Protenas Recombinantes I

BIOTECNOLOGIA

MAFIA TRANSCRIPTORA BQ
Profesor: Daniela Seelenfreund
Autor: Fabin Pinto

DIAZ LAS HERAS PINTO REYES RIVERA RIVERA ROMERO

TRANSCRIPCIONES DE CTEDRAS
SEMESTRE PRIMAVERA 2012

Protenas Recombinantes I
BIOTECNOLOGIA
Las protenas recombinantes son
aquellas que podemos obtener a partir de
una especie o lnea celular distinta de la
original. Su produccin en la actualidad es
pan de cada dia ya que sus aplicaciones
ya se han instaurado en el mercado y estn
teniendo un gran impacto en la sociedad.
Es as como diversas protenas de
caractersticas relevantes y que no pueden
producirse masivamente en su organismo
nativo,
pueden
ser
instauradas
estratgicamente en otros organismos con
el fin de promover su superproduccin. Evidentemente esto tiene una gran serie de implicancias,
limitantes y demases, todo lo cual ser explicado ms adelante.
Dentro de las protenas que podramos describir como de carcter relevante encontramos al
Fibrinogeno, la cual se produce en cantidades superiores a 500 kilos al ao, lo cual es equivalente a
una enorme cantidad de donante, con fines teraputicos. Asimismo hay una ingente cantidad de
dinero asociada a la produccin de esta proteina, lo cual revela el impacto que esta misma ha tenido
(50 1000 dolares por mg!)

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Las proteinas recombinantes pueden ser expresadas en una gran gamma de hospederos, sin
embargo hay que tener en cuenta las caractersticas de cada uno de ellos para poder maximizar la
produccin de sta y su eficacia. Muchas de ellas son de carcter complejo y precisan de
interacciones Disulfuros, glicosilaciones, fosforilaciones y otras modificaciones postraduccionales, las
cuales no podrn ser llevadas a cabo en una bacteria por ejemplo, dado que carecen de Aparato de
Golgi.

La forma de producir una proteina recombinante no ser purificndola de su medio natural

sino mas bien aislando el gen de la especie nativa que lo porta e introducirlo en un vector plasmidial
de expresin, no de clonamiento solamente porque deseamos que ste posea las seales
moleculares que permita no solo el clonamiento del gen sino su transcripcin. Este vector debe
introducirse en alguna celula hospedera para poder expresarse, y posteriormente permitir la
purificacin de la proteina, para luego generar alguna metodologa de administracin en el paciente.
En la imagen inferior podemos ver todos los tipos de sistemas a utilizar como mtodo de
produccin: bacterias, levaduras, hongos filamentosos, plantas transgnicas, animales transgnicas,
lneas celulares de mamferos, sistemas de insectos y microalgas

Sin embargo, como sabemos el Sistema de E. Coli tiene sus pros y contras bien marcados:

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Cul ocuparemos? NO EXISTE un sistema ideal para todos, por lo cual tenemos que barajar
los pro y los contra de cada uno. La ingeniera gentica comenz utilizando E Coli como sistema de
produccin de proteinas recombinantes. Hay trabajos pioneros del ao 1977 donde se reporta la
utilizacin de E Coli para la produccin de proteinas eucariontes como la Insulina. Otros trabajos de
la poca sintetizaron un gen para la hormona humana Somatostatina, la cual tambien fue clonada en
E. Coli.

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En relacin a lo anterior, es importante destacar que E. Coli es un Pirogeno, o sea es un

agente productor de fiebre, lo cual ejecuta mediante polisacridos como el LPS, irrumpiendo en el
sistema inmune del hospedero. Es importante que tambien posee una preferencia codogenica
distinta, lo cual se manifiesta en que la eficiencia del sistema baja. Por otro lado, tambien se pueden
formar agregados proteicos insolubles que podran ser un problema si la proteina tiene
caractersticas importantes. En este caso puede evitarse la formacin de stos fomentando un buen
plegamiento de dichas proteinas, para lo cual seria preciso la co-expresin de Chaperonas junto con
el clonamiento del gen en cuestin. Se logra asi mejorar la solubilidad, disponibilidad de la proteina,
etc. El problema con este sistema es que no
promueve una mejora universal ya que no
para todas las proteinas no resulta, de hecho
para otras puede ser perjudicial.

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Por lo tanto podramos cambiarnos

de sistema heterologo, ya que adems E. Coli
no es una buena bacteria secretora. Si
quisisemos expresar una proteina que se
exporte, no nos seria ptimo. Para esto
podra utilizarse otro sistema procariotico
como Bacillus Subtillis

El hecho de que este considerado como organismo GRAS le da mucha relevancia al momento
de ser aplicada la proteina en aspectos teraputicos. Dentro de las desventajas es que secreta
proteasas, lo cual obviamente va en desmedro de la produccin de la protena de inters.

Hay distintas EPO humanas. Tienen distintas modificaciones en general. En el recuadro de

arriba se ven algunos ejemplos. Una causa importante de estas modificaciones es que algunas de
ellas promueven un aumento de la vida media de estas proteinas, lo cual es sumamente importante
si las estamos considerando como un frmaco estable que debe pasar por todo el proceso de
generacin farmacutica hasta que llegue al paciente.
El primer sistema eucarionte que se utilizo fue Levaduras. La ingeniera gentica en estos
organismos comenz en el ao 1981. Ya se haba visto que este sistema s era capaz de procesar
intrones, aunque uno podra pensar No es posible poner el cDNA y ahorrarse el problema de los
intrones? Ocurre que el rendimiento en la expresin es mucho ms eficiente si se retiene al menos
el primer intrn, por lo tanto la protena ser ms optima de si yo pusiese solo el cDNA. Por otro
lado, tambien las levaduras pueden llevar a cabo un monton de modificaciones postraduccionales.
Muchos de los vectores que se utilizan son aquellos que se pueden usar tanto en procariontes como
eucariontes porque es mas fcil realizar algunas primeras etapas de la clonacin, en procariontes, y

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Si ningn sistema de estos nos satisface, nos cambiamos a otro: Sistemas Eucariontes. Estos
son muy importantes para las protenas esencialmente de carcter teraputico, ya que es importante
mantener las condiciones tanto bioqumicas como funcionales, idnticas con respecto a la nativa.
Esto se asocia con el concepto de Autenticidad, que es sencillamente poder probar cuan idntica
puede ser dicha protena con la de su sistema original. Esto no es nada de fcil. Por ejemplo, EGF
(facto de crecimiento epidermal) se ha producido de forma recombinante y se usa para tratar
cicatrices, quemaduras, etc. Se produce de forma natural en el calostro, el cual contiene muchas
isoformas distintas de la protena, por lo cual no es trivial elegir cual es la forma nativa de la proteina.
Otro ejemplo es Eritropoyetina, la cual se utiliza bastante hoy en dia para el tratamiento de los
dializados, ya que la EPO se produce en el rion, por lo cual debe administrrsele. Si bien se
encuentra en la orina, nadie va a extraer eritropoyetina del pichi asi que hay que buscar otra manera.
La forma recombinante no es igual a la nativa y recibe el nombre de Epoetina, agente promotor de la
hematopoiesis

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luego tranfectar el plasmido a una celula eucarionte. Es asi como se utiliza ampliamente los vectores
Shuttle o lanzadera, ya que tienen adems elementos propios de E. Coli como marcadores de
seleccin y un Ori de replicacin.

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En la imagen lateral se puede

apreciar un vector prototipo pro-euca.
Posee dos orgenes de replicacin, uno
para cada gnero. Posee marcadores de
seleccin tanto para bacterias (Ampr)
como para eucariontes, que en este
caso es algn marcador auxotrfico y
que esta delimitado por un promotor y
un terminador.

La gran mayora de los vectores que se utilizan en levaduras provienen del plasmidio 2um el
cual no se sabe muy bien la funcin que tiene en levaduras.

Esto se hace acoplando a la via de la glicosilacion de levadura varias enzimas de la via de

glicosilacion de mamferos. Asi se logra controlar de forma precisa dicha modificacin.

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Si bien pueden las levaduras ejecutar

muchas modificaciones post-traduccionales existe
un problema. El tema radica en que las levaduras
hiperglicosilan, ya que agregan manosas en
excesos, a diferencia de las glicosilaciones
caractersticas de mamferos que son en menor
grado y mas variadas, ya que poseen acido sialico,
pocas manosas y varios otros azucares. Qu se
puede hacer al respecto? Se podra humanizar la
glicosilacion de la levadura, de forma de modificar la levadura con el objetivo de que las
glicosilaciones que introduzca sean como las de mamferos.

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Todos los vectores de expresin de levaduras deben cumplir con las siguientes
caractersticas:

Recordemos que la seal de terminacin ser la poliadenilacion. Hay distintas formas para poder
transformar levaduras. Existen diferentes tipos:

El mtodo del acetato de litio tiene el mismo fundamento que el CaCl2. El procedimiento de
remocin de la pared celular es bastante mas engorroso y no se utiliza mucho.

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Al dia de hoy se han producido muchsimas

protenas utilizando el sistema de Levadura. Algunos
ejemplos estn listados en la imagen del costado.
Tambien la primera vacuna recombinante fue producida
en levaduras.

Que promotores deberamos usar para

levadura? Se usan generalmente aquellos de la via
glicolitica dado que esta via es super eficiente en
levadura. Actualmente se utilizan los promotores que
estn listados en la imagen inferior, donde por lo general
se activan constitutivamente, pero otras veces se utilizan promotores inducibles. Esto se decide
segn el tipo de protenas que quisisemos expresar, por ejemplo en el caso de expresar una
proteasa, lgicamente tendr que estar bajo el control de un promotor inducible ya que de lo
contrario se expresara constitutivamente (peor si el organismo est en su fase de crecimiento) y
dejara la cag en la pobre levadura . Para evitar esto, se cultiva la celula del hospedero hasta que
alcance el total de la biomasa y de ah inducir la produccin de la protena recombinante bajo el
promotor inducible, ya que da lo mismo que no pueda seguir creciendo.

En relacin a los vectores utilizable en levadura, hay de distintos tipos, segn hemos visto en
otros cursos.
Vectores Episomales (YEP)

Lo malo es que el plasmidio es inestable, por lo que en el tiempo se ira perdiendo, por lo que
no tendr niveles de protena adecuados. Pero es posible estabilizarlo agregando secuencias de
centromero de cromosomas de levadura y se ha visto que esto lo hace bastante independiente y
estable.
El vector pAUR123 es un tipo de YEP. Observa que realmente posee los elementos
mencionados.

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Son unos de los mas utilizados y

corresponde al mismo plasmido 2um que
se encuentra naturalmente dentro de la
levadura. A este se le han agregado
elementos como secuencias de origen de
E.Coli, marcadores de seleccin a
antibioticos, promotores de alta expresin en levaduras como el de Gliceraldehido fosfato
deshidrogenasa, un promotor y un terminador, aparte de un marcador de seleccin eucarionte, que
como ya fue mencionado, son marcadores de seleccin auxotrofica. Ademas, el origen eucariotico es
el propio origen de replicacin del plasmidio 2um nativo y aveces este lo remplazan por las
secuencias ARS que son aquellas que permiten replicacin autnoma en levaduras.

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Vectores YIP
Se denominan Yeast Integrating Plasmid. Son plasmidios muy estables y, si bien se insertan
en el cromosoma, solo lo hacen poquisimas copias (incluso puede ser una), por lo que el nivel de
expresin proteica es muy bajo. Si se integran varias copias de genes, aumenta su expresin, pero
tambin su inestabilidad. Es decir, uno debe elegir si desea alto numero de copias por corto tiempo,
o un bajo numero de copias por largo tiempo. Se integran mediante recombinacin homologa
mediante secuencias llamadas HIS4 que se repiten en el cromosoma de levadura.

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No solo se recombinan mediante

secuencias HIS4 sino tambin
mediante una Recombinacin doble
entre el YIP y el DNA genmico entre
las secuencias AOX.

Vectores CEN
Son bsicamente plasmidios formados por secuencias centromericas de levadura .

(Recordar que todos estos vectores caen dentro de la clasificacin de Shuttle vectors)

Son vectores diseados para clonar grandes fragmentos de DNA de un tamao aproximado
mayor de 1500 kb. No son vectores de expresin por lo que no producirn la protena. Son
cromosomas artificiales de levadura lineales y contienen todos los elementos propios de un
cromosoma, por ejemplo telomeros y centromeros.
Por mas grande sean las secuencias que estn entre
los centromeros y los telomeros, mas estable ser
el cromosoma artificial. Por esto sirven para hacer
genotecas grandes usando trozos de cromosomas
de otros organismos, por lo que es mas fcil que
estar clonando por ejemplo en fago Lambda que
tiene como tope 40kb, ya que aca se pueden meter
hasta megabases y por mas que meta, mas estable
ser el YAC. Por lo tanto se puede subclonar un
genoma de otro organismo en estos YAC y es
mucho mas manejable.

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Vectores YAC

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