You are on page 1of 23

PROYECTO DE TESIS

I.

GENERALIDADES:
1. Ttulo:
EVALUACION DE LA EFICACIA DE PRODUCTOS QUIMICOS Y BIOLOGICOS EN
EL CONTROL DE TIRO DE MUNICION EN EL CULTIVO DE DURAZNO EN
CALANA - TACNA
2. Personal investigador:
2.1. Autores:
Ana Saraih Cari Flores
Carmen Gabriela Gavancho Paredes
Diego Armando Rojas Meza
Escuela Acadmico Profesional de Biologa Microbiologa
4to Ao
2.2. Asesor: Dra. Liduvina Sulca Quispe.
3. Tipo de Investigacin:
De acuerdo al propsito de la investigacin; y objetivos formulados, el presente
estudio rene las condiciones para ser calificado como una investigacin por el
mbito ya que ser en laboratorio.
Es una investigacin de tipo: descriptiva y experimental de acuerdo a la finalidad de
las mismas.
4. Rgimen de investigacin
Orientada
5. Departamento y Seccin a la que pertenece el proyecto:
Departamento de Biologa Microbiologa. rea de Fitopatologa
6. Localidad e Institucin donde se desarrollar el proyecto:
Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann
-

Laboratorio de botnica, rea de fitopatologa

Distrito Calana, Provincia Tacna, Regin Tacna

7. Duracin total del Proyecto: 3 meses


8. Fechas probables de inicio y terminacin
8.1. Inicio: 29 de Agosto del 2014
8.2. Terminacin: 18 de Noviembre del 2014
9. Etapas

1
2
3
4
5
6
7

8
9
1
0

AO 2014
AGOST
DESCRIPCION
O
SEPTIEMBRE
SE SE SE SE
SEM 4
M1 M2 M3 M4
Revisin en campo X
Elaboracin
del
proyecto
X
Revisin
Bibliogrfica
X
X
X
X
X
Muestreo
X
X
X
X
X
Trabajo in vitro
X
X
X
X
Determinacin del
control
Elaboracin
de
informe
(primer
avance)
Aplicacin
del
Control
Resultados
Elaboracin
y
presentacin del
Informe final

NOVIEMB
OCTUBRE
RE
SE SE SE SE SEM SEM
M1 M2 M3 M4 1
2

X
X
X

X
X
X

X
X

X
X

X
X

10. Recursos Disponibles:


10.1. Personal:
Autores:
Ana Saraih Cari Flores
Carmen Gabriela Gavancho Paredes
Diego Armando Rojas Meza
Asesor:
Mblga. Liduvina Sulca Quispe

10.2. Material y Equipo:


Material biolgico:
o Hojas y tallo de Durazno, Prunus persicum, apunto de florecer

Materiales de laboratorio:
Equipos:
Microscopio ptico
Estereoscopio
Autoclave
Cocina electrica
Balanza
Horno
Termmetro
Incubadora

Materiales de vidrio
Placas petri de 15 x 10 mm
Matraces de 250 ml
Pipetas de 0.1,1.5 y 10 ml
Vasos precipitados
Laminas porta objeto
Laminas cubre objeto
Baguetas
Mechero

Materiales de metal y otros


Asa de siembra
Estiletes
Pinzas
Bisturis
Tijeras
Esptulas
Bolsa de propileno
Papel peridico o absorbente

Medios de cultivo y Reactivos:

Azul de lactofenol
Alcohol de 70
Ron de quemar
Agua destilada
Agar PDA

Otros:
o
o
o

Cmara fotogrfica
Papel kraft
Pabilo

o
o

Algodn
Tijera de podar

10.2.1. Material:
Agar papa
Agua destilada
Papa cortada en rodajas
Agar
Cocina elctrica
Vaso de Precipitado
Matraz Erlenmeyer
Papel Filtro

Tijera de podar
Placa Petri
Tubos de ensayo
Asa de Col
Mecheros
Alcohol
Algodn
Bolsas de recoleccin
Lupa
Estiletes
Porta y cubre objetos

10.2.2. Equipos:

Autoclave
Incubadora
Microscopio
10.3. Locales, laboratorio, etc.
Se llevara a cabo en la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohomann en la
Facultad de Ciencias de la Escuela Acadmico Profesional de Biologa
Microbiologa, ambientes del Laboratorio de Botnica.

11. Presupuesto:
11.1. Bienes:
11.1.1. Material de laboratorio

Algodn
Detergente
Alcohol 70
Jabn carblico

Porta objetos
Cubreobjetos
Ron de quemar
Pabilo

Cmara
fotogrfica
Impresiones

subtotal

410.00

30.00

440.00

Fosforo (paquete)
Tapers de plstico
Bistur (20 u.)
Papel kraft (5 u.)
Cinta de embalaje
Subtotal

13.8

3.5

7.00

3.00
11.1.2. Material fotogrfico

11.1.3.

Material de escritorio
Cuaderno
apuntes

de

Papel bon A4
Marcador
Subtotal
11.1.4.

5.00
5.00
2.50
2.00
1.00
X
5.00
3.50
2.00
1.50
54.80

10.00
12.00
3.50
25.50

30.00
20.00
50.00

Servicios
Movilidad local
Viticos
Subtotal

TOTAL

570.30


12. Financiacin:

Con recursos externos (autofinanciacin)

El estudio a realizar ser autofinanciado

II.

PLAN DE INVESTIGACION

1. Problema

1.1.
Enunciado del problema cientfico
Cul ser la eficacia de los productos qumicos y biolgicos en el control
de tiro de municin que infecta a durazneros?

1.2.
Definicin y delimitacin del problema

1.2.1. Conocimientos previos, antecedentes y origen del problema

Origen
y
descripcin
de
Prunus
persica:
El durazno o melocotn es un rbol deciduo que pertenece a la
familia Rosaceae. Es originario del Oeste de China y segn la
evidencia arqueolgica y literaria se presume que fue domesticado
alrededor del 3.000 A.C. (Desmond y Bassi, 2008). El rbol de
durazno puede alcanzar 8 metros de altura, sus hojas son
lanceoladas y las flores presentan una gama de colores entre
blanco y rosado, segn la variedad. Sus frutos se caracterizan por
tener un endocarpio endurecido y un mesocarpio carnoso. En el
caso de Prunus persica var. Diamante, la piel es pubescente,
mientras que en Prunus persica var. Nectarina la piel es lisa y de
coloracin
rojiza
(Desmond
y
Bassi,
2008).
Dependiendo de las condiciones climticas en las que se
encuentren las plantaciones de durazno, este frutal puede llegar a
tener una vida media de 12 a 17 aos, alcanzando su edad
productiva a partir del sexto o sptimo ao (Whealy, et.al, 2001).

Caractersticas del Producto


El durazno Prunus prsica, es un caducifolio de la familia de
las rosceas, cuyo fruto es una drupa de gran tamao. Esta fruta
pesa alrededor de 90 gramos que contiene una nica y gran
semilla encerrada en una cscara dura. La forma del durazno es

generalmente semi-esfrica, con un surco longitudinal bien


marcado, de piel lisa o pubescente y un color amarillo, rojizo o
prpura. La pulpa suculenta es blanca, amarilla o rojiza y puede
estar adherida o separada de la nuez. Tiene sabor dulce y olor
perfumado, variando la intensidad de acuerdo a la variedad.
Entre las especies cultivadas en el Per tenemos: Huayco
rojo, huayco crema, nectarina, fortaleza, dixie red, entre las ms
importantes.
Su uso se da para el consumo humano directo y como
ingrediente para la industria de alimentos, bebidas, cosmticos.
Un durazno mediano, a pesar de su sabor dulce, no contiene
ms de 60 caloras, hecho que lo convierte en un postre ideal para
personas
sujetas
a
una
dieta
baja
en
caloras.
Enfermedades

de

durazno

en

el

Ecuador:

SISAGRO (2010) dice: Una de las causas que afecta el


rendimiento de este cultivo son los patgenos. Especficamente,
en lo que respecta a las enfermedades fngicas, los cultivos
nacionales de durazno se encuentran afectados bsicamente por
dos tipos de hongos: Taphrina deformans conocida tambin como
cloaca, la cual enrolla y daa las hojas y Monilinia spp., causante
de la podredumbre morena, conocida as por atizonar y podrir los
frutos.
En el pas, las variedades de Prunus persica como Conserveros y
Abridores, son susceptibles a contraer otras enfermedades
fngicas como Oidium, Tranzchelia pruni-spinoseae, conocida
comnmente como roya y Wilsonomyces carpophilus o tambin
conocido como Stigmina carpophila es el hongo caracterstico de
la enfermedad llamada tiro de municin, la cual causa
despigmentacin de hojas y fruto.

Per no es productor a gran escala del durazno fresco.

Se tiene conocimiento que es muy pequea la produccin


nacional y no hay registros nacionales que den cuenta de ello, sin
embargo se tiene el clima propicio para la produccin a gran
escala de dicho producto. El departamento de Ayacucho viene
siendo explorado por Sierra Exportadora en la produccin de
duraznos, se han desarrollado proyectos de produccin de
duraznos los cuales vienen generando resultados positivos.
Se brinda a continuacin detalle de la produccin nacional de
damasco, (Prunus armeniaca), al ser este fruto es muy parecido al
durazno (es casi redondo y con un surco de color amarillento a
naranja aunque a veces con tiras rojas en parte encarnadas,
aterciopelado, de sabor agradable y con hueso liso de almendra
generalmente amargo); produccin que se da en los
departamentos Moquegua, Tacna y Arequipa, siendo el primero, el
principal productor con 243 toneladas en el ao 2010.

Le sigue Tacna con una participacin de 22% y Arequipa con


4%.

Enfermedades

Podredumbre blanca de las races (Armillaria mellea), los


rboles con ms de cinco aos de edad que han sido infectados
por la enfermedad, muestran un crecimiento terminal pobre y hojas
de tamao reducido. El follaje puede permanecer verde hasta
mediados del verano, cuando todo el rbol colapsa y quedan las
hojas secas adheridas. Se presenta amarillamiento, marchitez y
muerte parcial de ramas y ramillas.

Marchites del durazno (Verticillium albo-atrum),


defoliacin de las ramas afectadas al principio del verano,
presencia de hojas blancas opacas antes de caer, puede afectar
toda la copa, un lado del rbol o limitarse a un lado de una rama,
provocando improductividad durante varios aos.

Agalla de corona (Agrobacterium tumefaciens), se


caracteriza por la presencia de agallas cerca del cuello y sobre
races primarias y secundarias. Cuando las agallas son jvenes la
superficie es suave y blanda, de color cremoso y ms o menos
esfricas, a medida que crecen se vuelven ms oscuras y de
consistencia leosa, superficie spera y agrietadas. Las agallas
miden de 0.5 hasta 30 cm de dimetro.

Cancro de tallo y ramas (Valsa leucostoma), las cnceres


en el tronco principal, horquetas de las ramas, ramas principales y
ramas viejas son el sntoma ms evidente de la infeccin, los
primeros sntomas se manifiestan con la presencia de gotas de
goma sobre las heridas que aparecen a inicios de la primavera, la
parte interna de la corteza comienza a degradarse de tal forma que
la superficie afectada se deshidrata.

Tiro de municin (Coryneum beijerinckii), ataca ramas,


yemas, hojas, flores y frutas. En los frutos se observan lesiones
circulares hundidas de color rosado o caf-rojizo, al envejecer
estas lesiones se tornan negras por la esporulacin del hongo.

Tiro
de
municin:
Esta enfermedad tambin afecta a las hojas y frutos, ocasionando

manchas de color purpura sobre hojas y frutos. El agente causal


es Wilsonomyces carpophilus o tambin conocido como Stigmina
carpophila.
La enfermedad generalmente comienza afectando hojas, sobre las
cuales se forma la mancha purpura y luego su parte central se cae
dejando orificio (tiro de municin). La enfermedad tambin
comienza a desarrollarse en ambientes secos calurosos en la
etapa de crecimiento y maduracin de fruto. La poca hmeda
favorece la infeccin a los frutos. El control debe realizarse desde
la etapa de cuajado hasta inicio de maduracin (Coca M, 2011).
Sntomas
Ledezma, F (2002) dice las yemas y ramillas son afectadas severamente
encondiciones de alta humedad y temperatura comprendida entre 5 a 26
C con una ptima de 15C. Las lluvias de primavera inducen la infeccin
del
follaje
y
los
frutos.
En las ramillas aparecen manchas circulares de color prpura de 2 a 3
mm de dimetro, cuyo dentro luego se oscurece, apareciendo en su
superficie ramilletes de esporas de color pardo oscuro. Si esta infeccin
es intensa se produce destruccin de ramilla en primavera y comienzo de
verano.
Las yemas afectadas adquieren un color castao oscuro y aparecen
cubiertas de goma. Frecuentemente en las lesiones presentes en ramillas,
yemas y frutos se encuentra este exudado gomoso (gomosis).
En hojas se presentan manchas de color prpura, a veces rodeadas por
un halo angosto verde claro, luego el tejido enfermo se necrosa,
separndose del sano que los rodea, dndole al follaje la apariencia tpica
de tiro de municin. La presencia del patgeno en ramillas, yemas o
frutos, es importante para tener un adecuado diagnstico, puesto que
estos sntomas tambin pueden ser provocados por otros agentes o ser
problema
de
nutricin
de
plantas.
1.2.2. Caractersticas y significado del problema

1.2.3. Delimitacin del problema


Interrogante esencial

2. Hiptesis

Los fungicidas, productos qumicos, tendrn alta eficacia sobre el


wilsonomyces carpophilus agente etiolgico del tiro de municin en cultivos de
durazno
3. Objetivos

Objetivo General:

Evaluar la eficacia de fungicidas sobre el tiro de municion en condiciones de


laboratorio

Objetivos Especificos:

Aislar al hongo fitopatogeno causante de la enfermedad en el rea foliar


Aislar e identificar la especie Wilsonomyces carpophilus a partir de muestras
foliares y de tallo
Determinar el control ms efectivo para el fitopatogeno causante del Tiro de
municin

4. DISEO DE INVESTIGACION

En esta investigacin Se utilizara diferentes diseos para cada tipo de


controlador

Para controladores qumicos:

Se utilizara un diseo completamente aleatorio en el cual


consideraremos 4 tratamientos con 5 repeticiones cada una; la unidad
experimental consiste en una placa de petri.

Para controladores biolgicos:

Los tratamientos seran distribuidos en un diseo completamente al


azar, con cinco repeticiones cada uno; la unidad experimental consiste en una
placa de petri.

5. VARIABLES
Variables independientes
o Trichoderma sp
o Pseudomonas sp.
o Streptomyces sp:
o Oregano:

Variables dependientes

Efecto controlador de los fungicidas y biocontroladores frente a


Wisonomyces carpophillus causante del Tiro de municin.

6. PROCEDIMIENTOS
6.1.
Toma de muestra
Para la recoleccin de muestras se extraer hojas del rbol de Prunus
persicum, que presenten los posible signos y sntomas que caracterizan a esta
enfermedad en diferentes reas de cultivo en el valle viejo de Calana. Luego
sern llevadas al laboratorio de Botnica de la Universidad Nacional Jorge
Basadre Grohomann para comprobar la presencia del hongo y su posterior
aislamiento mediante sembrado en agar y final reconocimiento.

La distribucin de las plantas en el terreno: estos diagramas describen


algunos de los patrones dentro del terreno que usted puede seguir para la toma
de sus muestras. Tomar muestra mnimo 8 submuestras/ha en la cantidad
propuesta, segn el cultivo, en la tabla anexa; luego mezclar, empacar y
rotular.

1. AISLAMIENTO DEL PATOGENO:


El aislamiento se realiz a partir de hojas de durazneros procedentes
de fundos del distrito a trabajar, las cuales mostraban sintomatologa del
tiro de municin. Las hojas se lavaron en agua corriente, se sumergieron
en una solucin de hipoclorito de sodio al 5 % durante 5 minutos, se
enjuagaron con agua destilada estril y se dejaron secar sobre papel
toalla para luego ser colocadas en la cmara de siembra (cmaras
hmedas). Luego se cortaron las hojas afectadas en pequeas porciones
las cuales se sembraron en placas Petri conteniendo medio nutritivo
Papa-Dextrosa- Agar (PDA). Las placas sembradas se incubaron a 25 C
por siete das, y por ultimo se obtendran placas con cultivo puro.

2. IDENTIFICACION DEL PATOGENO:


Se cogera un poco del micelio de los cultivos del hongo fitopatogeno
y se procedera a realizar la tecnica de la cina skoch, la cual consiste en
pegar la cinta al micelio formado por la colonia de hongos y adehirlo
sobre una gota de lactofenol inoculada en una lamina portaobjeto; se
extendera bien la cinta y se procedera a observar el microscopio.
Una vez ubicado las estructuras fructificativas se procedera
identificarlos basandonos en las claves de Barnett & Hunter.

3. PRUEBA DE PATOGENICIDAD:
La prueba de patogenicidad se realizar sobre plntula. El hongo se
cultiv en placas petri conteniendo PDA y luego se inocularan en suelo
previamente esterilizado con bromuro de metilo a razn de una placa petri
por cada cuatro kilogramo de suelo. El suelo inoculado se dejara incubar
por quince das, luego se distribuirn en macetas de un kilogramo cada
una donde se trasplantarn las plntulas de durazno. Se efectuaron riegos
interdiarios. La infeccin se acelerara a 6 horas a una temperatura de 25

C, y de las plantulas afectadas se procedera a reaislar el hongo tal como


se indic en el aislamiento.

4. CONTROLADORES:

4.1 PRUEBA DE FUNGICIDAS IN VITRO


Se evaluaran diversos fungicidas disponibles y de diversas
formulaciones, considerndose productos de contacto. Se utilizara el
mtodo del alimento envenenado, esto es, PDA licuado mezclado con
cada fungicida, por separado, a la dosis comercial recomendada; se
homogenizara la mezcla y se plaquear. Una vez solidificado el medio se
sembrara una rodaja de 0.8 cm del hongo crecido en PDA al centro de
cada placa petri. Las Placas sembradas se incubaran a 25 C por durante
siete das y diariamente se medir el dimetro de crecimiento. Los
fungicidas utilizados figuran en el siguiente cuadro, los cuales se
evaluaron con el
Diseo Completo al Azar (DCA), con 4 tratamientos y con 5
repeticiones por tratamiento.

TRAT
AMIENTO

NO
MBRE
COMER
CIAL

NOM
BRE
TCNICO

CONCE
NTRACION
EMPLEADA

TI
P
O

T1
OXICLOR
URO DE
COBRE

OXI
CLORUR
O
DE
COBRE

OXIC
LORURO
DE
COBRE

1g/100
ml

T2
FERBAM
76 WG

Ditio
carbamat
o

0,22g/
100ml

T3
CAPTAN
83 WP

cap
tan

ftala
mida

0,18g/
100ml

T4
Dithane
NT

ma
ncozeb

Ditio
carbamat
o

0,21g/
100ml

Te

4.2 PRUEBA CON BIOCONTROLADOREES



El control biolgico es el uso de organismos (o de sus metabolitos o
subproductos) que son enemigos naturales de una plaga o patgeno, con
el fin de reducir o eliminar sus efectos dainos en las plantas o sus

I.

productos. De manera similar al uso de gatos para controlar poblaciones


de ratones o el uso de bacterias benficas (como los lactobacilos) para
preservar alimentos o prevenir infecciones gastrointestinales, el control
biolgico de plagas y patgenos ha sido utilizado en la agricultura de
manera emprica desde sus inicios. La razn principal por la cual muchos
productos agrcolas no son destruidos completamente por las plagas y las
enfermedades es la presencia natural de agentes de control biolgico:
organismos capaces de antagonizar con las plagas o patgenos,
reduciendo sus efectos nocivos. El desarrollo y aplicacin de este
potencial de la naturaleza cobra cada vez mayor importancia, y
seguramente tendr un gran impacto en la agricultura en el futuro
cercano.
La seleccin de microorganismos benficos se basa principalmente:
1) en la habilidad de los antagonistas para colonizar rpidamente la
superficie de la fruta y las heridas y persistir en ellas en niveles efectivos,
2) en su capacidad para superar al patgeno en la adquisicin de
nutrientes y 3) en que sobreviva y se desarrolle bajo una amplia gama de
condiciones ambientales (Wisniewski y Wilson, 1992). Segn Wilson y
Wisniewski (1989) y Spadaro y Lodovica (2004) las caractersticas ptimas
que debe poseer un antagonista microbiano son las siguientes:
genticamente estable, efectivo a bajas concentraciones, no exigente en
requerimientos nutritivos, hbil para sobrevivir condiciones adversas del
medio ambiente, incluyendo refrigeracin y almacenamiento controlado,
efectivo para una amplia gama de microorganismos patgenos en una
variedad de frutas y hortalizas, fcil de producir y en medios de bajo
costo, fcil de manipular, resistente a los fungicidas, compatible con
procedimientos de procesos comerciales, no patognico en el hospedero
y que no produzca metabolitos secundarios dainos a la salud humana.
(Bautista-Baos, 2006)

MECANISMO DE ACCION:

Competencia por nutrientes: La competencia por nutrientes y espacio,


son los principales componen tes en el modo de accin de las levaduras
antagonistas. Por
ejemplo, en ctricos el control potencial de la levadura Pichia
guilliermondii en el sitio de infeccin se revirti mediante la adicin de
nutrientes exgenos (Arras et al., 1998). En ese estudio, la aplicacin de
bajas dosis de glucosa en las heridas del fruto previamente tratadas con
Pichia guilliermondii e inoculadas con Penicillium italicum aumentaron la
incidencia de la pudricin. Uno de los aspectos que respalda la teora de
la competencia por nutrientes esta estrechamente relacionada con
aspectos de la maduracin de los frutos, es decir que la disminucin de la
actividad del El control biolgico en la reduccin antagonista se reduce
drsticamente a medida que el fruto madura. Por ejemplo, en frutos de

II.

limn la habilidad de Pseudomona cepacia para disminuir el desarrollo de


Penicillium digitatum, se redujo a medida que el fruto cambi de
coloracin verde a amarilla, parmetro fisiolgico que indica un avance en
la maduracin (El Ghaouth et al., 2002).
Resultados similares se reportaron en naranjas y limones en donde la
efectividad antagonista microbiana de Candida saitoana fue mayor en
frutos de la primera estacin que en los de la estacin tarda (El Ghaouth
et al., 2000). Se cree que la disminucin en la actividad del antagonista se
debi al incremento en nutrientes disponibles como resultado de los
cambios bioqumicos asociados a la maduracin. (Bautista-Baos, 2006)
CONTROLES BIOLOGICOS QUE SE USARAN:

a) Trichoderma sp

aa) Localizacin del rea de estudio: El presente trabajo se realizara en el


laboratorio de Fitopatologa de la UNJBG Tacna.

ab) Microorganismos en estudio: Las cepas nativas de Trichoderma spp. se


obtendrn de suelo colectado en las 10 fundos de durazno infectadas
con Wilsonomyces carpophilus con grados de incidencias de hasta el
100%, ubicadas en la localidad de Santa Rita, municipio de Calana,
Tacna, Per. De cada sitio de muestreo se colectaran cinco
submuestras de 1 kg de suelo cada una, bajo el esquema del mtodo
cinco de oros (Figura 01), se mezclaran y homogeneizaran,
tomndose 1 kg como muestra representativa del sitio. Se considera
cada submuestra de suelo de los primeros 20 cm de profundidad,
eliminando la materia orgnica superficial (Michel, 2001).

Figura 01: Esquema de divisin de una superficie homognea a


muestrear y distribucin de los puntos de muestreo. Mtodo cinco de
oros.
Fuente: (Elizondo Barron & Castillo Tovar, 2012)

Los aislamientos en el laboratorio se realizaran directamente del suelo


por el mtodo de dilucin en placa. El suelo se diluye en proporcin
1/1000 (p/v), de esta suspensin, una alcuota de 0.5 mL se deber
dispersar uniformemente sobre la superficie de una placa Petri con el
medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA).

Las placas se incubaran a 25C, 12 h luz/oscuridad y 40% de humedad


relativa por siete das (Michel, 2001). En total se utilizaran 4 cajas Petri por
cada muestra de suelo bajo un diseo completamente al azar. Las
colonias se reconocern por su crecimiento rpido y las caractersticas
morfolgicas observadas al microscopio compuesto (Barnett y Hunter,
1972). Para cada muestra de suelo se aislaran y contabilizaran las
colonias que apareceran durante los 7 das despus de la siembra. De
cada aislamiento se realizaran cultivos monospricos. Las cepas se
mantendran a 25C en tubos inclinados con medio de cultivo PDA hasta su
uso.

Seleccin de cepas nativas de Trichoderma spp. Utilizando el mtodo


del papel celofn (Dennis y Webster, 1971)
Se elegirn los aislamientos de Trichoderma spp. con mayor habilidad
para inhibir el crecimiento del micelio de W. carpophilus.
Papel celofn estril y cortado a la medida de la caja Petri (9.0 cm de
dimetro) se debe colocar bajo condiciones aspticas sobre el medio de
cultivo PDA, inmediatamente se proceder a inocular cada caja en la parte
central con discos de 5 mm de dimetro de cada uno de los diferentes
aislamientos de Trichoderma spp. de 10 das de crecimiento. Despus de
la inoculacin, las placas se incubaran a 25C, 12 h luz/oscuridad y 40% de
humedad relativa por 2 das; pasado este tiempo, el papel celofn con el
crecimiento del hongo antagonista se deber retirar cuidadosamente para
evitar que esporas del hongo se desarrollaran sobre el PDA.
Inmediatamente se inoculara nuevamente el centro de esta misma
placa Petri con un disco de 5 mm de W. carpophilus. El cultivo se debe
incubar nuevamente a 12 h luz/oscuridad, 25C y 40% de humedad
relativa; el dimetro de la colonia se debe medir a los 8, 16 y 24 das
despus de la siembra, tiempo en el que el testigo deber cubrir
totalmente la placa. El nmero de tratamientos ser de 5 cepas de
Trichoderma spp. Obtenidas de las diferentes muestras de suelo,
distribuidos bajo un diseo completamente al azar con cuatro
repeticiones. La variable a considerar ser el porcentaje de inhibicin del
crecimiento del micelio de W. carpophilus, calculado con la siguiente
formula:

%inhibicin = [(D1 - D2) / D1] x 100 (Worasatit et al., 1994)

Dnde:
D1 = dimetro de la colonia de W. carpophilus creciendo en placas con
PDA libre de inhibidores.
D2 = dimetro de la colonia de W. carpophilus creciendo en placas
donde antes creci Trichoderma spp. sobre el papel celofn.

Actividad antagnica de Trichoderma spp. Sobre Wilsonomyces


carpophilus
Se utiliz la tcnica de Cherif y Benhamou (1990). Para cada
tratamiento en placa Petri con PDA se deposit en un extremo de la caja
un disco de 5 mm de dimetro con micelio activo de colonias fungosas de
un mes de edad de W. carpophilus, se dejara desarrollar por un perodo de
16 das por su crecimiento lento. Transcurrido este tiempo, en el otro
extremo de la caja se depositaran discos de 5 mm de Trichoderma spp.
incubndose a 25C, 12 h luz/oscuridad y 40% de humedad relativa. Se
tomaran lecturas cada 24 h para determinar el nmero de das al primer
contacto entre las hifas de los dos hongos. A los 15 das despus de la
siembra de Trichoderma spp. se clasificara el tipo de antagonismo segn
Bell et al. (1982)

TIPO
DE
ANTAGONISMO
1

OBSERVACION
Trichoderma sobrecrece
completamente al patgeno
y cubre totalmente la
superficie del medio
Trichoderma sobrecrece
las dos terceras partes de la
superficie del medio
Trichoderma y el
patgeno colonizan cada
uno aproximadamente la
mitad de la superficie y
ningn organismo parece
dominar al otro
El patgeno coloniza las
dos terceras partes de la
superficie del medio y
parece resistir a la invasin
por Trichoderma
El patgeno sobrecrece
completamente a
Trichoderma y ocupa la
superficie total del medio

El nmero de tratamientos para esta prueba corresponder a las tres


cepas de Trichoderma spp. seleccionadas con el porcentaje de inhibicin
del micelio de W. carpophilus mas alto, distribuidos bajo un diseo
completamente al azar con cuatro repeticiones.


Anlisis estadstico:
Los datos obtenidos para cada uno de los ensayos se someteran a un
anlisis de varianza y una prueba de comparacin de medias de Tukey (P
= 0.05), con el paquete estadstico SPS (2010). En el caso de los datos en
porcentajes, antes de someterlos al ANOVA y prueba de Tukey, se les
realizara la transformacin angular de X + 0.5

b) Pseudomonas sp.

ba) Localizacin del rea de estudio: El presente trabajo se realizara en el


laboratorio de Fitopatologa de la UNJBG Tacna.

bb)Microorganismos en estudio: Para el aislamiento de cepas ambientales


se partira de muestras de agua y tierra recogidas en el entorno
hospitalario, que fueron tranportadas al laboratorio donde se
procesaran de la siguiente manera:

Se inocula medio TSB (1:10) con cada una de las muestras


recogidas y se incubaran durante 24 horas a 37 C (Enriquecimiento
de las muestras).
Los cultivos enriquecidos se utilizan para inocular de GSP Agar,
mediante la utilizacin de un hisopo esteril.
Las placas de GSP se incuban durante 24 horas a 37 C, y las
colonias a obtener sern resembradas e identificadas.
Las colonias de color azul violeta (presunta Pseudomonas spp) sern
aisladas e identificadas siguiendo mtodos microbiolgicos estndar.
Una vez aislado el antagonista. Se preparara 1 Erlenmeyer con 150mL
de caldo
nutritivo (HIMEDIA Nutrient agar ) estril .Se incub a temperatura
ambiente por cinco das. Para la preparacin del grupo antagonista en
solucin se sembraran 50mL de caldo previamente inoculado con el
antagonista con un tiempo de crecimiento de 72 horas y se incubara a
temperatura ambiente durante 5 das. Luego se realizara el recuento de las
UFC/mL.

Actividad antagnica de Pseudomonas spp. Sobre Wilsonomyces


carpophilus:
Para estudiar el efecto del antagonista sobre el crecimiento de W.
carpophilus en medio slido (placa petri) se utilizara el mtodo KirbyBauer o difusin en agar, donde se sembrara por extensin con esptula
de Drigalsky en tres placas de agar Sabouraud, 0,1 mL de cada
fitopatgeno con una concentracin de 102 UFC/mL. Inmediatamente, se
tomaron discos de papel de filtro de 5mm de dimetro con una pinza
estril y se sumergira en la suspensin del antagonista a una

concentracin de 102 UFC/mL, para luego sembrarse sobre las placas. Se


incubara durante cinco das a temperatura ambiente.

Anlisis estadstico:
Los datos obtenidos para cada uno de los ensayos se someteran a un
anlisis de varianza y una prueba de comparacin de medias de Tukey (P
= 0.05), con el paquete estadstico SPS (2010). En el caso de los datos en
porcentajes, antes de someterlos al ANOVA y prueba de Tukey, se les
realizara la transformacin angular de X + 0.5

c) Streptomyces sp:
Las bacterias de gnero Streptomyces son muy abundantes en el
suelo.
Muchos miembros de esta familia prefieren los suelos neutros o
alcalinos. Otros utilizan suelos cidos como hbitat natural. Se los
encuentra entre los principales productores de compuestos bioactivos y
de enzimas extracelulares. Pueden liberar a su entorno enzimas que le
permiten utilizar materiales orgnicos como algodn, lana, hidrocarburos
y goma. Adems pueden degradar polmeros naturales como lignina
(Anderson y Wellington, 2001; Madigan, 2005; Kmpfer, 2006).
Su efectividad como agente de biocontrol ha sido probada contra
bacterias, hongos y algunos protozoos y nematodes (Dicklow y col., 1993;
Coelho y col., 1995; Trejo-Estrada y col., 1998; Kim y col., 1999;
Ouchdouch y col., 2001).

ca) Localizacin del rea de estudio: El presente trabajo se realizara en el


laboratorio de Fitopatologa de la UNJBG Tacna.

cb) Microorganismos en estudio:

Aislamiento, recuento e identificacin de Streptomyces:


El aislamiento de cepas de Streptomyces se realizara utilizando la
tcnica de Panthier y col. (1979) a partir de muestras de suelo (campos de
produccin de cereales, campos sin labranza y huertas orgnicas) del
Distrito Calana, provincia de Tacna.
Las muestras de 10g de suelo seran molidas en mortero estril
adicionando una pequea alcuota de agua. Este homogenizado sera
transferido a un erlemeyer con 90ml de agua fenolada. La suspensin
debe agitarse 10min en agitador mecnico (110 golpes/min). Se realizaran
diluciones sucesivas 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 en agua. Alcuotas de 100l de
cada una de ellas seran sembradas sobre placas de APD adicionado con
cicloheximida (200mg/l). Las placas se incubaran a 28C durante 7 das.
Se debe realizar el estudio macro y micromorfolgico de las colonias
desarrolladas.

Aquellas que presenten caractersticas compatibles con el gnero


Streptomyces seran inoculadas en APD e incubadas durante 7das a 28C.
Se realizaran suspensiones de esporos en caldo PD adicionado con
glicerina en csp 20% V/V. Las suspensiones deben conservarse a -20C
para estudios posteriores (Korn-Wendisch y Kutzner, 1992; Williams y col.,
1989).

Ensayos de interaccin Streptomyces W. carpophilus:


Cada uno de los Streptomyces aislados se sembrara por estras en
placas de APD e incubado 48h a 28C. A cada una de las placas se les
inoculara por rociado con una suspensin 106conidios/ml de cada HT/HP.
Luego de 7 das de incubacin a 28C se registra el dimetro de las zonas
de inhibicin (Z) producidas por los Streptomyces sobre el desarrollo de
las cepas fngicas (Fig 02).

FIGURA 02: Esquema BC para ensayar la actividad biolgica de P

Ensayos de interaccin BAL-HT/HP/Streptomyces:


Las cepas de BAL, conservadas a -20C, seran repicadas a caldo MRS
e incubadas a 30C toda una noche. A partir de tales cultivos se sembraran
estras de 2 cm de longitud sobre placas de agar MRS que se incubaran
48h a 30C en anaerobiosis. Dichas placas fueron luego cubiertas con una
preparacin de APD soft conteniendo 105conidios/ml de cada uno de los
HT/HP/Streptomyces. Las placas seran luego incubadas aerbicamente a
30C por 5 das determinndose en ese momento el dimetro de la zona de
inhibicin (Z) alrededor de las estras (Fig 02) (Magnusson y Schnurer,
2001).

d) Oregano:

da) COLECTA DEL MATERIAL VEGETAL:

Las hojas de organo (Origanum vulgare) sern colectados en predios


de CPM. Los Palos, Tacna, Per los cuales sern trasladados en bolsas de
plstico al Laboratorio de Qumica Orgnica, Facultad de Ciencias, UNJBG
para la preparacin del extracto.

db) OBTENCIN DE EXTRACTO VEGETAL:


Se emplearan 300 g de material fresco por litro de solvente. Se
obtendr el hidrolato del organo.

dc) METODO:
Hidrolato por destilacin: para el proceso de extraccin se utiliz el
material vegetal fresco, bien picado y macerado, en un solvente que
consiste de una solucin de agua y alcohol etlico (10:1). Para obtener el
extract se emplea un destilador adaptado para este fin. El material
vegetal se coloc dentro de la marmita del destilador junto con el
solvente, se tap hermticamente para hacer el proceso de extraccin
continuo mediante la aplicacin de calor y presin constante, el vapor fue
conducido a un condensador y mediante enfriamiento con agua corriente
se obtuvo el hidrolato.

dd) DISEO EXPERIMENTAL:


Los tratamientos seran distribuidos en un diseo completamente al
azar, con cinco repeticiones cada uno; la unidad experimental consiste en
una placa de petri. En todas las pruebas se incluy un testigo absoluto.
Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, a los datos
obtenidos se les practicara un anlisis de varianza y la prueba de
comparacin de Tukey al 5%.

5. PRUEBA DE FUNGICIDAS EN INVERNADERO:


Se realiz despus de seleccionar los fungicidas en la prueba in
vitro. Para esto se procedi dela siguiente manera:

a. Preparacin del sustrato:


El sustrato, suelo arena (1:1), fue esterilizado con bromuro de metilo.
Luego de quince das de ventilado se humedeci a capacidad de campo
para la inoculacin.

b. Preparacin del inculo:


El hongo, W. carpophilus, se sembrara en placas petri con PDA y de
all se sembr en medio lquido caldo de Papa-Dextrosa-Oxitetraciclina
(PDO) previamente esterilizado. Despus de 30 das de incubacin a 25
C, se licu a baja velocidad para fragmentar el micelio y homogenizar la
mezcla.

7.

o
o

c. Preparacin de las semillas:


Las plntulas de durazno se desinfestaran con los fungicidas
seleccionados en la prueba in vitro a la dosis comercial recomendada.
Las plntulas del testigo no fueron tratadas con fungicida alguno.

d. Inoculacin:
La inoculacin del sustrato se realizara agregando 10 cc. de licuado
por cada kilogramo de suelo estril, el cual se distribuy en bolsas
plsticas transparentes de poliestireno y se dejaran incubar a la sombra
por un periodo de 30 das con la finalidad de que el hongo se establezca
en el sustrato.

e. Siembra:
El suelo inoculado e incubado se distribuy en macetas de un
kilogramo y se sembraron las plntulas desinfestadas. Se emple el
Diseo Completo al Azar con 9 tratamientos (plntulas desinfectadas) y un
testigo (plntulas sin desinfectar), con cinco repeticiones cada uno. En
cada repeticin se sembraron aproximadamente 1 plntula.

f. Evaluaciones:
Las evaluaciones de realizaran a los treinta das, midindose los
siguientes parmetros: hojas con sntoma y hojas sin sntomas

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

PDF:

Coca Mario. Boletn tcnico Enfermedades del fruto en durazno. Recuperado el


25
de
septiembre
de
2013
de:
http://www.agr.umss.edu.bo/documentos/754852294ARCHIVOSI.pdf
Desmond R. Layne y Daniele Bassi. The Peach: Botany, production and uses.
Biddles: Kings Lynn. 2008.
Dr. Victor Manuel Coria Avalos, Dr. Jose Luciano Morales Garcia, Ing. Juan Jose
Alcantar Rocillo. ENFERMEDADES DEL DURAZNO Prunus prsica (L.) Batsch.
EN MICHOACAN.
F.T. Arroyo; J.F. Herencia; C. Santamara; M. Castejn; A. Daza. INCIDENCIA DEL
CRIBADO EN DIFERENTES CULTIVARES DE CIRUELO JAPONS EN CULTIVO
ECOLGICO. IFAPA Centro Las Torres-Tomejil. Junta de Andaluca - Espaa.
Ing. M Sc. Cadenas. Universidad Nacional Agraria la Molina. FITOPATOLOGIA
GENERAL. Dpto. Academico de Entomologia y Fitopatologia.

o
o

o
o
o

Ing. Luis Miguel Colonia Coral. Universidad Nacional Agraria la Molina. MANEJO
INTEGRADO DE PLAGAS EN EL CULTIVO DE MELOCOTN. Pichupampa
Leoncio Prado Huaura Lima, Peru 2012.
Ing. Vladimir Humberto Baza Avelar. Programa Nacional de Frutas de El Salvador.
GUA TCNICA DEL CULTIVO DEL MELOCOTN. Santa Tecla, El Salvador,
octubre de 2004.
Ing. Agr. Walter Nievas, INTA - EEA Alto Valle - Coord. del rea Desarrollo Rural,
wnievas@correo.inta.gob.ar. Ing. Agr. Carmina Besada, INTA - AER Valle Medio Cambio Rural, cbesada@correo.inta.gob.ar. EL CULTIVO DE DURAZNEROS Y
PELONES EN EL VALLE MEDIO DEL RIO NEGRO. Argentina, septiembre 2012.
Klever M.Garcia Snchez. "MANUAL CULTIVO DE DURAZNO" EN LAS
PROVINCIAS DE HUANUCO y PACHITEA 2013.
Milagro Mata H. Loengrin Umaa T. Jose Luis Chaves C. PROTOCOLO PARA LA
RECOLECTA, DESCRIPCION, IDENTIFICACION Y MANTENIMIENTO DE
HONGOS. Museo Nacional de Costa Rica. Agosto, 2006.
Organismo Pblico Sierra Exportadora. DURAZNO FRESCO. Lima Per

Pginas web:

http://www.sinavimo.gov.ar/plaga/wilsonomyces-carpophilus
http://www.infoagro.com/frutas/frutas_tradicionales/melocoton2.htm
http://www.larepublica.pe/07-03-2013/no-se-exporta-durazno-de-calana-por-bajaproduccion

02 de Setiembre del 2014

Firma de los alumnos


Firma del Asesor de
Tesis

You might also like