Instituto de Biotecnologa

Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Curso:
Mtodos Fisco-Qumicos en Biotecnologa

Plataformas de Protemica

Presentan:
Ing. Daniela Morales Snchez.
Ing. Lil Esmeralda Gallo Ramrez.

30 de Mayo 2006, Cuernavaca Morelos.

NDICE
1. Introduccin
1.1 Tecnologa de la protemica
1.1.1 Separacin de protenas
1.1.2 Identificacin y caracterizacin de protenas
2. Fundamentos de la electrofresis
3. Tipos de electrofresis
3.1 Electrofresis libre
3.2 Electrofresis zonal
3.2.1 Equipamiento de la electrofresis
3.3 Tipos de soporte
3.3.1 Soportes no restrictivos tipo I
3.3.2 Soportes restrictivos tipo II
3.4 Factores que afectan la electroforesis
3.4.1 Campo elctrico
3.4.2 Muestra
3.4.3 Tampn
3.4.4 Soporte
3.5 Tipos de electroforesis
3.5.1 Inmunoelectroforesis
3.5.2 Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
3.5.2.1 Formacin del gel de poliacrilamida
3.5.2.2 Tipos de monmeros
3.5.2.3 Catalizadores empleados en la formacin del gel de
poliacrilamida
3.5.2.4 Sistemas de tampones que se emplean en la electroforesis en
geles de poliacrilamida
3.5.2.5 Formatos de la PAGE
3.5.2.6 PAGE en condiciones no desnaturalizantes
3.5.2.7 PAGE en condiciones desnaturalizantes
3.5.2.8 PAGE-SDS
3.5.3 Electroforesis en geles de gradientes
3.5.4 Electroforesis en geles de azarosa
3.5.5 Electroforesis capilar
3.5.6 Enfoque isoelctrico
3.5.7 Electroforesis bidimensional
4. Informacin sobre la estructura de las protenas
4.1 Fragmentacin de protenas
4.1.1 Protelisis
4.1.1.1 Digestin en solucin
4.1.1.2 Digestin en gel
4.1.2 Rompimiento qumico
4.2 Anlisis de secuencia amino y carboxilo terminal
4.2.1 Secuenciacin del extremo amino terminal
4.2.1.1 Protenas con modificaciones en el amino terminal
4.2.2 Secuenciacin del extremo carboxilo terminal
5. Espectrometra de masas
5.1 Preparacin de la muestra
5.2 Ionizacin de la muestra
5.2.1 MALDI (Matrix Assisted Lasser Desorption Ionization)

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5.2.2 ESI (ElectroSpray Ionization)

5.3 Anlisis de masa
5.3.1 Analizador de cuadrupolo
5.3.2 Analizalizador de tiempo de vuelo (Time of Flight, ToF)
5.3.3 Analizador de trampa de iones
5.3.4 Analizadores hbridos.
5.3.5 Analizadores ToF/ToF
5.3.6 FT-ICR (Fourier transform-ion cyclotron resonance)
5.3.7 Fragmentacin de iones
6. Identificacin de protenas utilizando bases de datos.
6.1 Huella de masa del pptido (peptide mass fingerprint, PMF)
6.2 Secuenciacin utilizando datos generados con la tcnica product
ion scan MS/MS
6.3 Secuenciacin de novo
7. Identificacin de modificaciones post-traduccionales
7.1 Identificacin de sitios de fosforilacin
7.1.1 Enriquecimiento de fosfoprotenas
7.1.2 Determinacin de sitios de fosforilacin mediante degradacin
de Edman
7.1.3 Determinacin de sitios de fosforilacin mediante
espectrometra de masas
8. Bibliografa

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1. INTRODUCCIN
Los rpidos avances conseguidos en la tecnologa del DNA estn permitiendo
la secuenciacin sistemtica de los genomas de diversos organismos.
Los proyectos de secuenciacin a gran escala estn proporcionando una ingente
cantidad de secuencias de DNA. Sin embargo, an se desconoce la funcin biolgica de
la mayora de las protenas codificadas por los genes detectados. As pues, el siguiente
paso en la era post-genmica debe ser el estudio funcional de todos estos genes.
Se puede decir que hubo tres factores decisivos para el desarrollo de la
protemica:

La secuenciacin de genomas a gran escala y el desarrollo de bases de datos de

protenas.
El desarrollo de tcnicas de espectrometra de masas para analizar protenas y
pptidos.
Los avances realizados en la separacin de protenas mediante 2D-PAGE con
la introduccin de los gradientes de pH inmovilizados (IPGs).

La protemica es uno de los campos que puede ayudar a establecer una conexin
entre las secuencias genmicas y su comportamiento biolgico, constituyendo una
herramienta importante en el anlisis funcional de genes de funcin desconocida.
El trmino Proteoma fue usado por vez primera en 1995 para describir el
conjunto de PROTEnas de un genOMA, en una clula o un tejido. De forma
imperceptible, la palabra proteoma dio lugar a una nueva disciplina, la Protemica.
Pero, qu es la protemica? Esencialmente la protemica es el estudio a gran escala de
los productos gnicos de un genoma mediante mtodos bioqumicos, con el fin de
obtener una visin global integrada de los procesos celulares. El trmino protemica se
ha asociado tradicionalmente con la separacin de un gran nmero de protenas de una
clula u organismo mediante 2D-PAGE. Segn esto, la protemica comienzo en los
aos setenta cuando se empezaron a construir bases de datos de protenas utilizando la
electroforesis bidimensional. Sin embargo, la identificacin de las protenas era difcil
debido a la falta de mtodos analticos rpidos y sensibles para la caracterizacin de las
protenas. En los aos noventa la espectrometra de masas surge como un mtodo
analtico muy poderoso, ya que limita la mayora de las limitaciones del anlisis de
protenas. Este desarrollo, junto con la disponibilidad de los genomas secuenciados
marca el comienzo de una nueva era. Actualmente muchas reas de estudio han sido
agrupadas dentro de la protemica. Se pueden incluir, entre otros, los estudios de
interacciones de protenas, de modificaciones pos-traduccionales, el anlisis funcional
de las protenas y estudios de localizacin.
Se puede hablar de dos tipos de protemica: protemica de expresin y
protemica del mapa celular.
La protemica de expresin es el estudio cuantitativo de la expresin de protenas
entre muestras que difieren en alguna variable. En esta estrategia se compara la
expresin del proteoma total o de subprotemas entre diferentes muestras. La
informacin obtenida puede permitir la identificacin de nuevas protenas implicadas

en transduccin de seales, la identificacin de protenas especficas de una

enfermedad y protenas de inters en microbiologa mdica.
La protemica del mapa celular o estructural es el estudio de la localizacin
subcelular de las protenas y de las interacciones protena-protena, mediante la
purificacin de orgnulos o complejos y la posterior identificacin de sus componentes
mediante espectrometra de masas.
Tambin se utiliza el trmino de protemica funcional para referirse a diversas
aproximaciones protemicas que permiten el estudio y caracterizacin de un grupo de
protenas determinado proporcionando informacin importante sobre sealizacin,
mecanismos de la enfermedad o interacciones protena-frmaco.

Identificacin

Caracterizacin

Reduccin y
Alquilacin

Anlisis de
secuencias Amino y
Carboxilo terminal

Tcnicas
Electroforticas:
E-2D, E-1D, FFE,
CZE

Aproximaciones de afinidad
Inmunoblot
Captura por afinidad (E-1D
y E-2D)

Protemica Estructural

Mapeo de
Pptidos

Cromatografa:
RP-HPLC,
afinidad, IEX,
SEC, HIC

Fragmentacin de Protenas: en gel vs. en solucin

Enzimtica: tripsina, V8, quimiotripsina, pepsina, etc.
Qumica: CNBr, hidrlisis cida, etc.

Mapeo
de pptidos

Modificaciones
posttraduccionales:
fosforilacin, glicosilacin,
metilacin, acetilacin

Modificaciones
covalentes
Uniones por enlaces
disulfuro

Presencia de ligandos

Localizacin celular
in vivo,
inmunolocalizacin
por FRET

Espectrometra de masas
Peptide mass
fingerprinting
MS/MS
Protelisis

Protemica Funcional

Separacin
de Protenas

Conformacin de
protenas

Variantes de
empalme
alternativo

Fig. 1. Estrategias utilizadas en protemica para la identificacin y el anlisis de protenas. Siglas: (SEC)
Size-exclusion chromatography; (IEX) ion-exchange chromatography; (HIC) hidrophobic interaction
chromatography; (FFE) free flow electrophoresis; (CZE) capillary zone electrophoresis; (FRET)
flourescence resonance energy transfer.

Para poder desarrollar los ambiciosos objetivos de la protemica se requiere la

implicacin de diversas disciplinas como biologa molecular, bioqumica,
microbiologa y bioinformtica. Siendo esta ultima de enorme importancia, ya que ser
necesario desarrollar ordenadores con una gran capacidad para organizar la gran
cantidad de informacin que se generara en estas investigaciones.
Para caracterizar un proteoma de una clula es importante tener en cuenta que el
proteoma es dinmico y que es reflejo del medio ambiente en el que es estudiado.

Como respuesta a estmulos externos e internos, las protenas pueden ser modificadas
post-traduccionalmente, translocadas, sintetizadas o degradadas (Fig. 2).

Fig. 2 Mecanismos por los que un gen puede dar lugar a mltiples productos gnicos.

1.1 Tecnologa de la protemica

El desarrollo de la protemica se debe en parte a los avances importantes
realizados en la tecnologa de protenas. Sin embargo, la metodologa disponible tiene
sus limitaciones y actualmente todava no es posible realizar muchos tipos de
protemica. Es necesario mejorar algunas de estas limitaciones y desarrollar nuevas
tecnologas para conseguir el mximo partido. Las cuatro plataformas de la tecnologa
protemica son:

Preparacin y manejo de la muestra

Determinacin de la informacin de la secuencia parcial de aminocidos

Identificacin y cuantificacin de protenas

Mapeo celular

1.1.1 Separacin de protenas

La tecnologa mas usada para la separacin de protenas es la electroforesis en
geles de poliacrilamida. Esta tcnica es la ms eficaz para resolver mezclas complejas
de protenas.
Para muchas aplicaciones protemicas, la electroforesis en una dimensin es el
mtodo de eleccin. Las protenas se separan de acuerdo a su masa y como las
protenas son solubilizadas en dodecil sulfato sdico (SDS), no suele haber problemas
de solubilizacin. Es una tcnica sencilla, reproducible y permite la separacin de
protenas de 10-300 KDa. Una de las aplicaciones mas comunes de la 1-DE es la
caracterizacin de protenas despus de realizar algn tipo de purificacin previa.
La electroforesis bidimensional 2D-PAGE permite separar hasta miles de
protenas en un solo experimento, y constituye actualmente el mtodo ms eficiente
para la separacin de mezclas muy complejas de protenas. Esta basada en una
separacin de protenas en funcin de la carga, seguida de una separacin de las
protenas en funcin de su masa molecular. La separacin de la primera dimensin se

realiza mediante isoelectroenfoque, durante el cual las protenas son separadas en un

gradiente de pH hasta alcanzar una posicin en la que su carga neta es cero, es decir,
su punto isoelctrico. En una segunda dimensin, las protenas son separadas
mediante electroforesis en presencia de SDS. La alta resolucin de la tcnica se basa en
que las dos separaciones se basan en parmetros independientes. La innovacin clave
para la 2D-PAGE fue el desarrollo de geles con un gradiente de pH inmovilizado (IPG).
El gradiente de pH inmovilizado elimina los problemas de inestabilidad del gradiente
y baja capacidad de carga que iban asociados a los gradientes de pH preparados con
anfolitos acarreadores. En los geles IPG, el gradiente es generado por las llamadas
inmobilinas y est copolimerizado con la matriz de acrilamida del gel. Este sistema
ha permitido mejorar la resolucin y reproducibilidad de los geles as como aumentar
la cantidad de protena que puede ser cargada. La reproducibilidad conseguida con los
IPGs ha hecho posible la comparacin de mapas entre distintos laboratorios,
facilitando as el intercambio de informacin.
En cuanto a la deteccin de protenas, tradicionalmente se ha venido
empleando el marcaje radioactivo o la tincin con azul de de Coomassie, o con plata,
para conseguir mayor sensibilidad. Tambin se ha desarrollado un mtodo de tincin
de plata superficial compatible con la digestin proteica y la espectrometra de masas,
aunque el umbral de deteccin no es tan sensible como el seguido con los protocolos de
tincin de plata mas utilizados. As mismo, se han comenzado a utilizar tinciones y
marcajes fluorescentes (Sypro-Ruby, Cy3, Cy5) que presentan un sensibilidad
comparable a la plata y tambin permiten el anlisis posterior de las protenas
mediante espectrometra de masas. Tambin se han desarrollado programas para
comparar las imgenes de 2D-PAGE y facilitar la identificacin y cuantificacin de
manchas de protenas entre diferentes muestras.
La aplicacin principal de la 2D-PAGE es la protemica de expresin. En esta
aproximacin, la expresin de protenas de dos muestras se puede comparar de forma
cuantitativa. La aparicin o desaparicin de manchas proporciona informacin sobre la
expresin diferenciadle protenas y la intensidad de las manchas permite conocer los
niveles de expresin. Para realizar estos estudios se pueden utilizar organismos
completos, lneas celulares o fluidos biolgicos. Se pueden comprar tejidos normales
con tejidos enfermos, o clulas tratadas con drogas o diferentes estmulos.
Otra aplicacin importante de la protemica del mapa celular, donde la 2DPAGE se utiliza para hacer mapas de protenas de microorganismos, orgnulos
celulares y complejos de protenas. Tambin se puede utilizar para caracterizar
protenas en subproteomas que se han obtenido mediante alguna forma de purificacin
del proteoma.
La 2D-PAGE tambin presenta muchas limitaciones. Es una tcnica muy
laboriosa que requiere bastante tiempo, y difcil de automatizar. La 2D-PAGE esta
limitada por el nmero y el tipo de protenas a resolver. Las protenas muy grandes o
hidrofbicas no entran en el gel durante la primera dimensin y las protenas muy
cidas o muy bsicas no se resuelven bien. Algunos de estos problemas se pueden
resolver mediante fraccionamiento, la utilizacin de IPGs con diferentes rangos de pH.
Otra limitacin importante de la 2D-PAGE es la deteccin de protenas poco
abundantes, algunas de ellas se consideran muy importantes (protenas regulatorias,
protenas implicadas en la transduccin de seales, receptores). En estos estudios es
necesario realizar un fraccionamiento de la muestra para reducir la complejidad de los

extractos. Debido a estas limitaciones, la mayor aplicacin de esta tcnica en el futuro

ser el anlisis y caracterizacin de subproteomas y de complejos proteicos.
Las limitaciones de la 2D-PAGE han impulsado el desarrollo de otras
metodologas. Una estrategia desarrollada consiste en digerir con tripsina una mezcla
de protenas para despus purificar y analizar los pptidos mediante MS. Los pptidos
se pueden purificar mediante cromatografa liquida, electroforesis capilar o mediante
una combinacin de tcnicas como cromatografa de intercambio inico y
cromatografa de fase reversa. La ventaja de este procedimiento es que se dispone de
una gran cantidad de protenas. Sin embargo, el anlisis de los datos requiere una
enorme cantidad de tiempo y ordenadores muy potentes. Adems se puede perder
mucho tiempo y esfuerzo en el anlisis de protenas que no tienen inters.
1.1.2 Identificacin y caracterizacin de protenas
En los proyectos protemicos la identificacin de protenas es esencial. Es el
primer paso para otros estudios que suponen en ltima instancia la caracterizacin
funcional. Adems, en el caso de los geles bidimensionales, la identificacin de las
manchas conduce a la creacin de mapas de referencia, que definen las protenas
expresadas por unos organismos o tejido en unas condiciones determinadas.
Las protenas pueden ser identificadas por diversos procedimientos, entre los
que se incluyen la secuenciacin del extremo N-terminal, deteccin con anticuerpos
especficos, composicin de aminocidos, co-migracin con protenas conocidas, y
sobre-expresin y delecin de genes. Todos estos mtodos generalmente son lentos,
laboriosos, o caros, y por tanto no resultan apropiados para su utilizacin como
estrategias a gran escala.
Debido a su rapidez y elevada sensibilidad, la espectrometra de masas se ha
convertido en el mtodo de deteccin para la identificacin de protenas a gran escala,
el primer paso para el estudio de proteoma de distintos organismos. Tambin permite
la caracterizacin de modificaciones post-traduccionales que presentan relevancia
fisiolgica, tales como la glicosilacin y la fosforilacin. La estrategia general empleada
para la identificacin a gran escala de protenas mediante espectrometra de masas se
muestra en la Fig. 3.
El anlisis de las protenas mediante espectrometra de masas ha sido posible
gracias al desarrollo de varios mtodos de ionizacin suave para convertir
biomolculas grandes, polares y no voltiles en iones en fase gaseosa.
Los espectrmetros de masa estn formados al menos por una fuente de iones,
un analizador de masas y un detector que mide la relacin masa/carga (m/z) de los
iones en fase gaseosa.

Esta tcnica tan robusta implica:

1.- La conversin de los pptidos en iones en fase gaseosa mediante tcnicas de
ionizacin suave, como ionizacin desorcin con lser asistida con matriz (MALDI) a
partir de una muestra en estado slido, o la ionizacin mediante electrospray (ESI) de
una muestra en solucin.

2.- Separacin de los iones segn su m/z en un analizador de masas (por ejemplo un
analizador tipo ToF (Time of Flight), cuadrupolo, trampa inica, etc.)
3.- Fragmentacin opcional de los iones peptdicos.
4.- Medida de las masas en un detector obteniendo un espectro de masas que refleja la
abundancia de los iones frente a su valor m/z.

Fig. 3 Estrategia para la identificacin de protenas mediante espectrometra de masas (Pitarch et al. 2003).

Recientemente se han desarrollado tambin fuentes de MALDI que se acopan a

un analizador QToF o a dos analizadores ToF en tndem (MALDI-ToF/ToF).
Para la identificacin de protenas se han desarrollado diversas estrategias, de
las cuales, dos se encuentran representadas esquemticamente en la Fig. 4:

Identificacin mediante huella peptdica (PMF: peptide mass fingerprinting) o

mapeo peptdico utilizando un espectrmetro tipo MALDI-TOF.

Identificacin mediante fragmentacin de pptidos obteniendo la secuencia

total o parcial de los aminocidos (etiqueta de secuencia) utilizando un
espectrmetro de masas en tndem.

Fig. 4 Dos nuevas aproximaciones para la deteccin y cuantificacin diferencial de protenas. A. ICAT
(isotope coded affinity tag). B. DIGE (Differential gel electrophoresis). (Pitarch et al. 2003).

En esta revisin sobre tecnologa protemica pretende solamente resaltar algunos

aspectos de inters, especialmente de la separacin de protenas mediante
electroforesis y del anlisis de stas mediante espectrometra de masas (MS) sealando
las aproximaciones para la identificacin y caracterizacin.

2. FUNDAMENTOS DE LA ELECTROFORESIS
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo
elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en
dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional.
Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de alta
sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo de separacin
de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde
aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer tambin mediante estas
tcnicas, las caractersticas cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto
crudo, lo que da la informacin necesaria si se pretende realizar una separacin
cromatogrfica basada en diferencias de carga. Es til adems para determinar otros
parmetros como peso molecular, punto isoelctrico y nmero de cadenas
polipeptdicas de las protenas.

La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al

producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la
molcula,
o
sea,
a
la
resistencia
que
le
ofrece
el
medio.

V=qE/f

La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la velocidad de

migracin de un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo es igual
al de la carga de la partcula.
La velocidad de migracin electrofortica depende de la densidad de carga de la
molcula (relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de
electroforesis. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se
genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre
separacin, por causa de la difusin por tiempo muy prolongado de la corrida
electrofortica.
La mayora de las biomacromolculas (protenas, cidos nucleicos y polisacridos)
poseen determinada carga elctrica con grupos aninicos y catinicos capaces de
disociarse. La carga neta de la partcula est dada por el pH del medio y puede ser
modificada por la interaccin con pequeas molculas de iones u otras
macromolculas. De lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de
migracin de las molculas.2 En el punto isoelctrico de la biomolcula, pH al cual su
carga neta es 0, esta no migra. Por debajo del punto isoelctrico tiene carga neta
positiva y migra hacia el ctodo, y por encima del punto isoelctrico tienen carga neta
negativa y migra hacia el nodo.
3. TIPOS DE ELECTROFORESIS
Existen dos modalidades de electrofresis:
3.1 Electrofresis libre
El campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones (Fig. 5). Histricamente,
es el origen de la electroforesis tal y como hoy la conocemos y fue desarrollada por
Arne Tiselius en 1937. Actualmente est en desuso, ya que al ser un fluido el medio en
el que se desarrolla, tiene poco poder de resolucin.

Fig. 5 Las molculas cargadas migran hacia los electrodos, aunque no bien separadas por tratarse de una
disolucin.

3.2 Electroforesis zonal

Es una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa molecular por su
elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en
vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo (Fig. 6).

Fig. 6 Electroforesis de zona sobre un soporte.

Son tiles para lograr la separacin de componentes de mezclas complejas. Se

aplican pequeas cantidades de la disolucin de protenas a un soporte slido, que se
impregna con una solucin de tampn. Los soportes son en general polmeros y
forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del medio
durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del solvente. Como
soportes han sido utilizados papel (celulosa), almidn, poliacrilamida, agarosa, acetato
de celulosa, etctera.
Este mtodo tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad pequea de
protena a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor
que la zona de aplicacin. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder y
cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). Con el
desarrollo de la ciencia se han diseado equipos automatizados de electroforesis como
el PhastSystem.

3.2.1

Equipamiento de la electrofresis

Para llevar a cabo una separacin electrofortica zonal se necesitan los elementos
mostrados en la Fig. 7:

Fuente de alimentacin. Proporciona el campo elctrico mediante dos

electrodos, uno positivo (nodo) y otro negativo (ctodo) entre los que se
establece una diferencia de potencial.

Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitan los electrodos.

Soporte electrofortico.

Fig. 7 Equipo electrofortico. La cubeta tiene en sus extremos los reservorios para el tampn de
electroforesis. En el centro se aloja el soporte (gel) con la muestra aplicada en su zona central.

3.3 Tipos de soporte

El elemento fundamental es el soporte. Aunque todas las electroforesis responden a
un mismo principio, las de zona pueden ser de distintos tipos en funcin del soporte
que se utilice. En todos los casos, la muestra se dispone inicialmente en una pequea
zona del soporte, y posteriormente lo va recorriendo impulsado por el campo elctrico.
Para que esta situacin sea estable, tanto al comienzo como a lo largo del proceso de
separacin, es necesario contrarrestar el efecto de la difusin y las posibles corrientes
de conveccin. Para ello se utilizan reticulados moleculares (el soporte de la
electroforesis), que forman un entramado tridimensional que impide o reduce dicha
difusin y permite la entrada de agua en sus poros; el tamao de estos poros debe
permitir el paso de molculas voluminosas como son los cidos nucleicos y las
protenas. Adems, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe tener cargas que
interfieran con la migracin de las molculas de la muestra.
Los diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos:
3.3.1

Soportes no restrictivos tipo I

Tamao de poro no opone impedimento al paso de las molculas. El agar es el

ejemplo ms representativo y se obtiene a partir de algas marinas y esta formado por
dos tipos de polisacridos: la agarosa y la agaropectina; sta ltima posee varios
grupos cargados (grupos carboxilo y sulfato), lo que la hacen inadecuada como soporte
electrofortico por el efecto electroendosmtico que produce. La agarosa (Fig. 8) se
utiliza ampliamente sobre todo para la separacin de cidos nucleicos y para el anlisis
de protenas. Los diferentes tipos de agarosas se caracterizan por su punto de fusin
(entre 35-95C), su resistencia fsica y el grado de electroendsmosis.

Fig. 8 Estructura qumica de la agarosa, polisacrido lineal formado por la repeticin de la estructura
bsica (agarobiosa), con un peso molecular medio de 120kDa (que corresponde a unas 400 unidades). Las
caractersticas de la agarosa se ven modificadas dependiendo de la naturaleza de los diferentes radicales
R.

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3.3.2 Soportes restrictivos tipo II

El tamao de poro opone resistencia al paso de las molculas. El ejemplo
caracterstico son los geles de poliacrilamida, que no slo evitan la conveccin y
minimizan la difusin, sino que adems participan en el proceso de separacin. Estos
geles son medios porosos en los que el tamao de poro es similar al de las protenas, de
tal modo que existe un efecto de tamizado molecular y la separacin electrofortica
depende de la densidad de carga de las molculas y de su tamao.
3.4 Factores que afectan la electrofresis
El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario
conocerlos para lograr la mxima resolucin.
3.4.1 Campo elctrico
Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez,
depende de diferentes parmetros:

Diferencia de potencial (V). Se mide en voltios y es lo que define el campo

elctrico. Cuanto mayor sea, mayor ser la velocidad de migracin. Las
electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la
mayora) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios.

Intensidad (I). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga elctrica. Esta

relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm:
V=IR
y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA)
viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en ltima instancia,
da cuenta de la distancia recorrida por las molculas.

Resistencia (R). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del

soporte, menor ser la movilidad electrofortica (ya que la intensidad ha de ser
menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del
soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y seccin) y de la concentracin
del tampn de electroforesis.

Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente elctrica produce

calor, y este efecto ser tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial
y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que
puede afectar a la muestra (desnaturalizndola), al soporte e incluso al equipo
electrofortico. Todo esto justifica, por s solo, la necesidad de un sistema de
refrigeracin en las cubetas de electroforesis.

3.4.2

Muestra

La movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea su

carga y disminuye segn aumenta su tamao, ya que mayor es la friccin de la
molcula con el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razn, las
molculas globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la
esfera presenta la mnima superficie a igualdad de volumen. As, molculas del mismo

11

tamao y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electrofortica
diferente y ser, por tanto, separables mediante una electroforesis.
3.4.3

Tampn

Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por accin del
campo elctrico, lo cual genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo
en el ctodo. El tampn es, por esta razn, esencial durante la electroforesis para evitar
que el nodo se acidifique y el ctodo se haga ms bsico, pero no debe afectar a las
molculas a separar.
Adems, la fuerza inica condiciona la movilidad electrofortica de las substancias
a separar, ya que influye en su esfera de solvatacin y en la conductividad de todo el
sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza inica suficiente para mantener el pH y la
conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegara a
interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas inicas moderadas (0.05-0.10M),
siendo el pH la caracterstica que debe ser ms controlada, puesto que determina la
carga de la muestra.
Conviene sealar tambin que atendiendo a la distribucin del tampn, los
sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un nico tampn en el proceso, y
discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y composicin
diferentes.
3.4.4

Soporte

La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie
de fenmenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:

Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra sobre

el soporte, por lo que afecta negativamente a la resolucin, ensanchando las
bandas de migracin.

Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes

(sobre todo en los no reductivos tipo I), en los que aparecen cargas negativas,
debido a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolucin
inica. Al aplicar el campo elctrico, los iones y las molculas se desplazan
segn su carga, pero en su migracin se encuentran con un flujo de cationes
desplazndose sobre la superficie del soporte y otro de aniones hacindolo por
el centro de los poros (Fig. 9). Este flujo orientado se llama flujo
electroendosmtico. El EEO va en contra de la resolucin de una electroforesis,
ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la
EEO contribuir a una mejor resolucin en las inmunoelectroforesis y en la
electroforesis.

12

Fig. 9 Efecto electroendosmtico en la superficie de un soporte cargado negativamente. Los aniones

migran desplazndose por el centro del poro, mientras que los cationes lo hacen por la superficie.

Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los

soportes; cuanto ms tupida sea la red de fibras, menores sern los poros. El
movimiento de las molculas a travs del soporte es ms o menos fcil en
funcin de su tamao respecto al de los poros; aquellas molculas cuyo tamao
se aproxime al del poro, ver impedido su avance respecto a aquellas cuyo
tamao sea muy inferior. Por esta razn, el soporte acta como un cedazo que
separa o tamiza las molculas en funcin de su tamao.

3.5 Tipos de electrofresis

Las protenas son molculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de
aminocidos (fundamentalmente cido glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e
histidina) y del grado de ionizacin de stos al pH considerado (Fig. 10 ).

Fig. 10 Principales aminocidos responsables de la carga neta de una protena, dependiendo del pH.

En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la

migracin, ya que el tamao de las protenas es muy pequeo en comparacin con el
tamao de poro del soporte), la separacin depende de la densidad de carga de las
molculas y, as, cuanto mayor sea la densidad, mayor ser la velocidad de migracin
en un campo elctrico hacia el polo que determine su carga neta.
La primera etapa del proceso es la aplicacin de la muestra. En papel o acetato
de celulosa, esto se puede efectuar de forma puntual (permite el anlisis de varias
muestras simultneamente en pequeas cantidades) o longitudinalmente (permite el
estudio de una sola muestra pero en mayor cantidad). La muestra se aplica disuelta en
el tampn de electroforesis, del que est impregnado el soporte y que se encuentra en
los reservorios de la cubeta, y se deposita en una pequea zona, lo ms estrecha
posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se conoce cul va a ser la direccin

13

de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la direccin del campo

elctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que all el campo
elctrico no es homogneo y se distorsionan las bandas segn avanzan. El volumen que
se aplica suele ser inferior a 10 L y si se necesitan mayores volmenes porque la
muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la
misma zona, dejando secar entre aplicacin y aplicacin. Es necesario humedecer el
soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el
soporte de tampn de electroforesis por ambos extremos y de forma simultnea para
que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicacin de la muestra.
En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta
de dimetro adecuado y se elimina esa porcin por succin. La perforacin puede ser
cilndrica o rectangular, dependiendo del nmero y cantidad de muestra a analizar y la
muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el
tampn est embebido en el soporte (agarosa).
En todos los casos, la zona de aplicacin debe ser lo ms estrecha posible, para
aumentar la resolucin y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones
cercanas.
La electroforesis termina cuando se haya producido la mxima separacin de
los componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los lmites del soporte. Para evitar
que se sobrepasen estos lmites, se utilizan los marcadores electroforticos que son
molculas coloreadas con una movilidad electrofortica superior a cualquier
componente de la muestra (poseen elevada carga respecto a su tamao). Entre los
marcadores ms utilizados se encuentran la dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de
bromofenol.
Una vez acabada la electroforesis, se procede a la etapa de tincin. El soporte se
retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contiene una disolucin de un
colorante que se une de manera especfica a los componentes de la muestra y que
precipita a los componentes separados en la posicin en la que se encuentren. Las
disoluciones ms utilizadas en el caso de protenas son el Negro Amidn al 1% (p/v)
en cido actico y el Azul de Coomassie al 0.1% (p/v) en metanol/agua/cido actico
(9:9:2 v/v/v).
Si la electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa, ha de utilizarse un
papel de mayor grosor (175 gr/cm2), en lugar del utilizado en la electroforesis analtica
(85-100 gr/cm2; 0.15mm de espesor), lo que permite la aplicacin de una mayor
cantidad de muestra (50-100L).
3.5.1

Inmunoelectrofresis

Es una combinacin de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una

inmunodifusin (Fig. 11). En la primera parte, se realiza una aplicacin puntual de la
muestra, por lo que al final las distintas protenas estarn distribuidas a lo largo del gel
segn el eje de migracin. Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tincin, se practica
en el gel un canal (trinchera) paralelo a la direccin de migracin con un bistur de
doble hoja (la separacin de las hojas determina la anchura de la trinchera) en el que se
deposita un antisuero que contenga anticuerpos especficos frente a una o varias de las
protenas separadas en la electroforesis.

14

Los geles se mantienen as a temperatura ambiente (20-22C) durante 24-48 horas.

Los anticuerpos y las protenas (que actan como antgenos) difunden, y si se
encuentran en la proporcin adecuada, producen complejos antgeno-anticuerpo
insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales.
Estos complejos solamente se producen cuando ambos compuestos se hallan en lo
que se conoce como relacin de equivalencia y que no son idnticas para todas las
protenas presentes en la muestra; por eso, deben determinarse en experimentos
preliminares las cantidades idneas de antisuero y de la muestra, as como las
distancias entre el pocillo de aplicacin de la muestra y la trinchera, ya que si las
distancias son muy pequeas, el antgeno (las protenas) difunde rpidamente y puede
no formarse el precipitado, y si la distancia es mayor de la idnea, hay que emplear
mayor cantidad de antisuero y la duracin del proceso se alarga.
Una vez formadas las bandas de precipitacin, el gel puede lavarse para eliminar
las protenas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente, teirse como se ha
descrito anteriormente. Cada protena de la muestra produce una banda de
precipitacin independiente, por lo que es posible identificar el nmero de
constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuerpos.
La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipitacin, permite
diferenciar substancias con movilidades electroforticas idnticas y detectar
componentes que se encuentren en concentraciones mnimas (g).

Fig. 11 Fases de una inmunoelectroforesis (IEF).

El nmero de bandas observado en una IEF debe entenderse como el nmero

mnimo de componentes presentes, es decir, puede haber ms componentes que no
sean detectados por el antisuero empleado o que no hayan alcanzado la relacin de
equivalencia antgeno-anticuerpo adecuada.
La IEF es una tcnica principalmente cualitativa, que se desarrolla en condiciones
nativas y es especialmente apropiada para el anlisis de lquidos fisiolgicos y
extractos celulares. Permite identificar substancias en mezclas muy complejas y en
concentraciones muy bajas. Sin embargo, requiere que dichas substancias sean
inmunognicas y depende de los anticuerpos utilizados, por lo que es difcil de
estandarizar.

15

3.5.2

Electrofresis en gel de poliacrilamida (PAGE)

La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel,

es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma
rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica,
insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las
bandas durante tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la
concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao del
poro.3
3.5.2.1 Formacin del gel de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin vinlica del monmero
acrilamida y del monmero entrecruzador N, N'-metilen-bis-acrilamida (Fig. 12). La
polimerizacin se inicia con la formacin de radicales libres del monmero, que se
producen por radicales libres de oxgeno, por causa de la accin de iones persulfato.
Las aminas terciarias como el N, N, N, N-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean
como catalizadores de esta reaccin, porque causan la formacin de radicales libres del
persulfato. Esta reaccin es fuertemente inhibida por altos niveles de oxgeno, por lo
que la solucin debe ser desgasificada para lograr una formacin de gel reproducible.
Hay muchos factores que desempean una funcin importante en la separacin
electrofortica, como son pH, fuerza inica, gradiente de potencial, tiempo de corrida,
concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida, etc. Las condiciones ptimas de una
buena separacin, en la prctica se determinan experimentalmente, con el anlisis de
cmo influyen los diferentes factores en la electroforesis en cuestin. La naturaleza de
la muestra sirve de gua para alcanzar las condiciones en la que se deben obtener los
mejores resultados.
Durante la polimerizacin del gel a temperaturas inferiores a 17 C, la iniciacin
del control cataltico y el tiempo de elongacin de la cadena comienzan a ser
diferencialmente controlables.

Fig. 12 Estructura de la acrilamida, bisacrilamida y poliacrilamida

La concentracin de acrilamida (% T) representa el porcentaje en peso del

monmero total empleado (acrilamida + entrecruzador en gramos por 100 mL) y
determina la longitud promedio de la cadena del polmero. La concentracin de bis-

16

acrilamida (% C) representa el porcentaje de este monmero en el gel y determina el

grado de entrecruzamiento.
La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 % T; 0,2-5 % C. Los factores que
gobiernan la talla del poro del gel son complicados, pero en general el tamao del poro
disminuye con el incremento del % T. Las proporciones en que ambas se encuentran
determinan las propiedades fsicas del gel como su densidad, elasticidad, resistencia
mecnica y el tamao del poro. En general se recomiendan valores de T de 5 a 15 % y
de C de 2 a 4 %. Para separar molculas por tamao, es necesario tomar en cuenta la
relacin entre el poro efectivo del medio y el tamao de la molcula que se pretende
separar. Si el poro del medio es significativamente mayor que la molcula, la
separacin electrofortica ser sobre la base de diferencias de carga y el tamizaje
molecular ser mnimo. Al aplicar muestras biolgicas en un gel con gradiente de
acrilamida, todas las macromolculas comienzan su migracin a bajo porcentaje y en la
medida en que avanzan se encuentran con poros ms pequeos que retardan su
movimiento. Las molculas menores comienzan a tener alta friccin cuando los poros
son ms pequeos, mientras que las grandes comienzan la friccin en los poros de
mayor tamao.
Al polimerizar la acrilamida, adquiere la forma del recipiente, por lo que es
necesario un molde para preparar el gel; los hay de dos tipos:

Tubo. Consiste en un tubo de vidrio de dimensiones variables, aunque

normalmente es de 15-20 cm de largo 0.5-0.8 cm de dimetro interno, abierto
por los extremos. Se tapa el orificio inferior y se rellena con la disolucin de
polimerizacin sobre la que se deposita una pequea cantidad de butanol (con
esto se evita que al polimerizar el gel forme menisco y se excluye el oxgeno que
interfiere en la polimerizacin). Una vez formado el gel, se elimina el butanol y
se retira la tapa inferior del tubo. En la actualidad, la utilizacin de PAGE en
tubo ha quedado restringida a la primera dimensin en electroforesis
bidimensionales, PAGE preparativa y algunos casos muy especficos de anlisis
de protenas radioactivas.

Placa. Es la forma ms habitual en la que se desarrolla la PAGE. Puede llevarse

a cabo en posicin horizontal o vertical (dependiendo del tipo de cubeta
empleada), aunque lo ms habitual (sobre todo para la separacin de protenas)
es el modo vertical (Fig. 13). Si se aumenta la longitud del gel, aumenta la
resolucin de la electroforesis, aunque tambin se incrementa su duracin.
Asimismo, cuanto mayor sea la anchura del gel, mayor ser el nmero de
pocillos y, por lo tanto, el de muestras que se pueden analizar simultneamente
y en idnticas condiciones. El espesor del gel y las dimensiones de los pocillos
viene determinado por el grosor de los espaciadores y el tamao del peine
determina la cantidad de muestra que puede aplicarse.

Una modalidad de la electroforesis vertical es la realizada con geles en gradiente en

los que la concentracin de acrilamida (%T) aumenta progresivamente desde la parte
superior del gel hasta la inferior, es decir, el tamao de poro decrece de forma inversa.
Este gradiente de concentracin de acrilamida puede ser lineal o no (cncavo, en pasos,
etc.), aunque los primeros son los ms utilizados. Con estos geles el intervalo de
tamaos de protenas que pueden separarse se incrementa considerablemente frente a
los geles homogneos y presentan una mayor resolucin. Adems, las molculas de la

17

parte delantera de la banda se frenan ms (encuentran antes los poros ms pequeos)

que las molculas de la parte trasera, con lo que las bandas se estrechan,
concentrndose sobre su parte delantera, produciendo bandas muy finas y con una
gran resolucin.
En la cubeta, el tampn del reservorio superior cubre el gel y los pocillos en los que
se ha de cargar la muestra. Con el fin de que sta, disuelta en el mismo tampn, no
difunda al depositarla en los pocillos, se le puede aadir un compuesto que aumente
su densidad (normalmente, glicerol o sacarosa). El volumen de muestra que puede
aplicarse a cada pocillo depende del tamao de la propia muestra y del pocillo, pero
oscila entre 10- 100L con un mximo de 200L. En el tampn de la muestra, tambin
se aade el marcador electrofortico (el ms utilizado es el azul de bromofenol) para
poder determinar el final del proceso.

Fig. 13 Preparacin del gel para una electroforesis en placa. Elementos para ensamblar el molde. Los
espaciadores (sujetados con pinzas de presion) colocados sobre los cristales forman el molde. Adicin de la
solucin de monmeros. Colocacin del peine en la parte superior. El gel formado presenta los pocillos
donde aplicar la muestra. Las dimensiones habituales de los geles son: 10-20 cm (L) x 10-15 cm (A) x 0.5-1.5
mm (E).

3.5.2.2 Tipos de monmeros

La bis-acrilamida es el agente entrecruzador ms comnmente empleado en este
tipo de electroforesis. O Gaal et al. (1984), plantearon que la bis-acrilamida puede
actuar como terminador de la cadena en el proceso de polimerizacin y
concentraciones altas pueden disminuir el tamao de poro mximo de gel.
Se han reportado otros agentes entrecruzadores como: la N, N-diallitartar diamina
(DATD) que da un tamao de poro mayor que el obtenido con bis-acrilamida; la N,
NC-bisacrililcistamina (BAC) cuyo gel resultante se une por los grupos bisulfuro, lo
que hace que pueda disolverse en soluciones de reactivos tilicos yel N,N-(1,2dihidroxietileno) bis-acrilamida o DHEBA forma geles de poros altamente hidroflicos.
3.5.2.3 Catalizadores empleados en la formacin del gel de poliacrilamida
La polimerizacin se lleva a cabo con la utilizacin de sistemas catalticos redox
como por ejemplo:
Persulfato de amonio (agente oxidante) y TEMED como agente reductor.

18

Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propio-nitrilo (DMAPN).

Perxido de hidrgeno, sulfato de hierro y cido ascrbico.

La polimerizacin no ocurre a bajo pH, ya que requiere radicales de monmeros

libres formados por catlisis bsica de radicales oxgeno del persulfato.
La fotopolimerizacin con riboflavina no es inhibida por el oxgeno; sin embargo,
en ambos casos el TEMED acta como agente reductor suave y acelera la
polimerizacin.
3.5.2.4 Sistemas de tampn que se emplean en la electroforesis en geles de
poliacrilamida
La fuerza inica (m) determina el potencial electrocintico ya que reduce la carga
neta de los grupos con cargas efectivas. Se ha determinado que la movilidad de las
partculas cargadas es inversamente proporcional a la raz cuadrada de la fuerza
inica, a baja m se eleva la velocidad de migracin y es menor la difusin, de manera
que la zona de separacin es ms ancha y mayor la resolucin.1 Con el aumento de la
m, se incrementa el desprendimiento de calor y la evaporacin. En la electroforesis, los
efectos de absorcin de agua, no-homogeneidad del material, intercambio inico con
grupos cargados del soporte y electroendsmosis, pueden influir sobre la movilidad y
la calidad de la separacin. La electroendsmosis generalmente ocurre porque grupos
cargados del soporte se ionizan en soluciones tampn neutras o cidas y los
contraiones libres hidratados.
(H 3O+) migran hacia el ctodo, esto provoca un movimiento relativo del solvente
respecto al soporte slido y que las molculas no cargadas sean transportadas hacia el
ctodo a pesar de no tener grupos ionizados.
La electroforesis en geles de poliacrilamida puede realizarse en el rango de pH de 2
a 11, sin embargo la desaminacin de las protenas o las reacciones hidrolticas pueden
ser severas a valores de pH inferiores a 3 y superiores de 10. La mayora de las
protenas con puntos isoelctricos comprendidos entre pH 4 y 7,5, son separadas en
geles con pH entre 8 y 9.
La fuerza inica del sistema tampn debe mantenerse a un nivel adecuado para
garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora. Es usual
utilizar concentraciones de tampn en un rango entre 0,025 y 0,1 mol/L, pero pueden
emplearse concentraciones sobre 0,5 mol/L en sistemas fuertementes cidos, pues a
bajos valores de pH muchos cidos dbiles (que son los ms empleados) estn
dbilmente ionizados y es necesaria una alta concentracin para obtener la adecuada
capacidad amortiguadora.
3.5.2.5 Formatos de la PAGE
Existen 3 formas diferentes de realizar electroforesis en geles de poliacrilamida:
lmina vertical,varilla cilndrica y lmina horizontal.
Los geles ms finos son ms econmicos porque emplean menos reactivos y
pueden ser eficientemente refrigerados durante la corrida, por lo tanto pueden ser
corridos a mayor voltaje, logrndose as una alta resolucin en corto tiempo. Los

19

tiempos de tincin y destincin son menores tambin porque la difusin es muy

rpida; sin embargo como el gel es tan fino es ms propenso a perturbaciones y
problemas en la polimerizacin.
Se ha planteado que la resolucin de las molculas generalmente aumenta con la
disminucin del grosor del gel.
3.5.2.6 PAGE en condiciones no desnaturalizantes
La modalidad ms sencilla es la descrita en apartados anteriores en las que la
muestra se carga directamente en el gel en el cual se va a producir la separacin, por lo
tanto, la concentracin del gel es uniforme y hay un nico tampn. La PAGE se
desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las
protenas separadas, por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios
de funcionalidad de dichas protenas separadas (actividad enzimtica, capacidad de
unin de anticuerpos, unin a receptores, etc.).
Otra modalidad de electroforesis no desnaturalizante es aquella en la que el
tampn presente en los reservorios es diferente al que impregna el gel, el cual tampoco
es homogneo, ya que, en realidad, hay dos geles diferentes en uno solo: una zona de
resolucin (donde tiene lugar la separacin de las protenas) que se polimeriza sin
colocar el peine (por lo que la parte superior presenta un frente plano) y otra pequea
zona de concentracin de 1-3 cm, que se polimeriza sobre la anterior (quedan
fundidas), que contiene los pocillos de aplicacin de la muestra y cuya finalidad es
concentrar la muestra en la zona de contacto con la zona de resolucin (Fig 14).
Este hecho es debido a que la zona de concentracin tiene un tamao de poro muy
grande (2.5-3.0%T), por lo que no es restrictiva frente al de la zona de resolucin cuyo
tamao de poro s es restrictivo.

Fig. 14 PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas de tampn discontinuo.

3.5.2.7 PAGE en condiciones desnaturalizantes

En presencia de algunos compuestos qumicos, las protenas pierden su estructura
nativa; tales compuestos, llamados agentes desnaturalizantes, producen el
desplegamiento de la protena que queda, as, sin la organizacin tridimensional
caracterstica de su funcionalidad biolgica.
En algunas protenas hay puentes disulfuro entre los residuos de Cys (para formar
cistinas) de una misma cadena polipeptdica (puentes intracatenarios) o de diferentes
cadenas (puentes intercatenarios) de algunas protenas con estructura cuaternaria.

20

Estos puentes se pueden romper mediante tratamiento con determinados agentes

reductores, como por ejemplo, el -mercaptoetanol (-ME) o el ditiotreitol (DTT).
Otros agentes desnaturalizantes de protenas, son la urea y determinados
detergentes. La urea interfiere con las reacciones hidrofbicas de las protenas y debe
incluirse en el tampn de la muestra y en todos los que se empleen para la preparacin
de los geles; las principales aplicaciones de la urea es en la separacin de las histonas,
as como de protenas nucleares y ribosomales (ya que tienen mucha tendencia a
agregar y son insolubles) y para el anlisis conformacional de protenas (mediante
geles con gradientes transversales de urea).
Los detergentes afectan a la estructura nativa de las protenas y a las interacciones
con otras molculas (protenas, lpidos, etc.), ya que las interacciones hidrofbicas de
las protenas son sustituidas por interacciones detergentes-protena. Existen tres tipos
principales de detergentes:

Detergentes no inicos. Son dbilmente desnaturalizantes y no alteran la carga

de las protenas a las que se unen; se pueden utilizar en geles con urea y en
electroenfoque. Los ms empleados son el Triton X-100 y el Octilglucsido,
particularmente para solubilizar protenas de membrana. Se utilizan a
concentraciones de 0.1-3.0% (p/v) y deben incluirse en el tampn de la muestra
y en el del gel.

Detergentes inicos. Pueden tener carga positiva (catinicos) que se usan para
la separacin de protenas muy cidas o muy bsicas; el ms utilizado es el
cetiltrimetilamonio (CTAB). Otros poseen carga negativa y un fuerte carcter
desnaturalizante; el ms empleado es el dodecilsulfato sdico o lauril sulfato
sdico (SDS).

Detergentes anfteros. Son dbilmente desnaturalizantes y no afectan a la

carga de las protenas; algunos, como el 3-(cloroamido propil)-dimetilamonio-1propanosulfato (CHAPS) solubilizan muy bien las protenas de membrana. Son
compatibles con la utilizacin de urea y su uso es frecuente como alternativa a
los detergentes no inicos.

3.5.2.8 PAGE-SDS
Permite el clculo de parmetros moleculares (al contrario que el resto de los tipos
de electroforesis), pues los complejos SDSprotena se separan estrictamente segn su
tamao molecular. El SDS interacciona con las protenas formando complejos de
caractersticas comunes independientemente de las de cada protena.
Las protenas unen una molcula de SDS por cada dos aminocidos, lo que implica
que las cargas propias de las protenas quedan enmascaradas o anuladas; asimismo, la
molcula de SDS proporciona una carga negativa, por lo que los complejos SDSprotena estn cargados negativamente de forma uniforme (la carga por unidad de
masa es prcticamente constante para todos los complejos).
Como ya se ha comentado, la movilidad electrofortica en una PAGE es funcin del
tamao y de la carga por unidad de masa; como sta es constante para todos los

21

complejos SDS-protena (que, adems, tienen la misma forma elipsoide), esta

movilidad es solamente funcin de la masa molecular, es decir, cuanto menor sea la
masa molecular de la protena, mayor ser la movilidad de la misma y viceversa.
En resumen, la SDS-PAGE es la electroforesis ms utilizada para el anlisis de
protenas debido a:

La gran mayora de las protenas son solubles en SDS.

Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo tanto,
en el mismo sentido.

Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin

tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas.

La separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa

molecular, que se puede calcular.

Los complejos SDS-protena se tien fcilmente.

La preparacin de la muestra es de la mxima importancia para asegurar que todo

lo comentado anteriormente se cumple. Al tampn en el que va disuelta la muestra
(Tris HCl; 0.05M, pH = 6.8) se aade un exceso de SDS (2% p/v); para facilitar la unin
del SDS a las protenas, la muestra se calienta a 100C durante al menos 3-5 minutos y,
opcionalmente, se aade -ME (5% v/v) DTT (20 mM) si se requieren condiciones
reductoras. Para incrementar la densidad de la disolucin de la muestra, se aade
glicerol o sacarosa al 10% (p/v) y como marcador azul de bromofenol al 0.001% (p/v).
La cantidad de muestra que se aade depende de la sensibilidad de la tincin posterior
que se vaya a utilizar, pero como regla general y para geles de 2020 cm de 1.5mm de
espesor y tincin con azul de Coomassie, se suele aadir entre 1-10g de muestra (ms
de 100g de protena supone una sobrecarga del gel).
El SDS debe incluirse en el tampn de los reservorios, en los de los geles (de
concentracin y de resolucin) y en el de la muestra para mantener las condiciones
desnaturalizantes. La PAGE-SDS puede realizarse en condiciones reductoras o no
reductoras; la ausencia de reductores se traduce en que si las protenas poseen puentes
disulfuro, el SDS slo producir una desorganizacin parcial de la estructura (Fig. 15).
Si son dos o ms las cadenas unidas por puentes disulfuro intercatenarios, en presencia
de SDS, quedarn ms o menos desplegados en funcin de la posicin de los puentes
disulfuros (Fig. 16).

22

Fig. 15 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electrofortica de protenas monomricas. En una
protena nativa de 25 kDa, carente de puentes disulfuro, el tratamiento con SDS ( ) SDS+DTT ( )
producen idntico resultado. La protena con un puente disulfuro intracatenario, en presencia de SDS se
desnaturaliza parcialmente, manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. El tratamiento con
SDS+DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de la protena.

23

Fig. 16 Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electrofortica de protenas oligomricas.

Una vez finalizada la PAGE, se separa el gel de las placas de vidrio haciendo
palanca con una esptula y se visualiza con un colorante; el ms utilizado es el azul de
Coomassie con el que se pueden visualizar 0.1-0.5 g de protena por banda. Otro
mtodo de tincin es con sales de plata, que tiene como principal ventaja su elevada
sensibilidad (hasta 0.1ng de protena por banda), aunque tiene como desventajas que es
muy laboriosa y cara, presenta elevado background, baja reproducibilidad, algunas
protenas no se tien y, sobre todo, no es totalmente especfico de protenas, ya que
algunos lipopolisacridos, cidos nucleicos y polisacridos tambin se tien.
Un mtodo de sensibilidad comparable a la tincin con sales de plata, emplea
compuestos fluorescentes que se unen especficamente a las protenas (la unin puede
realizarse antes o despus de la electroforesis), como el cloruro de dansilo (detecta
hasta 10ng de protena por banda), la fluorescamina (detecta hasta 3-5ng de protena
por banda) y el MDPF (2-metoxi-2,4-difenil-3(2H) furanona; detecta hasta 1ng de
protena por banda).
Una vez teido el gel de poliacrilamida, la imagen que se obtiene es un conjunto de
bandas coloreadas sobre un soporte transparente. Su anlisis permite identificar el

24

nmero mnimo de componentes (bandas) de cada muestra. Cada banda se caracteriza

por su movilidad electrofortica relativa (Ur).
Ur = Lmuestra/Lmarcador
donde:
Lmuestra = Longitud recorrida por la muestra
Lmarcador = Longitud recorrida por el marcador
La PAGE es un criterio de pureza negativo, es decir, permite saber si una
muestra no es homognea (porque aparecen varias bandas en un gel) pero no permite
establecer que sea homognea (puede haber varias protenas que tengan la misma
movilidad electrofortica y apareceran como una sola banda).
En las condiciones de la SDS-PAGE, si se representan los valores de logaritmo del
peso molecular (logM) frente a la movilidad electrofortica (Ur) de un conjunto de
protenas, se obtiene una relacin lineal (Fig. 17). Normalmente, se utiliza un conjunto
de protenas de peso molecular conocido (marcadores de peso molecular) que se
someten a SDS-PAGE en el mismo gel que se analizan las protenas cuyos peso
molecular se desea conocer.

Fig. 17 Clculo de pesos moleculares de protenas por SDS-PAGE

Es importante sealar que la relacin lineal entre logM y Ur se mantiene para una
concentracin dada de poliacrilamida (%T) y slo en un corto intervalo de peso
molecular. De forma general, en geles del 15%T la relacin lineal es vlida para
protenas comprendidas entre 12 y 45 kDa; en geles del 10%T, el intervalo lineal va
entre 15 y 70 kDa, y en los del 5%T, entre 25 y 200 kDa.
Hay protenas con un comportamiento anmalo en SDS-PAGE; en las
glicoprotenas y las lipoprotenas, que llevan unidos azcares o lpidos, la parte no
proteica no une SDS y puede impedir el acceso del mismo a la protena. Por ello, las
glicoprotenas y lipoprotenas unen menos SDS que la mayora de las protenas; esto
hace que la relacin carga/tamao sea menor y, por lo tanto, tengan menor movilidad
electrofortica y se comporten como si tuvieran mayor tamao.
3.5.3

Electrofresis en geles de gradientes

El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de

concentracin (Fig. 18) de acrilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente
decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de
concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena migra
hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier avance. Una vez se
alcanza el limite del poro no se produce una migracin apreciable aunque no se detiene
completamente. Una de las ventajas de este tipo de geles es que resuelve mejor las

25

bandas pues las concentra en regiones mas estrechas, adems de incrementar el rango
de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de
una concentracin fija.

Fig. 18 Electroforesis en gel con gradiente.

3.5.4

Electroforesis en geles de agarosa

La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar,

pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %)
poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 C y formar un gel,
semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional
de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso
de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor
20.000 nucletidos.
3.5.5

Electrofresis capilar

La electroforesis capilar (Fig. 19) se basa en los mismos principios de las tcnicas
electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos
permiten obtener una serie de ventajas al respecto. Esta separacin de pptidos
realizada sobre un capilar de silica fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un
campo
de
400
a
500
v/cm
refrigerados
por
aire.
La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la
superficie interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del
lquido que contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta
resolucin. La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que
generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y
resistencia, tiene una ventaja a travs de ella que permite el pasaje de la luz UV de tal
manera
que
la
visualizacin
es
on-line.
Con esta tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, protenas,
macromolculas y sustancias no cargadas en forma simultnea.

26

Fig. 19 Electroforesis capilar

3.5.6

Enfoque isoelctrico

Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfteros se

separan segn su punto isoelctrico (pI; pH al cual la carga neta de la protena es nula)
en un gradiente continuo de pH.

La carga neta de una protena

es funcin del pH:

pH>pI
pH=pI
pH<pI

Carga nula negativa

Carga neta nula
Carga nula positiva

(Fig. 20)

Fig. 20 Curva de titulacin de una protena. Representacin de la carga neta (Q) de una protena en
funcin del pH.

En todos los mtodos electroforticos descritos anteriormente, la difusin es un

fenmeno con efectos negativos, que tiende a ensanchar las bandas, disminuyendo la
resolucin. En el EEF el efecto de la difusin es mnimo y por ello posee una enorme
resolucin, pudiendo llegar a separar protenas que difieran en 0.001 unidades de pI.
Esto se debe a que si una protena focalizada en su pI se desplazase por difusin,
adquirira carga (positiva o negativa segn hacia el polo que difundiera) y por efecto
del campo elctrico volvera a la zona de su pI; esto se llama efecto focalizante del EEF
y es el responsable de su enorme resolucin. Adems, el EEF aumenta su resolucin al
disminuir el intervalo de gradiente de pH.
Por todo esto, el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF;
para ello, se emplean compuestos anfteros de bajo peso molecular llamados anfolitos
portadores, que son pequeas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes

27

grupos cidos y bsicos, con un pI que abarca desde 2.5 hasta 11.0, con gran capacidad
de tamponacin cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad.
Una disolucin de una mezcla de estos anfolitos tendrn un pH prximo al
promedio de los pIs. Si esta disolucin se emplea para la preparacin de un gel de
poliacrilamida, al aplicar una diferencia de potencial cada molcula de anfolito migrar
hacia uno u otro polo en funcin de su carga, hasta alcanzar la zona de su pI. Cuando
se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel. Si, debido
a la difusin, los anfolitos abandonasen la zona de su pI, adquiriran carga y
experimentaran el efecto focalizante mencionado anteriormente.
Los gradientes de pH generados en algunos soportes, como los geles de
poliacrilamida, muestran el fenmeno denominado deriva catdica, que consiste en
que el gradiente se hace inestable con el tiempo y se desplaza, junto con las protenas,
hacia el ctodo; esto se debe, fundamentalmente, al flujo electroendosmtico. La deriva
catdica puede evitarse variando la naturaleza qumica del gel (se usan derivados de
acrilamida, como la 3-dimetilaminopropil metacrilamida) o utilizando gradientes de
pH inmovilizados (que se consigue copolimerizando con la acrilamida los compuestos
qumicos que establecern el gradiente, por lo que las molculas que forman el
gradiente estn fijas sobre las propias fibras de poliacrilamida).
La variedad ms utilizada de EEF es la analtica. El gel se prepara a partir de
una disolucin de acrilamida (3-5%T para facilitar la movilidad) y bisacrilamida en
agua, a la que se aaden los anfolitos. La preparacin del gel es totalmente anloga a la
de PAGE, aunque tambin puede llevarse a cabo en cubetas horizontales, en cuyo caso
los geles son de muy poco grosor (<0.5 mm) y se polimerizan sobre lminas de plstico
tratadas especialmente para que se adhieran al gel.
El EEF puede llevarse a cabo en condiciones que mantengan la estructura nativa
de las protenas o en condiciones desnaturalizantes, incorporando, adems de los
anfolitos, urea (8M) o detergentes ni inicos o anfteros (pero nunca detergentes
inicos como el SDS).
Si el EEF se va a desarrollar en un gel con un gradiente de pH inmovilizado, se
utiliza un formador de gradiente (sistema de vasos comunicantes) y dos disoluciones
con distinta densidad (una ms densa de carcter cido, por lo que quedar en la parte
inferior del gel y otra ms bsica de menor densidad que quedar en la parte superior
del gel).
El desarrollo del EEF es ms complejo que el de la PAGE, ya que se utilizan
voltajes variables (ya que segn se va formando el gradiente, los anfolitos van
perdiendo carga hasta llegar a su pI, con lo que se reduce la conductividad del medio);
en el EEF se necesitan fuentes de alimentacin capaces de generar 3.000V, para
proporcionar intensidades constantes del orden de 50-150mA. Estos voltajes tan
elevados lleva asociado un importante incremento de temperatura, por lo que el
soporte debe estar refrigerado a 4C o alrededor de 10C si se utilizan geles con urea
(ya que la urea precipita a 4C).
Una de las aplicaciones ms importantes del EEF es el clculo de pI (Fig. 21); en
el pocillo I se aplican los marcadores de pI, y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea
conocer. El carril III (sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Una

28

vez corrido el gel, se trocea el carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en
1mL de agua, determinndose su pH. Finalmente, se representa el pH de cada fraccin,
frente a su posicin en gel. La distancia migrada por la muestra (X) se interpola en la
recta obtenida, determinndose as su pH.

Fig. 21 Determinacin del punto isoelctrico de una muestra.

Hay que volver a destacar, una vez ms, que el EEF es un criterio de pureza
negativo, es decir, varias bandas indican que la muestra es heterognea, pero la
aparicin de una nica banda no permite afirmar que la muestra sea homognea, ya
que pueden coexistir protenas diferentes con igual pI; no obstante, cuanto menor sea
el gradiente de pH utilizado, mayor ser la probabilidad de que al aparecer una banda,
la muestra sea homognea.
3.5.7

Electrofresis bidimensional

Es una sucesin de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones)

realizadas sobre una misma muestra. En la primera de ellas (primera dimensin) se
separan los componentes de la muestra segn un criterio (carga, tamao o pI), y en la
segunda (segunda dimensin) segn un parmetro distinto del anterior. De esta
manera, se combinan dos modos de separacin diferentes y se consigue el mximo de
resolucin posible mediante tcnicas electroforticas.
La primera dimensin puede llevarse a cabo, por ejemplo, en condiciones no
desnaturalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes; las protenas
ribosomales se separan en un gel discontinuo en la primera dimensin, seguido por
otro continuo en la segunda, y ambos en presencia de urea; las histonas se separan en
geles con urea y cido en la primera dimensin y utilizando tritn/cido/urea en la
segunda.

29

Sin embargo, normalmente, la idea de electroforesis bidimensional suele referirse a

la combinacin de los dos tipos de electroforesis ms resolutivos: electroenfoque
(primera dimensin) y SDS-PAGE (segunda dimensin) (Fig. 22).
La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de pureza
positivo debido a su gran poder de resolucin, aceptndose que la aparicin de una
sola mancha indica una muestra homognea.

Fig. 22 Electroforesis bidimensional. Primera dimensin (SDS-PAGE). En el pocillo I se aplica el marcador

de pesos moleculares y en los pocillos II y III la muestra. El carril del pocillo III (sombreado) se corta y el
resto del gel se tie. El carril III se coloca sobre un nuevo gel que se ha polimerizado sin pocillos, donde se
desarrolla la segunda dimensin (EEF) perpendicularmente a la primera. Obsrvese que algunas bandas
producen ms de una mancha en la segunda dimensin.

4. INFORMACIN SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS.

4.1 Fragmentacin de Protenas.
Las estrategias ms utilizadas en la identificacin de protenas por
espectrometra de masas (MS) requieren que la muestra sea fragmentada, ya sea por
mtodos qumicos o enzimticos, en sus constituyentes peptdicos.
En general las protenas que poseen enlaces disulfuro en su estructura no se
digieren, y aquellas que son digeridas producen mezclas de pptidos muy complejas.
Por esta razn resulta necesario reducir y alquilar los residuos de cistena en las
protenas que han sido resueltas por electroforesis antes de llevar a cabo la digestin.
Este proceso comprende 2 pasos: primero se reduce el enlace disulfuro y
posteriormente se alquilan los grupos tiol de los residuos de cistena. De esta manera la
protena se encuentra desplegada de forma tal que mejora el rendimiento durante el
proceso de digestin.
4.1.1 Protelisis.
La fragmentacin enzimtica se ha convertido en el mtodo ms utilizado en
protemica para el rompimiento de protenas, teniendo a su disposicin una gran
variedad de enzimas. Algunas de las ventajas que ofrece este mtodo son la alta

30

especificidad y eficiencia en el rompimiento de las protenas, as como un mnimo de

reacciones laterales.
La enzima ms utilizada para este fin es la tripsina, ya que produce pptidos
trpticos de tamao adecuado (tamao promedio de 9 aminocidos) para su anlisis
por MS. Al fragmentar protenas bsicas (con alto contenido de residuos de lisina y/o
arginina) con esta enzima se genera un alto nmero de fragmentos de tamao pequeo
que no resultan adecuados para anlisis de secuencia ya sea mediante el mtodo de
Edman o MS. La accin de la tripsina se puede restringir slo a los residuos de arginina
al modificar selectivamente los residuos de lisina (por succinilacin y citraconilacin),
propiciando as la produccin de fragmentos de tamao mayor que sean sujetos de
anlisis de secuencia por los mtodos anteriormente mencionados. En estudios sobre
modificaciones post-traduccionales, tales como fosforilacin, resulta ms conveniente
el empleo de otras enzimas. En la tabla 1 se indican otras enzimas utilizadas en
protelisis.
Tabla 1. Enzimas utilizadas frecuentemente en digestin enzimtica de pptidos.

Enzima
Trypsina
Endoproteinasa
(V8-DE)
Quimiotripsina

Glu-C

Endoproteinasa Lis-C
Endoproteinasa Arg-C
Pepsina

Sitio de corte
C-terminal de R-X, K-X
C-terminal de E-X, D-X

Excepcin
Cuando X=P
Cuando X=P

Rango de pH
7-9
4-8

C-terminal de F, Y, W, L,
I, V, M-X
C-terminal de K-X
C-terminal de R-X
C-terminal de F, L y E

Cuando X=P

7.5-8.5

Cuando X=P
Cuando X=P

8.5-8.8
7.5-8.5
2-4

4.1.1.1 Digestin en Solucin.

La digestin de protenas puede realizarse ya sea en solucin o en gel. La
digestin en solucin presenta el problema de que la electroelucin de una protena
desde la matriz de un gel de poliacrilamida hacia la solucin de digestin es difcil y
vara de protena a protena.
4.1.1.2 Digestin en Gel.
La digestin en gel se utiliza de manera rutinaria en protenas separadas
mediante electroforesis en 2D. Se ha reportado que utilizando este procedimiento es
posible fragmentar cantidades tales como 10pmoles de protena; sin embargo, al
emplear cantidades por debajo de 5 pmoles se observa una disminucin significativa
en la produccin de pptidos.
En 1996, Wilm et al. reportaron que la digestin de protenas en geles teidos
con azul de Coomassie y plata era compatible con el anlisis de protenas por MS;
mientras que Shevchenko et al. demostraron que al teir con plata se poda omitir el
uso de glutaraldehdo (que reacciona con los grupos amino libres de las protenas) sin
afectar la sensibilidad de visualizacin de las protenas y favoreciendo el anlisis por
MS.
Independientemente del mtodo de visualizacin, es importante que el desteido de
las protenas se realice de manera correcta antes de la digestin. Si no se remueve el

31

azul de Coomassie de la muestra se afectar la eficiencia de digestin de la tripsina ya

que ste se une a los residuos bsicos de las protenas. La presencia de iones de plata,
de azul de Coomassie, y de detergentes como el SDS (que se ioniza fcilmente) puede
afectar tambin el anlisis de MS.
La protena de inters se recupera del gel cortando la banda manualmente, aunque
existen tambin sistemas automatizados. Antes de aadir la enzima al fragmento de
gel con la protena de inters, ste se deshidrata mediante lavados sucesivos con
acetonitrilo y posteriormente se seca al vaco. Este paso favorece que la enzima se
incorpore eficientemente por difusin cuando el gel es rehidratado con el buffer de
digestin. Una vez llevada a cabo la reaccin enzimtica los pptidos producidos se
extraen de la matriz del gel por difusin utilizando solventes orgnicos y cidos, entre
ellos el cido trifluoroactico y el acetonitrilo. Para eliminar eficientemente sales,
buffers y contaminantes de los pptidos extrados de la matriz del gel se utilizan
columnas de cromatografa en fase reversa (RP-HPLC). Una vez eliminados los
contaminantes, las muestras estn listas para ser analizadas por MS si se encuentran en
la concentracin requerida por el mtodo.
Las protenas resueltas en geles de poliacrilamida pueden tambin ser
transferidas por electroblotting a membranas con tripsina inmovilizada donde se lleva
a cabo su fragmentacin.
4.1.2 Rompimiento qumico.
Los mtodos qumicos son complementarios a la protelisis, y aunque no siempre se
utilizan tienen aplicaciones especficas en casos donde la protelisis no es apropiada o
no se cuenta con la enzima adecuada. El rompimiento qumico presenta varias
desventajas, entre ellas: baja eficiencia de corte, inespecificidad en el corte con la
mayora de los mtodos y reacciones laterales indeseables.
Un mtodo que presenta una excelente especificidad de corte es el rompimiento con
bromuro de ciangeno (CNBr), que se utiliza para cortar protenas insolubles o de
membrana generando pptidos relativamente largos. En la siguiente tabla se muestran
los mtodos qumicos empleados ms comnmente para digerir protenas.
Tabla 2. Agentes qumicos utilizados frecuentemente en fragmentacin de pptidos.

Agente qumico
Bromuro de ciangeno
(CNBr)

Sitio de corte
C- terminal de Metionina

Hidrlisis cida (cido

frmico)
Hidroxilamina

Residuos de Aspartil
Enlaces Asn-Gly

BNPS-skatole

Triptofano

Observaciones
Excelente especificidad y rendimiento
de corte.
Exceso de CNBr puede causar
rompimiento en residuos de Y y W.
Rompimiento especfico.
Algunos enlaces Asn-X se pueden
romper.
Inestable en condiciones cidas.

32

4.2 Anlisis de Secuencias Amino y Carboxilo terminal

4.2.1 Secuenciacin del extremo amino terminal.
Uno de los primeros mtodos utilizados en la identificacin de protenas fue el
desarrollado por Pehr Victor Edman para obtener la secuencia amino terminal.
El mtodo de degradacin de Edman se divide en 3 etapas:
-

Acoplamiento: Se lleva a cabo en un tiempo de 15-30 min a pH 9 y 40-55C. En la

reaccin de acoplamiento el fenilisotiocianato (PITC) modifica qumicamente al
grupo -amino del amino terminal libre de un polipptido para formar un
feniltiocarbamil (PTC) polipptido. Esta reaccin se inhibe por modificaciones
en el amino terminal, tales como formilacin, acetilacin, acilacin y ciclizacin
de residuos de glutamina.

Rompimiento: En presencia de cido anhidro el residuo PTC amino terminal se

libera rpidamente del polipptido. Esto genera un aminocido
anilinotiazolinona (ATZ) y un polipptido. El ATZ aminocido generado es
hidrofbico, por lo que puede ser extrado de la solucin empleando solventes
como el etilacetato. El polipptido liberado tiene un aminocido menos y posee
un extremo amino terminal libre capaz de reaccionar con el PITC.

Conversin: En este paso, mediante la reaccin con cido acuoso el ATZ

aminocido que es muy inestable se convierte en un feniltiohidantoin
aminocido (PTH) ms estable. El PTH es posteriormente analizado por HPLC
para definir la identidad del aminocido.

Si bien el mtodo de secuenciacin de Edman est perdiendo terreno en el campo

de la protemica, an sigue siendo una alternativa viable para la obtencin de
secuencias en caso de no contar con un espectrmetro de masas. Hoy en da se utiliza
en la tcnica de secuenciacin de mezcla de pptidos. En esta tcnica la mezcla de
protenas resuelta por electroforesis en 2-D se transfiere a una membrana inerte por
electroblotting. Las protenas son visualizadas en la superficie de la membrana,
escindidas y fragmentadas en 3 5 pptidos largos con CNBr o skatole. El fragmento
de la membrana se coloca directamente en un secuenciador de Edman automatizado.
Esta metodologa sirve para analizar protenas con modificaciones en el extremo Nterminal que no son susceptibles de ser secuenciadas por el mtodo de degradacin
tradicional.

33

Figura 23. Mtodo de degradacin de Edman.

4.2.1.1 Protenas con modificaciones en el amino terminal.

Estimaciones empricas sugieren que cerca del 40-50% de las protenas que se
resuelven por electroforesis en 2-D estn bloqueadas en el extremo N-terminal por
grupos formil, acetil y piroglutamil (por ciclizacin de residuos de glutamina en
condiciones cidas). Si la protena de inters no est bloqueada naturalmente an
puede sufrir un bloqueo de su N-terminal durante la preparacin de la muestra, en
especial durante la electroforesis. Para evitar el bloqueo del extremo N- terminal en las
protenas de inters se han implementado algunas medidas tales como: adicionar
glicerol grado HPLC al buffer de muestra o correr la electroforesis con slo el gel de
corrida y antes de colocar el gel empacador para evitar que los monmeros de
poliacrilamida reaccionen con los N- terminales de las protenas. Existen tambin
diversos mtodos para desbloquear protenas, aunque no han probado ser muy
eficientes; es por ello que no se recomienda su empleo para protenas poco abundantes.

34

4.2.2 Secuenciacin del extremo carboxilo terminal.

Las tcnicas de secuenciacin del carboxilo terminal se han desarrollado poco en
comparacin con la metodologa empleada para secuenciar el amino terminal. La
mayora de las secuencias del extremo carboxilo terminal reportadas en los ltimos
aos se han obtenido utilizando MALDI en espectrometra de masas; para ello los
pptidos son digeridos con carboxipepsidasas.

5. ESPECTROMETRA DE MASAS
Mediante espectrometra de masas es posible obtener informacin estructural de
las protenas tal como secuencia de aminocidos y la masa de los pptidos. Esta
informacin puede utilizarse para identificar protenas comparando los resultados con
bases de datos. La espectrometra de masas tambin resulta til para identificar y
localizar modificaciones post-traduccionales en las protenas. La recoleccin de
informacin por medio de MS se podra dividir en las 3 etapas que se mencionan a
continuacin.

5.1 Preparacin de la muestra

Como se mencion previamente, la protena se resuelve de una mezcla proteca
empleando generalmente tcnicas electroforticas. Debido a que la conversin de la
protena en sus constituyentes peptdicos proporciona mayor informacin que la
obtenida con la protena completa es necesario llevar a cabo una fragmentacin de la
misma por los mtodos que ya se describieron en este trabajo. Una vez obtenidos los
constituyentes peptdicos estos pueden ser purificados por RP-HPLC, utilizando
ZipTips (Millipore) o material de perfusin Poros R2 (PerSeptive Biosystems,
Framingham, Mass). (Fig. 3)
5.2 Ionizacin de la muestra
Para el anlisis de muestras biolgicas por MS es necesario que las molculas estn
cargadas elctricamente y secas. Este requisito se cumple convirtiendo las molculas en
iones desolvatados. Han sido varias las tcnicas que se han desarrollado con este fin,
las primeras de ellas se basaron en el impacto de electrones y en la ionizacin qumica.
Estas tcnicas resultaron efectivas para ionizar molculas pequeas pero no para la
ionizacin de molculas de alto peso molecular, como las biomolculas. La
espectrometra de masas se revolucion en 1981 gracias a la introduccin del
bombardeo rpido de tomos (FAB, fast atom bombardment) por Barber. Esta tcnica
posibilit la ionizacin y deteccin de biomolculas con relativamente buena
sensibilidad. Hoy en da, los mtodos ms comnmente empleados para generar iones
desolvatados son el MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization) y el ESI
(electrospray ionization), estos han reemplazado por completo al FAB. Tanto el MALDI
como el ESI son mtodos de ionizacin suaves donde se mantiene relativamente la
integridad de la muestra.

35

5.2.1 MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization)

Este mtodo fue introducido en 1988 por Karas y Hillenkamp. En el MALDI la
muestra se incorpora en una matriz de molculas y posteriormente es sometida a
radiacin con un lser. El lser promueve la formacin de iones moleculares. La matriz,
capaz de absorber luz de la longitud de onda emitida por el lser, est constituda por
una molcula pequea tal como el cido 2,5-dihidroxibenzico, el cido ciano-4hidroxicinmico o el cido sinapnico. Tanto la muestra como la matriz se colocan en
una placa de metal y se dejan evaporar, propiciando la formacin de cristales. La placa
de metal se coloca en el espectrmetro y el lser es dirigido automticamente a sitios
especficos de la placa. La luz emitida por el lser, generalmente con una longitud de
onda de 337 nm, causa la desorcin y la ionizacin de la muestra tanto por protonacin
como por desprotonacin generando iones predominantemente monovalentes. Los
iones producidos son posteriormente acelerados hasta el analizador.
El proceso puede estar automatizado desde la aplicacin de la muestra hasta la
recoleccin y el anlisis de los datos, lo que constituye la principal ventaja del MALDI.
Adicionalmente, no siempre es necesario que las muestras a analizar sean sometidas a
procesos de purificacin despus de la digestin en gel, lo que constituye otra ventaja
de este mtodo sobre el ESI.

Figura 24. Ionizacin por MALDI.

5.2.2

ESI (Electrospray Ionization)

Este mtodo fue descrito en 1989 por Fenn. En el ESI, la muestra lquida fluye
desde un microcapilar hasta el orificio del espectrmetro de masas, donde una
diferencia de potencial entre el microcapillar y la entrada al espectrmetro de masas
genera una nube de finas gotas cargadas elctricamente. Conforme se evapora el
solvente, disminuye el tamao de las gotas mientras que la carga de las mismas
permanece constante, dando como resultado iones desolvatados. Las cargas elctricas
se distribuyen estadsticamente en los sitios potenciales de carga de las molculas de

36

analito, dando como resultado iones multivalentes. A cada in multivalente se le

denomina un estado de carga, y es comn obtener una distribucin de estados de carga
al analizar macromolculas por ESI. Las protenas tambin generan iones
multivalentes, sin embrago generalmente la resolucin de cada in multivalente no es
suficiente para determinar el nmero de cargas que posee el in, con el cual se podra
determinar su masa real. Por lo tanto se utilizan las masas de al menos 2 iones
multivalentes para calcular la masa real de la protena mediante algoritmos de
deconvolucin.
La obtencin de iones multivalentes es una caracterstica nica del mtodo de ESI;
esto permite utilizar una menor cantidad de masa del analito, lo que constituye una
ventaja para el anlisis de macromolculas.
La tcnica de electrospray genera flujos que van de 10 a 100 L/min. Este flujo
resulta problemtico para el anlisis de protenas, especficamente debido a que la
muestra se consume rpidamente y a que el tiempo de anlisis es muy corto. Por ello,
una mejora importante a este mtodo de ionizacin ha sido el desarrollo de la
ionizacin por nanospray, donde se utilizan microcapilares con dimetro interno de 1
a 2 m y velocidades de flujo de 5 a 10 nL/min. Estos flujos permiten reducir la
cantidad de muestra consumida e incrementar el tiempo disponible para el anlisis.
Existen diversas maneras de hacer llegar la muestra al espectrmetro. La ms
simple es utilizando microcapilares individuales para cada muestra, de esta manera se
evita la contaminacin cruzada entre muestras. La purificacin de la muestras
posterior a la digestin en gel es un requisito para utilizar el mtodo de ESI, y puede
llevarse a cabo directamente en los tubos microcapilares. Es debido a este pre-requisito
que algunas fuentes de electrospray estn conectadas a sistemas de cromatografa que
de manera automtica purifican y dirigen la muestra al espectrmetro de masas.

Figura 25. Ionizacin por ESI

En la siguiente tabla se enlistan las ventajas y desventajas de los 2 mtodos

descritos previamente.

37

Tabla 3. Ventajas y desventajas de los mtodos de ionizacin MALDI y ESI

Ventajas
MALDI
Lmite de tamao 300,000 Da
Sensibilidad en el orden de fentomoles a
picomoles.
Ionizacin
suave
con
baja
o
nula
fragmentacin de los pptidos.
Apropiado para anlisis de mezclas complejas.
Las muestras no requiren preparacin previa.

ESI
Lmite de tamao 70,000 Da
Sensibilidad en el orden de fentomoles a
picomoles.
Ionizacin suave. Capaz de observar
interacciones no covalentes nativas.
No hay interferencia de alguna matriz.
Fcil de adaptar a anlisis de tripe
cuadrupolo.
Formacin de iones multivalentes: mayor
precisin en el clculo de masas, anlisis de
iones de alto peso con un relativamente bajo
rango m/z del instrumento.
Excelente para determinar modificaciones
post-traduccionales.
Capacidad para secuenciacin de pptidos
excelente.

Desventajas
Ruido de fondo generado por la matriz,
problemas en compuestos de menos de 1,000
Da.
Imposible
estudiar
interacciones
no
covalentes.
Capacidad mnima para secuenciacin
(MS/MS) y determinacin de modificaciones
post-traduccionales a menos que se equipe con
un reflectrn (post-source decay).
Baja tolerancia a sales. Necesario utilizar RPHPLC.
Alta sensibilidad a contaminantes.
Baja tolerancia a mezclas. La pureza de la
muestra es muy importante.
Iones
multivalentes.
Puede
ocasionar
confusin especialmente al analizar mezclas.

5.3 Anlisis de masa.

Despus de la conversin de protenas o pptidos en iones moleculares, estos son
acelerados desde la fuente de iones hacia el analizador de masa. En el analizador de
masa los iones son separados de acuerdo a su relacin carga-masa (m/z) en el vaco.
5.3.1 Analizadores de Cuadrupolo.
Uno de los analizadores de masa ms comnes es el analizador de cuadrupolo. En
l los iones son conducidos a travs de un campo elctrico creado por un arreglo de 4
barras metlicas paralelas, el cuadrupolo. Un cuadrupolo puede transmitir todos los
iones, o bien actuar como un filtro msico que permita la transmisin de de iones con
una cierta relacin m/z. Un solo analizador de cuadrupolo no brinda informacin til
en anlisis de protemica, sin embargo al combinar tres cuadupolos en serie (figura 27)
y acoplarlos a un sistema de ESI es posible obtener informacin acerca de la secuencia
de amino cidos de un pptido. Empleando esta configuracin, el primer y tercer
cuadrupolo actan como filtros de masa, mientras que el segundo funciona como una
celda de colisin en la cual se produce la informacin sobre la estructura proteca. A
esta configuracin se le denomina tandem space o MS/MS.

38

Figura 26. Analizador de iones de cuadrupolo.

Figura 27. Configuracin de un analizador de cuadrupolo triple.

Utilizando un analizador de cuadrupolo triple es posible realizar tres tipos de

experimentos en espectrometra MS/MS, estos experimentos se denominan: product ion
scan, precursor ion scan y neutral loss scan. (ver figura 28)
En product ion scan, se selecciona el in de inters en el primer cuadrupolo, que
posteriormente es dirigido al segundo cuadrupolo, que acta como una celda de
colisn. En esta celda el in se fragmenta para producir una distribucin de fragmentos
de in, o iones producto. Estos iones se resuelven en el tercer cuadrupolo, que acta
como un filtro de masas.
En precursor ion scan, el primer cuadrupolo permite que todos los componentes de
la mezcla pasen a la celda de colisin (segundo cuadrupolo). El tercer cuadrupolo, que
acta como filtro de masas, est fijo en un valor de masa, de manera que slo los
pptidos que hayan generado fragmentos con la masa especificada por el filtro podrn
ser detectados en el analizador de masas.
En neutral loss scan, el primer y tercer cuadrupolos se barren sincronizadamente con
un offset de valor m/z especfico. Toda la mezcla de iones pasa al segundo cuadrupolo,
que nuevamente es la celda de colisiones, pero slo las especies que generan
fragmentos de masa igual a la del offset son observadas en el detector.

39

Figura 28. Modos en que se emplea un cuadrupolo triple. 1) Product ion scan, 2) Precursor
ion scan, 3) Neutral loss scan.

5.3.2 Analizador de tiempo de vuelo (ToF).

ste es uno de los analizadores ms simples. Mide la relacin m/z de un in
determinando el tiempo requerido para recorrer la longitud de un tubo de vuelo desde
que el in abandona la fuente de iones; el in es impulsado con una velocidad inicial, la
cual depende directamente de su masa. El tiempo de vuelo del in es proporcional a la
raz cuadrada de su relacin m/z dada una aceleracin constante provocada por el
voltaje.
Tiempo de vuelo= k (m/z)
Algunos analizadores de masa de ToF incluyen un espejo de iones o reflectrn al
final del tubo de vuelo, el cual repele los iones a travs de este tubo y los dirige al
detector. De esta forma, se ve incrementada la longitud del tubo de vuelo con lo que
mejora la resolucin. El reflectrn sirve tambin para corregir las pequeas diferencias
en la energa cintica (Ec) que existe entre iones de la misma masa. Estas diferencias se
deben a la posicin que guarda cada in en la fuente de iones al momento de que son
acelerados al aplicar una diferencia de potencial. Las diferencias en la energa cintica
de los iones se reduce debido a que los iones con Ec mayor viajan ms lejos en el
reflectrn que los iones con Ec menor. Esto ocasiona que los iones con la misma masa
se enfoquen mejor en el detector mejorando considerablemente la resolucin y la
precisin del clculo de masas.

40

Figura 29. Analizador de tiempo de vuelo.

Los espectrmetros de masa con analizadores de tiempo de vuelo acoplados a

sistemas de ionizacin MALDI se denominan espectrmetros MALDI-ToF. Estos se
utilizan principalmente en fingerprinting de pptidos y se usan como herramienta
primaria en la identificacin de protenas debido su velocidad. Un sistema MALDI-ToF
sirve para obtener la secuencia de pptidos empleando la tcnica de decaimiento post fuente (post source decay, PSD).

5.3.3 Analizador de trampa de iones.

La funcin de estos analizadores es atrapar iones moleculares en un campo
elctrico tridimensional. En contraste con un analizador de cuadrupolo, en el cual los
iones son descartados antes de iniciar el anlisis, el analizador de trampa de iones
posee la capacidad de almacenar los iones y liberarlos de manera selectiva de la
trampa. Esto incrementa la sensibilidad.

Figura 30. Analizador de Trampa de iones.

5.3.4 Analizadores hbridos.

Los analizadores hbridos se han convertido en una herramienta muy til para la
secuenciacin de protenas. Combinando un cuadrupolo que acte como filtro de masa
y una celda de colisin con un analizador ToF con reflectrn, es posible obtener
informacin con alta precisin, resolucin y sensibilidad. Los analizadores hbridos
usualmente estn acoplados a un sistema de HPLC.

41

5.3.5 Analizadores ToF/ToF.

Este tipo de analizador, acoplado a una fuente de iones MALDI, se utiliza para
secuenciacin de pptidos y huella de masa de pptidos. Dos analizadores ToF se
encuentran separados por una celda de colisin. El primer analizador ToF se emplea
como selector de iones. En la celda de colisin se producen choques de alta energa
entre los iones. Y el segundo analizador ToF resuelve los iones.
5.3.6 FT-ICR (Fourier transform-ion cyclotron resonance).
El analizador de masas FT-ICR se utiliza para el anlisis de biomolculas acoplado
a una fuente de iones MALDI o ESI. Se ha empleado para resolver mezclas complejas,
estudiar interacciones de protenas, as como para elucidar la conformacin de
protenas.
El FT-ICR, es una trampa de iones magntica. En este analizador los iones son
atrapados en una celda que est bajo un campo magntico fuerte. La celda est
compuesta por tres pares de placas (figura 31): placas de confinamiento
(perpendiculares al campo magntico), transmisoras y receptoras. Dentro de la trampa,
los iones se mueven en rbita circular, perpendicular al campo magntico. Los iones se
mantienen en la celda debido al potencial elctrico aplicado a las placas de
confinamiento. Cuando se aplica un potencial elctrico de radio-frecuencia en las
placas transmisoras los iones atrapados se excitan. Una frecuencia dada excita iones
con una relacin m/z particular. La excitacin de los iones provoca que giren en
rbitas mayores. Cuando los iones excitados pasan cerca de las placas receptoras se
detecta su frecuencia de rotacin (que es inversamente proporcional a su masa) y se
induce una corriente en las placas. A esta corriente se le denomina corriente de imagen.
Mediante las transformadas de Fourier es posible medir simultneamente todas las
frecuencias de rotacin al mismo tiempo.

Figura 31. Analizador de masas FT-ICR. A) Placas de confinamiento, atropamiento de iones por campo
magntico. B) Placas transmisoras, excitacin de los iones. C) Placas receptoras, generacin de corriente de
imagen.

42

5.3.7 Fragmentacin de Iones.

Una vez que los iones son dirigidos a la cmara de colisin del espectrmetro de
masas, estos interactan con el gas de colisin (N2 o Ar) y sufren una fragmentacin
primaria.
Los fragmentos que se generan pueden ser muy variados (Figura 32). Si el despus
de la fragmentacin la carga se mantiene en el extremo N-terminal, el in es designado
como in -b; en cambio, si la carga se mantiene en el extremo C-terminal, el in es
denominado un in -y. La diferencia en masa entre un in -b y un in -y corresponde
a un aminocido. Esta diferencia de masa entre los iones se utiliza para identificar los
aminocidos, y con ello, la secuencia peptdica. Para distinguir entre los aminocidos
leucina e isoleucina, que poseen la misma masa molecular, es necesario que la
fragmentacin se lleve a cabo con energas de colisin muy altas, de manera que se
propicie la fragmentacin de cadenas laterales de los aminocidos.
Tanto los iones -b como los -y pueden perder NH3 (principalmente de los residuos
bsicos como arginina y lisina), H2O (principalmente del alcohol contenido en residuos
de serina y treonina; y de los residuos que contienen grupos carboxilo libres como el
cido glutmico y el asprtico) y CO. Cuando un in b pierde CO se forma un in-a.

Figura 32. Fragmentacin de pptidos. Adems de la formacin de iones y y b, se indica la formacin de

otros iones.

6. IDENTIFICACIN DE PROTENAS UTILIZANDO BASES DE DATOS.

Los datos generados en un espectrmetro de masas, son visualizados en forma de
picos; a la representacin grfica de los datos se le denomina espectro de masas. Cada
uno de los picos de un espectro de masas representa valores de m/z y la intensidad de
cada seal.
Definir la identidad o secuencia de una protena a partir de su espectro de masa es
un procedimiento comn en estudios de protemica. Utilizando la informacin
contenida en bases de datos es posible la identificar rpidamente un gran nmero de
protenas con gran precisin. En la tabla 4 se muestran algunas de las bases de datos
ms utilizadas en estudios de protemica.

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Tabla 4. Bases de datos utilizadas para identificacin de protenas.

Nombre del sitio

ProFound

URL
http://prowl.rockefeller.edu/cgibin/ProFound

MOWSE

http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse

MASCOT

http://matrixscience.com/

SEQUEST

http://fields. Scripps.edu/sequest/

FindMod

http://www.expasy.ch/tools/findmod/

FASTA

http://fasta.bioch.virgina.edu/

Comentarios
Peptide mass fingerprinting y
secuenciacin. Considera
propiedades de la protena, y
preparacin de la muestra.
Calcula peso molecular, pI,
etc.
Peptide mass fingerprinting y
secuenciacin.
Mapeo de masa de pptidos y
secuenciacin (uninterpreted
MS/MS).
Secuenciacin (uninterpreted
MS/MS).

Modificaciones posttraduccionales.
Base de datos de protenas
y nucletidos.

La identificacin exitosa de protenas depende de la calidad de los datos generados

en el espectrmetro de masas, de los datos contenidos en la base de datos y, del
mtodo empleado en la bsqueda de datos. En general, existen diversas estrategias
para el manejo de datos obtenidos por MS, algunas de ellas se describen a
continuacin.
6.1 Huella de masa del pptido (peptide mass fingerprinting, PMF).
Esta tcnica comprende los siguientes pasos: digestin de la protena, anlisis por
MALDI-ToF y empleo de algoritmos de bsqueda en bases de datos.
Para llevar a cabo el anlisis de datos, cada protena en la base de datos es digerida
tericamente empleando el mismo agente utilizado para fragmentar la protena
problema. Posteriormente se compara el espectro obtenido por MS (la huella de masa
del pptido) con los espectros tericos generados en la base de datos; se calcula y
asigna una puntuacin, la cual refleja la paridad entre los datos experimentales y los
tericos obtenidos por la base de datos. La protena identificada como la ms probable
es aquella con la puntuacin ms alta.
Esta tcnica posee la ventaja de ser bastante rpida, sin embargo no es buena
cuando se trabaja con mezclas de protenas a pesar de que se han desarrollado algunos
programas para tal fin. La presencia de un alto nmero de modificaciones posttraduccionales en la protena problema puede generar un espectro de masa distinto a
los predichos por las bases de datos, lo que representa un problema para el anlisis.
La tcnica PMF puede ofrecer mejores resultados si la bsqueda en la base de datos
es suplementada con una secuencia parcial. En este caso s es posible identificar
protenas en una mezcla.

44

6.2 Secuenciacin utilizando datos generados con la tcnica product ion scan en
MS/MS.
Como se mencion previamente, la fragmentacin de pptidos utilizando la tcnica
ion product scan o de decaimiento post-fuente de masas proporciona informacin acerca
de la secuencia. La informacin obtenida a partir de una secuencia es indudablemente
ms precisa que la proporcionada por la masa molecular. Por tanto, la secuencia de un
pptido suficientemente largo puede ser suficiente para identificar una protena que ha
sido caracterizada previamente.
Es posible llevar a cabo un anlisis manual del espectro de masa para determinar la
secuencia tomando como base los iones (de la serie b y y) generados.
Los datos tambin pueden interpretarse en bases de datos, a este tipo de bsqueda
se le denomina MS/MS no interpretado (uninterpreted MS/MS). Y generalmente basta
con obtener la secuencia de 2 pptidos para identificar una protena de un genoma
conocido. Son muchas las bases de datos disponibles para realizar bsquedas de este
tipo, sin embargo presentan problemas en el anlisis cuando existen modificaciones y
polimorfismo en las protenas.

6.3 Secuenciacin de novo.

El objetivo de esta aproximacin es obtener secuencias completas de aminocidos
que se deduzcan de novo de los espectros MS/MS (bien mediante interpretacin
manual o con ayuda de algoritmos) y buscar homologas frente a protenas presentes
en bases de datos.
La secuenciacin de novo es necesaria cuando el anlisis por MFP o MS/MS no
interpretado no produce resultados confiables. Esto es comn en casos en que el
genoma del organismo del cual procede la protena no ha sido caracterizado
completamente. Aunque la protena de inters pueda no ser identificada o sea una
protena desconocida, la informacin de la secuencia puede ser utilizada para clonar el
gen correspondiente.
En condiciones de baja energa, el in precursor se fragmenta para producir iones
b y y de longitudes variadas. La secuencia de los iones de ambas series es
complementaria, de manera que es posible obtener una secuencia completa an
cuando existan gaps en la secuencia de una u otra serie.
Cuando los pptidos son obtenidos por digestin con tripsina, el extremo Cterminal de los mismos es arginina o lisina. En un espectro MS/MS, el residuo Cterminal se puede observar en el fragmento correspondiente al in-y1. Por tanto, el
punto de inicio de la serie y siempre ser conocido. A la masa observada del in-y1 hay
que aadir la masa de una molcula de agua y de un protn. Si la masa del in y1 es
de 175 Da, entonces el residuo es arginina; en cambio, si la masa es de 147 Da el
residuo es lisina. Una vez identificado el in y1 en el espectro, la secuencia de la serie
puede iniciarse a partir de ese punto.

45

Figura 33. Identificacin de protenas por MS/MS. A) Resolucin y digestin de la protena. Anlisis en
espectrmetro de cuadrupolo-ToF. B) Barrido del espectro y seleccin de in precursor. C) Ampliacin de
in precursor. Identificacin de la carga del in. D) In precursor se somete a MS/MS. Espectro de iones
hijos. E) Identificacin de la protena mediante bases de datos.

7. IDENTIFICACIN DE MODIFICACIONES POST-TRADUCCIONALES.

Para comprender la funcin de una protena es fundamental identificar las
modificaciones post-traduccionales (MPT) que sta ha sufrido. Generalmente, la masa
molecular del producto de un gen se ve aumentada o disminuida despus de una MPT.
En general, es posible aplicar los mtodos espectromtricos empleados en
identificacin de protenas al anlisis de modificaciones post-traduccionales. El anlisis
de MPT resulta en definitiva ms complicado que el anlisis de secuencia por las
siguientes razones:

Debido a que la MPT representa una fraccin muy baja del peso total de la
protena, se requieren mayores cantidades de la muestra para el anlisis.
En algunos casos, los enlaces entre la MPT y el pptido se desestabilizan durante la
preparacin de la muestra.
Frecuentemente las MPT son transitorias, por lo que para el anlisis resulta
complicado recuperar las protenas en su estado modificado.

Las MPT que ms comnmente sufren las protenas son la glicosilacin y la

fosforilacin. En este trabajo nos enfocaremos en esta ltima.

46

7.1 Identificacin de sitios de fosforilacin.

Identificar los sitios de fosforilacin en una protena proporciona informacin
acerca de los mecanismos de regulacin enzimtica, as como de las enzimas
involucradas (cinasas y fosfatasas). Para estudiar la fosforilacin de protenas in vivo se
utiliza un marcaje de las fosfoprotenas con 32P inorgnico. Se puede determinar los
sitios de fosforilacin de una protena utilizando el mtodo de degradacin de Edman
o espectrometra de masas.
7.1.1 Enriquecimiento de fosfoprotenas.
El enriquecimiento de fosfoprotenas en una clula favorece la identificacin de
protenas fosforiladas que se encuentran en baja abundancia y que de otra manera no
seran detectadas.
Para enriquecer fosfoprotenas se emplean anticuerpos que reconocen protenas
con tirosina fosforilada en baja abundancia, estos anticuerpos pueden utilizarse en
ensayos de inmunoprecipitacin. Otros mtodos de enriquecimiento involucran la
conversin de residuos de fosfoserina a residuos biotinilados; las protenas
derivatizadas pueden purificarse por cromatografa de afinidad utilizando avidina, por
lo que utilizando esta tcnica es posible aislar es fosfoserin-proteoma de una clula.
Esta tcnica no modifica residuos de fosfotirosina y fosfotreonina.
Empleando Fe, Al y Ga en columnas de cromatografa de afinidad, tambin es
posible llevar a cabo el enriquecimiento de protenas debido a la alta afinidad que
presenta el grupo fosfato por estos metales.

7.1.2 Determinacin de sitios de fosforilacin mediante la degradacin de Edman.

El mtodo de degradacin de Edman se utiliza ampliamente para determinar sitios
de fosforilacin en protenas marcadas con 32P. En este mtodo las protenas son
digeridas y los fosfopptidos generados se purifican por RP-HPLC. Los pptidos
purificados se fijan a membranas inertes en su extremo C-terminal. La membrana se
somete a varios ciclos de degradacin de Edman. El 32P liberado es cuantificado en un
contador de centelleo. Este mtodo posiciona el fosfoamino en la secuencia del
fosfopptido.

7.1.3. Determinacin de sitios de fosforilacin mediante espectrometra de masas.

La espectrometra de masas permite la secuenciacin directa de fosfopptidos y la
identificacin de los sitios de fosforilacin. Debido a que una MPT puede alterar el
patrn de fragmentacin de una protena, el tratamiento de la muestra previo al
anlisis de los sitios de fosforilacin por MS puede ser muy diferente del que se aplica
en anlisis de secuencias tambin por este mtodo.
De la mezcla de pptidos, producto de la fragmentacin enzimtica o qumica de la
protena, se pueden identificar los fosfopptidos utilizando el mtodo de precursor ion
scan. Para este fin, el tercer cuadrupolo se fija en el valor de masa del in reportero del

47

grupo fosfato (PO3- ) con una relacin carga/masa de 79. La mezcla de pptidos se
roca bajo condiciones bsicas o neutras, y slo se detectan los pptidos que al
fragmentarse generan un in con m/z igual a 79. Una vez que se detecta un
fosfopptido, la mezcla se roca bajo condiciones cidas y el anlisis de la secuencia se
realiza por MS/MS convencional. Durante la fragmentacin del pptido los residuos
modificados pueden ser identificados por la formacin de productos especficos de la
eliminacin del fosfoaminocido. La fosfoserina produce deshidroalanina (69 Da),
mientras la fosfotreonina produce deshidroamino-2 cido butrico.
Utilizando la tcnica de neutral loss scan, tambin es posible identificar sitios de
fosforilacin. En esta tcnica, el tercer cuadrupolo est fijo en un offset de 49; este valor
corresponde a la masa de cido fosfrico en un in con doble carga. Durante la
colisin de los pptidos, los residuos de serina y treonina pierden cido fosfrico
fcilmente, an en colisiones de baja energa. Por tanto, cualquier pptido con doble
carga que pierda 49 Da es identificado como fosfopptido.

48

8. BIBLIOGRAFA
Gaal, O., Medgyesi, G.A. and Vereczkey, L. (1984). Electrophoresis in the separation of
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funcin. Actualidad SEM (35): 12-20.
Graves, R. P. and Haystead, A.J.T. (2002). Molecular Biologists Guide to Proteomics.
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49