la derivatizacin pre-columna
con OPA utilizando el cido mercaptopropinico.
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MATERIALES Y MTODOS

concentracin de 0,25 mol/mL en 0,1 N

de HCl.

Muestra: FitoMas-E producido en la planta

industrial del ICIDCA como una suspenRESULTADOS Y DISCUSIN
sin acuosa. Se analiz la fase lquida del
producto, donde se encuentran los amiSe desarroll un procedimiento rpido y
nocidos.
sensible por HPLC utilizando la derivatizaPatrones: Se utiliz un kit de L-aminocidos
cin con OPA para la determinacin del perde la firma SIGMA Chemicals Corp.
fil aminoacdico del FitoMAs-E. En el mto(Saint Louis, Missouri, USA).
do utilizado, la combinacin del OPA con el
Solucin de o-ftalaldehdo (OPA): Se prepacido mercaptopropinico produce un derir mezclando 50 mg de OPA, 4 mL de
vado isoindlico fluorescente que absorbe a
metanol, 500 L de tampn borato y 50
338 nm. Esta modificacin permite la eluL de cido mercaptopropinico.
cin de los isoindoles en el intervalo de 14,5
Mtodo de derivatizacin de la muestra: Se
min, antes que los derivados del FMOC-CI,
utiliz la derivatizacin con OPA para los
otro de los productos para derivatizacin
aminocidos primarios, con una modificomnmente empleado para los aminocicacin al reemplazar el mercaptoetanol
dos secundarios.
por el cido-3-mercaptopropinico sobre
Este mtodo permite su completa autola base del procedimiento reportado por
matizacin, al utilizar un autoinyector en
Godel (2). Se realiz una mezcla automlnea, y obtener una excelente reproducibitica en el inyector durante 3 min de 30
lidad, en comparacin con los procedimienL de muestra con 180 L de tampn
tos manuales o mecnicos que no estn en
borato a pH 10,4 y 30 L de OPA.
lnea con el equipamiento.
Condiciones cromatogrficas: Se utiliz un
Cuando se inyect el sobrenadante de la
equipo de HPLC Shimadzu con bombas
muestra de FitoMas-E y se analiz, se obtuLC-10 AD VP117 y autoinyector SIL-10
vo el contenido en mol/mL de 15 aminoAD VP con un sistema controlador SCLcidos. La tabla 1 resume los resultados obte10 AD VP y un detector UV SPD-10A. Se
nidos.
utiliz una columna: Lichrospher 100 RPComo puede apreciarse en la composi18, 5 m (Merck) con deteccin por UV a
cin de aminocidos, se destacan como
338 nm a temperatura entre 30 y 35 C a
mayoritarios los aminocidos: alanina, gluun flujo de 1,2 mL/min, con un volumen
tamina, fenilalanina, triptfano, valina, leude inyeccin de 10 L, utilizando un procina y lisina. La cuantificacin result pregrama de gradiente binario. La fase mvil
cisa al obtenerse CV menores que 0,5% para
consisti en un gradiente en el tiempo de
todos los aminocidos.
los solventes A (20 mM de buffer acetato
La figura 1 muestra la composicin de
sdico con 0,018% (v/v) de trietilamina y
aminocidos encontrada.
0,03% de tetrahidrofurano) y B (20% de
100 mM de buffer acetato sdico, 40% de acetonitrilo y 40% de
metanol).
Calibracin externa: Para la cuantificacin se realiz una calibracin externa con mezcla de Laminocidos: cido asprtico
(Asp) , cido glutmico (Glu),
asparagina (Asn), serina (Ser),
glutamina (Gln), histidina (His),
glicina (Gly), threonina (Thr),
alanina (Ala), arginina (Arg),
tirosina (Tyr), valina (Val),
metionina (Met), triptfano
(Tryp), fenilalanina (Phe), leuciFigura 1. Perfil aminoacdico obtenido por HPLC de
na (Leu) y lisina (Lys), a una
fase reversa del FITOMAS-E.
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with
UV
detection.
J.Liq.Chromatogr. 14 (7):p.
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4.
Imakyure, O.; Kai, M.;
Mitsui, T.; Nohta, H.;
CV, %
Ohkura, Y. Fluorogenic rea0,08
gents for aminoacids in
0,10
high-performance
liquid
0,04
chromatography, phenanth0,14
ra-oxazolylphenylisothioc0,45
yanates. Anal. Sci. 9 (5):p.
0,05
647-652, 1993.
0,07
5.
Yang, S.S.; Smetena I.
0,36
Determination
of
free
0,04
amino-acids in tobacco by
0,15
HPLC with fluorescence
0,22
detection and pre-column
0,02
d e r i v a t i z a t i o n .
0,22
Chromatographia 37 (110,11
12):p. 593-598, 1993.
0,06
6.
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Tabla 1. Contenido en mol/mL de aminocidos del

FITOMAS-E, cuantificado por HPLC con columna C18 y
derivatizacin con OPA.
Aminocido

M/ml

Asp
Glu
Asn
Ser
Gln
Gly
Thr
Ala
Arg
Tyr
Val
Trp
Phe
Leu
Lys

1,40
0,37
0,16
1,43
5,99
0,98
1,10
11,65
0,94
1,54
4,29
4,99
5,87
3,60
3,57

Desviacin
estndar
0,14
0,18
0,07
0,24
0,78
0,08
0,12
0,62
0,07
0,26
0,37
0,04
0,38
0,18
0,11

CONCLUSIONES
1. Se desarroll un procedimiento rpido y
sensible por HPLC, utilizando la derivatizacin con OPA y el cido-3-mercaptopropinico, para la determinacin del
contenido de aminocidos presente en el
FitoMas- E.
2. En la composicin de aminocidos
encontrada en el FitoMas-E, se destacan
como mayoritarios los aminocidos: alanina, glutamina, fenilalanina, triptfano,
valina, leucina y lisina.
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