Dissertação Parte3

Avaliao da qualidade higio-sanitria da carne de frango: pesquisa de Listeria monocytogenes por PCR
Introduo
A segurana alimentar tem vindo nestes ltimos anos a adquirir enorme relevncia
no domnio da sade pblica. Os alimentos muitas vezes funcionam como fonte de
bactrias causadoras de doena para os animais e pessoas.
A carne de frango, tem nos nossos dias uma grande representatividade na
alimentao humana por se tratar de um alimento cujo preo relativamente baixo,
nutricionalmente equilibrado, fcil de confeccionar e de sabor muito agradvel. Alm
do vulgar consumidor, este tipo de alimento tambm muito utilizado na alimentao
de grupos mais susceptveis, como sendo idosos, crianas e doentes, o que implica a
necessidade de padres de segurana ainda mais elevados.
Uma das bactrias patognicas que pode contaminar as carcaas de frango,
Listeria monocytogenes, sendo causadora de infeces localizadas e generalizadas,
particularmente grave em grupos vulnerveis.
Listeria monocytogenes actualmente motivo de grande preocupao por estar
associada a infeces de origem alimentar, veiculada por vrios tipos de alimentos
nomeadamente pela carne de frango.
A verdadeira situao nacional quanto presena de Listeria monocytogenes em
frango, bem como relativamente aos casos de listeriose associada, bastante
escassa ou inexistente, e para isso, muito contribui o facto de esta doena no ser de
declarao obrigatria em Portugal nem existir nenhuma rede de alerta.
Os mtodos convencionais para a deteco de L. monocytogenes nos alimentos
obrigam a trabalho intensivo e moroso, (Rodriguez-Lzaro, Jofr, Aymerich, Hugas &
Pla, 2004), o que levou procura de novas metodologias mais rpidas e mais
sensveis, onde se incluiem metodologias moleculares como a reaco em cadeia da
polimerase (PCR).
Perante a importncia scio-econmica que representa a carne de aves, em
particular a de frango, e pelo facto de no existirem dados recentes respeitantes ao
grau de contaminao da carne de frango por L.monocytogenes, foi objectivo
primordial deste trabalho fazer essa avaliao em amostras de peito de frango
provenientes de um matadouro industrial e em simultneo validar a metodologia
alternativa baseada em PCR utilizada para a deteco de L.monocytogenes.
O trabalho constitudo por uma reviso bibliogrfica, em que referida a
importncia do sector avcola mundial e nacional, perspectivas futuras deste sector, e
o abate como factor importante da qualidade microbiolgica das carcaas. Faz-se
tambm uma abordagem acerca da bactria Listeria monocytogenes, da doena por
ela causada e dos riscos associados aos alimentos. Por fim descrevem-se as
1
diferentes metodologias passveis de detectar esta bactria em alimentos, bem como

as dificuldades inerentes s matrizes alimentares.
O trabalho experimental foi dividido em dois grupos. Num primeiro grupo
determinou-se o teor de Enterobacteriaceae, como factor adicional de avaliao higiosanitrio das amostras, tendo em conta o dia de abate, o sistema de produo e a
explorao de origem dos diferentes bandos. Descrevem-se os mtodos utilizados e
discutem-se os resultados obtidos, com a finalidade de se detectar ou no relao
entre as variveis descritas anteriormente e as contagens de Enterobacteriaceae.
O segundo grupo foi dividido em dois sub-grupos, um primeiro em que se avalia a
sensibilidade da metodologia molecular da reaco em cadeia da polimerase (PCR)
adoptada para este trabalho na deteco de Listeria monocytogenes, inoculando-se
para isso amostras de peito de frango e um segundo sub-grupo em que avaliada a
presena de Listeria monocytogenes em amostras de peito de frango colhidas em
matadouro industrial, atravs da metodologia clssica e em simultneo pela utilizao
de PCR. Discutem-se os resultados, a metodologia e fazem-se as comparaes com
os resultados obtidos por outros autores. Por ltimo, descrevem-se as concluses
finais e as perspectivas futuras.
Reviso bibliogrfica
1. Importncia do sector avcola mundial e nacional. Perspectivas de futuro
Existe consenso por parte de consumidores, mdicos e nutricionistas, de que a
carne de aves mais saudvel que a carne vermelha por conter menos gordura
saturada, apontada actualmente como a grande responsvel por problemas
cardacos. Ao contrrio de outras carnes, a carne de aves possui nveis reduzidos de
gordura intramuscular, estando a maior parte da gordura localizada subcutaneamente
e por isso fcil de remover (Alvarado, 2006; Meira, 2002). Alm de saudvel, um
alimento altamente nutritivo. Cem gramas de carne de peito sem pele contm apenas
110 kcal e 23 gramas de protena, e com esta quantidade o consumidor satisfaz 46%
de suas necessidades dirias de protena (Meira, 2002). A carne de frango barata
relativamente s restantes, atributo fundamental no momento da compra. As
caractersticas nutricionais e tecnolgicas da carne de aves fazem com que seja uma
ptima opo para a alimentao de grupos populacionais de risco, tais como idosos,
doentes, crianas e grvidas.
O aumento do consumo deste tipo de carne deve-se evoluo da tecnologia e
integrao da produo de forma vertical, que diversificou a oferta de forma criativa
conseguindo chegar a mais segmentos de mercado, expandindo assim a produo e
aumentando a importncia do sector e os respectivos lucros (Lima, 2008a),
estimando-se que continue a aumentar dada a ptima relao preo / qualidade /
produto saudvel (Lima, 2008b).
A indstria avcola deixou de fornecer apenas carcaas inteiras para consumo
domstico, para comear a desmanchar as aves e vender sob diferentes
apresentaes, embaladas em atmosfera modificada quer para o mercado domstico
quer para exportao (Lues, Theron, Venter & Rasephei, 2007). Consequentemente,
o sector avcola aumentou a taxa de produo tendo para isso recorrido
mecanizao completa e automatizao da linha de abate; em muitos casos os
matadouros conseguem abater 12.000 aves por hora (Gksoy, Kirkan & Kk, 2004).
Alm dos factores nutricionais, baixo custo e diversificada oferta referidos
anteriormente, temos o factor segurana, continuando os consumidores europeus a
confiar na carne de aves (AVEC, 2008).
O consumo de carne de frango tem aumentado consideravelmente ao longo dos
ltimos 40 anos, apresentando em 2005 a nivel mundial um valor mdio de 12,4
kg/habitante nos Estados Unidos da Amrica, enquanto na Europa no mesmo ano o
consumo mdio foi de 23,2 kg/habitante. Este perodo foi acompanhado pelo aumento
do n de aves abatidas a nvel dos principais pases produtores de aves (GPP, 2008).
Em Portugal, a produo de aves de capoeira registou um crescimento sustentado
nas ltimas duas dcadas, em volume e em valor (GPP, 2008), apesar das
dificuldades e riscos que enfrenta. O sector avcola tem mantido uma dinmica
aprecivel, tornando-se competitivo a nvel europeu e assegurando 95% do
fornecimento de carne e ovos do pas (Lima, 2008b; Soares, 2008).
O consumo de carne de aves no nosso pas, foi afectado em 2003 pela crise dos
nitrofuranos (decresceu 12,7%). Aps esta crise, a produo de aves cresceu 7% no
ano de 2004 (de 208 652 em 2003 para 222 737 em 2004) e 1,5% em 2005 (Tabela 1)
(GPP, 2008). Mais tarde em 2005 foi afectada pela gripe aviria, que embora no
tendo sido registado qualquer caso nacional, teve um impacto negativo no
consumidor. As frequentes notcias relativas gripe das aves desde Outubro de 2005
na Europa, levaram a uma quebra no consumo e nos preos da carne de aves
obrigando a industria avcola nacional a reduzir a oferta de forma a tentar equilibrar o
mercado, tomando medidas restritivas de produo e provocando a sua diminuio
em 2006 (INE, 2006).
Ano (toneladas)
Meses
2001
2002
2003
2004
2005
Janeiro
16 311
17 468
16 923
15 882
15 082
Fevereiro
19 771
18 489
18 238
18 614
16 981
Maro
18 150
19 559
18 284
18 705
17 142
Abril
21 538
19 625
16 111
17661
17 581
Maio
20 957
20 291
15 289
20467
18 526
Junho
23 111
21 649
16 461
20829
19 518
Julho
21 756
20 958
17 814
18902
20 719
Agosto
21 465
20 688
19 418
18062
19 579
Setembro
23 474
21 211
19 066
19312
20 511
Outubro
19 251
20 418
17 160
18596
19 810
Novembro
19 941
20 201
17 501
19330
20 917
Dezembro
17 267
18 561
16 387
16377
19 707
Total
242 992
239 118
208 652
222 737
226 073
Tabela 1: Produo da carne de frango (toneladas) registada entre 2001 e

2005 (adaptado de GPP, 2008).
As fortes medidas de combate e vigilncia da gripe aviria empreendidas por

Portugal e o seu controlo a nvel europeu e mundial, fizeram com que o consumidor
voltasse a ganhar confiana neste alimento, observando-se uma tendncia crescente
de consumo reflectida no aumento do nmero de aves abatidas nos anos de 2006 a
4
2008 (Tabela 2). Em 2008, observa-se um aumento da produo e do abate de aves,

quando comparado com o ano anterior (INE, 2008).
A produo de carne de frango em Agosto de 2008 registou um aumento de 8,1%
(22,1 mil toneladas) relativamente produo no ms homlogo de 2007 (INE, 2008).
Ano
Jan
Fev
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Set
Out
Nov
Dez
Total
Cabeas
2006
12210
10522
13105
11204
12605
13074
13415
15683
13142
13411
12767
154192
1000 n
2007
13856
11792
13140
12846
14257
13570
15303
16845
15143
14005
13328
167677
2008
14706
13398
13581
15023
14617
17096
Frangos
de carne
Tabela 2: Frangos de carne abatidos e aprovados para consumo pblico em Portugal

nos anos de 2006, 2007 e 2008 (adaptado de INE, 2008).
A integrao vertical da produo, a qual significa que a mesma empresa ou grupo

econmico possuem vrias ou a totalidade das etapas produtivas que vo desde a
produo do pinto at ao produto final pronto a ser consumido, tem permitido uma
uniformizao da produo e um aumento das margens de lucro (Alvarado, 2006).
Portugal tem que dispr de polticas estruturais que garantam a sua
competitividade em mercado aberto, interna e externamente. As polticas de crescente
liberalismo do mercado com exigncias desiguais relativamente a pases concorrentes
fora do espao comunitrio como o Brasil, EUA, Chile, Argentina e Tailndia, podem
causar perdas de rendimento importantes no espao Europeu e em Portugal (Lima,
2008c). Ainda este ano, a Unio Europeia (UE) corre o risco de perder a sua autosuficincia no sector da carne das aves. A produo no espao comunitrio obriga a
produes
responsveis,
cumpridoras
de
legislao
exigente
ao
nvel
de
licenciamento, do bem-estar animal, da sanidade e da higiene, com responsabilidade

social o que encarece a produo relativamente a pases terceiros onde estas
obrigaes no existem. Sabemos, que actualmente o principal factor de deciso do
consumidor o preo, e os operadores da moderna distribuio pressionam a
industria avcola a baixar o preo ou ento recorrem importao de carne de pases
como o Brasil, Tailndia ou Chile (Lima, 2008b). Nan Dirk Mulder, perspectiva que o
consumo de carne de aves continuar a aumentar nos prximos anos, mas com
quebras de resultados financeiros na UE, devido ao aumento dos custos de produo
(AVEC, 2008). O saldo da balana comercial (Figura 1) apresenta valores negativos,
com um dfice mdio de 29 milhes de euros, que aumentou 130% de 2000 at 2007
e com aumento das importaes em 94% (em volume) essencialmente no subsector
da carne de peru. O valor mais elevado dos ltimos oito anos, 46,4 milhes de euros,
registou-se em 2007 (Lima, 2008a).
O futuro da produo avcola nacional e europeia passa pela garantia, por parte
das autoridades, da sustentabilidade do sector, atravs de preos de mercado
competitivos, garantia da sade pblica e em simultneo pela exigncia, a todos os
intervenientes no mercado, de respeito pelas mesmas regras no exerccio da
actividade (Lima, 2008a).
O sector avcola no conseguir fornecer por mais tempo aos consumidores
europeus carne de aves alimentadas com matrias-primas importadas e os
consumidores iro ser confrontados com carne importada, de aves que foram
alimentadas com variedades de organismos geneticamente modificados (OGM) no
autorizados na UE (AVEC, 2008).
Figura 1: Evoluo da balana de pagamentos no sector da carne das aves, em

volume (adaptado de GPP, 2008).
2. Sistemas de produo de aves

O frango biolgico um sistema de produo cujas aves tm acesso a espao
ao ar livre sempre que as condies metereolgicas o permitam, sendo necessria
uma rea exterior de 4 m2/frango de engorda (no excedendo o limite de 170 kg/ de
N/ ha/ ano, em que N corresponde a cabeas normais e igual a 0,013 para frangos).
O efectivo no pode ultrapassar as 4800 frangos e os 10 animais/m2 de rea interior
com um mximo de 21 kg de peso vivo/m2 de pavilho. A idade de instalao dos
pintos no pode ultrapassar os 3 dias e a de abate no pode ser num perodo inferior
a 81 dias (Socampestre, 2004; Regulamento CE n. 889/2008).
O frango do campo, denominao comercial do frango produzido em regime
extensivo, criado ao ar livre, alimentado com raes com um mnimo de 70% de
cereais sendo a produo e o abate controlados de forma especfica pelas
autoridades. Os pavilhes tm uma rea de 200 m2 e uma rea de 2 m2/frango. O que
distingue o frango do campo do frango industrial a alimentao, mas tambm o
tempo de vida: os primeiros so abatidos ao fim de 81 dias de criao, enquanto os
outros ao fim de 38-40 dias (Socampestre, 2004).
3. Abate e desmancha de frango

A operao de abate, contempla todas as etapas que vo desde a chegada das
aves ao matadouro at carcaa ou parte dela estar pronta a sair para a distribuio.
O processo de abate de aves determinante na qualidade final da carne pois cada
etapa tem enorme influncia nas suas caractersticas higinicas e tecnolgicas.
Assim, um bom entendimento do processo pode ser de extrema importncia para um
abate bem sucedido do qual resultem carcaas e derivados de altssima qualidade.
Este processo pode ser dividido em vrias etapas (Veloso, 2007).
3.1.
Perodo que antecede o abate
3.1.1. Jejum
As aves devem deixar de ter acesso ao alimento cerca de 8 -12 horas antes do
abate, mas mantendo-se disponvel a gua. O impedimento do acesso alimentao
antes do abate ir provocar o esvaziamento do contedo intestinal, o que diminui a
quantidade de fezes excretadas durante o transporte, reduz as excrees fecais ante
mortem e reduz a contaminao transversal fecal durante a eviscerao, evitando
assim que ocorra contaminao pelo contedo fecal das carcaas, gua do escaldo,
depenadoras e ainda do pavimento das jaulas (Hinton, Buhr & Ingram, 2000; Veloso,
2007).
Se o jejum for inferior a 8 horas, facilmente poder ocorrer ruptura do intestino
durante a eviscerao com consequente conspurcao das carcaas por bactrias
causadoras de infeces de origem alimentar tais como Salmonella, Campylobacter,
Listeria monocytogenes (Cox, Bailey & Berran, 1997) presentes na matria fecal
destes animais. Por outro lado se o jejum ocorrer durante um perodo muito longo,
podem surgir consequncias negativas em termos de qualidade do produto final
sendo que a partir da sexta hora de jejum se verificam perdas de 0,2 a 0,5 % do peso
da carcaa por cada hora excedente, devido a catabolizao do tecido corporal
(Veerkamp, 1978).
Uma das defesas das aves contra a colonizao do tubo digestivo por bactrias
patognicas, o pH baixo, a presena de microflora bacteriana nativa produtora de
cido lctico e produo de cidos gordos com actividade anti-bacteriana. O jejum vai
remover os hidratos de carbono fermentveis de que as bactrias produtoras de cido
lctico necessitam para o seu crescimento e produo de cido. O jejum causa assim
uma diminuio na populao das bactrias produtoras de cido lctico e um aumento
no pH intestinal. O baixo pH produzido pelos subprodutos metablicos destas
bactrias foi associado inibio do crescimento de Escherichia coli. Durante o jejum,
h por isso uma reduo da capacidade de inibir o crescimento de Enterobacteriaceae
o que permite uma estabilizao ou um aumento do nmero de Salmonella e outras
Enterobacteriaceae, e assim se o perodo de jejum for prolongado, podem aumentar
as bactrias patognicas (Hinton et al., 2000).
3.1.2. Captura
A apanha das aves deve ocorrer durante o perodo de jejum, tendo presente que
esta etapa pode ter grande influncia na qualidade da carne bem como no aspecto da
carcaa no final do processo de abate. O stress resultante da apanha das aves um
factor determinante de qualidade da carne e por isso ela dever ser rpida,
agrupando-se o lote e sendo efectuada pelos apanhadores com as duas mos de
modo a abranger o dorso e as asas do frango. Os traumatismos tambm podem ser
consequncia desta etapa e correspondem a 20% a 30% da totalidade das rejeies
post mortem (Alvarado, 2006; Veloso, 2007).
3.1.3. Transporte
O transporte desde a explorao at ao matadouro, e a sua influncia sobre os
animais depende do tipo de conduo, da distncia a percorrer, do horrio em que
feito e do nmero de aves por jaula, bem como do nmero de filas de jaulas. Todos
estes factores tm implicaes importantes nas carcaas e na carne com perdas
qualitativas e quantitativas (Warriss, Bevis, Brown & Edwards, 1992; Nijdam, Arens,
Lambooij, Decuypere & Stegeman, 2004). O dimensionamento das unidades de
transporte dada em funo do peso dos animais a transportar (Tabela 3), de acordo
com o Regulamento (CE) n. 1/2005 do Conselho, de 22 de Dezembro de 2004,
relativo proteco dos animais durante o transporte e operaes afins e que altera
as Directivas 64/432/CEE e 93/119/CE e o Regulamento (CE) n. 1255/97.
O transporte deve acontecer durante a madrugada, o que assegura temperaturas
mais baixas e assim reduo do stress pelo calor. Quanto maior a distncia a
percorrer durante o transporte das aves, maiores taxas de mortalidade sero
esperadas e menor ser a qualidade da carne (Warriss et al., 1992; Alvarado, 2006).
rea em cm2 *
Categoria
Pintos do dia
Aves de capoeira que no sejam pintos do dia:
21 25 por pinto
2
rea em cm por kg*
<1,6 kg
180 200
1,6 a 3 kg
160
3 a 5 kg
115
> 5 kg
105
*Estes valores podem variar em funo no s do peso e do tamanho das aves de capoeira, mas
tambm do seu estado fsico, das condies meteorolgicas e da durao provvel da viagem.
Tabela 3: reas mnimas de cho e densidades aplicveis ao transporte de aves de

capoeira em contentor, de acordo com o Regulamento (CE) n. 1/2005.
Durante o transporte, o stress causado leva a alteraes dos padres de excreo

dos portadores de Salmonella, atravs da alterao da funo intestinal (Davies &
Board, 1998).
3.1.4. Repouso e Descarga

O repouso dever ser de algumas horas, as quais so contabilizadas no perodo
de jejum. Durante este tempo, as aves podem ser pesadas e determinados alguns
parmetros tais como peso mdio e desvio relativamente ao peso mdio das aves
com a mesma idade, sendo estimado o ndice de converso do bando o qual pode
ajudar a avaliar o maneio produtivo e a existncia de doenas no bando. Um repouso
insuficiente pode conduzir a dificuldades na depena por contraco do folculo da
pena (Veloso, 2007).
Depois da chegada ao matadouro, as jaulas com as aves devem ser colocadas
em local protegido das condies climatricas adversas e com ventilao adequada
para recuperarem do stress associado ao transporte. O perodo que decorre entre a
introduo da primeira ave na jaula (na explorao) e a retirada da ultima ave da jaula
(no matadouro) deve ter a durao mxima de doze horas. As jaulas podem ser
descarregadas de forma automatizada ou manual (geralmente em perus), ambos os
mtodos podem originar ferimentos e traumatismos sseos se a manipulao no for
a correcta (Fraqueza, 2006; Veloso, 2007).
3.2.
Abate
3.2.1.
Dependura
O abate inicia-se com a dependura (Figura 2) das aves pelos metatarsos nos
ganchos da linha de abate (Veloso, 2007). Durante este perodo as aves debatem-se
violentamente pois trata-se de uma postura fisiologicamente anormal para aves que
causa compresso dos metatarsos pelo metal e extremamente doloroso induzindo o
batimento das asas, o que pode conduzir a fracturas sseas e luxaes (EFSA, 2004).
O batimento das asas desaparece em doze segundos nas galinhas e em vinte
segundos nos perus e est relacionado com o stress e desconforto que provoca na
ave, por estar dependurada.
Figura 2: Dependura de frangos no incio da linha de

abate.
Este processo geralmente realizado em local escuro, com luz violeta ou negra
que tem efeito calmante nas aves, reduzindo o stress (Alvarado, 2006). A dependura
no deve ultrapassar a durao de um minuto (Veloso, 2007).
10
3.2.2.
Insensibilizao
Um dos mtodos utilizados na insensibilizao das aves a electronarcose em

tanque de gua, no fundo do qual so colocados elctrodos em toda a extenso
(Veloso, 2007). Na Unio Europeia obrigatrio a aplicao de uma descarga
elctrica que provoque insensibilizao at que ao momento da sangria (Lambooij,
Reimert, Van de Vis & Gerritzen, 2008). A intensidade e a durao da corrente
elctrica utilizada determinada pelo Instituto de Proteco da Produo AgroAlimentar (IPPAA), de modo a garantir que o animal atinja imediatamente um estado
de inconscincia que dure at sua morte. O elctrodo imerso na gua deve ser do
comprimento do tanque e, quando se empregam 50 Hz de corrente alternativa
sinusoidal, os nveis mnimos de corrente devem ser igual a 120 mA para Broilers
(Decreto-Lei n 28/96 de 2 de Abril). As aves entram no tanque de cabea para baixo,
ficam imersas at base das asas com as cabeas prximas dos elctrodos. Os
tanques de imerso para aves de capoeira devem possuir uma dimenso e
profundidade adequadas ao tipo de ave a abater e no devem deixar transbordar
gua entrada (Decreto-Lei n 28/96 de 2 de Abril). Uma amperagem elevada como a
que a EU obriga, pode provocar fracturas, hemorragias sobretudo nos msculos
peitorais, rotura da artria femoral e outros danos. Quando a intensidade de corrente
muito baixa pode ser suficiente para imobilizar o animal, mas pode no impedir que
as aves percepcionem a dor, o stress e o desconforto. Alm disso, a sangria no
ocorre totalmente, sendo a carne resultante de baixa qualidade, e as aves podem
recuperar a conscincia antes de morrerem (Alvarado, 2006).
Lambooij et al. (2008), determinaram que pode haver insensibilizao efectiva das
aves se for aplicada uma corrente de 111 mA durante um segundo num banho onde a
cabea imersa e colocado outro elctrodo metlico que vai penetrar na cloaca.
3.2.3.
Sangria
Logo aps a insensibilizao deve ocorrer a sangria, realizada atravs da seco

de ambas as artrias cartidas para que a morte cerebral ocorra de imediato (Veloso,
2007). O uso do corte unilateral (que atinge apenas uma artria cartida e a veia
jugular) conduz a uma taxa de sangramento mais lenta, a um incio tardio da morte e
a nveis mais elevados de contaminao bacteriana interna dos sacos areos durante
a imerso no escaldo, comparativamente sangria obtida por corte bilateral (Buhr,
Berrang, Cason & Bourassa, 2005).
11
A electronarcose causa um aumento da presso sangunea levando a

hemorragias caso a sangria no se efectue de imediato (William, Hagstad, Spangler,
Hinton & Hughes, 1996).
As cartidas podem ser seccionadas por faca automtica (Veloso, 2007) ou
manualmente (Figura 3). Os animais perdem 30 a 50% da totalidade do sangue
(Wilson, 2005) a partir destes grandes vasos, ocorrendo paragem cerebral e morte. O
volume de sangue perdido corresponde entre 3 a 4 % do peso vivo do animal. Se a
sangria no for suficiente teremos deficincias qualitativas na carne, alterao da cor
da carcaa e da pele durante o escaldo e grande alterao do sabor por depsitos
de sangue nos msculos (Alvarado, 2006).
Figura 3: Exemplo de sangria manual em frangos de produo extensiva.
3.2.4.
Escaldo
Para que ocorra a remoo das penas, as aves so submetidas a um escaldo

com gua quente, que est dependente de duas variveis, tempo e temperatura,
determinantes para a qualidade do produto final e que devem ser regulados de acordo
com a idade das aves e tipo de conservao pelo frio a que vo ser sujeitas. A gua
quente deve atingir o folculo, abrindo-o e de modo a facilitar a depena (Alvarado,
2006; Veloso, 2007).
Quando a temperatura do escaldo muito elevada origina desprendimento da
epiderme durante a depena e inutiliza a gordura sub cutnea provocando adeso
entre a pele e o msculo subjacente conferindo um aspecto manchado e de
12
cozimento superficial dos msculos peitorais o que leva rejeio das carcaas no
exame post mortem (Veloso, 2007).
O escaldo de frangos cujas penas so mais fceis de remover e que se destinam
a ser refrigerados em tunel de ar, feito com gua a uma temperatura de 50 a 54C
durante cento e vinte segundos, condies suficientes para remover as penas e no
causar danos na camada externa da pele ou cutcula (Alvarado, 2006). Por outro lado,
em galinhas e perus cujas penas esto fortemente inseridas nos folculos e nos
frangos que se destinam congelao, a temperatura do escaldo dever ser
superior a 55C; o binmio tempo temperatura pode ser de 61-63C durante quarenta
e cinco segundos (William et al., 1996; Alvarado, 2006; Veloso, 2007).
No escaldo so frequentes as contaminaes cruzadas por gua conspurcada
com fezes presentes nas patas, pele e penas e com sangue porque a temperatura
que a gua atinge no suficiente para eliminar os microrganismos veiculados
(Davies & Board, 1998; Veloso, 2007). Esta contaminao pode ser por
microrganismos patognicos e no patognicos causadores da decomposio das
carcaas.
A minimizao das contaminaes poder obter-se atravs da lavagem das
carcaas depois da depena e da manuteno da gua do escaldo limpa (Veloso,
2007). O teor de microrganismos aerbios totais presentes na gua do escaldo pode
variar entre 102 e 103 ufc/ml (Cunningham, 1982 citado por Fraqueza, 2006b). A gua
do escaldo pode reduzir significativamente a carga microbiana das carcaas se for
continuamente substituda por gua limpa (Gksoy et al., 2004), se ao invs disso, for
mudada apenas uma vez por dia pode fazer aumentar a contaminao total em 8 log
ufc/g levando a que o produto final tenha contagens de 6,6 log ufc/g (Abu-Rwaida et
al., 2004 citado por Gksoy et al., 2004). Esta operao pode ainda favorecer as
bactrias resistentes ao calor e as formadoras de esporos (McNamara,1997 citado por
Gksoy et al., 2004).
Pelo exposto, tm sido estudadas vrias alternativas ao escaldo por imerso.
Veerkamp & Hofmans (citado por Davies & Board, 1998) efectuaram o escaldo
usando spray de gua quente seguido da depena, e obtiveram redues nos teores
de bactrias relativamente ao mtodo convencional. Contudo este mtodo nunca foi
implementado comercialmente, pois a depena no era eficiente.
O escaldo em contra corrente tende a ter maior impacto na redues nos
teores bacterianos da carcaa (McNamara, 1997 citado por Gksoy et al., 2004),
embora comercialmente esta alterao tambm parea improvvel, pois h sempre
uma mistura da gua o que dispersa as bactrias por todo o tanque. Waldroup et al.
13
(1992 citado por Davies & Board, 1998) no encontraram diferenas entre o escaldo
realizado em contra corrente, e o mtodo convencional em termos de teores
bacterianos do produto final.
Outra alterao implementada relativamente ao escaldo convencional foi a
diviso do tanque em vrios pequenos sub-tanques, com ou sem re-circulao de
gua. A vantagem deste sistema em cascata deve-se ao facto de se conseguir
realmente um sistema em contra corrente entre a gua e as carcaas, o qual d
origem a teores microbianos mais reduzidos. Um abaixamento do pH atravs da
utilizao de cidos orgnicos poder ser til em termos de reduo do teor
bacteriano das carcaas mas pode provocar alteraes organolpticas do produto
final (Davies & Board, 1998), no no entanto permitido na Unio Europeia.
3.2.5.
Depena
A operao de depena foi automatizada h j vrios anos (Davies & Board, 1998).
A boa remoo das penas da carcaa feita atravs da rotao de dedeiras de
borracha da depenedora e depende do escaldo que a antecede, do tempo de
permanncia da carcaa na depenedora e da velocidade de rotao das dedeiras
(Alvarado, 2006). Se excessiva, a depena pode causar perdas e mutilaes da
carcaa e se insuficiente pode no remover a totalidade das penas (William, Hagstad,
Spangler, Hinton & Hughes, 1996; Davies & Board, 1998; Fraqueza, 2006b; Alvarado,
2006). As penas que no so removidas de forma automtica, devem s-lo
manualmente (William et al., 1996).
Esta etapa tem sido considerada a grande responsvel por contaminaes
cruzadas (Gksoy et al., 2004). Este facto deve-se s dedeiras poderem facilmente
ser conspurcadas e persistncia de biofilmes, pelo que devem ser submetidas a
lavagem e desinfeco dirias (Fraqueza, 2006b; Veloso, 2007). A depena de uma
ave contaminada pode levar a contaminaes cruzadas das aves que so depenadas
a seguir (Mulder et al., 1997, citado por Davies & Board, 1998).
Depois da depena as aves devem ser lavadas para reduzir o teor microbiano da
sua superfcie. A primeira inspeco post mortem acontece nesta zona (Wilson,
2005).
Para garantir a elevada qualidade higinica da carne, o parmetro mais importante
da depena est dependente da uniformizao das aves e do ajuste do equipamento.
Assim, se no existir este ajuste do equipamento ao tamanho das aves ou se o
tamanho das carcaas variar muito, podem aumentar as mutilaes e as perdas de
14
qualidade (Alvarado, 2006). Esta premissa tambm se aplica s restantes estapas do

abate.
3.2.6.
Corte das cabeas e das patas
Esta etapa pode ou no existir (Figura 4), e na maioria das aves de capoeira
eliminada a cabea pela articulao occipito atlideia e as patas ao nvel do tarso
(Wilson, 2005; Veloso, 2007).
Figura 4: Carcaas de frango aps o corte da cabea pela articulao occipito

atlideia e das patas ao nvel do tarso.
3.2.7. Eviscerao
A remoo das vsceras normalmente automtica, mas pode ser manual (Figura
5). Em ambos os mtodos, depois de aberta a cavidade toracoabdominal, as vsceras
so expostas e removidas (Alvarado, 2006). As carcaas e seus orgos so
inspeccionados aps esta fase (Veloso, 2007).
A presena de vsceras na carcaa contribui para a rpida degradao da mesma,
principalmente os pulmes que possuem elevada carga microbiana em consequncia
da aspirao da gua do escaldo (Veloso, 2007), no entanto existem vrios estudos
que indicam que esta etapa no reduz significativamente os teores microbianos
(Gksoy et al., 2004).
15
A lavagem por asperso aps a eviscerao contribui para uma reduo do

teor microbiano das carcaas, no que respeita aos microrganismos no aderentes
pele, a gua utilizada tem que ser potvel (Fraqueza, 2006b).
Figura 5: Exemplo de eviscerao manual de frangos.
3.2.8.
Arrefecimento rpido das carcaas e refrigerao
Durante a refrigerao das carcaas, pretende-se que a temperatura dos

msculos peitorais desa para 4C mas a rapidez do arrefecimento depende do
tamanho das aves (Veloso, 2007; Alvarado, 2006). O mtodo de refrigerao tambm
influncia este tempo de arrefecimento, e a refrigerao pode ser feita por imerso
(mtodo mais frequente nos EUA) ou por ar frio (mtodo vulgarmente utilizado em
Portugal, resto da Europa, Amrica do Sul e Canad).
Em Portugal, tal como na Europa, as aves depois da eviscerao e lavagem
entram num tnel de ar frio, onde permanecem o tempo necessrio a uma
temperatura que pode ir de -1C at 2C, por este mtodo pode haver tambm
pulverizao das carcaas o que ajuda a diminuir a temperatura e as perdas por
evaporao. As carcaas arrefecidas por ar frio ficam com um aspecto seco mas que
desaparece aps re hidratao, contudo tm geralmente menor carga microbiana e
maior tempo de validade quando comparadas com as arrefecidas por imerso
(Alvarado, 2006).
A legislao Europeia estabelece que a temperatura da carne fresca deve ser
igual ou inferior a 4C, e quanto mais prxima do ponto de congelao da gua mais
se contraria o crescimento bacteriano (Ayres, 1960, citado por Cox et al., 1998). Para
que haja inibio mxima do crescimento bacteriano, a temperatura deveria situar-se
16
entre -2C e -1C, mas corresponde ao incio da congelao e por isso no

praticvel (Roseiro, 1999, citado por Fraqueza, 2006).
At serem refrigeradas, as carcaas permanecem com os folculos das penas
abertos, onde se vo acumular microrganismos, que a ficam aprisionados aquando
da refrigerao por fecho desses mesmos folculos, dificultando a remoo dos
microrganismos por lavagem e ou desinfeco, esta ultima no permitida na Unio
Europeia (Fraqueza, 2006).
3.2.9.
Desmancha e embalagem
Depois de reduzida e estabilizada a temperatura das carcaas, elas so

acondicionadas ou so penduradas em grilhes e desmanchadas sendo depois
embaladas. No primeiro caso em que o frango se destina a ser comercializado inteiro,
j na sala de embalagem, podem ser adicionadas carcaa as vsceras comestveis
(moela, fgado e corao) e as patas acondicionados em sacos de plstico e o
conjunto depois pr-embalado e pr-refrigerado. Posteriormente as carcaas devem
ser acondicionadas na embalagem, normalmente caixas de plstico ou papelo, com
padronizao do peso total.
Por outro lado, pode ser efectuada desmancha da carcaa, que depois vendida
em partes, o que traz valor acrescentado a este tipo de produto. Nestes casos a
carcaa pode ser refrigerada durante oito a doze horas a 4C. Este perodo permite
reverter a tenrura inicial. Depois de maturada, a carcaa pode ser desmanchada de
forma manual ou automtica, e em ambos os casos os peitos, as asas e os membros
so separados da restante carcaa. O peito de frango a parte mais cara, e uma vez
que esta pea deprovida de pele, qualquer alterao mais facilmente percebida
pelo consumidor (Alvarado, 2006).
Os peitos de frango obtidos so depois embalados em embalagem de atmosfera
modificada (MAP), em que temos uma embalagem cujo ar removido por vcuo ou
por flushing e depois ocorre preenchimento com uma mistura de gases, seguido de
selagem da embalagem. A composio da mistura altera-se com o tempo de
armazenamento como resultado do metabolismo bacteriano, absoro de gases pelo
produto e difuso atravs da pelcula ds embalagem (Rao & Sachindra, 2002 citado
por Nollet & Toldr, 2006).
Verificou-se que em carne fatiada de peru embalada em atmosfera com 50% de
CO2 L. monocytogenes inibida a 0C e 7C, mas esta inibio no acontece para
temperaturas abusivas (Fraqueza, Ferreira & Barreto, 2006a)
17
4. Contaminao das carcaas durante o abate e desmancha

As aves que chegam ao matadouro esto geralmente contaminadas com bactrias
patognicas para o Homem.
Os teores bacterianos de carcaas recentemente processadas so influnciados
pela durao do jejum que antecede o abate, transporte, durao do perodo entre a
chegada ao matadouro e o abate, controlo das temperaturas do interior das
instalaes e do ar exterior, etapas do abate e boas prticas de higiene (Gksoy et al.,
2004).
Hidromel (1989), citado por Gksoy et al., (2004) definiu as razes pelas quais o
controlo de microrganismos nos locais de abate de aves difcil: 1) a velocidade
elevada da linha de abate mantm as aves com grande proximidade durante todo o
processamento; 2) limitaes
do equipamento usado para o escaldo, depena e
eviscerao; 3) dificuldade de lavar a cavidade toracoabdominal eficazmente aps a

eviscerao quando a carcaa permanece inteira; 4) reteno de gua pela pele, que
transporta as bactrias para as fendas cutneas e folculos das penas, embora estes
ltimos paream ter uma contribuio menor (Buhr et al., 2003, citado por Cason,
Hinton & Buhr, 2004).
As diferentes estaes do ano, nas quais ocorrem diferentes amplitudes trmicas,
parecem influnciar a flora bacteriana do frango, a qual nas estaes mais quentes
aparece aumentada (Cohen, Ennaji, Hassar & Karib, 2007).
Os bandos de frangos tm teores baixos ou nulos de Listeria monocytogenes, que
se mantm baixos nas primeiras etapas do abate (Berrang, Lyon, Smith & Northcutt,
2000). Contudo, como geralmente as exploraes avcolas no so inspeccionadas
quanto existncia de Listeria monocytogenes, podem estar na origem da
contaminao dos matadouros e salas de desmancha (Esteban, Oporto, Aduriz, Juste
& Hurtado, 2007).
Ao longo de toda a linha de abate pode haver contaminao das carcaas com
bactrias patognicas (Campylobacter spp., Salmonella spp., Listeria monocytogenes,
Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus) e bactrias responsveis pela
decomposio das carcaas (Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens,
Acinetobacter, Alteromonas, etc.) que podem ser transportadas nas patas, penas e
intestinos (Gksoy et al., 2004).
A contaminao das carcaas pode ocorrer atravs do contacto com as
superfcies (equipamento), a gua do escaldo e aerossis (Gksoy et al., 2004;
Veloso, 2007). Embora a fonte desta contaminao ainda no esteja totalmente
esclarecida, parece que ocorre essencialmente nas ltimas fases do processamento
18
das carcaas (Cox et al., 1997; Barbalho, Almeida, Almeida & Hofer, 2005). A
contaminao das carcaas por Listeria monocytogenes pode acontecer durante ou
depois do escaldo, na depenadora por contaminao cruzada, o que advm do facto
de no ser possvel detectar a presena deste agente patognico atravs do acto
inspectivo (Cox et al., 1997; Barbalho et al., 2005). Depois de um animal infectado
entrar no matadouro, vai contaminar os instrumentos e toda a linha de abate, o que
posteriormente levar contaminao das um elevado nmero de carcaas abatidas
em seguida (Cox et al., 1997).
Nos matadouros de aves Listeria monocytogenes, j foi isolada das superfcies de
ao inoxidvel, material de transporte, puxadores das portas, utenslios de limpeza,
luvas dos manipuladores e gua de lavagem. Esta frequncia demonstra que existe
contaminao a partir das prprias instalaes, como por exemplo atravs dos
aerossis produzidos durante a lavagem, no sendo Listeria monocytogenes
eliminada pela limpeza e desinfeco e conseguindo sobreviver durante longos
perodos em condies desfavorveis (Lawrence & Gilmour, 1994). Geralmente, o
aumento da manipulao das carcaas faz aumentar os teores de Listeria spp. e de
Listeria monocytogenes (Lawrence & Gilmour, 1994).
Como possvel causa de sobrevivncia e persistncia de Listeria monocytogenes,
temos a aderncia desta bactria s superfcies que contactam com os alimentos
aps um contacto de apenas vinte segundos (Lawrence & Gilmour, 1994). As
bactrias podem formar microcolnias dinmicas que podem mais tarde originar
biofilmes, os quais posteriormente contaminaro os alimentos que contactarem com
estas superfcies. A formao de biofilmes pode conferir proteco s bactrias e
permitir-lhes resistir melhor limpeza e desinfeco, sendo assim focos de
contaminao para os alimentos (Lawrence & Gilmour, 1994). Embora existam vrios
estudos sobre os contaminantes microbianos associados s vrias etapas do abate e
desmancha de carcaas de aves de capoeira, poucos investigaram a qualidade do ar
nestes locais (Rylander, Hsieh & Courteheuse 1994; Whyte et al., 2001, citados por
Lues et al., 2007). Os estabelecimentos de abate e desmancha de aves de capoeira
esto predispostos a contaminao do seu ar interno o qual vai veicular
microrganismos para as superfcies, equipamento, e mos dos trabalhadores (Whyte,
2002, citado por Lues et al., 2007). Alm disso, o ar tem um papel significativo na
transmisso dos micrbios
patognicos
e pode mesmo ser implicado na
contaminao de carne de aves de capoeira nas vrias etapas do abate e do

processamento das carcaas (Geornaras et al.,1996, citado por Lues et al., 2007).
19
A potencial contaminao de alimentos e doenas de origem alimentar por

aerossis que contm microrganismos precisa de ser melhor estudada. As contagens
microbianas
demonstram
um
padro
similar
na
predominncia
dos
vrios
microrganismos nas diferentes etapas do processamento. Existe um declnio definitivo

nos nmeros bacterianos desde a rea de recepo e sangria para a rea de
expedio. A rea de refrigerao tem as contagens microbianas mais baixas. A
elevada predominncia de microrganismos nas zonas de recepo, atordoamento e
sangria atribuda ao batimento das asas e aos movimentos das aves que
contribuem para que os microrganismos se dissiminem por via area. Os nveis
mdios de L. monocytogenes transportados por via area nas reas de recepo e
sangria, depena e eviscerao obtidos por Lues et al. (2007) foram de 9,3 103, 3,9
103, e 2,5 103 ufc/m3, respectivamente.
As contagens elevadas dos microrganismos transportados por via area
observados na zona de recepo, sangria e depena enfatizam a importncia do
controlo a este nvel da laborao. Nos locais de abate e processamento de aves, os
micrbios patognicos cuja existncia conhecida devem ser reduzidos para nveis
mnimos de forma a limitar o seu transporte a partir das reas fortemente
contaminadas para as reas a jusante, onde h uma maior exposio das carcaas
contaminao por via aria e por contacto com as superfcies. As carcaas de aves
esto sujeitas a contaminao e os cuidados no devem visar apenas a limpeza das
superfcies e desinfeco dos utenslios, mas tambm a diminuio ou eliminao da
contaminao microbiana pelo ar (Lues et al., 2007).
Durante as operaes de desmancha de carcaas as contaminaes cruzadas
so inevitveis quer por contacto com o equipamento, quer atravs dos
manipuladores (Fraqueza, 2006b).
5. Bactrias causadoras de infeces de origem alimentar
Uma infeco de origem alimentar resulta da ingesto de um agente patognico
seguido de crescimento no hospedeiro. Os principais processos patologicos deste tipo
so causados por (Prescott, Harley & Klein, 2002):
Salmonella, resultado da ingesto de diversos serovares, em particular o

Typhimurium e o Enteritidis, que geralmente causam sintomas de gastroenterite
oito horas aps a ingesto de alimentos contaminados.
Campylobacter jejuni responsvel por um grande numero de gastroenterites

agudas em individuos de diferentes idades.
20
Listeria monocytogenes, geralmente causadora de doena em grupos de risco,

cujos sintomas e periodos de incubao so variveis.
Escherichia coli, bactria causadora de diarreia no Homem .
Nas ltimas dcadas, Salmonella tem estado na origem da maioria dos casos de
infeces alimentares, geralmente resultantes da ingesto de ovos, carne de aves de
capoeira e outras carnes, leite cru e chocolate. No entanto, a freqncia de infeces
por Campylobacter jejuni tem aumentado de tal modo nos ltimos anos que, nalguns
pases, chega a rivalizar com Salmonella. Embora ainda com baixa expresso, o
aparecimento de casos de infeces por Listeria monocytogenes nas ltimas dcadas
tem trazido preocupaes, pois esta bactria pode provocar danos severos ou mesmo
fatais em bebs, crianas, mulheres grvidas, idosos e indivduos imunodeprimidos
(INSA, 2008).
As intoxicaes provocadas por Yersinia enterocolitica e por algumas estirpes de
Escherichia coli tm-se tornado frequentes nos ltimos anos, embora existam outras
bactrias como Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, ou Bacillus cereus,
implicadas em intoxicaes alimentares (INSA, 2008).
Relativamente toxinfeco de origem bacteriana, por definio, doena
provocada por toxinas produzidas por baterias, verifica-se que existem quatro agentes
que mais frequentemente so responsabilizados por toxinfeco colectiva: Clostridium
perfringens, S. aureus e Campylobacter (INSA, 2008).
5.1. Enterobacteriaceae
A quantificao de Enterobacteriaceae permitir avaliar a contaminao de origem
intestinal durante o processo de abate e os seus teores no devem ser superiores a
104 ufc/g ou ento 103 ufc/cm2 (Mossel, 1995). A principal fonte de contaminao por
estas bactrias parecem ser as superficies e instrumentos de trabalho contaminados
(Nychas & Drosinos, 1999).
Enterobacteriaceae, uma familia de bactrias Gram-negativas, bacilos,
fermentadores da glicose, oxidase negativos, com capacidade de reduzir os nitratos a
nitritos, catalase positivos, aerbios ou anaerbios facultativos, com flagelos pertricos
ou ento imveis e de distribuio ubiquitria (Nychas & Drosinos, 1999; Prescott et
al., 2002).
As principais bactrias deste grupo que podem estar presentes em frangos so,
Escherichia coli, Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphy, Shigella disenteriae,
Shigella sonei, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Citrobacter
freundii, Citrobacter braaki, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytocae, Enterobacter
21
cloacae, Serratia marcencens, Providencia alcalifaciens, Edwardsiella e Yersnia spp

(Nychas & Drosinos, 1999).
5.2. Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes, bactria do gnero Listeria foi descoberta em 1926 por
E.G.D.Murray (Cossart, 2007). Caracteriza-se por ser ubiquitria, Gram positiva,
movimentar-se por flagelos e anarobia facultativa (FDA, 1992; Liu, 2007;
Chaturongaku, Raengpradub, Wiedmann & Boor, 2008).
O gnero Listeria formado por seis espcies Listeria monocytogenes, Listeria
seeligeri , Listeria ivanovvi, L. welshimeri, L. grayi e L. innocua, baseado na homologia
do DNA, homologia do 16S rRNA, propriedades quimiotaxicas e anlise enzimtica
(McLauchlin, Mitchell, Smerdon, Jewell, 2004; Rebuffo, Schmitt, Wenning, Stetten &
Scherer, 2005). Apenas as espcies hemolticas provocam doena, sendo
representadas pela Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri e Listeria ivanovvi (IFT,
2004). No entanto, s a primeira pode de facto ser considerada patognica para o
Homem, (Cossart, 2007; EFSA, 2007a; IFT, 2004). Listeria ivanovvi est associada
essencialmente a doena nos animais (Cossart, 2007), particularmente em
ruminantes onde ocasionalmente pode provocar aborto (ovelhas e vacas) ou
septicmia (ovelhas) (Orndorff, Hamrick, Smoak & Havell, 2006). As outras espcies
de Listeria, no esto geralmente associadas a doena (OIE, 2005).
Esta bactria pode desenvolver-se em ambientes extremos de pH (5 9,6), e
resiste a congelao e descongelao repetidas (Liu, 2007; IFT, 2004; Herenda &
Franco, 1996). Tolera bem a presena de NaCl, a desidratao e variaes de
osmolaridade (IFT, 2004; Liu, 2007). Consegue tolerar temperaturas vrias o que lhe
permite resistir ao calor, mas tambm a baixas temperaturas incluindo as de
refrigerao existentes em inmeros ambientes tecnolgicos de produo de gneros
alimentcios (EFSA, 2007;Liu, 2007).
Listeria monocytogenes pode ser encontrada em diversas fontes ambientais (FDA,
1992; OIE, 2005; Barocci et al., 2007). Os grandes reservatrios deste agente de
infeco so o solo, a silagem, o tracto gastro-intestinal de animais assintomticos,
nomeadamente mamferos domsticos e silvestres, aves, peixes e crustceos, e
ainda fetos abortados e ocasionalmente nas descargas nasais e urina de animais
doentes (OIE, 2005; FDA, 1992). Alguns estudos mostram que 1 a 10% da populao
humana portadora de Listeria monocytogenes a nvel intestinal (FDA, 1992).
A espcie Listeria monocytogenes inclui treze serovares, que se distinguem pelos
carbohidratos de superfcie e antignios flagelares (Orndorff et al., 2006; Lpez,
22
Surez, Chico-Calero, Navas & Martnez-Surez, 2006). Os serovares 4b, 1/2a e 1/2b
so os agentes isolados na maioria dos casos de doena no animal e no Homem
(Chaturongakul, Raengpradub, Wiedmann & Boor, 2008; Lpez et al., 2006; OIE,
2005). Eles so responsveis por mais de 90% das infeces em humanos, e so
tambm os mais frequentes em gneros alimentcios e locais de processamento de
alimentos (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).
As estirpes do serovar 4b so a causa predominante de surtos e de alguns casos
de listeriose. Existem estirpes de outros serovares que no o 4b que causaram surtos
graves, como por exemplo o serovar 1/2a na Alemanha (279 casos) e o serovar 3a na
Finlndia (15 casos) (McLauchlin et al., 2004). Os casos espordicos so causados
pelos mesmos serovares, mas a frequncia do serovar 4b menor que a do serovar
1/2a e 1/2b (Lpez et al., 2008).
Nos alimentos no associados a listeriose os serovares 1/2a e 1/2b predominam.
As estirpes do serovar 4b podero ter menor capacidade de formar biofilmes nas
instalaes de transformao dos produtos alimentares quando comparada com a do
serovar 1/2, o que explica a menor prevalncia daquele serovar. Contudo, a diferente
distribuio dos serovares parece no estar, aparentemente, relacionada com a
existncia de algum tipo de vantagem do serovar 1/2a quando comparado com o 4b
em meios selectivos habitualmente usados na cultura destas bactrias (Lpez et al.,
2006).
O serovar 4b alm de ser o principal responsvel pela listeriose, tambm mais
isolado em pacientes com meningoencefalite do que em pacientes com infeco
sistmica, o que pode indicar que mais virulento que os restantes. Associado a este
facto est tambm a maior taxa de mortalidade registada associada ao serovar 4
(26%) relativamente ao serovar 1/2 (16%). A base molecular destas diferenas ainda
no est determinada (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).
As estirpes do serovar 4b de Listeria monocytogenes so geneticamente muito
semelhantes entre si e o nmero de estirpes pertencentes a este servar, em
diferentes pases e nos ltimos 20 anos, muito pequeno. Uma estirpe do sertipo
4b isolada na ustria no ano de 2000 era idntica a uma outra tambm epidmica
isolada nos Estados Unidos em 1985 (Lpez et al., 2008).
Listeria monocytogenes tem o seu genoma codificado para mais de 209
reguladores de transcrio (s a bactria Pseudomonas aeroginosa tem mais do que
ela) o que reflecte a sua capacidade para sobreviver e multiplicar-se em ambientes
muito diferentes. Um gene deste tipo que est bem estudado o prfA, o qual regula a
23
expresso de diversos genes pertencentes ao grupo responsvel pela virulncia das

espcies do gnero Listeria (Liu, Ainsworth, Frank, Austin & Lawrence, 2004).
Embora Listeria monocytogenes seja considerada patognica, existem estirpes
com diferentes graus de virulencia. Algumas estirpes de Listeria monocytogenes so
capazes de causar doena ou morte, mas outras h cujo potencial patognico
pequeno e so relativamente avirulentas (Liu, Ainsworth, Austin & Lawrence, 2003;
McLauchlin et al., 2004; Lpez et al., 2008). No
caso da listeriose humana, o
procedimento habitual de pesquisa e contagem de L. monocytogenes claramente

insuficiente porque no permite diferenciar as estirpes virulentas das no virulentas,
que provavelmente so maioritrias, mais importante ainda por se tratar de uma
bactria ubiquitria amplamente distribuida no meio ambiente (Lpez, 2006).
A sequenciao, em 2001, do genoma completo de L. monocytogenes e a sua
comparao com o genoma de L. innocua revelou que 10% dos genes so diferentes
entre a espcie patognica e a no patognica. Posteriormente, compararam os
genomas de diferentes serovares de L. monocytogenes (1/2a e 4b) o que permitiu
identificar genes especficos dos serovares e 8% das sequncias so especficas do
sorovar 4b, diferena semelhante que existe entre L. monocytogenes e L.innocua.
Dos 484 genes regulados durante o crescimento intracelular de Listeria spp., 41 so
especficos de L. monocytogenes, mas tambem existem 25 genes especficos do
serovar 1/2a que no est presente no genoma sequnciado do serovar 4b. Estes
resultados poderiam explicar o potencial de virulncia do serovar 4b. A diversidade
gentica que existe entre alguns serovares de L. monocytogenes to grande como a
que existe entre algumas espcies de Listeria (Lpez et al., 2008).
A capacidade de diferenciar as estirpes verdadeiramente virulentas das restantes
poderia evitar a eliminao injustificada de alimentos e prevenir surtos de doena. Os
mtodos desenvolvidos para determinar a virulncia de Listeria monocytogenes
incluem mtodos in vivo e mtodos in vitro. Os primeiros atravs dos efeitos em ratos
e os segundos pelos efeitos citopatognicos em linhagem de entercitos Caco-2 ou
em embries de galinhas (Liu et al., 2004).
Liu et al. (2004) estudaram a correlao entre os resultados in vivo e por PCR
quanto virulencia de diferentes estirpes de Listeria monocytogenes. Utilizaram para
isso oito primers diferentes derivados de um painel de oito genes (quatro codificam
factores de transcrico, dois codificam protenas com funo desconhecida e dois
codificam uma internalina) de L. monocytogenes em doze estirpes virulentas e um
painel maior que incluia amostras do meio ambiente, alimentares e clinicas e
determinaram que as estirpes virulentas de Listeria monocytogenes contm genes
24
que podem potencialmente ser utilizados para as diferenciar de estirpes no

virulentas.
Existe correlao entre ambas as metodologias, o DNA das estirpes
virulentas para o rato sofreu amplificao pelo PCR relativamente a pelo menos dois
dos primers utilizados e o DNA das avirulentas (ATCC19114 e HCC25) no sofreu
amplificao. Os oligonucletidos derivados do gene lmo2821 ( que codifica para a
internalina) permitiram identificar todas as estirpes virulentas testadas.
Algumas estirpes de L. monocytogenes expressam uma forma no funcional de
internalina. As estiprpes de origem clnica expressam a internalina completa com
maior frequncia (96%) que as estirpes isoladas em alimentos (65%). Dos quatro
serovares que se isolam com maior frequncia, o serovar 4b (que est associado a
um maior nmero de surtos de listeriose humana) e o serovar 1/2b expressam sempre
a internalina completa. Contrariamente a estes, o serovar 1/2a f-lo de forma variavel
e o serovar 1/2c (raramente responsvel por casos de listeriose humana) expresa
sempre a forma truncada da internalina. A expresso da internalina pode ser um bom
marcador de virulncia de L. monocytogenes em humanos, o que permit avaliar os
riscos de listeriose em funo no s dos nveis de contaminao mas tambm da
funcionalidade da internalina (Lpez et al., 2008).
A hemolisina, deleces no gene actA, defeitos na expresso ou na funo da
protena ActA tambm parece influenciar a virulncia de L. monocytogenes (Lpez et
al., 2008).
A regulao e a expresso dos numerosos factores de virulncia de L.
monocytogenes , a diversidade gentica bacteriana e o grau de susceptibilidade da
populao humana torna muito dificil a diferenciao inequvoca entre estirpes
virulentas de estirpes no virulentas de L. monocytogenes. A atenuao da virulncia
de L. monocytogenes deve-se a diversos mecanismos e por isso pouco provvel
que um nico mtodo baseado em tcnicas moleculares, culturas celulares ou
ensaios em animais permita diferenciar os isolamentos com diferentes graus de
patogenicidade. A longo prazo, ser possivel identificar determinados aminocidos
fundamentais para a correcta actividade das protenas associada virulncia, o que
permitir a deteco das mutaes responsveis atravs de mtodos mais sensiveis,
como o PCR multiplex (Lpez et al., 2008).
Actualmente, a legislao e a Organizao Mundial de Sade (OMS) no fazem
ainda distino de estirpes, referindo-se espcie como um todo, quando mencionam
os riscos associados aos diferentes tipos de alimentos.
6. Listeriose nos animais
25
A Listeriose nos animais est mais associada a problemas de segurana alimentar

do que a perdas a nvel de produo (Orndorff et al., 2006). Esta doena de origem
alimentar afecta vrias espcies de animais e tem geralmente trs formas de evoluo
clinica, spticemia, aborto e doena neurolgica (Rissi et al., 2006). Aparece na forma
de doena clnica em ovinos (Figura 6) e bovinos, cujas manifestaes so encefalite,
aborto e septicmia (OIE, 2005). Em frangos, geralmente no est associada a
sintomas nem a quebras de produo, mas torna-os portadores capazes de eliminar
o agente atravs das fezes e sendo por isso fontes de infeco para os locais de
abate e manipulao de aves (Cox et al., 1997). A doena clinica nas aves rara e
ocorre sobretudo nos jovens na forma de septicmia (OIE, 2005; Rissi et al., 2006).
Os ruminantes geralmente infectam-se quando consomem silagem contaminada
por L. monocytogenes. Muitas vezes o processo de fermentao que est na origem
da silagem, no baixa suficientemente o pH de modo a prevenir o sobrecrescimento
desta bactria ubiquitria (Orndorff et al., 2006; Rissi et al., 2006). No caso de recmnascidos, a transmisso da infeco geralmente vertical (OIE, 2005). O perodo de
Figura 6: Manifestaes neurolgicas associadas listeriose em ovinos (adaptado de

Vazquez Boland et al., 2001)
incubao para a encefalite dos ruminantes de dez dias a trs semanas. Septicmia
e aborto podem ocorrer depois de um ou mais dias (OIE, 2005). Existem algumas
evidncias indicativas de que a encefalite nas ovelhas pode ser adquirida atravs de
cicatrizes nas razes dos dentes ou com outras localizaes na mucosa oral, que leva
a uma neurite, especialmente do nervo trigmio, resultando em leso cerebral, no
est no entanto estabelecido que haja paralelismo no Homem (McLauchlin et al.,
2004).
Listeria monocytogenes tem sido isolada em diversos pases membros da Unio
Europeia de animais de produo, que geralmente se infectam atravs dos alimentos,
26
gua e animais silvestres tais como aves e ratos. A Tabela 4 mostra a frequncia de
Listeria monocytogenes em animais de produo em alguns pases da Europa (WHO,
2004).
Em 2003, treze pases membros referenciaram casos de Listeria spp. e de Listeria
monocytogenes em animais, a maioria localizados na Alemanha. Foi encontrada em
diferentes espcies de animais de produo sendo mais frequente em ruminantes
(EFSA, 2006). A frequncia em frangos, registada em apenas quatro pases, baixa,
tal como se pode observar na Tabela 5.
Listeria monocytogenes
Pas
Espcie afectada
N de casos
Frequncia (%)
Alemanha
Vacas leiteiras
1246
14
21
648
11
110
26
46
11
188
(explorao)
Vacas de carne
(explorao)
Ovinos e caprinos
(explorao)
Itlia
Ovinos e caprinos
(animais)
Portugal
Ovinos e caprinos
(animais)
Finlndia
Porcos
(animais)
Tabela 4: Frequncia de Listeria monocytogenes em animais de produo de alguns

pases da Unio Europeia referente ao ano de 1998. (adaptado de WHO, 2004).
O diagnstico pode ser feito atravs de isolamento de Listeria monocytogenes na

placenta, feto e descarga uterina aps aborto, no sangue e liquido cefalorraquidiano
de animais com septicemia ou encefalite, figado, bao
e rins em animais com
septicemia e ainda pons e medula para casos de encefalite. Nas fezes e no leite,
Listeria monocytogenes pode ser isolada mesmo em animais que no esto doentes
(OIE, 2005). Alm do isolamento, podem ser utilizados testes rpidos para
identificao baseados nos caracteres bioqumicos e reaces enzimticas e ainda
atravs de ELISA (enzyme-linked-immuno-sorbent assay), imunofluorescncia,
imunocromatografia, separao imunomagntica e PCR. Das provas referidas
anteriormente, as serolgicas no so vulgarmente utilizadas, pois muitos animais
27
saudveis possuem ttulos elevados de anticorpos para Listeria e pode haver reaco
cruzada com Enterococus, Staphylococcus aureus e outros microrganismos (OIE,
2005).
Gallus gallus
N de Animais
% de
Testados
positivos
Repblica Checa
131
Alemanha
2170
0,2
Irlanda
397
Litunia
42
4,8
Tabela 5: Frequncia de Listeria monocytogenes em frangos em alguns pases da

Unio Europeia (adaptado de EFSA, 2007).
Nas aves com septicmia as leses post mortem so: necrose, degenerescncia
do miocrdio e pericardite serofibrinosa. Pode haver tambm petquias no prventrculo e corao e ainda esplenomeglia, hepatomeglia, reteno de blis e
necrose focal heptica. As leses da forma enceflica no so detectveis
macroscopicamente (OIE, 2005).
7. Listeriose Humana
7.1. Generalidades
A listeriose geralmente um problema grave em mulheres grvidas, recmnascidos, idosos e imunodeprimidos, (Figura 7) que pode ser fatal (OIE, 2005) e cujos
sinais so inespecficos. Alm do impacto econmico e da ameaa associada com os
surtos, a listeriose representa um problema importante de sade pblica, devido sua
taxa de mortalidade entre as mais altas de todas as infeces transmitidas por
alimentos (20-30%), e ao seu alto potencial epidmico. A evoluo dos mtodos de
produo dos alimentos, tal como a distribuio e o armazenamento, facilitaram a
ocorrncia de surtos afectando numerosos pases (Valk et al., 2005).
A fonte de contaminao humana mais importante a ingesto de alimentos
contaminados (OIE, 2005; EFSA, 2007), com relevncia para a carne e o peixe no
ou insuficientemente cozinhados, leite no pasteurizado e seus derivados, vegetais
crus, e tambm refeies processadas que foram contaminadas aps esse mesmo
28
processamento (OIE, 2005). Para alm da ingesto, a infeco pode tambm

acontecer por contacto directo animal infectado Homem (assistncia ao parto,
necrpsia, contacto com aves doentes e carcaas que estavam saudveis em vida),
Homem infectado Homem, e tambm por inalao e transmisso venrea (OIE,
2005; EFSA, 2007). No caso de recm nascidos, a infeco geralmente vertical e
Listeria monocytogenes transmitida ao feto por via transplacentria ou ento
aquando do nascimento, por infeco do canal cervical materno (OIE, 2005).
O perodo de incubao da listeriose varivel, enquanto em adultos pertencentes
aos grupos de risco pode ser de 3 a 70 dias (o valor mdio de 3 semanas), nos
recm-nascidos infectados durante o nascimento, temos sinais clinicos poucos dias a
algumas semanas depois. A gastroenterite febril, que ocorre em pessoas saudveis
tem um perodo de incubao de 1 a 2 dias (OIE, 2005; Deciso da Comisso
2008/426/CE).
A dose infectante efectiva est dependente da estirpe, do grau de susceptibilidade
do hospedeiro e do meio (FDA, 2002; McLauchlin et al., 2004). No Homem e em
indivduos susceptveis, parece que a ingesto de apenas 102 clulas bacterianas ou
menos so suficientes para causarem doena (OIE, 2005; IFT, 2004; FDA, 2002). Ao
invs destes, adultos saudveis parecem ser capazes de ingerir alimentos fortemente
contaminados sem que isso lhes cause doena (OIE, 2005).
Figura 7: Possveis evolues da infeco por Listeria monocytogenes aps ingesto

de alimentos contaminados (adaptado de Vazquez-Boland et al., 2001).
29
Alm da susceptibilidade do hospedeiro, a dose infectante depende de outros

factores: virulncia do agente causador de infeco e tipo de alimento que pode
proteger a bactria do ambiente hostil do estmago (OIE, 2005).
A gravidade desta doena enorme em virtude da elevada taxa de mortalidade
que lhe est associada, 20-30% (WHO, 2004) e uma das causas mais importantes
de morte associada a doena de origem alimentar nos pases industrializados
(Barrang et al., 2000; EFSA, 2007).
A infeco pode evoluir para um quadro clnico de enorme gravidade (gripe,
meningite, encefalite, septicemia e ocasionalmente culminar em morte), em particular
nos indivduos pertencentes a grupos de risco, em que podemos destacar recmnascidos, grvidas, idosos, imunodeprimidos por doena ou teraputica, pacientes
com cancro, diabetes mellitus, alcolicos e doentes renais (OIE, 2005; Liu, 2007;
Swaminathan & Gerner Smidt, 2007; OGrady, Sedano-Balbs, Maher, Smith &
Barry, 2008).
Na mulher grvida a infeco pode atingir o feto, no qual pode provocar
septicmia, granulomatose generalizada, doena respiratria ou meningite e que por
isso pode nascer gravemente doente ou mesmo morrer antes do nascimento
culminando em aborto ou nado morto (OIE, 2005; EFSA, 2007). A me apenas
experienca um conjunto de sintomas no especficos semelhantes ao de uma gripe.
O risco de morte do feto varia inversamente ao tempo de gestao e no h dados
rigorosos relativamente a esta causa de aborto espontneo, pelo facto de originar
sintomas no especficos na grvida (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).
O nmero de idosos, doentes crnicos e imunodeprimidos est a aumentar, pelo
que a susceptibilidade da populao Europeia dever tambm aumentar e as
consequncias sero mais graves (WHO, 2004). Em Portugal, a populao com idade
superior a 65 anos correspondia em 2007, a 17,4% da totalidade da populao
(1.849.831 indivduos) (INE, 2007), o que demonstra bem como significativo este
grupo susceptvel.
Listeria monocytogenes em indivduos saudveis, pode ter manifestaes clnicas
de gastroenterite, associadas a febre (gastroenterite febril), nusea, diarreia, dor de
cabea, dor abdominal e por vezes mialgia e nos ltimos dez anos a maioria dos
surtos em diversos pases correspondem a esta situao (OIE, 2005; Swaminathan &
Gerner-Smidt, 2007). Contrariamente a outros quadros clnicos mais graves, o
aparecimento de sinais ocorrem mais rapidamente, doze horas aps a ingesto do
alimento contaminado e auto-limitante resolvendo-se em um a trs dias (IFT, 2004;
OIE, 2005). Afecta sobretudo adultos saudveis com consumo de doses infectantes
30
elevadas de Listeria monocytogenes (IFT, 2004; Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).

Esta fase entrica pode eventualmente ocorrer sem sintomas, ou ento estes serem
to tnues que no sejam valorizados. Os indivduos podem tornar-se portadores e
estima-se, tal como referido anteriormente, que 1-10% dos indivduos sem sintomas
possam ser portadores e excretores de Listeria monocytogenes o que torna muito
complicado relacion-lo como agente responsvel por toxinfeco alimentar ou
doena de origem alimentar. Assim, dever haver sempre isolamento a partir do
prprio alimento ingerido para a confirmao (IFT, 2004).
Alm desta gastroenterite, tambm j foi observado em indivduos saudveis o
aparecimento de erupes cutneas, do tipo papular ou pustular que ocorrem
sobretudo em pessoas que tenham manipulado fetos ou abortos de bovinos ou
realizado necrpsias em animais infectados. As erupes cutneas podem
acompanhar-se de febre, arrepios e dor generalizada, quadro clnico mais frequente
na classe veterinria (OIE, 2005). Tambm podem aparecer conjuntivites em
trabalhadores de matadouros.
7.2. Patofisiologia da listeriose humana
Aps a ingesto de alimentos contaminados com Listeria monocytogenes, esta
sobrevive ao pH cido do estmago e vai colonizar a mucosa gstrica (FDA, 1992)
causando sintomas gastro-entricos, tal como diarreia. Depois transloca-se do
intestino e vai-se replicar no bao e fgado, onde a infeco pode ser resolvida pela
imunidade mediada pelos linfcitos T ou ento pode chegar por via sistmica a outras
partes do organismo (Chaturongakul et al., 2008).
Esta bactria invade e multiplica-se em clulas fagocitrias (polimorfonucleares
neutrfilos, macrfagos, clulas dendrticas) atravs do receptor do complemento CR3
e no fagocitrias (entercitos e hepatcitos) (McLauchlin et al., 2004). a prpria
bactria que induz a sua entrada nas clulas no fagocitrias do hospedeiro no caso
dos mamferos (McLauchlin et al., 2004). Depois de invadir as clulas (Figura 8),
Listeria monocytogenes consegue escapar aos vacolos primrios (formados
aquando da entrada na primeira clula) e secundrios (quando depois da replicao
na primeira clula, invade a clula adjacente formando-se um vacolo com uma dupla
membrana), multiplicando-se no citosol da clula do hospedeiro (Chaturongakul et al.,
2008). A sada duma clula para a outra faz-se atravs da polimerizao de actina
(Chaturongakul et al., 2008; Annimo, 2007a; Orndorff et al., 2006; Popowska,
Markiewicz, 2006). A bactria fica rodeada pela actina polimerizada do hospedeiro,
preferencialmente num dos seus plos resultando numa estrutura em forma de cauda
31
de cometa e permitindo a propulso da bactria para a clula adjacente (McLauchlin

et al., 2004).
Os genes envolvidos na invaso e nos movimentos intracelulares nas clulas de
mamferos esto localizados em operes adjacentes ou prximo do cromossoma
bacteriano e a virulncia uma caracterstica multifactorial em que temos pelo menos
nove genes que se expressam na infeco, invaso, sobrevivncia, mobilidade e
disperso para as clulas adjacentes (McLauchlin et al., 2004). Cada etapa da
infeco dependente da produo de factores de virulncia (Figura 8), que incluem
InlA e InlB para adeso e invaso da clula, listeriolisina O (LLO), que uma citolisina
codificada pelo gene hly que forma poros e a fosfolipase C (PI-PLC e Pc-PLC) para
escapar aos vacolos primrios e secundrios e pelo gene ActA para os movimentos
intra e extra-celulares (Orndorff et al., 2006; Popowska & Markiewicz, 2006).
Figura 8: Listeria monocytogenes no interior da clula do hospedeiro (Pamer, 2004).
As estirpes virulentas de Listeria monocytogenes multiplicam-se no interior das

clulas do hospedeiro, destruindo-as, adquirindo acesso a todas as reas do
organismo incluindo o sistema nervoso central, o corao, os olhos, outras
localizaes e ainda o feto no caso de mulheres gestantes (FDA, 1992; IFT, 2007).
A resposta imunitria do hospedeiro, envolve a imunidade inata no especfica e a
adquirida especfica mediada pelos linfcitos T. A resposta imunitria comea
32
imediatamente aps o despoletar da infeco e serve para conter a fase aguda, at a

resposta adquirida e mediada por linfcitos T estar pronta para eliminar as bactrias
que se encontram no interior das clulas (Orndorff et al., 2006). Embora at h pouco
tempo se pensasse que os anti-corpos no tinham qualquer efeito protector
relativamente infeco por Listeria monocytogenes, sabe-se hoje que vo
neutralizar a LLO, o que torna a bactria incapaz de escapar ao fagossoma tornandoa susceptvel aos mecanismos dos vacolos e culminando na sua morte (Orndorff et
al., 2006).
Existe um risco aumentado de contrair a doena por parte das grvidas, mas a
razo porque tal acontece ainda no est bem determinada, tendo sido proposta
como explicao a infeco por via hemtica (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007;
Orndorff et al., 2006) ou ento por via ascendente, especialmente nos casos de
listeriose neonatal. O tero, tal como o sistema nervoso central possibilita o
crescimento da bactria mas parece ser certo que no existe qualquer tropismo inicial
(Orndorff et al., 2006).
Nos indivduos no grvidos, as sequelas mais frequentes so as localizadas no
sistema nervoso central (SNC) e o envolvimento deste traz vrias complicaes, uma
vez que Listeria monocytogenes consegue replicar-se intra-celularmente. Os frmacos
capazes de combater a infeco tero que atravessar a barreira hemato-enceflica e
ainda algumas das clulas do SNC que so susceptveis infeco por Listeria
monocytogenes e que no expressam os antignios MHC classe I. Assim, a
imunidade celular mediada pelos linfcitos T, muito importante neste tipo de infeco,
menos efectiva (Orndorff et al., 2006).
A antibioterapia geralmente no funciona e isso deve-se ao facto descrito
anteriormente, em que a bactria consegue multiplicar-se e passar de clula para
clula sem nunca abandonar o ambiente protector da clula do hospedeiro, o que no
s limita a aco do antibitico, como exige uma boa resposta imunitria do tipo
celular por parte do hospedeiro (Orndorff et al., 2006).
Os isolados de Listeria monocytogenes so naturalmente susceptveis s
penicilinas, aminoglicosdeos, trimetoprim, tetraciclinas, macrlidos e vancomicina.
Possuem reduzida susceptibilidade ou mesmo resistncia ao sulfametoxazol,
cefalosporinas e quinolonas mais antigas, mas so geralmente sensveis
fluorquinolona. A resistncia antimicrobiana rara nos isolados clnicos de listeriose
humana mas algo significativa nos isolados de animais, o que pode significar que
tambm vai emergir em humanos (Orndorff et al., 2006).
33
O tratamento da listeriose consiste na administrao de doses intravenosas

elevadas de penicilina ou ampicilina e simultaneamente ou no aminoglicosdeos. Nos
casos de alergia penicilina, as drogas de eleio so vancomicina/teicoplanina ou
trimetoprim/sulfametoxazol (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007). Todas as estirpes
de L. monocytogenes so intrisecamente resistentes s cefalosporinas (EFSA, 2008).
No h vacina contra Listeria spp. e por isso o nico meio de prevenir a Listeriose
reduzindo a exposio de pessoas susceptveis a alimentos contaminados. Por esta
razo a contaminao dos alimentos deve ser controlada devendo ser informada a
populao de risco sobre as regras bsicas de higiene (Swaminathan & Gerner-Smidt,
2007).
8. Epidemiologia
A investigao epidemiolgica demonstrou que so poucos os alimentos que no
transmitem Listeria monocytogenes causadora de doena, a maioria dos casos so
espordicos ou surtos e esto associados a alimentos processados (Roche &
Gracieux, 2009).
A primeira vez que Listeria monocytogenes foi associada a doena no Homem, foi
no Canad em 1981, quando surgiu o primeiro surto de doena de origem alimentar
que atingiu 60 pessoas e causou a morte a 20 devido ao consumo de uma salada de
repolho cr. Um outro surto no ano de 1983, em Massachusets teve origem na
ingesto de leite de vaca pasteurizado, questionando-se a eficcia da pasteurizao
na eliminao deste agente. A contaminao ter-se-ia devido a uma elevada
concentrao de Listeria monocytogenes no leite cr, protegida no interior das clulas.
Estudos posteriores demonstraram que a pasteurizao eficaz a eliminar esta
bactria (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).
Antes de ocorrerem grandes surtos, Listeria monocytogenes era tida apenas como
um
importante agente patognico em veterinria, e interessantemente tambm
associado ingesto de alimentos contaminados para animais (Barbalho et al., 2005).

Aps as ocorrncias de infeces descritas, foi ento associada ingesto de
diferentes gneros alimentcios contaminados, onde se incluem o queijo, a carne, o
leite, os vegetais e o peixe (O Grady, Sedano-Balbs, Maher, Smith & Barry, 2008).
Um grande surto com queijo Mexican Style, em 1985, estabeleceu definitivamente
Listeria monocytogenes como agente de doena de origem alimentar. Outros surtos
associados a queijo evidenciaram o perigo da utilizao de leite cru na produo de
queijo. Os alimentos pr-cozinhados ou prontos a consumir tambm
constituiem
34
motivo de preocupao, pois tm ocorrido surtos de listeriose relacionados com este

grupo de alimentos (Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).
No Reino-Unido foram referenciados dois casos de listeriose associados a frango
pr-cozinhado refrigerado e a per adquiridos em supermercado, envolvendo uma
mulher grvida e um indivduo com cancro, respectivamente, passando a carne de
aves a ser considerada uma fonte de listeriose (Barbalho et al, 2005).
Listeria monocytogenes tem sido isolada de carcaas de frango e seus derivados,
em pases industrializados tais como os EUA e pases da Europa (Tabela 6). Foi
tambm isolada em sandwich de frango e em alimentos cozinhados prontos a
consumir base de frango (Barbalho et al., 2005).
Contagem
Deteco
Listeria
Estnia
Aves
Carne de frango, cozinhado
Aves
---
---
Irlanda
Aves
65
104
36,5
no processamento
33
30,3
---
---
---
104
545
---
---
---
---
no comrcio retalhista
Aves

Itlia
Aves
Rpublica
Bando
--385
0
83
Checa
Polnia
Bando
710
Eslovquia
Bando
153
---
Tabela 6: Listeria monocytogenes em carcaas de frango e seus derivados, 2006

(Adaptado de EFSA, 2007).
Em 2002, foi levado a cabo um estudo para avaliar a necessidade e a viabilidade

de uma rede europeia que centralizasse toda a informao sobre as infeces
humanas provocadas por Listeria monocytogenes. Em todos os pases questionados
(ustria, Alemanha, Blgica, Dinamarca, Esccia, Espanha, Finlndia, Frana, Grcia,
Holanda, Irlanda, Islndia, Itlia, Noruega, Portugal, Reino Unido, Sucia, Suia),
excepto Portugal, existiam sistemas de vigilncia da listeriose e tinham um laboratrio
35
> 100 ufc/g
com
Detectada
com
100 ufc/g
N
Detectada
---
Frana
Aves
Testadas
Unidades
N
em 25g
Testadas
28
(presena)
Descrio
Unidades
Pas
(contagem)
monocytogenes
nacional de referncia (LNR) para Listeria monocytogenes. Em todos os pases, a

definio de caso de listeriose estava baseada no isolamento de Listeria
monocytogenes. Catorze LNR utilizavam pelo menos um mtodo de tipificao das
estirpes humanas. Treze pases caracterizavam os isolados das estirpes humanas por
electroforese em campo pulstil (PFGE) seguindo um protocolo harmonizado ou
tinham inteno de o fazer. Para os pases participantes, a existncia de uma rede de
vigilncia
europeia
da
listeriose
seria
um
verdadeiro
valor
acrescentado,
especialmente para a deteco e a investigao de surtos. Tambm foi confirmada a

viabilidade de uma rede de vigilncia baseada nos programas nacionais existentes
(Valk et al., 2005).
Em 2005 foram referidos na Comunidade Europeia 1427 casos de listeriose, e em
2006
os
estados
membros
reportaram
1583
casos,
todos
confirmados
laboratorialmente, o que corresponde a uma mdia de 0,3 casos por cada 100 000
habitantes, representando um acrscimo de 8,6% relativamente aos anos de 2005 e
2004 (EFSA, 2007). Refira-se ainda que estes valores so os mais elevados dos
ltimos oito anos na Europa (Denny & McLauchlin, 2008). A incidncia de listeriose
em 2006 (Figura 9), relativamente aos cinco anos anteriores na Unio Europeia, teve
um aumento significativo, para o qual muito contriburam os aumentos da doena
Figura 9: Incidncia de listeriose humana nos pases com aumentos estatisticamente

significativos, periodo entre 1999 a 2006 (adaptado de Denny & McLauchlin, 2008).
registados em Frana e Repblica Checa (EFSA, 2007). Neste ultimo pas, ocorreu
um surto, com setenta e oito pessoas afectadas e treze mortos, associados ao
36
consumo de queijo de pasta mole, tendo sido o nico surto reportado nesse ano
(Denny & McLauchlin, 2008).
O caso da Frana particular, pois a listeriose de declarao obrigatria o que
faz aumentar os casos reportados (EFSA, 2007). A Frana, Alemanha e Reino Unido
apresentaram 64% do total dos casos de listeriose humana declarados em 2005 e
2006 na Unio Europeia. A Dinamarca e o Luxemburgo registaram as maiores
incidncias de listeriose, com valores iguais ou superiores a 0,9 casos por 100 000
indivduos no ano de 2006 (Denny & McLauchlin, 2008).
A listeriose em Portugal no uma doena de declarao obrigatria mas h
estudos que indicam a sua existncia (Mena et al., 2004; Chambel et al., 2007).
Segundo os resultados apresentados pela prpria EFSA, a situao em Portugal no
est oficialmente documentada e no h valores actuais quanto expressividade da
listeriose humana.
A listeriose humana ocorre durante todo o ano na Europa, mas em 2006 existiu
um pico no final do ano (Denny & McLauchlin, 2008). Quanto distribuio etria
(Figura 10), a maioria das infeces ocorrem no grupo etrio acima dos 65 anos
(55,6%) e do sexo masculino (54%), seguido do grupo etrio imediatamente anterior
compreendido entre os 45 e os 65 anos (24,3%). As crianas com idade inferior a 4
anos tm uma incidncia de 0,4 casos por cada 100 000 habitantes (7%) (Denny &
McLauchlin, 2008; AVEC, 2008; EFSA, 2007).
Figura 10: Incidncia de listeriose humana por grupo etrio (adaptado de Denny &
McLauchlin, 2008).
37
Aproximadamente 33% dos casos documentados de listeriose acontece em

mulheres grvidas e estas representam 60% da totalidade dos casos entre os 10 e os
40 anos (Orndorff et al., 2006).
No total dos casos conhecidos de toxinfeces causadas por Listeria
monocytogenes, 59,7% tiveram origem em contaminao do ambiente domstico e
36,6% por causas desconhecidas (EFSA, 2007).
Nos Estados Unidos da Amrica, estima-se que anualmente ocorram 76 milhes
de toxinfeces alimentares, e sabendo-se que os dados (tal como no caso Europeu)
se reportam apenas aos casos confirmados este valor est sem dvida sub-estimado.
Destes, 30% tem causa bacteriana (Tabela 7), 3% parasitria e 67% tm origem viral
(IFP, 2004).
Bactria
N de doentes
N de mortes
27 360
1 963 141
99
58
Clostridium perfringens
248 520
Enterobacter sakazakii
1:100 000 Crianas
2 493
499
1 342 532
556
Shigella spp.
89 648
14
Staphylococcus aureus
185 060
145
18
86 731
Bacillus cereus
Campylobacter spp
Clostridium botulinum
Salmonella spp.
Vibrio spp
Yersinia enterocolitica
Tabela 7: Infeces de origem alimentar nos EUA (Adaptado de IFP, 2004)
O estudo epidemiolgico da listeriose particularmente complexo, porque o tempo

de incubao pode ser longo e muito varivel, cinco a setenta dias, (Swaminathan &
Gerner-Smidt, 2007). Aliam-se outros factores tais como o facto dos gneros
alimentcios estarem disponveis para consumo apenas num perodo de tempo
relativamente curto aps a sua colocao no mercado. Por outro lado, a
contaminao do ambiente fabril pode manter-se por um perodo de tempo longo, e
por isso podem produzir-se alimentos contaminados mesmo com longos intervalos de
tempo entre produes. Assim, as ocorrncias de listeriose podem ser muito
dispersas no tempo e no espao o que impossibilita muitas vezes relacionar a doena
38
com o alimento, embora se assuma que a maioria dos casos de listeriose se devam a
alimentos (McLauchlin et al., 2004).
9. Controlo de Listeria monocytogenes
No podemos esperar conseguir um controlo absoluto da presena de Listeria
monocytogenes em matadouros, salas de desmancha e locais de transformao de
carcaas, pois uma bactria ubiquitria e que por isso facilmente poder re-infectar
estes locais, mas podemos tomar determinadas medidas pro-activas e correctivas que
minimizem este risco.
9.1.
Medidas pro-activas
9.1.1. Reduo dos agentes patognicos para o Homem nos bandos

A existncia de agentes patognicos nos bandos conduz a contaminao directa e
indirecta de alimentos. Consequentemente, a pele e as penas contaminadas por fezes
so as fontes principais de contaminao das carcaas.
Os agentes entricos patognicos, tais como Salmonella spp. e C. jejuni, existem
em vrias espcies animais e por isso uma espcie animal pode servir como
reservatrio para uma outra. Assim as exploraes devem dedicar-se apenas a uma
nica espcie animal (Doyle & Erickson, 2006).
As variaes genticas podem alterar o modo como as aves resistem colonizao
bacteriana. Foram observadas nas galinhas diferentes respostas colonizao por S.
Enteritidis ou vacinao e tem sido sugerida a seleco de linhagens genticas que
possuam resistncia gentica natural s infeces entricas, objectivo esse dificultado
pela falha na identificao dos mecanismos genticos independentes que o controlam
(Doyle & Erickson, 2006).
Devem ser adoptadas prticas de saneamento que possam impedir a contaminao
da explorao, do ambiente e do transporte (Doyle & Erickson, 2006):
Limpeza dos avirios e equipamento entre a sada de um bando e entrada de

outro, em sistema all-in/all-out que inclui a desinfeco do sistema de
fornecimento de gua;
Remoo de todo o material fecal e camas, antes da entrada de um novo

bando;
Minimizao da exposio do equipamento, da alimentao, e dos bandos aos

animais selvagens (pssaros, roedores, etc.);
39
Restrio e minimizao do trfego na explorao, nos alojamentos e entre

bandos;
Existncia de locais de higienizao de veculos e do pessoal;
Limpeza e desinfeco das caixas e veculos de transporte aps cada

utilizao.
9.1.2. Boas prticas de abate e HACCP (Hazard Analysis Critical Control

Point)
As etapas mais susceptveis de originarem contaminao so a recepo das
aves vivas, o escaldo, a depena, a lavagem das aves com gua sob presso devido
formao de aerossois, a eviscerao e os tneis de frio.
Durante o transporte as aves encontram-se geralmente em stress e os portadores
saudveis podem eliminar muitas bactrias patognicas juntamente com as fezes. Por
ingesto das fezes, as aves no portadoras tornam-se susceptiveis infeco.
A infeco pode ser reduzida se o tempo de espera at entrada na linha de
abate for pequeno, e mantendo a zona de recepo das aves limpa e isenta de penas
e fezes de bandos anteriores. A limpeza regular das instalaes e do equipamento
associada a uma drenagem adequada ajudam a eliminar o nmero de agentes
patognicos que entram na linha de abate. As jaulas e os camies contaminados
introduzem microrganismos patognicos no interior do matadouro. Quando as jaulas
de transporte dos animais so limpas, deve ser eliminada a matria orgnica primeiro
e s depois aplicado o desinfectante. De modo a minimizar a contaminao
transversal entre a rea de recepo de aves vivas e as reas menos contaminadas
do matadouro, benfico que a dependura seja efectuada em zona escurecida e que
haja limitao da circulao entre estas reas. A zona de recepo de aves vivas
dever ser limpa regularmente (Herenda & Franco, 1996).
De forma muito simplificada, podemos minimizar as contaminaes cruzadas se
durante o abate eliminarmos as aves doentes, se o tratamento das aves com penas e
patas ocorrer em zona separada da de eviscerao e se for usada gua potvel em
abundncia para lavagem tanto dos equipamentos e utensilios como das mos. A
limpeza dos trabalhadores e das instalaes deve ser regular e rigorosa (Hubbert,
Hagstad, Spangler, Hinton & Hughes, 1996).
As boas prticas, tal como na agricultura devem existir para minimizar os perigos
microbiolgicos associados aos alimentos desde a sua produo e atravs da
distribuio dos produtos finais (USDA, 1999).
40
Algumas das boas prticas que devem ser aplicadas para de uma forma geral
minimizar os riscos de contaminao por Listeria monocytogenes (USDA, 1999):
a. Seleccionar matrias-primas e ingredientes e se necessrio utilizar critrios
microbiolgicos para aceitar ou rejeitar essas matrias-primas e ingredientes;
b. Evitar a contaminao e/ou a introduo de L. monocytogenes nos locais de
processamento de alimentos; combater a multiplicao e a disperso de Listeria
monocytogenes nos locais de processamento de alimentos, nomeadamente
programas de gesto e monitorizao do ambiente;
c. Inactivar
atravs de pasteurizao,
esterilizao,
confeco a presso elevada, entre outros;

d. Remover Listeria monocytogenes dos produtos, atravs da lavagem por exemplo;
e. Prevenir a recontaminao de alimentos j processados e embalados, por
exemplo separando os alimentos crus dos j cozinhados; reduzir os teores
microbianos em alimentos cozinhados e embalados; prevenir o aumento dos
nveis de Listeria monocytogenes entre a embalagem e o consumo;
f. Estabelecer planos e incentivos que contribuam para minorar os riscos atravs do
desenvolvimento de sistemas de segurana alimentar como por exemplo o
HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point).
O sistema HACCP uma aproximao cientfica ao controlo do processo.
projectado para impedir a introduo de perigos, assegurando que os controlos dos
pontos crticos so aplicados em qualquer momento do sistema de produo
alimentar, onde as situaes perigosas ou crticas poderiam ocorrer. Os perigos
incluem a contaminao biolgica, qumica, ou fsica de alimentos. Embora o HACCP
d algumas garantias de que as aves abatidas e desmanchadas em locais onde ele
est implementado so seguras, no h maneira de eliminar completamente todos os
perigos. A implementao do HACCP mais eficaz quando so previamente
cumpridos os pr-requisitos e se fazem auditorias sistemticas para avaliar a eficcia
(USDA, 1999; Northcutt & Russel, 2003).
9.2.
Tratamentos tecnolgicos aplicados a carcaas e carne de frango
9.2.1.
Irradiao
A irradiao de carcaas de frango, prtica utilizada em diversos pases como o

Brasil e EUA, mas no permitida na Unio Europeia, reduz a contaminao das
carcaas por Listeria monocytogenes, contudo algumas clulas podem sobreviver e
41
crescer durante o perodo de armazenamento em refrigerao (Zhu, Mendona, Ismail

& Ahn, 2008).
Como efeitos colaterais temos a alterao da flora microbiana, consequncia das
diferentes sensibilidades que os vrios grupos de bactrias possuem irradiao,
aumento da oxidao e alteraes da cor e sabor da carne.
9.2.2.
Tratamentos anti-microbianos (AMT) das carcaas
Na UE, a gua do escaldo e da lavagem tem que ser gua potvel, no entanto
existem outros pases como
EUA e Brasil, em que permitida a adio de
hipocloritos gua de lavagem dos frangos, que ajudam a eliminar Listeria

monocytogenes e outros agentes patognicos das carcaas. O tratamento antimicrobiano (AMT) utilizado com maior frequncia na descontaminao de carcaas de
frango o hipoclorito de sdio, por ser barato, seguro e de fcil utilizao. No entanto,
as suas propriedades anti-microbianas podem ser diminudas por variao de pH,
concentrao (de hipoclorito), composio da gua e existncia de matria orgnica.
Alm disso, podem originar maus odores e compostos carcinognicos (tricloraminas)
resultantes da reaco do cloro com a matria orgnica (Barbalho et al, 2005;
Northcutt, Smith, Ingram, Hinton & Musgrove, 2007).
Segundo a Association of Poultry Processors and Poultry Trade in the EU
Countries (AVEC), as medidas rigorosas de higiene aplicadas actualmente nas
exploraes da UE e os programas de controlo de zoonoses so suficientes para o
controlo microbiolgico das carcaas. Foram publicados resultados por parte da
Scientific Committee on Health and Environmental Risks (SCHER), Scientific
Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks (SCENIHR) e Panel on
Biological Hazards (BIOHAZ, EFSA) em Abril de 2008 que levantam srias dvidas
sobre a eficincia da aplicao de AMT. Contudo, a Comisso Europeia poder
propor a utilizao de AMT durante um perodo de teste de dois anos, muito pelo facto
de os EUA exercerem presso quanto ao actual impedimento pela UE de importao
da sua carne de frango tratada com solues de cloro (AVEC, 2008).
10. Causas de sucesso da Listeria monocytogenes
Podemos questionar sobre a razo de Listeria monocytogenes se ter tornado uma
bactria emergente nos pases desenvolvidos e industrializados. O que acontece aos
pases desenvolvidos como a Alemanha, o Reino Unido, a Dinamarca, a Espanha, a
Frana ou a Finlndia, onde existe j a implementao dos planos de HACCP,
prticas meticulosas de higiene, tecnologia avanada e monitorizao rigorosa, mas
42
cuja listeriose tem vindo a aumentar nos ltimos anos? Podemos achar que estamos
apenas perante melhores e maiores estratgias de comunicao de risco e de casos
de doena, quando comparado com pases como Portugal ou do Leste Europeu cujos
dados referentes listeriose so escassos? Dever-se- a um consumo crescente de
alimentos processados com maior risco de contaminao ou ser a prpria bactria
que est a mudar? (Hagens, 2008).
Em suma, as causas deste sucesso podem ser (WHO, 2004. Annimo, 2007 d):
I. Tcnicas laboratoriais de isolamento melhores, mais sensveis e mais especficas;
II. Caractersticas da prpria bactria que ao invs de outros agentes causadores de

toxinfeces alimentares bem mais conhecidos e frequentes, no causam sintomas
tpicos de gastroenterite, apresentando um quadro de sintomas mais grave,
caracterizado por meningite ou septicmia;
III. Afecta com maior frequncia os indivduos mais susceptveis o que pode explicar a
taxa de mortalidade elevadssima que lhe est associada, e este potncial efeito
nefasto em consumidores vulnerveis que torna L. monocytogenes to perigosa;
IV. Perodo de incubao muito varivel, o qual pode chegar aos dois meses ou mais e
que torna muito difcil associ-la infeco, em particular nos casos ou em grupos
pequenos;
V. Bactria diferente dentro do grupo de agentes patognicos de origem alimentar, por

crescer a temperaturas muito baixas, que podem atingir os 0C (psicrotrficas), o
que lhe confere capacidade para se multiplicar em ambientes refrigerados;
VI. mais resistente ao calor, desidratao e irradiao que as suas congneres, e

tambm mais tolerante a variaes ambientais;
VII. Aumento acentuado da produo de produtos refrigerados prontos a serem

consumidos com prazos de validade longos, que podem criar nichos ecolgicos para
o desenvolvimento de Listeria monocytogenes e que no foram considerados
aquando da criao dos sistemas massificados de produo actuais;
43
VIII. Aumento muito significativo da produo e do consumo de carne de frango (Anurio

pecurio, 2008);
IX. Variabilidade de virulncia de L. monocytogenes, que faz variar a sobrevivncia e a

virulncia destes subtipos (Lpez, Surez, Chico-Calero, Navas, Martinez-Suarez,
2006).
10.1. Modulao pelo Stress: Termotolerncia de Listeria monocytogenes
Um dos factores que explica a ocorrncia de infeces alimentares por Listeria
monocytogenes o facto de to bem se adaptar s temperaturas de refrigerao.
Actualmente, referido que Listeria monocytogenes tem capacidade de adquirir
termoresistncia, o que grave tendo em conta que o processamento trmico dos
alimentos o mtodo mais frequentemente aplicado para destruio dos agentes
patognicos (Lin & Chou, 2004; Sergelidis & Abrahim, 2009).
Embora estejamos na presena de uma bactria no produtora de esporos, ela
tem capacidade para se tornar tolerante a temperaturas elevadas (Sergelidis &
Abrahim, 2009).
Os microrganismos desenvolvem termotolerncia quando so expostos a
diferentes tipos de stress ambiental tal como choque trmico, choque osmtico, subnutrio, contacto com cidos ou bases, exposio ao etanol e ao perxido de
hidrognio.
As condies a que sujeitamos as bactrias durante o processamento dos
alimentos mimetizam condies de stress ambiental o que fazem com que Listeria
monocytogenes monte uma resposta adaptativa durante a exposio a intervenes
sub-letais do processamento (Skandamis, Yoon, Stopforth, Kendall & Sofos, 2007).
Muitas bactrias desenvolvem tolerncia a temperaturas elevadas aps terem sido
expostas previamente a valores de temperatura acima da sua temperatura ptima de
crescimento, por um perodo curto de tempo. O choque trmico de extrema
importncia em sade pblica, em especial quando temos bactrias psicrotrficas
como o caso de Listeria monocytogenes, pois as clulas que sobrevivem podem
depois crescer durante o armazenamento em refrigerao e mais rapidamente que as
saprfitas. No h ainda dados quanto s temperaturas que induzem a
termotolerncia bacteriana (Sergelidis & Abrahim, 2009).
A carne e os produtos base de carne quando so aquecidos lentamente at
temperatura desejada no seu centro trmico, podem ter microrganismos tolerantes ao
aumento da temperatura por exposio prvia a choque trmico. Quanto mais lento o
44
aquecimento, maior a tolerncia temperatura. Nos alimentos slidos h penetrao

do calor por conduo de forma lenta, criando um gradiente trmico que pode
funcionar como choque trmico provocando um aumento da resistncia de Listeria
monocytogenes temperatura. (Sergelidis & Abrahim, 2009).
Este fenmeno deve-se a uma resposta fisiolgica por parte de Listeria
monocytogenes, para proteger as protenas celulares, traduzindo-se em produo de
varias protenas conhecidas por protenas de choque trmico (PCT) (Sergelidis &
Abrahim, 2009). Estas tm como funo proteger a clula das alteraes fsicas
induzidas pelo calor e tambm induzir a proteolse ou novo enrolamento de protenas
anormais que tenham sido desnaturadas pelo calor. Estas PCT so chaperoninas, um
tipo de protenas citoplasmticas, com vrias funes de proteco da clula, tais
como assistncia nas interaces protena-protena (ex: enrolamento, conformao,
estabilizao das protenas parcialmente no enroladas, transposio das protenas
ao longo da membrana celular, entre outras) que existem nos procariotas e nos
eucariotas e que mesmo sem factores de stress podem ser encontradas nas clulas
ainda que em concentraes reduzidas.
O aumento da expresso das chaperoninas regulado ao nvel da sua
transcrio, sendo induzido em grande parte por factores de choque trmico. O
aumento da sntese destas protenas pode dever-se tambm exposio a outros
factores de stress tais como etanol, arsnio, luz ultra-violeta, privao de gua,
privao de alimento, etc., mostrando que mais do que protenas de choque trmico,
estas so parte de uma resposta a um factor modulador de stress da clula. Parece
no haver universalidade quanto a estas estruturas protecas, sendo no entanto
comuns a um ou dois tipos de factores de stress (Sergelidis & Abrahim, 2009).
Aps ser desenvolvida a termotolerncia como resultado da adaptao ao calor, L.
monocytogenes desenvolve em simultneo tolerncia a outros factores de stress
(Sergelidis & Abrahim, 2009). Em geral temos que, para um choque trmico de 45C
durante uma hora, aumenta a tolerncia ao NaCl (25%), ao etanol (18%) e ao cristal
de violeta (0,01%), (Lin & Chou, 2004). A termotolerncia parece estar dependente da
combinao de vrios factores de stress, mas no da sequncia com que eles
ocorrem. Uma combinao de pH baixo e temperatura insuficientemente alta pode ser
suficiente para que a segurana do alimento seja posta em causa (Skandamis et al.,
2007).
O grau que esta resistncia pode assumir depende da espcie bacteriana, da
estirpe (Lin & Chou, 2004; Skandamis et al., 2007), da fase de crescimento (Lin &
Chou, 2004), da composio do meio do choque trmico e da sua temperatura. A
45
temperatura indutora de stress trmico a que as clulas so sujeitas dever ser igual
que provoca morte bacteriana. Assim, pode acontecer morte bacteriana em
simultneo com a aquisio de termotolerncia por parte de outras bactrias ainda
vivas (Sergelidis & Abrahim, 2009).
Esta adaptao pode ter consequncias gravssimas para a indstria alimentar,
comprometendo a conservao e a segurana dos alimentos, sem esquecer os
mltiplos factores de stress a que os alimentos esto sujeitos durante o
processamento, distribuio e armazenamento, fases essas que devero ser revistas
e estudadas de modo a obterem-se novos modelos preditivos de segurana alimentar
(Sergelidis & Abrahim, 2009).
Os mecanismos de adaptao ao stress causado pelas condies ambientais ou
pela transformao e conservao dos alimentos na indstria (temperaturas extremas,
falta de nutrientes e acidez), podem causar alteraes na clula bacteriana, que se
por um lado dificultam a deteco de clulas de L. monocytogenes danificadas de
forma subletal, por outro lado, podem afectar a virulncia. L. monocytogenes encontra
condies similares (pH cido, temperatura elevada, stress oxidativo) durante o seu
ciclo intestinal e tambm intracelular (no fagossoma). possvel que algumas
tecnologias normalmente usadas na indstria alimentar, como a refrigerao,
desidratao, congelao, descongelao, tratamentos com sal, pH cido, exposio
a desinfectantes e outras substncias antimicrobianas sejam, entre outros factores,
capazes de induzir alteraes na virulncia bacteriana e seleccionar subpopulaes
de bactrias mais resistentes ao stress e mais virulentas, e podem atingir a populao
humana, por isso necessrio estudar a sua rastreabilidade e conhecer o risco real
que representam. A anlise da virulncia de estirpes especficas de L. monocytogenes
isoladas da indstria alimentar podera contribuir para resolver o dilema que envolve a
elevada contaminaco dos alimentos por L. monocytogenes ao longo da cadeia de
produo de determinados alimentos, e que no acompanhada de um
correspondente elevado nmero de casos de listeriose (Lpez et al., 2006).
11. Deteco de Listeria monocytogenes

Sabendo que as espcies de Listeria so encontradas essencialmente como
contaminantes de alimentos, isto pode indicar um potncial risco de contaminao por
L. monocytogenes e a sua presena requer actuao imediata por parte do operador
econmico. So por isso fundamentais s metodologias rpidas e fidedignas que
permitam identificar a presena de Listeria monocytogenes, diferenciando-a das
restantes espcies do gnero, aspecto muito relevante para a indstria alimentar.
46
11.1. Mtodo clssico

Actualmente a presena de Listeria spp. e de Listeria monocytogenes, detectada
pelo mtodo de referncia ISO 11290-1, modificado em Fevereiro de 2005 (Roche &
Gracieux, 2009). Neste mtodo de referncia, depois de utilizados meios lquidos
selectivos de enriquecimento, as amostras ou as diluies apropriadas so semeadas
em meio selectivo, Agar Listeria de acordo com Ottaviani e Agosti (ALOA). Este meio,
baseia-se
simultaneamente
na
deteco
da
actividade
da
fosfolipase
fosfatidilinositol-especfica (PIPLC) e na actividade da -glucosidase (Leclercq, 2004).

A PIPLC uma enzima associada virulncia que est presente nas espcies de
Listeria monocytogenes e Listeria ivanovvi, cuja actividade detectada no meio de
ALOA atravs da degradao do L--fosfatidilinositol (suplemento enriquecedor
presente no Agar), o que leva formao de um precipitado em volta da colnia,
originando um halo opaco. A actividade da -glucosidase torna-se visivel num
substrato cromognico, 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glicosido, o qual hidrolisado e
confere s colnias cor azul em todas as espcies de Listeria spp. Alm destes, o
ALOA tem tambm um suplemento selectivo, constitudo por diferentes antibiticos e
agentes anti-microbianos (cido nalidxico, ceftazidime, polimixina B, cicloheximida, ou
anfotericina B) (Leclercq, 2004).
Este mtodo, alm de moroso, (Rodriguez-Lzaro et al., 2004; Liu, 2008), cinco
dias para casos negativos e mais de dez para os positivos (OGrady et al., 2008)
baseia-se numa srie de provas fundamentadas nos caracteres fenotpicos,
bioqumicos e serolgicos (Liu, 2008). Estes, alm de demorados podem dar
resultados no fidedignos uma vez que caracterizam protenas de L. monocytogenes
cuja estrutura e funo pode ser alterada por factores externos, por exemplo a
existncia de colnias atpicas de bactrias mutantes que no produzam PIPLC
(Leclerq, 2004).
Nem sempre se conseguem obter colnias tpicas e determinar a concentrao
inicial com os mtodos de referncia, relativamente a alguma estirpes de Listeria
monocytogenes. Nos casos em que aps 24 ou 48 horas de incubao conforme
descrito na norma ISO 11290 1 e 2, no se observarem colnias tpicas, devemos
prolongar o prazo em pelo menos mais 96 horas uma vez que os tempos
recomendados podem ser claramente insuficientes (Leclerq, 2004). Esta situao
torna este mtodo ainda mais moroso alm de no permitir a distino entre espcies
dificultando o isolamento e a contagem de Listeria monocytogenes. Por outro lado se
a amostra tiver para alm de Listeria monocytogenes outras bactrias em proporo
47
elevada, tal como L. innocua, estas podem competir com a espcie-alvo pelo meio de
enriquecimento (Amagliani, Giammarini, Omiccioli, Brandi & Magnani, 2007).
Roche & Gracieux (2009), determinaram que algumas estirpes menos virulentas
de Listeria monocytogenes so mais susceptiveis a alguns dos agentes selectivos
presentes nos diferentes meios selectivos como o caso da ceftazidime do ALOA que
podero no ser detectadas pela metodologia ISO. Este facto tem particular
relevncia nos alimentos que a legislao prev ausencia total deste microrganismo.
11.2. PCR
11.2.1. Generalidades
Como consequncia da morosidade dos mtodos convencionais de identificao
de Listeria monocytogenes, foram feitos ao longo do tempo esforos para encontrar
mtodos alternativos mais eficientes e rpidos. Alguns dos mtodos desenvolvidos
baseiam-se na deteco de DNA ou RNA em vez de protenas, uma vez que os
cidos nucleicos, em particular o DNA, tm menor probabilidade de serem afectados
por variaes externas (Liu, 2008). Alm disso, baseando-se na amplificao do sinal
biolgico (DNA ou RNA), estes mtodos so mais rpidos e sensveis e permitem
reduzir o tempo de anlise at a obteno de resultados. Os custos destes mtodos
so tambm reduzidos, exceptuando-se o investimento inicial, o que ptimo para a
indstria (OGrady et al., 2008).
Os mtodos moleculares para deteco e identificao de Listeria monocytogenes
remontam aos anos 90 e nos ltimos 10 anos tm nos ultimos tempos sofrido enorme
evoluo (Rantsiou, Alessandria, Urso, Dolci & Cocolin, 2008). Um dos mtodos
moleculares a reaco em cadeia da polimerase (Figura 11) vulgarmente conhecido
por PCR (Polimerase Chain Reaction) que permite uma amplificao controlada in
vitro, por enzimas, de um fragmento de DNA de interesse, de forma extremamente
rpida. Com o PCR, quantidades mnimas de material gentico podem ser
amplificadas milhes de vezes em poucas horas, permitindo a deteco rpida e fivel
de diferentes marcadores genticos (Brown, 2006).
Permite amplificar qualquer regio da cadeia de DNA, desde que conhecidas as
sequncias das extremidades dessa mesma regio (Figura 12), para que possamos
adicionar dois primers, que so pequenas sequncias de DNA iniciadoras que vo
hibridar com a molcula de DNA que queremos amplificar, um em cada extremidade
da hlice (Brown, 2006).
48
Figura 11: Exemplo da reaco da

polimerase em cadeia PCR (adaptado
de Vierstraete, 1999).
Figura 12: Etapas iniciais de um PCR: desnaturao da dupla cadeia de DNA e

hibridao dos primers (adaptado de Vierstraete, 1999).
A amplificao efectuada por uma enzima denominada polimerase. Esta

polimerase, tal como todas as enzimas funcionam melhor temperatura corporal.
Abaixo da sua temperatura ptima a actividade enzimtica reduzida e acima da
temperatura ptima a polimerase destruida. Contudo, para que as cadeias de DNA
sejam separadas e ocorra a ligao dos primers, necessria uma temperatura de
95C. A esta temperatura as polimerases da maioria dos organismos destruida. A
soluo encontrada foi a utilizao de uma DNA-polimerase sintetizada pela bactria
termfila Thermus aquaticus, denominada de Taq polimerase que termoestvel,
49
resistindo desnaturao pelo tratamento trmico da metodologia PCR (Brown,

2006).
Para que a amplificao do material gentico comece, a enzima Taq-polimerase
adicionada ao DNA com os primers e nucletidos. De modo a dar inicio sntese de
novas cadeias complementares, a mistura ento aquecida (a 95C) para que as
cadeias de DNA se separem e arrefecida em seguida para que os primers possam
hibridar nas suas posies respectivas, seguindo-se um aquecimento para extenso
das cadeias de DNA, cpias do DNA molde (sntese). O ciclo desnaturaohibridao-sntese geralmente repetido 25 a 30 vezes resultando numa sntese de
vrias centenas de milhar de cpias de fragmentos do DNA amplificado. No final do
PCR, geralmente a mistura resultante da reaco analisada atravs de electroforese
em gel de agarose. O DNA produzido durante a reaco ser visvel como uma banda
discreta revelada pelo brometo de etdeo (Brown, 2006).
11.2.2. Primers
A seleco dos primers essencial para a execuo da metodologia PCR, em
que apenas se tem amplificao da regio da cadeia de DNA desejada se os
primers escolhidos forem complementares das extremidades 3 e 5 dessa mesma
zona da cadeia. Deste modo uma seleco incorrecta dos primers inviabilizar a
metodologia (Brown, 2006).
Os fragmentos de DNA que vo ser amplificados no devem exceder os 3000
pares de base e idealmente devero ser inferiores a 1000 pares de bases (Brown,
2006).
O tamanho dos primers importante. Estas sequncias de oligonucletidos
devero ter tamanho suficiente para que a probabilidade de
hibridar com outras
regies que no a desejada seja reduzida. A utilizao de primers com 17 pares de

base de comprimento (17-mer) ou superior torna a reaco muito especifica. Por
outro lado as temperaturas elevadas de hibridao podem no ser suficientes para
prevenir a ocorrncia de mismatch se os primers forem excessivamente longos. Na
prtica, primers de tamanho superior a 30-mer no so utilizados (Rybicki, 2001;
Brown, 2006). .
Muitos dos primers utilizados no PCR correspondem a sequncias de genes que
codificam factores de virulncia. A maioria dos testes de diagnstico por PCR para
deteco de Listeria monocytogenes utiliza primers com sequncias do gene hly o
qual codifica a LLO ou ento sequncias imediatamente antes ou imediatamente
depois deste gene. O conjunto de genes de virulncia inclui alm do gene hly, os
genes prfA, plcA, hlyA, mpl, actA e plcB, todos presentes em Listeria monocytogenes,
50
Listeria seeligeri e Listeria ivanovii (Liu et al., 2004). A heterogeneidade presente nos
determinantes genticos do gene hly das diferentes espcies de Listeria permitiu o
desenvolvimento de primers especficos de Listeria monocytogenes (Denneer &
Boychuk, 1991; Rossen et al., 1991; citados por Levin, 2003). O produto do gene
actA, a protena de superfcie ActA responsvel pela polimerizao da actina
necessria propulso e invaso clula-clula (Levin, 2003). O gene inlA codifica
uma protena de superfcie denominada internalina que possibilita a invaso de
eritrcitos humanos (Gaillard et al., 1991 citado por Levin, 2003). O produto do gene
lmaA um polipptido de 21 "kilodalton" capaz de estimular uma reaco de
hipersensibilidade tardia em ratos. O gene lmaA est presente apenas em Listeria
monocytogenes e Listeria ivanovii, mas apenas a primeira o expressa (Ghmann et
al., 1990, citado por Levin, 2003).
Liu et al. (2004), utilizaram um par de primers (lmo0733F e lmo0733R) derivados
do gene lmo0733 especfico de Listeria monocytogenes que codifica uma protena
semelhante a um regulador de transcrio, que uma protena de ligao ao DNA,
importante no direccionamento da expresso gentica bacteriana de forma a que esta
se adapte a diferentes ambientes e geralmente so nicos para cada grupo de
bactrias, especficas para cada gnero, espcie e subespcie e com grande
potencial para diagnstico. O gene escolhido est relacionado com a capacidade
desta bactria se adaptar ao organismo humano, hiptese corroborada pelo facto de
no estar presente em nenhuma outra espcie do gnero Listeria.
A metodologia que utiliza os genes correspondentes ao 16S rRNA ou intergenic
spacers necessita de processamento adicional tal como sequenciao dos produtos
de PCR ou digesto restritiva; processo realizado por uma endonuclease de restrio,
que altamente especfica, reconhecendo uma sequncia particular da dupla cadeia
de DNA que vai cortando, ambas as cadeias, em pontos especficos dessa zona
originando fragmentos de restrio iguais, para que se possam diferenciar espcies, o
que faz deles pouco teis para anlises de alimentos de rotina (Liu, 2003).
11.2.3. Temperatura
Durante cada ciclo de PCR, a mistura reaccional submetida a trs temperaturas
diferentes, a de desnaturao, a de hibridao ou annealing e a de extenso ou
sntese. A primeira (94C-96C), vai fazer com que haja separao da dupla cadeia de
DNA, para que as cadeias possam funcionar como moldes na etapa de sntese de
DNA. A segunda, corresponde temperatura qual os primers se ligam cadeia
simples de DNA que lhe servir de molde (70-72C). A terceira corresponde
51
temperatura em que ocorre a sntese de DNA, cujo valor ligeiramente inferior

temperatura ptima da Taq polimerase.
A temperatura de hibridao pode afectar a especificidade da reaco, uma vez
que a reaco de hibridao DNA-DNA dependente da temperatura. Se a
temperatura for muito elevada, no h hibridao entre os primers e a cadeia molde,
por outro lado se a temperatura for muito baixa pode haver ligao de um ou de
ambos os primers a sequncias que no a sequncia alvo e consequentemente
ocorrer mismatched. A temperatura ideal de hibridao, dever ser suficientemente
baixa para permitir a hibridao entre o primer e a cadeia molde, mas alta o suficiente
para que no tenhamos hibridaes anormais. Assim, a temperatura que devemos
utilizar dever estar 1 a 2 C abaixo da temperatura de fuso (Tf) que corresponde
temperatura em que temos dissociao da ligao entre dois nucletidos
complementares e esta temperatura pode ser obtida pela seguinte frmula:
Tf = 4 X [G+C] + 2X [A+T] (C)
Em que o G (Guanina), o C (Citosina), o A (Adenina) e o T (Timina) correspondem
ao nmero de cada um destes nucletidos presentes na sequncia dos primers
(Rybicki, 2001; Brown, 2006).
A temperatura de hibridao depende dos primers escolhidos para essa mesma
reaco e estes devero ter Tf semelhantes ou ento a hibridao ser deficiente
(Uyttendaele & Debever, 2006; Brown, 2006).
11.2.4. Extraco de DNA e PCR
Alm dos microrganismos de interesse, a matriz quer seja alimentar, ambiental ou
clnica, pode conter mltiplas substncias que podem interferir com o processo de
amplificao do DNA, talvez por inibio da DNA polimerase ou mesmo degradao
ou sequestro dos cidos nucleicos e por isso tm que ser eliminadas por mtodos de
extraco (Liu, 2008). As variaes existentes a este nvel podem convergir para
sensibilidades diferentes (Tabela 8).
11.2.4.1. Substncias inibidoras do PCR e pureza do DNA
J foram identificadas inmeras substncias que inibem a aco da DNA
polimerase, em fluidos corporais e fezes (ex: grupo heme, hemoglobina, etc.), em
amostras do meio ambiente (ex: metais pesados, etc.) e nos alimentos (ex: compostos
fenlicos, glicognio, ies de clcio, gordura e outros compostos orgnicos). Alguns
reagentes usados para extrair o DNA, so tambm capazes de inibir a amplificao do
DNA (Liu, 2008). O PCR ao invs de outras tcnicas moleculares, como o Southern
52
blot ou RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) consegue funcionar mesmo com
preparaes de DNA menos puras (Liu, 2008).
O grupo heme ( fraco no proteica da hemoglobina que lhe confere a sua cor
vermelha por conter ferro) um importante inibidor da reaco de amplificao que
nunca totalmente removido aquando da extraco do DNA, por isso temos que
adicionar albumina bovina srica (BSA) aos reagentes do PCR, que se liga ao grupo
heme, impedindo a sua aco inibidora.
O NaOH e o dodecil sulfato de sdio (Sodium Dodecyl Sulfate/SDS), ajudam a
diminuir o efeito inibitrio da gordura e das protenas, no PCR para pesquisa de
agentes causadores de toxinfeces alimentares (Liu, 2008).
De modo a assegurar a autenticidade dos resultados obtidos por meios de biologia
molecular, importante que as substncias que possam interferir com a reaco
sejam removidas antes da reaco de amplificao, e por isso importante a
utilizao de mtodos eficientes e rpidos de extraco associados a protocolos
eficazes de amplificao e deteco (Liu, 2008).
A avaliao da pureza de uma amostra de cido nucleicos muito importante e
frequentemente efectuada atravs de um procedimento referido geralmente como a
relao A260/A280. A base deste teste a lei de Lambert-Beer:
OD = BC
Onde a absorvncia da amostra (OD) o produto do coeficiente de extino molar (),
da concentrao da amostra (c), e do comprimento ptico (b). O ratio A260/A280 que
corresponde ao ratio dos valores de absorvncia da amostra, lidos a 260 nm e 280 nm
respectivamente, d uma estimativa da pureza do DNA relativamente a contaminantes
que absorvam na regio dos UV (ultra-violeta) tais como protenas, RNA e compostos
aromticos, sendo muito influenciado pelo pH do meio. Um ratio A260/A280 entre 1,8 e
2,0 corresponde a DNA puro; se inferior a 1,8 indica contaminao por protenas e se
superior a 2,0 indica contaminao por RNA. Compostos, tais como ies clcio,
polissacardeos ou gorduras que normalmente inibem a amplificao do sinal, no so
detectados em leituras a A280 (Amagliani et al., 2007).
11.2.4.2. Eficcia da extraco do DNA
O mtodo de extraco pode influnciar a eficcia da metodologia de PCR (figura
8). Pelo procedimento convencional o isolamento dos cidos ncleicos de Listeria
monocytogenes era conseguido atravs da lise bacteriana pela lisozima, disgesto
das protenas contaminantes pela proteinase K, extraco das protenas digeridas
e detritos celulares pelo fenol/clorofrmio e precipitao dos cidos nucleicos pelo
53
Limite de deteco
Com enriquecimento
Autor
Amostra
Fitter et al.
Primer
Pele de frango e queijo
(1992)
-2
hly, regio 3
10 10 ufc/g
de pasta mole
a
Sem
enriquecimento
10 ufc/g
(24h 48h)
Makino et al. (1995)
Queijo amanteigado
LA1, LB1
Duffy et al.
Carne de vaca picada
hly
10 ufc/0,5g
4
10 ufc/g
(1999)
10h / 30C/APT
Knabel
Comida
(2002)
consumida
pronta
ser
(ready-to-
Sub-unidade 16S do
1-5 ufc/25g
gene do rRNA
Meio selectivo
hly
Pr-enriquecimento
eat-food)
Aznar & Alarcon
Vrios tipos
(2003)
24h/30C
Enriquecimento
24h/37C
Jung et al. (2003)
Salsicha Franckfurt
Internalina
AB
inlAB
Pelo menos 16h
105 L.monocytogenes
10
/ml
L.monocytogenes/25
g
Choi & Hong (2003)a
Leite
hlyA
16 Horas
Liu et al.
Culturas estacionrias
Lmo 0733
BHI
103 ufc/0,5 ml
1 ufc/0,5 ml
(2004)
10 pg de DNA
Rodrguez-Lzaro et al.
Fiambre
(2004)c,d
gordura
com
2%
de
hlyA
equivalentes
de
genoma (deteco)
30
equivalentes
de
genoma
(quantificao)
Oracova et al.
24h F1/2
(2007) a
6h F1
10 ufc/25gb
d
Barocci et al.
Fiambre
hlyA
24 h HFB
3x101 ufc/ml
(2007)
48 h HFB
3 ufc/ml
OGrady et al.
Alimentos
ssrA
24 h F1/2
(2008)
4h F1
1-5 ufc/25gb
Tabela 8: Valores limites de deteco de ufc de Listeria monocytogenes por

metodologia molecular
Legenda:
APT:gua peptonada tamponada; F: Fraser
b
d:
: In Liu (2008); : Valores obtidos por PCR em tempo real; : PCR em tempo real, quantitativo. Fiambre
inoculado artificialmente;
54
etanol, o que alm de demorado, expunha os tcnicos do laboratrio a agentes

txicos e agressivos. Por essa razo houve uma vontade por parte da comunidade
cientfica para desenvolver novos mtodos de extraco menos agressivos e tambm
mais eficientes no que diz respeito lise da clula (Liu, 2008).
O DNA pode ser extrado pelo Chelex 100 (sem a utilizao da proteinase K), que
uma resina permutadora de ies, desenvolvida especificamente para extraco de
DNA para ampliao por PCR que se liga aos componentes celulares depois da lise
celular (Rodriguez-Lzaro et al., 2004). Esta resina mantm os cidos ncleicos em
suspenso, permitindo a sua fcil separao dos restantes componentes celulares
ligados ao Chelex 100 por centrifugao (Liu, 2008).
Actualmente j existem diversos kits comerciais para rpida e eficiente
purificao de DNA e RNA, embora insuficientes para os casos em efectuada a
deteco directa de Listeria monocytogenes presente em baixas concentraes, como
frequentemente acontece com amostras de origem alimentar (Liu, 2008). Nestes
casos, as amostras devem ser previamente sujeitas a protocolos que envolvam
filtrao e extraco (Rodriguez-Lzaro et al., 2004).
No caso de produtos crneos, a homogeneizao dever ser efectuada para
maximizar a recolha de microrganismos e para isso vantajosa a realizao
combinada de homogeneizao, filtrao atravs de filtro com poros de 4-micron e
centrifugao, o que permite detectar por PCR baseado no gene 16S rRNA, 2 a 20
ufc
de Listeria monocytogenes em cultura pura e 4 a 40 ufc em amostras de
alimentos. Aplicando um passo de centrifugao de 1 hora removem-se muitas mais

partculas de alimento e libertam-se deste muitas mais bactrias do que pelo mtodo
tradicional de homogeneizao em Stomacher (Liu, 2008).
11.2.5. Controlos da reaco de PCR
Uma das grandes preocupaes quando extramos o DNA e recorremos ao PCR,
garantir que os resultados negativos se devem de facto a ausncia de Listeria
monocytogenes e que no se tratam de falsos negativos. Estes resultados podem ser
devidos a interferncias com a lise celular durante a extraco do DNA, degradao
do material gentico ou ainda por inibio directa da reaco de PCR e por isso
essencial a introduo de controlos para validar a reaco de PCR. Devem ser
utilizados controlos internos e externos (Murphy et al., 2007).
Os controlos externos (CE) servem para monitorizar os instrumentos, os reagentes
e garantir que no h reaces cruzadas de DNA. Estes controlos tm na sua
constituio os mesmos reagentes que a mistura que se quer testar, mas em vez das
55
amostras a serem testadas contm, no caso do CE positivo, DNA igual ao que se quer
pesquisar na amostra ( por isso sofrer amplificao pela reaco de PCR) e um outro
CE, denominado de negativo, sem material gentico o qual no ser amplificado por
PCR (Murphy et al., 2007).
A existncia de compostos inibidores da reaco de PCR pode ser identificada
pela amplificao de uma segunda sequncia alvo de cidos nucleicos que serve de
controlo interno (CI). A obteno de um sinal positivo do segundo alvo demonstra que
a amplificao foi bem sucedida, validando deste modo um resultado negativo
relativamente ao alvo principal. Uma sequncia normal do gene, que esteja sempre
presente em todas as amostras, como por exemplo um gene endgeno do tipo
housekeeping, pode ser usada como um CI. Iste procedimento tem a vantagem de
monitorizar a integridade do DNA alvo; nos casos de amostras impropriamente
colhidas, armazenadas e processadas, o CI endgeno estar ausente (ou degradado)
e no resultar em resultado positivo. Uma desvantagem do CI interno que a
amplificao destas sequncias endgenas pode no reflectir exatamente a
amplificao da sequncia alvo principal devido s diferenas nas sequncias dos
primers, no tamanho do produto amplificado e da quantidade relativa das duas
sequncias alvo exgena adicionada aos reagentes de PCR.
O CI utilizado pode ser sinttico sem as limitaes inerentes a um CI endgeno.
Um exemplo de um CI sinttico o DNA de um plasmdeo ou um RNA transcrito in
vitro com as regies de ligao dos primers idnticas quelas da sequncia alvo.
Estas caractersticas asseguram que a amplificao do CI e dos cidos nucleicos alvo
sejam equivalentes. Um nmero limitado de molculas de CI adicionado a cada
amostra do teste e co-amplificado com sequncia de DNA alvo; assim, um sinal
positivo do CI assegura que houve amplificao suficiente para gerar um sinal positivo
de quantidades muito pequenas do fragmento de DNA alvo. Quando introduzido na
mistura de reao pronta para sofrer amplificao, o CI pode monitorizar a
amplificao e a deteo. Quando introduzido na mistura no processada o espcime,
o CI vai tambm monitorizar a recuperao dos cidos nucleicos durante a
preparao da mistura da reaco. Ao contrrio de um gene housekeeping, um CI
sinttico no pode ser usado para avaliar a integridade dos cidos nucleicos da
sequncia de DNA alvo (Rosenstraus, Wang, Chang, Debonville & Spadoro, 1998;
Murphy et al., 2007).
11.2.6. Importncia das fases de pr-enriquecimento e enriquecimento
selectivos para a realizao do PCR
56
Para o estudo da presena de Listeria monocytogenes muito vantajosa a

utilizao de meios de enriquecimento, de modo que as bactrias presentes em
reduzidas concentraes possam multiplicar-se at quantidades possveis de se
detectarem por mtodos moleculares (Liu, 2008).
Existem mtodos de deteco directos, no entanto a utilizao de meios de prenriquecimento continua a ser necessria para a deteco de L. monocytogenes em
alimentos, quando esta se encontra em quantidades reduzidas. Os mtodos que no
necessitam de qualquer tipo de enriquecimento so geralmente menos sensveis
(OGrady et al., 2008). Podemos ainda ter outros problemas associados deteco de
agentes patognicos em alimentos por este mtodo molecular, como a inibio do
PCR por componentes do alimento e a amplificao de DNA de bactrias mortas, o
que faz com que os mtodos directos sejam realizados muito raramente (Jersek,
Majstorovic, Klun & Mozina, 2005).
A incubao das amostras em meios de enriquecimento ocorre durante 24 a 48
horas e so essenciais para aumentar os teores de L. monocytogenes nos meios de
diagnstico de rotina. Meios como o Fraser ou a gua peptonada tamponada j foram
utilizados com sucesso (Liu, 2008).
Os meios de pr-enriquecimento contm maior quantidade de amostra do alimento
relativamente aos meios de enriquecimento, mas como consequncia os primeiros
podem no ser suficientes para remover ou diluir as substncias inibidoras da reaco
de PCR presentes na amostra do alimento (Murphy, McLauchlin, Ohai & Grant.,
2007). Embora um enriquecimento de 24 horas em Fraser e de 48 horas em Fraser
I se tenha mostrado til para a deteco de Listeria monocytogenes, estudos recentes
demonstram ser mais eficaz a utilizao de meios de enriquecimento no selectivos
ou ento meios de pr-enriquecimento para detectar bactrias que se encontrem em
stress, em fase sub-letal ou lesionadas. Assim, por exemplo uma incubao de 24
horas em Fraser I/2 e de 16 horas em Fraser I de leite e outros alimentos
contaminados melhorou o isolamento de L. monocytogenes pela metodologia de PCR
(Liu, 2008).
Rantsiou et al. (2008), desenvolveram um protocolo de qPCR para deteco e
quantificao de clulas viveis de Listeria monocytogenes em alimentos, sem
necessidade de enriquecimento, tendo a regio inter-gnica 16S-23S como alvo. A
amplificao de genes relacionados com virulncia, tais como hly ou inl A, quando
efectuada sem enriquecimento prvio da amostra, no permite quantificar apenas as
clulas viveis, e por isso escolheram genes de RNA ribossomal que do indicao
directa da viabilidade de Listeria monocytogenes. A quantificao foi possivel a partir
57
de 104-105 ufc/ml. Com enriquecimento (uma noite) a presena de Listeria

monocytogenes pode ser detectada a partir de 10 ufc/ml ou g. Esta metodologia tem
elevada especificidade e pode ser preconizada em diversas matrizes alimentares.
11.2.7. Estudo dos produtos de PCR

Depois da amplificao das cadeias de DNA alvo, temos vrias opes para
estudar este produto e assim obtermos informao sobre a presena ou no da
seqncia de DNA alvo relativamente qual os primers foram seleccionados. As
tcnicas mais importantes para esse fim so a electroforese em gel, clonagem dos
produtos de PCR e sequenciao dos produtos de PCR (Brown, 2006).
A electroforese em gel (Figura 13) uma tcnica de separao de molculas que
envolve a migrao de partculas num determinado gel durante a aplicao de uma
diferena de potencial. A molcula de DNA por ter carga negativa, migra para o plo
positivo. As molculas so separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de
menor massa iro migrar mais rapidamente do que as de maior massa. Em alguns
casos, o formato das molculas tambm importa, pois algumas tero maior facilidade
para migrar pelo gel. A electroforese permite separar o DNA em fragmentos, a partir
do seu peso molecular. Neste caso, a agarose utilizada como gel para a
electroforese. A agarose um polissacardeo que forma uma rede que segura as
molculas durante a migrao. Dependendo da concentrao de agarose, tem-se
uma diferena no gradiente de separao. Para preparar um gel de agarose, faz-se a
mistura entre o p de agarose e a soluo tampo TBE (Tris/Borato/EDTA). Quando a
mistura arrefece o gel fica duro. Este endurecimento feito num local apropriado, o
mesmo local onde ser feita a corrida da amostra. colocado um pente no gel
durante o endurecimento, que vai criar poos que sero utilizados para a colocao
das amostras. Alm do referido anteriormente, adicionado brometo de etidio, que
um corante fluorescente que se vai intercalar entre as bases de DNA, e sob a
radiao ultra-violeta permite a visualizao do DNA (Brown, 2006). Alm das
amostras, temos que utilizar um marcador, que uma mistura de fragmentos de DNA
de tamanho conhecido, com as quais comparamos os produtos do PCR em estudo
(Vierstraete, 1999).
58
Figura 13: Estudo dos produtos de PCR atravs de electroforese em gel (adaptado
de Vierstraete, 1999).
A electroforese em gel de agarose permite identificar os produtos de PCR atravs
do seu tamanho. Sabe-se no entanto, que por vezes durante a reaco de PCR h
amplificao de locais da cadeia para alm da sequncia alvo de oligonucletidos.
Para se confirmar a identidade dos produtos amplificados podemos utilizar diferentes
metodologias (Uyttendaele & Debevere, 2006):
a. Southern-Blot , um mtodo usado para confirmao da presena de uma
sequncia de DNA em uma amostra de DNA. Combina a electroforese em gel
de agarose para a separao por tamanho das bandas de DNA com a
tranferncia
para
uma
membrana
de
nitrocelulose
ou
nylon
onde
posteriormente haver hibridao com uma sonda. A sonda de DNA

marcada de forma que permita a sua deteco e essa marcao
normalmente feita atravs da utilizao de tomos radioactivos ou pela
ligao sonda de corantes fluorescentes ou cromognicos. Se a sequncia
procurada no estiver presente na amostra no haver hibridao com a
sonda. Por outro lado, se a hibridao ocorrer, a sonda poder ser detectada
por exposio a raios X. Outros mtodos (isto , western blot, northern blot,
southwestern blot) empregam princpios similares, mas utilizam RNA ou
protena (Molina & Tobo, 2004).
b. Hidrlise do produto amplificado com uma endonuclease de restrio. A
tcnica de RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphisms) baseia-se
na hidrlise do DNA com endonucleases de restrio e posterior separao,
59
por electroforese, dos fragmentos, que correspondem a padres de restrio

especficos, que possuem as sequncias de reconhecimento das enzimas
usadas.
c. Produo de um fragmento interno usando o Nested PCR ou Semi
Nested PCR, que emprega uma segunda etapa de amplificao com um par
de primers internos aos utilizados na primeira etapa e visa aumentar a
sensibilidade e especificidade da metodologia de PCR (Molina & Tobo, 2004).
d. Sequenciao para identificao dos produtos de PCR (Molina & Tobo, 2004).
12. Variaes de PCR
O aparecimento da metodologia acoplada a PCR veio revolucionar a biologia
molecular, e trazer maior rapidez e eficincia relativamente s tcnicas anteriores. A
tcnica foi evoluindo, surgindo depois diversas metodologias resultantes da alterao
do PCR clssico (Molina & Tobo, 2004).
A
tcnica
de
Transcrio-Reversa-PCR
(RT-PCR),
utiliza
uma
enzima
denominada de transcriptase reversa que converte uma amostra de RNA em DNA

complementar (cDNA) antes da etapa de amplificao por PCR, permitindo a anlise
de RNA (Molina & Tobo, 2004).
O PCR Multiplex, utiliza primers diferentes que permitem detectar mltiplas
sequencias alvo numa mesma amostra em simultneo e veio trazer melhorias
significativas relativamente tcnica anterior (Lawrence & Gilmor, 1994).
Estamos a entrar numa nova era, em que o PCR vai alm de uma anlise
qualitativa, comeando a ser possvel quantificar os produtos de PCR.
O PCR em tempo real permite a amplificao, a deteco simultnea e a
quantificao das sequncias amplificadas (Molina & Tobo, 2004). Rodrguez-Lzaro
et al. (2005), descreveram um PCR em tempo real, quantitativo para deteco de
Listeria monocytogenes baseado na co-amplificao de um fragmento do gene alvo
hly e de um controlo interno de amplificao (IAC). A aplicao de sondas
fluorescentes para a deteco dos produtos de PCR, em conjunto com equipamento
adequado, capaz de combinar a amplificao e a deteco de sequncias
especficas de DNA. O fundamento desta metodologia a quantificao da
fluorescncia emitida durante a reaco, que serve de indicador de produo de
produtos resultantes da amplificao em cada ciclo reaccional. Esta metodologia
elimina a necessidade de realizao de electroforese para deteco dos produtos de
PCR e d os resultados em suporte informtico (Uyttendaele & Debevere, 2006).
Existem diferentes tcnicas (Figura 14) de deteco da fluorescncia do DNA em
tempo real, das quais se destacam:
60
a. SYBR Green
Esta molcula, SYBR Green, vai-se ligar especificamente dupla cadeia de
DNA. No inicio a fluorescncia reduzida por no se encontrar ligado ao DNA, mas
durante o alongamento, quantidades crescentes desta sonda vo-se ligando dupla
cadeia de DNA (Uyttendaele & Debevere, 2006).
b. Taqman
Alm dos dois primers convencionais, que so especficos para a sequnciaalvo, um terceiro primer desenhado para se ligar especificamente a um local no
meio da sequncia alvo. Este primer marcado com dois fluorforos, um Reporter
(R), na extremidade 5 e um Quencher (Q), na extremidade 3. Neste caso utilizada
a actividade 5-nuclease da DNA-Taq-Polimerase para hidrolizar a sonda hibridada
ligada ao DNA alvo. A sonda Taq contm o Reporter fluorescente na extremidade 5,
cuja emisso de fluorescncia eliminada pelo fluorocromo Quencher da
extremidade 3 quando o Reprter e o Quencher esto prximos um do outro, isto
, separados apenas por alguns oligonucletidos. Ento enquanto a sonda Taqman
est intacta, no h produo de sinal fluorescente. Durante a fase de annealing
ambos os primers (os no marcados) e a Taqman vo emparelhar com a sequncia
complementar do DNA alvo. medida que o alongamento da cadeia vai ocorrendo,
pela actuao da DNA Taq - Polimerase que adiciona oligonucletidos para
sintetizar a dupla cadeia de DNA, ocorre em simultneo a degradao da sonda
Taqman pela actividade 5 nuclease da DNA Taq Polimerase e deste modo h
separao entre o Reporter e o Quencher e a fluorescncia ocorre. A fluorescncia
pode depois ser medida no final de cada ciclo e deste modo a reaco de PCR pode
ser acompanhada em tempo real (Uyttendaele & Debevere, 2006).
c. Molecular Beacons
So sondas de DNA com estrutura Stem-and-Loop. A poro em hlice da sonda
beacon complementar da sequencia da poro alvo da molcula de DNA. Numa
das extremidades da sonda est ligado um fluorforo (Reporter) e na outra
extremidade um bloqueador do fluorforo (Quencher). Na ausncia de sequencias
complementares na cadeia alvo da sonda beacon, no h fluorescncia; se pelo
contrrio existir emparelhamento entre o DNA alvo e a sonda, ento d-se a abertura
da estrutura, o que faz aumentar a distncia entre o Reporter e o Quencher, e
assim surge a fluorescncia. Podemos utilizar diferentes beacons com diferentes
61
fluorforos para deteco em simultneo, de diferentes produtos de PCR (Uyttendaele

& Debevere, 2006).
d. Light Cycler
Este mtodo utiliza duas sondas. Uma sonda contm na sua extremidade 3 um
fluorforo dador (D) cujo espectro de emisso se sobrepe ao espectro de excitao
do fluorforo receptor (A) ligado extremidade 5 da outra sonda. A excitao do
dador resulta em transferncia de energia por ressonncia fluorescente (FRET) para o
receptor que depois adquire fluorescncia. Quando em soluo as duas sondas, D e
A, esto separadas e porque a FRET depende do espao existente entre ambas,
existe apenas uma fluorescncia de fundo. Depois durante a reaco de PCR, na fase
de emparelhamento, vai haver hibridao entre as sondas e as sequncias de DNA
alvo que lhe so complementares, ambas as sonda aproximam-se e assim d-se a
FRET cuja fluorescncia emitida medida (Uyttendaele & Debevere, 2006).
Figura 14: Mtodos de deteco de fluorescncia aplicados metodologia de PCR

em
tempo
real
(Adaptado
de
http://www.slideshare.net/labimuno/realtime-
presentation/).
13. Limites e legislao

A legislao europeia (Regulamento 1441/2007), estabelece que em alimentos
prontos para consumo, os teores de Listeria monocytogenes, devem ser inferiores a
62
100 ufc/g quando dentro do perodo de validade do produto e ausente no mesmo tipo
de alimento para certos grupos alvo de consumidores considerados de risco. A
legislao tambm aplicvel aos alimentos prontos para consumo, nos quais o
crescimento da bactria no susceptvel de ocorrer, e no destinados a lactentes
nem para fins medicinais, cujo teor dever ser inferior a 100 ufc/g.
A International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF),
concluiu que 100 ufc de Listeria monocytogenes por g de alimento no momento em
que consumido aceitvel para a maioria dos consumidores. A legislao Europeia
foca-se no controlo do crescimento de Listeria monocytogenes durante o perodo de
validade do alimento e no na ausncia total (excepto para os grupos de risco) e por
isso considerada por muitos microbiologistas, mais prtica e mais sensata que a
legislao Norte Americana (Annimo, 2007d), segundo a qual a tolerncia de zero
para a presena de Listeria monocytogenes. O United States Department of
Agriculture (USDA) obriga a que os produtores de alimentos base de carne faam
uma monitorizao regular dos produtos bem como dos locais de produo. A
legislao europeia prev ainda que possam ser adoptados testes alternativos
validados por protocolos internacionalmente aceites (OGrady et al., 2008).
14. Anlise de Risco

O motivo pelo qual as autoridades dos diferentes pases tomam fortes medidas de
preveno relativamente a Listeria monocytogenes deve-se elevada taxa de
mortalidade que provoca no ser humano. importantssimo do ponto de vista de
sade pblica identificar o alimento contaminado e remov-lo com a mxima
brevidade da cadeia de distribuio. H que perceber quais os gneros alimentcios
que mais frequentemente esto associados listeriose e o modo como se transmite
ao Homem, de modo a prevenir casos futuros (McLauchlin et al., 2004).
A anlise de risco associada cadeia alimentar, uma abordagem lgica,
sistemtica e transparente de processar informao sobre as doenas de origem
alimentar de forma a identificar os perigos e os riscos associados aos diferentes
alimentos (WHO, 2004). Esta anlise permite estimar a probabilidade de ocorrer
doena numa determinada populao. A anlise de risco compreende a avaliao, a
gesto e a comunicao do risco. Avaliao de risco pretende dar resposta s
perguntas Que perigos?, Quando so avaliados e com que mtodo?, Qual o grau
de incerteza?, Quem afetado?. A gesto de risco pretende determinar como os
valores influenciam a seleco e a execuo de polticas alternativas. Por fim, a
63
comunicao de risco no s promove a participao das partes interessadas como

possibilita a troca de informao e de opinies (Swaminathan & Gerner-Smith, 2007).
Uma nova abordagem da anlise de risco implica a participao activa do
consumidor nos vrios estgios do processo de anlise de risco, implementao de
procedimentos funcionais e estruturais melhorados de gesto de risco e
uma
melhoria da comunicao de risco com os consumidores durante todo o processo de

anlise de risco. Tudo isto dever ter aplicabilidade em toda a Unio Europeia
(Swaminathan et al., 2007).
Para aceder anlise de risco, a FAO/WHO (2004) determinou ser necessrio:
I. Estimar o risco dos consumidores dos diferentes grupos populacionais
relativamente susceptibilidade de cada um:
- a probabilidade de se ficar doente por ingesto de Listeria monocytogenes
maior
em
populaes
mais
susceptveis
(grvidas,
recm-nascidos,
imunodeprimidos e idosos) do que em adultos saudveis. Os idosos (que abrange

os ndividous com idade superior a sessenta anos) so 2,4 vezes mais
susceptveis e os recm nascidos 1,4 vezes mais susceptveis;
II. Estimar o risco da presena de Listeria monocytogenes em alimentos em que se
possa multiplicar e nos que em determinadas condies de armazenamento e no
perodo de validade no permitam o seu crescimento:
- a maioria dos casos de Listeriose causada pela ingesto de elevadas
quantidades de Listeria monocytogenes. A eliminao destas concentraes
bacterianas elevadas aquando do consumo dever prevenir muitos casos de
doena;
III. Estimar o risco da presena de Listeria monocytogenes em alimentos tendo em
conta o intervalo de ausncia em 25g at 103 ufc/g ou ento no exceder os
valores determinados at ao consumo dos alimentos:
- o potncial de multiplicao de Listeria monocytogenes, em alimentos
cozinhados prontos a consumir durante a refrigerao tem um enorme peso no
risco que estes alimentos podem representar. Naqueles alimentos que permitem o
crescimento desta bactria, a existncia de 102 a 103 ufc aumentar o risco de
listeriose.
Algumas das opes chave que se sabem ser efectivas no combate de L.
monocytogenes devem ser identificadas e sujeitas a anlise de risco. Listeria
monocytogenes pode causar problemas que devem ser combatidos atravs de
medidas de higiene. Assim, as autoridades competentes e a indstria devero
controlar a existncia deste microrganismo atravs da aplicao adequada e
64
verificao das boas prticas de higiene e implementao de HACCP (FAO/WHO,

2004). Geralmente o risco associado ao consumo de carne e de produtos dela
derivado est apenas relacionado com a presena de agentes patognicos, e as
bactrias patognicas no fazem per se parte da flora de decomposio da carne, a
sua ocorrncia deve-se a contaminaes da carne ainda crua ou ento ps
processamento (Lpez et al., 2006).
A criao de um modelo matemtico capaz de prevenir a relao dose-efeito
relativamente a Listeria monocytogenes tem sido objecto de estudo para se saber
qual a dose mnima infectante a partir da qual teramos doena clnica (McLauchlin et
al., 2004). Tm sido utilizados diversos modelos matemticos que poderiam
eventualmente dar esta resposta e a variabilidade quanto susceptibilidade dos
diferentes grupos de populao to dspar que pe em causa a possibilidade de
descrever toda a populao atravs de apenas uma curva dose-efeito. Estas
limitaes fazem com que estes modelos matemticos no sejam amplamente
utilizados em anlise de risco (McLauchlin et al., 2004).
De acordo com McLauchlin et al. (2004) a relao dose-efeito pode ser formulada
baseada em duas hipteses atravs de duas curvas. Na primeira hiptese a doena
causada pela ingesto de uma ou algumas doses elevadas de L. monocytogenes; ou
ento na segunda hiptese, a doena resulta de uma exposio frequente ou
continuada a Listeria monocytogenes, o que faz baixar a curva dose efeito para
nveis mais baixos.
Mataragas, Skandamis & Drosinos (2008), avaliaram os graus de risco da carne
de porco e de aves de capoeira atravs de um software baseado no Excel, o qual
tenta responder a vrias perguntas relativas probabilidade de exposio a um
perigo, susceptibilidade da populao em relao a esse perigo, severidade da
doena causada pelo perigo e probabilidade do alimento conter uma dose infectante
desse mesmo agente. O risco foi caracterizado como baixo, mdio e alto. O risco para
a sade tambm foi estimado separadamente, para populaes de baixo risco e de
risco elevado. Um risco baixo foi obtido para Salmonella spp., Listeria monocytogenes
e Escherichia coli enterohemorrgica em populaes de baixo-risco. Um risco
moderado foi calculado para Salmonella spp. e L. monocytogenes em produtos
processados de carne de porco ou aves (prontos a serem consumidos ou que
necessitam apenas de ser reaquecidos) e em produtos parcialmente cozinhados de
carne de porco, tambm numa populao de baixo-risco. As avaliaes com risco
elevado identificadas foram associadas ao desrespeito pela temperatura em carne de
porco e/ou carne de aves com vida til prolongada e contaminadas de forma cruzada
65
por L. monocytogenes (apenas para a populao de risco elevado), E. coli

enterohemorrgica (somente para a populao de risco elevado) ou S. aureus (toda a
populao). Estes resultados podem constituir uma fonte de informao para a
avaliao dos perigos durante a aplicao de um sistema de gesto da segurana
alimentar (Mataragas et al.,2008).
66
Parte Experimental
Avaliao da qualidade higio-sanitria da carne de frango: Pesquisa de Listeria
monocytogenes por PCR
Objectivos e justificao do tema

Listeria monocytogenes um importante agente de doena de origem alimentar
associada a elevadas taxas de mortalidade (IFT, 2004; OIE, 2005; EFSA, 2007a;
Chaturongakul et al., 2008; OGrady et al., 2008).
A carne de frango consumida em larga escala pela populao portuguesa (Lima,
2008b; INE, 2008) estando documentados teores elevados desta bactria em aves de
capoeira, realizou-se este estudo que tem como objectivo avaliar a presena de
Listeria monocytogenes em peitos de frango utilizando para isso a metodologia da
reaco em cadeia da polimerase (PCR), avaliando-se previamente o limite de
deteco
da
metodologia
adoptada,
simultaneamente
contribuio
do
equipamento da sala de desmancha (cone do carrossel de cones, bancada e fundo da

caixa de plstico de transporte de carcaas) para a contaminao das carcaas por
Listeria monocytogenes.
Pretende-se avaliar a qualidade higio-sanitria da carne de frango tendo como
indicador de higiene do processo a contagem de Enterobacteriaceae.
Materiais e Mtodos
1. Colheita e seleco das amostras de peitos de frango
Num matadouro, em diferentes dias de abate, foram seleccionadas ao acaso 4
carcaas por bando, provenientes de diferentes criadores. As amostras foram colhidas
de um total de 13 bandos diferentes. Foram colhidas 16 amostras de bandos de
produo biolgica, 20 amostras de bandos de produo extensiva e 16 amostras de
bandos de produo intensiva. As aves foram abatidas de acordo com as prticas
normais do matadouro e depois arrefecidas rpidamente em tnel de ar frio (11C).
Aps 24 horas, foi efectuada a desmancha manual das carcaas seleccionadas em
carrossel de cones e recolhidos os peitos para anlise que depois foram
transportados em camio refrigerado a 4C, em circuito normal de distribuio at ao
laboratrio.
Em todas as amostras recolhidas (n=52) foram efectuadas contagens de
Enterobacteriaceae e de Listeria monocytogenes. Realizou-se em paralelo a pesquisa
67
de Listeria monocytogenes pelo mtodo clssico e pelo mtodo de biologia molecular

PCR.
2. Colheita de amostras de equipamento da sala de desmancha
Colheu-se uma amostra de um cone do carrossel de cones, cuja rea aproximada
era de 930 cm2, uma amostra de uma das bancadas (1000 cm2) da sala de
desmancha e uma amostra do fundo (210 cm2) das caixas de plstico de transporte
das carcaas para o que se usou uma compressa estril humedecida com soluo de
neutralizao (GE Healthcare, USA).
3. Preparao
das
amostras
de
peito
de
frango
para
contagem
de
Enterobacteriaceae
Pesou-se de forma assptica 10 g de peitos de frango em saco de stomacher
estril e adicionou-se 90 ml de Triptona Sal (Scharlau Chemie, Barcelona)
efectuando-se a sua homogeneizao durante dois minutos no stomacher (diluio
10-1). Com uma pipeta estril transferiu-se 1 ml da suspenso inicial para 9 ml de
Triptona-Sal (diluio 10-2).
4. Preparao de amostras de equipamento da sala de desmancha

As compressas humedecidas foram transferidas de forma assptica para 100 ml
de
meio
de
enriquecimento
Fraser
1/2
(Scharlau
Chemie,
Barcelona)
homogeneizadas no stomacher. O restante procedimento analtico foi idntico ao

das amostras de peito de frango (ver ponto 6 e 7) para a pesquisa e contagem de
Listeria monocytogenes.
5. Contagem de Enterobacteriaceae em amostras de peito de frango
A contagem da Enterobacteriaceae em alimentos foi feita pelo mtodo
microbiolgico ISO 21528-2: 2004 (Figura 15).
Semeou-se por incorporao em duplicado 1ml de cada uma das diluies
realizadas com Triptona Sal (10-1 e 10-2 ) em caixas de Petri previamente identificadas.
Adicionou-se em seguida 15 ml de violet red bile glucose agar (VRBG, Scharlau
Chemie, Barcelona) fundido (462 C) a cada uma das caixas de Petri e agitou-se
cuidadosamente. Aps solidificao completa do meio, as placas de Petri incubaram
durante quarenta e oito horas a 371C. Contaram-se as colnias caractersticas
presentes (mucosas, cor rosa a vermelho com ou sem halo de precipitao de sais
68
biliares, ou incolores,) em cada uma das placas semeadas, com pelo menos dez
colnias caractersticas em cada uma delas.
O resultado foi obtido de acordo com a frmula A (Norma Portuguesa 4405),
expresso em ufc/g e depois convertido em log ufc/g.
C
A)
Legenda:
C:somatrio das colnias contadas em duas placas de duas
(n1+0,1n2) d
V x 1,1 x d
diluies sucessivas e que contenham pelo menos dez colnias

caractersticas.
n1: nmero de placas consideradas na primeira diluio.
n2: nmero de placas consideradas na segunda diluio.
d: factor de diluio correspondente primeira diluio considerada.
10 g de amostra de
peito de frango
90 ml de Triptona
Sal1
Homogenizar durante 2
minutos no
stomacher
1 ml
+
1 ml
9 ml de Triptona Sal1
(Diluio 10-1)
Homogenizar
1 ml
(Diluio 10-2)
Sementeira por incorporao

em VRBG Fundido2
Sementeira por incorporao

em VRBG Fundido2
Incubao (37 2C)
Incubao (37 2C)
Contagem das colnias caractersticas
Figura
15:
Esquema
da
metodologia
microbiolgica
para
contagem
de
Enterobacteriaceae em alimentos (adaptado da Norma ISO 21528-2: 2004).
69
Legenda:
1
: Triptona Sal: meio de cultura desidratado, com casena enzimtica hidrolisada (1,00g/l), cloreto de
sdio (8,50g/l) e pH final (a 25C) igual a 7.0 0.2. Para preparao do meio dissolveu-se 9.5 gramas em
1000ml de gua destilada e aqueceu-se para dissolver o meio completamente. Foi depois esterilizado em
autoclave a 15lbs de presso, a 121C durante 15 minutos.
2
VRBG: VIOLET RED BILE AGAR, com glicose, bilis e corante violeta. Baseia-se no meio de
MacConkey para deteco e enumerao de Entorobacteriaceae que so bactrias Gram-negativas

tolerantes a blis. Neste meio, a lactose substituda pela glicose. Tem na sua constituio glicose
monohidratada (10.00 g/l), cloreto de sdio (5g/l), sais biliares (1,5 g/l), Violeta Cristal (0.002g/l), digesto
pancretica de gelatina (7g/l), extrato de levedura (3 g/l), vermelho neutro (0,03g/l) e Agar (15g/l).
6. Pesquisa e Identificao de Listeria monocytogenes em amostras de peito

de frango
A pesquisa de Listeria monocytogenes em alimentos foi realizada de acordo com o
mtodo descrito pela ISO 11290:1 (Figura 16). A 25g de amostra de peito de frango
colhida de forma assptica, adionou-se 225 ml de meio de Fraser (Scharlau
Chemie, Barcelona), tendo sido efectuada a homegenizao em Stomacher 400 (LabBlender) durante cinco minutos. Realizou-se um pr-enriquecimento em durante 24
horas a 30C aps o que se fez o enriquecimento em meio de Fraser I, que foi posto
a incubar durante 48 horas a 37C. O isolamento foi ef ectuado a partir dos meios
Fraser e Fraser I atravs de sementeira superficie, com ansa, no meio Agr
Listeria de acordo com Ottaviani-Agosti (ALOA, AES Chemunex, Barcelona), que
incubou a 37C durante 24 horas. Para confirmao das colnias suspeitas de Listeria
monocytogenes foi efectuada repicagem de cinco colnias caractersticas (azuis
turquesa com halo opaco) para meio de TSA (Triptona Soja Agar, Scharlau Chemie,
Barcelona) seguida de incubao a 37C durante 24 horas. Seguiu-se a observao
por transiluminao de Henry, das colnias que cresceram no meio TSA. As colnias
que apresentaram uma luminescncia azul foram submetidas a testes da catalase e
oxidase. Para identificao e confirmao utilizmos o teste bioqumico APIListeria,
(bioMrieux, Frana) realizado de acordo com as intrues do fabricante a partir das
colnias catalase positivas e oxidase negativas. As colnias caracteristicas foram
coradas pelo mtodo de Gram para observao da morfologia bacteriana.
70
25 g de amostra
225 ml de meio de pr
(carne de peito de frango)
enriquecimento (Fraser 1/21)
Homogenizar
incubar 30C 1C durante 24 horas 2 horas
0,1 ml
Semear 0,1 ml
+
10 ml de Fraser1
superfcie de ALOA2
com ansa
Incubar
48 horas 2 horas
35 37C 1C
Semear 0,1 ml
superfcie de ALOA
Incubar 24 horas 3 horas a 37C 1C
Repicar 5 colnias caractersticas

(azuis turquesa com halo opaco)
Semear em placas de Petri com meio de TSA3
Colorao de gram
Transiluminao de Henry
Catalase +
Oxidase API Listeria
Figura 16: Diagrama do mtodo ISO 11290:1 para pesquisa e identificao de Listeria
monocytogenes em alimentos.
Legenda:
1
O meio de Fraser e Fraser I (por adio de suplemento ao Fraser ) so meios de enriquecimento

para Listeria spp. em amostras alimentares e do meio ambiente. Todas as espcies do gnero Listeria
hidrolizam a esculina a esculetina, que reage com os ies de ferro provocando um enegrecimento do
meio. A adio de citrato frrico de amnio melhora o crescimento de L. monocytogenes. O cloreto de
ltio em conjunto com o cido nalidixico e a acriflavina do suplemento inibem o crescimento de outras
bactrias que podem hidrolizar a esculina. A concentrao elevada de cloreto de sdio inibe o
crescimento de Enterococci. Triptona, peptona e extracto de levedura fornecem nitrognio, vitaminas,
2
minerais e aminocidos (ISO 11290-1). ALOA (Agar Listeria de acordo com Ottaviani e Agosti) um
meio cromognico para isolamento de Listeria que permite diferenciar L.monocytogenes das restantes
3
espcies (ISO 11290-1). TSA, consiste em Agar, Triptona de soja e extracto de levedura, formulado
para o isolamento e confirmao de Listeria monocytogenes atravs da transiluminao de Henry de
alimentos (ISO 11290-1).
71
7. Contagem de Listeria monocytogenes

A contagem da Listeria monocytogenes em alimentos foi realizada de acordo com
o mtodo descrito pela ISO 11290:2 (Figura 17). Semeou-se em duplicado 0,1 ml da
25 g de amostra + 225 ml do meio de pr enriquecimento Fraser 1/2

1 hora
20C
Semear 0,1 ml superfcie de ALOA com ansa
Incubar durante 24 horas + 24 horas 3 horas a

37C 1C
Contar as colnias caractersticas

(azul turquesa com halo opaco)
Confirmao de Listeria monocytogenes de acordo

com a pesquisa deste microrganismo descrito em 5
Figura 17: Diagrama do mtodo ISO 11290:2 para contagem de Listeria

monocytogenes em alimentos.
suspenso preparada tal como descrita em 6 para pesquisa, superficie com ansa,
seguida de contagem das colnias suspeitas (azuis turquesa com halo opaco) aps
incubao a 37C durante 24 a 48 horas. A confirmao de Listeria monocytogenes
efectuou-se de acordo com a pesquisa deste microrganismo descrito em 6. Os
resultados foram expressos em log ufc/g.
8. Optimizao e validao da mtodologia molecular de reaco em cadeia da
polimerase (PCR) para pesquisa de Listeria monocytogenes. Limite de
deteco.
Realizaram-se dois ensaios que eram repeties independentes de inoculaes
(como recomendado pela ISO 16140), em que cada uma de duas amostras de peito
de frango foram artificialmente inoculadas, nas quais foi previamente confirmada a
ausncia de Listeria monocytogenes em 25g de acordo com a metodologia descrita
72
em 5. A pesquisa de Listeria monocytogenes em 25g foi realizada em ambas as

amostras.
8.1.
Estirpe utilizada para as inoculaes
Utilizou-se uma estirpe de Listeria monocytogenes 4a CECT 934 conservada a

4C no meio de TSA (Triptona soja agar, Scharlau Chemie, Barcelona). Esta cultura
foi renovada semanalmente. Antes de ser utilizada no ensaio de inoculao para
optimizao
validao
da
mtodologia
PCR
para
pesquisa
de
Listeria
monocytogenes procedeu-se repicagem da estirpe para tubos com meio de BHI (

Brain Heart Infusion, Scharlau Chemie, Barcelona), incubando durante 24 horas a
37C e em seguida semeou-se por estria em placas de TSA as quais foram incubadas
por um perodo de 24 horas a 37C de modo a obterem-se colnias isoladas.
8.2.
Preparao das suspenses para serem inoculadas
Seleccionou-se uma colnia de Listeria monocytogenes 4a de uma placa de TSA

e inoculou-se em 10 ml de meio de BHI. Incubou-se a suspenso durante 24 horas a
37C. Segundo Rantsiou et al.(2008) a incubao de uma colnia de Listeria
monocytogenes 4a em BHI durante 24 horas a 37C, origina aproximadamente 109
clulas/ml (Figura 18).
Isolar colnias de Listeria

monocytogenes em TSA slido
Semear 1 colnia de Listeria

monocytogenes em tubo com 10 ml de
BHI
37 C
Inoculaes
(Figura 19)
24 horas
Confirmao da concentrao de
Listeria monocytogenes / ml
(Procedimento descrito em 6.)
Figura 18: Protocolo de preparao da suspenso bacteriana de Listeria

monocytogenes 4a em BHI para posteriores inoculaes e confirmao do n de
bactrias/ml da suspenso.
73
Efectuaram-se diluies seriadas da suspenso de BHI aps incubao, procedendose contagem de Listeria monocytogenes 4a de acordo com o procedimento descrito
em 6, para confirmao da concentrao bacteriana de Listeria monocytogenes 4a.
8.3.
Inoculao das amostras de peito de frango
Foi realizado um ensaio de inoculao em duas amostras de peito de frango para

avaliao da metodologia de PCR. Em cada um de quatro sacos de Stomacher
colocou-se 25g de frango e 225 ml de Fraser I/2, os quais foram inoculados com
diferentes volumes da suspenso bacteriana previamente preparada e posteriormente
homogeneizados no Stomacher 400 (Lab Blender) durante cinco minutos.
A suspenso inicial (com 109 clulas/ml aproximadamente) foi diluida a 103. No
saco n 1 introduziram-se 25l da suspenso ( para se obter um teor de bactrias
igual a aproximadamente 1-50 bactrias). No saco n 2, inoculou-se 75l de modo a
obter-se um teor de aproximadamente 50-100 bactrias, no saco n 3 inoculou-se
150l para se obter um teor de aproximadamente 100-200 bactrias. No saco n4
inoculou-se 25l da suspenso inicial (109 clulas/ml) para se obter um teor de
bactrias igual a aproximadamente 1-50 X 106 bactrias. Estes sacos (n 1, 2, 3, 4)
foram homogenizados em Stomacher durante 4 minutos). Preparou-se o saco n5
testemunha, no qual no se fez qualquer inoculao. Deste ltimo saco retiraram-se
10 ml para tubos de ensaio (n= 4) onde se inocularam concentraes de bactrias
iguais s inoculadas nos sacos de Stomacher. Estes tubos no foram incubados.
Os sacos de Stomacher com suspenso incubaram 24 horas a 30C. Aps a
incubao, retirou-se de cada saco 0,1 ml de suspenso e adicionou-se a 10 ml de
Fraser I que incubou durante 48 horas a 37C.
Aps cada fase de enriquecimento selectivo nos meios de Fraser durante 24
horas a 30C e Fraser I durante 24+24 horas a 37C, retirou-se 1 ml de suspenso
(em duplicado) para tubo de Eppendorf e congelou-se a -20C para posterior
extraco de DNA (ver ponto 8.2). Foi realizado o mesmo procedimento de colheita e
conservao de aliquota de amostra para os tubos de 10 ml de suspenso sem
incubao.
74
25 g de amostra + 225 ml de Fraser para cada saco de stomacher
Homogeneizar no Stomacher 400 durante alguns minutos
Inocular em cada saco de Stomacher:
Saco 1
Saco 2
Saco 3
Saco 4
Saco 5
1-50 bactrias
50-100 bactrias
100-200 bactrias
1-50x10 bactrias
Sem Inoculao
24 horas
30C
Tubo 1:1-50 bactrias/10 ml

Tubo 2: 50-100 bactrias/10ml
e,f
Retirar 0,1 ml de cada saco e

adicionar 10 ml de Fraser I
Reservar 1ml de cada

concentrao bacteriana em
Eppendorf e congelar a -20C
Tubo 3: 100-200 bactrias/10 ml

Tubo 4: 1-50x106 bactrias/10ml
48 horas 37C
Sem incubar
24 horas
37C



Figura 19: Protocolo de inoculaes das amostras para determinao da

sensibilidade da metodologia PCR.
9. Metodologia molecular baseada na reaco em cadeia da Polimerase PCR

para pesquisa de Listeria monocytogenes em 25g de amostra de peito de
frango colhido em matadouro comercial
9.1.
Preparao das amostras
A partir de 25g de carne de peito de frango colhida de forma assptica, realizou-se

um pr-enriquecimento em 225 ml de meio de Fraser
(Scharlau Chemie,
Barcelona) durante 24 horas a 30C aps o qual se fez o enriquecimento em meio de
75
Fraser I que incubou durante 48 horas a 37C. Aps cada periodo de enriquecimento
(Fraser e Fraser I) reservou-se em duplicado 1 ml de suspenso em tubo
Eppendorf que se colocou a -20C para posterior extraco do DNA.
9.2.
Extraco do DNA das amostras para PCR
Um mililitro de cada amostra foi centrifugado (Eppendorf Centrifuge 5415 R)

durante cinco minutos a 10,000g (10400 RPM), a 4C. O sobrenadante foi eliminado e
os pellets foram ressuspensos em 300 l de resina Chelex 100 a 6% (Merck,
Alemanha) em gua, misturados no Vortex, colocados em banho de gua a 100C
durante 8 minutos, misturados no vortex novamente e arrefecidos rapidamente no
gelo at uma temperatura de aproximadamente 52C. Finalmente foram centrifugados
de novo durante cinco minutos a 10000 g a 4C e reservou-se em novo tubo de
Eppendorf 300 l do sobrenadante que se congelou a -20C para utilizao posterior
(adaptado de Rodrguez Lzaro et al., 2004).
9.3.
Controlos da reacco
Para assegurar o procedimento analtico, em todas as reaces de PCR foram

utilizados controlos positivos (DNA de Listeria monocytogenes 4a CECT 934 e
extrado para este fim) e um controlo negativo (mqH2O) para controlo do processo de
extraco e amplificao.
9.4.
Reaco da Polimerase em Cadeia PCR
A reaco de PCR foi realizada num termociclador standard e a identificao dos

produtos da reaco foi efectuada por electroforese em gel de agarose a 1,5% com
brometo de etdio. Os primers utilizados foram os que se reportam ao gene prfA, em
que
LIP1
LIP2
so
referentes
aos
nucletidos
634
654
(5-
GATACAGAAACATCGGTTGGC) e 886 a 907 (5-GTGTAACTTGATGCCATCAGG)

respectivamente, os quais do origem a um produto de 274 pb (Simon, Gray & Cook,
1996; Talon et al., 2007). O gene prfA est envolvido na regulao da sntese da
listeriolisina (Holko, Urbanov, Kantikov, Pstorov & Kmet, 2002; Talon et al.,
2007). As reaces de PCR foram realizadas em tubos para PCR de 0,5 ml de parede
fina (Eppendorf, Hamburg), usando um termociclador (PCR System 9700, Gene Amp,
Applied Biosystems). A mistura utilizada tem na sua constituio 5 l de DNA extrado
das amostras e as concentraes finais de 2,5mM de MgCl2, 150 M de cada
desoxinucletido, 0,3 M de cada primer (Invitrogen, Lisboa), 1g/l de vBSA (SigmaAldrich, Alemanha) e 1U de Taq DNA Polimerase (NZyTech, Lisboa). Como controlo
76
positivo foi utilizado DNA de Listeria monocytogenes 4 CECT 934. Os parmetros dos
ciclos foram, pr incubao a 94C durante 2 minutos, 40 ciclos a 94C durante 30
segundos (desnaturao), 55C durante 30 segundos (annealing), 74C durante 1
minuto (extenso) e a incubao final a 74C durante 5 minutos. Os produtos da
reaco foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 1,5%, corados com
brometo de eitidio (Sigma, EUA) e visualizadas em transiluminador de UV (Image
Master VDS, Pharmacia Biotech). Foi incluido conjuntamente com as amostras um
marcador de DNA de 100 pb (Gehealthcare, USA). As imagens obtidas foram tratadas
com o programa Adobe Photoshop 7.0 para melhorar a definio.
10. Anlise Estatistica

Foi realizada uma anlise descritiva dos resultados, utilizando para o efeito o
programa SPSS Statistics 17.0 para Windows. O efeito do dia de abate, sistema de
produo e origem/produtor sobre o parmetro Enterobacteriaceae foi executado pelo
ajuste de um modelo Univariate ANOVA, com um grau de confiana de 95%.
77
Apresentao e Discusso de Resultados:
1. Avaliao da higiene das amostras de peito de frango

Embora o Regulamento 1441/2007 estabelea que para a carne de frango, o
critrio de higiene do processo deva ser Salmonella, foi escolhido como parmetro de
avaliao de higiene do abate a contagem de Enterobacteriaceae por motivos de
logistica do laboratrio. O Painel Cientfico dos Riscos Biolgicos (Painel BIOHAZ) da
Autoridade Europeia para a Segurana dos Alimentos (AESA) emitiu um parecer
sobre Enterobacteriaceae como indicadores de Salmonella e de Enterobacter
sakazakii. Concluiu no ser possvel estabelecer uma correlao entre as
Enterobacteriaceae e a Salmonella e que no existe uma correlao universal entre
as Enterobacteriaceae e Enterobacter sakazakii.
Na Figura 20 esto representadas as contagens de Enterobacteriaceae em
amostras de peito de frango recolhidas em trs dias diferentes de abate/desmancha.
Os valores mdios foram de 3,50 log ufc/g, 3,27 log ufc/g e 3,51 log ufc/g
respectivamente, e entre os quais no se verificaram diferenas significativas (F=2,55;
Significncia=0,09).
O valor mdio de Enterobacteriaceae em todas as amostras de carne de peito de
frango analisadas (n=52) foi de 3,4 log ufc/g, com um desvio padro de 0,06.
Nos peitos de frango provenientes dos trs tipos de produo, (Figura 21) as
contagens de Enterobacteriaceae foram de 3,41 log ufc/g, 3,46 log ufc/g e 3,37 log
ufc/g para a produo biolgica (n=16), produo extensiva (n=20), produo
intensiva (n=16) respectivamente, no se verificando qualquer diferena significativa
entre elas (F=0,27; Significncia=0,77).
As contagens mdias de Enterobacteriaceae em carne de frangos provenientes de
bandos e exploraes avcolas diferentes esto representadas na Figura 22,
verificando-se
que
existem
diferenas
significativas
entre
eles
(F=2,48;
Significncia=0,016), sendo esta diferena ainda mais significativa entre os bandos A,

D e N relativamente aos restantes.
78
4
Enterobacteriaceae
log ufc/g
3,5
3,50
3,51
3,27
3
2,5
2
n=20
n=20
n=12
1,5
1
0,5
0
14-07-2008
10-09-2008
13-10-2008
Dia de abate
Figura 20: Contagens de Enterobacteriaceae (log ufc/g) em amostras de peito de

frango recolhidas em diferentes dias de abate/desmancha.
Enterobacteriaceae (log ufc/g)
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
3,46
3,37
3,41
n=20
n=16
n=16
1,50
1,00
0,50
0,00
Extensiva
Intensiva
Biolgica
Sistema de produo
Figura 21: Contagens de Enterobacteriaceae (log ufc/g) em peitos de frango

provenientes de trs tipos de produo.
79
Legenda:
Bandos A, B, F, G,
Enterobacteriaceae (log ufc / g)
L, M:
3,5
3
Frango do campo;
D
E
2,5
Bandos C, D, H, I:
Frango de produo
biolgica;
Bandos E, J, N:
Frango de produo
1,5
intensiva.
1
0,5
0
Produtor/Bando
Figura 22: Contagens mdias de Enterobacteriaceae (log ufc/g) por bando em peitos
de frangos (n = 4 / bando), provenientes de diferentes bandos.
As aves quando chegam ao matadouro esto muito contaminadas com bactrias,
muitas delas potencialmente patognicas para o Homem, tais como E. coli e
Salmonella spp (Gksoy et al., 2004).
Da totalidade das amostras colhidas, apenas uma teve contagens de
Enterobacteriaceae superiores a 4 log ufc/g, que corresponde ao valor de referncia
referido por Mossel (1995), como limite superior de boa qualidade higinica.
Gksoy et al. (2004) observaram que o teor de Enterobacteriaceae foi de 3,81 log
ufc/g e 3,91 log ufc/g aps o arrefecimento em amostras de pele de carcaas de
frango provenientes de dois matadouros diferentes. A legislao nacional e da UE no
fixa teores mximos de concentraes de Enterobacteriaceae em carne de frango. No
entanto os valores de coliformes fecais por grama de preparados de carne referidos
na legislao francesa so iguais a 103 ufg/g .
O efeito dos diferentes dias de abate/desmancha no indicador de higiene de
processo Enterobacteriaceae encontrado em peitos das caracaas de frango abatidas
e desmanchadas no se verificou, visto no terem sido encontradas diferenas
significativas. Por fim, pode-se inferir que as prticas do matadouro relacionadas com
os procedimentos das linhas de abate se fazem de forma higinica e efectiva
relativamente preveno da contaminao fecal das carcaas, uma vez que as
contagens de Enterobacteriaceae foram baixas em todos os dias de recolha. Alm
disso as condies de trabalho no matadouro cumpriam os requisitos legais
80
relativamente temperatura da sala de desmancha (< 12C) (Regulamento

853/2003), limitando a proliferao bacteriana na carne.
A primeira colheita de amostras no presente estudo foi efectuada no Vero, o que
exps os bandos nas exploraes a temperaturas superiores. No segundo e terceiro
dia de colheita as temperaturas foram inferiores relativamente ao primeiro ensaio, por
j estarmos no final do Vero e incio do Outono respectivamente. Segundo Cohen et
al. (2007), nas estaes do ano mais quentes, a flora microbiana dos bandos e
consequentemente das carcaas aparece aumentada. No entanto, as alteraes
ambientais no contribuiram para variaes significativas nas contagens de
Enterobacteriaceae observadas nas amostras de peito de frango neste estudo, talvez
porque no nosso pas as amplitudes trmicas no so grandes, no final do Vero e o
Outono de 2008 registaram-se temperaturas superiores s previstas e as condies
de alojamento das aves permitirem maior controlo da temperatura. Tambm Mengert
& Fehlhaber (1996) submeteram as aves a stress por calor adicional durante o
transporte e verificaram que no teve influncia no teor bacteriano endgeno.
Outro factor que poderia ter efeito na higiene da carne de frango obtida o
sistema de produo de frangos. No matadouro em que se efectuaram as colheitas,
so abatidos frangos provenientes de exploraes de produo intensiva, de
produo extensiva e de produo biolgica. As aves provenientes destes dois
ltimos sistemas so abatidas na mesma linha de abate e posteriormente evisceradas
manualmente. Ao invs destas, os frangos do sistema intensivo so abatidos em linha
de abate diferente e a eviscerao feita de forma automtica. Estas diferenas no
abate e obteno de carcaas que so usadas na desmancha, poderiam introduzir
partida diferentes valores de flora contaminante nas carcaas de diferentes origens.
Os teores de Enterobacteriaceae no final do abate, podem em algumas situaes
aumentar devido eviscerao automtica porque durante a mesma h maior
probabilidade de rotura do tubo digestivo (Mead et al., 1993; Abu-Rwaida et al., 1994
citados por Gksoy et al., 2004). H poucos estudos focados na produo extensiva e
biolgica, onde as aves so expostas a mltiplas fontes de contaminao e a idade do
abate superior relativamente ao sistema intensivo (Esteban, Oporto, Aduriz, Juste &
Hurtado, 2007). Tm sido tomadas medidas de biossegurana na produo de aves
em sistema intensivo interior mas a preveno da transmisso de Salmonella e de
outras Enterobacteriaceae a partir do ambiente mais difcil para regimes de
produo no exterior (Esteban et al., 2007). Num estudo de Bailey & Cosby (2005)
citado por Esteban et al. (2007), a frequncia de Salmonella em frangos criados em
regime extensivo foi superior do sistema de produo intensivo. Por outro lado,
81
Uyttendaele et al. (2005), citado tambm por Esteban et al., (2007) estudaram a
frequncia de Salmonella em frangos na Blgica e os resultados indicaram que esta
era inferior no tipo de produo extensiva quando comparado com o sistema de
produo intensivo, apontando para esta diferena a diminuio do stress das aves o
que leva a uma diminuio da disperso bacteriana pelas fezes. Alm disso, a
densidade populacional nestes sistemas (extensivo e biolgico) menor, o que
diminui a transmisso fecal-oral.
Nos peitos desmanchados de carcaas de frango de diferentes sistemas
produtivos
no
se
verificaram
diferenas
significativas
dos
teores
de
Enterobacteriaceae, e isto pressupe que os diferentes sistemas de produo no

influenciaram a carga de Enterobacteriaceae dos bandos e que no matadouro ambas
as linhas de abate tm desempenhos similares em termos de contaminao fecal.
Por fim, avaliou-se se diferentes produtores do origem a diferenas significativas
nas contagens de Enterobacteriaceae e de facto so observveis diferenas
significativas entre as diferentes exploraes de origem. Pudmos ento verificar que
o maneio do frango at chegada ao matadouro poder de algum modo influnciar os
teores de Enterobacteriaceae na carne de peito de frango.
O maneio, inclui aspectos relacionados com o estado sanitrio dos animais, a
densidade populacional do avirio, a limpeza e remoo das camas, a alimentao, o
vazio sanitrio, a lavagem e desinfeco dos camies e caixas de transporte das aves
vivas, o cumprimento do periodo de jejum, a diminuio do stress aquando da apanha
e transporte, entre outras, que podem influnciar o estado higido das aves e assim
fazer aumentar a excreo destes agentes pelas fezes. A contaminao de aves vivas
com microrganismos potencialmente patognicos comea com a colonizao do
tracto gastro-intestinal por estas bactrias, e influnciada pelo estado vacinal dos
animais, tratamentos anti-microbianos, e competio com a flora intestinal nativa
(Mulder, 2008). No estudo de Mengert & Fehlhaber (1996), verificou-se que mesmo
um transporte normal de aves aumenta a taxa de contaminao bacteriana em quase
50% e 10% dos animais transportados sofriam de bacterimia induzida pelo stress.
Pelo exposto verificou-se que o maneio das aves at chegada ao matadouro tem
consequncias na sua contaminao, que por sua vez influncia a carga microbiana
do produto final.
82
2. Optimizao e validao da metodologia PCR. Limite de deteco

Na Tabela 9, Figura 23 e Figura 24 apresentam-se os resultados do ensaio de
inoculao em matriz de frango para validao e determinao do limite de deteco
Ensaio 1
Sub
Identificao
Amostras
Amostra A
Amostra B
PCR
PCR
Fraser I; sem incubao; 1-50 bactrias/10 ml
Fraser I; sem incubao; 50-100 bactrias /10 ml
Fraser I; sem incubao; 100-200 bactrias /10 ml
Fraser I; sem incubao; 1-50 x 106 bactrias /10 ml
Fraser I; sem incubao; sem inoculao
Fraser I; incubao 24h/30C; 1-50 bactrias/25g
Fraser I; incubao 24h/30C; 50-100 bactrias/25g
Fraser I; incubao 24h/30C; 150 bactrias/25g
Fraser I; incubao 24h/30C; 1-50 x 10 bactrias/25g
10
Fraser I; incubao 24h/30C; sem inoculao
11
Fraser II; incubao 48h/37C; 1-50 bactrias/25g
12
13
14
Fraser II; incubao 48h/37C; 1-50 x 10 bactrias/25g
15
Fraser II; incubao 48h/37C; sem inoculao
Tabela 9: Resultado das reaces de PCR realizadas em amostras recolhidas em diferentes

etapas de enriquecimento para pesquisa de Listeria monocytogenes em peito de frango,
inoculado com diferentes teores de Listeria monocytogenes.
Legenda:
N: Negativo para a presena de Listeria monocytogenes
P: Positivo para a presena de Listeria monocytogenes
da metodologia preconizada neste estudo. Nos tubos com 10 ml de suspenso de 25g

de frango em 225 ml de Fraser e inoculaes de concentraes crescentes de
Listeria monocytogenes, no incubados, no foi possvel detectar a presena desta
bactria. Das sub-amostras inoculadas e incubadas, aps a primeira fase de
enriquecimento (Fraser , 30C, 24 horas) apenas a amostra com concentrao
bacteriana igual a 25 x 106 bactrias/25g (106 bactrias/g) permitiu a deteco de uma
banda caracterstica (figura 23). Nas restantes sub-amostras (figura 24) no foi
possvel detectar a presena de bandas correspondentes a Listeria monocytogenes
em 25g. Aps a segunda fase de enriquecimento (Fraser I, 37C, 48 horas), foi
detectada a presena de Listeria monocytogenes em todas as sub-amostras
inoculadas com as diferentes concentraes desta bactria. As sub amostras 5, 10 e
83
15 (Tabela 9), que no foram inoculadas e serviram como controlo negativo, no

originaram nenhuma banda de amplificao correspondente a DNA de Listeria
monocytogenes.
Figura 23: PCR das amostras de peitos de frango

inoculadas, observando-se as bandas caractersticas
de Listeria monocytogenes.
Legenda:
9: Fraser 1/2; incubao 24h/30C; 25 x 106bactrias/25g;
P: Controlo Positivo;
N: Controlo Negativo;
M: Marcador com 100 pb.
Figura 24: PCR das amostras de peitos de Frango inoculadas com concentraes
crescentes de bactrias/g em meio Fraser incubadas durante 24 horas a 30C, a
37C em meio de Fraser I aps 48 horas, e zero horas de incubao correspondentes
ao ensaio nmero um e onde se podem observar as bandas caractersticas de Listeria
monocytoges nas amostras 11, 12, 14.
84
Legenda:
1: Fraser I; sem incubao; 25 bactrias/10 ml; 2: Fraser I; sem incubao; 75 bactrias /10 ml; 3: Fraser I; sem
incubao; 150 bactrias /10 ml; 5: Fraser I; sem incubao; sem inoculao 6: Fraser I; incubao 24h/30C; 25
bactrias/25g; 7: Fraser I; incubao 24h/30C; 75 bactrias/25g; 8: Fraser I; incubao 24h/30C; 150 bactrias/25g;
10: Fraser I; incubao 24h/30C; sem inoculao; 11: Fraser II; incubao 48h/37C; 25 bactrias/25g; 12: Fraser II;
incubao 48h/37C; 75 bactrias/25g; 13: Fraser II; incubao 48h/37C; 150 bactrias/25g; 15: Fraser II; incubao
48h/37C; sem inoculao; P: Controlo Positivo; N:Controlo Negativo; M:Marcador de 100 pb.
A deteco de Listeria monocytogenes, atravs de mtodos moleculares em

alimentos pode ser condicionada por diversos factores os quais podem comprometer
os resultados, importante elaborar um estudo prvio da sensibilidade do protocolo
de PCR clssico adoptado para este trabalho experimental. A avaliao da
sensibilidade desta metodologia demonstra que sem enriquecimento (Tabela 8),
mesmo concentraes to elevadas como 103 bactrias/ml no so passveis de
serem detectadas de forma directa, isto , sem enriquecimento, resultados que esto
de acordo com estudos anteriores. (Fitter et al., 1992; Barocci et al., 2008). Duffy et
al., (1999, citado por Levin, 2003) aps incubao durante 18-24 horas tiveram como
limite de deteco 1 x 104 bactrias/ml em carne de frango. Com esta metodologia
possvel detectar quantidades to pequenas como 1 bactria/g, aps enriquecimento
em Fraser I das amostras, embora as comparaes e extrapolaes devam ser
acauteladas uma vez que geralmente h diferenas na extraco, reaco e matriz
alimentar entre estudos diferentes e que influnciam os resultados obtidos (Liu, 2008).
Podemos verificar que o PCR um mtodo rpido e eficiente na deteco de
Listeria monocytogenes, mas cuja aplicao correcta a amostras de alimentos est
limitada, por estes terem geralmente baixas concentraes de agentes patognicos,
populaes bacterianas heterogneas e elevados volumes de matriz de alimento que
contm substncias que podem inibir alguns dos compostos da reaco de PCR
(Murphy et al., 2007). A ausncia de incubao leva a que tenhamos maior
quantidade de potnciais inibidores da reaco provenientes da matriz do alimento
(Liu, 2008). A metodologia acoplada a PCR utilizada foi associada a pr
enriquecimento da amostra a qual parece ser a opo certa para a identificao de
Listeria monocytogenes, pois permite a deteco de nveis relativamente baixos de
bactrias viveis (OGrady et al., 2008).
A utilizao de um controlo positivo interno, permite avaliar todas as possveis
falhas internas do mtodo PCR devido presena de substncias da matriz do
alimento. Assim assegura-se que o extracto de DNA pode ser passvel de sofrer
amplificao e que no existe na matriz do alimento qualquer composto que possa
85
inibir a amplificao do DNA. Os resultados negativos de PCR devem-se de facto a

ausncia de DNA e no a falsos negativos (Murphy et al., 2007; Amagliani et al.,
2007).
3. Avaliao da segurana de amostras de peitos de frango: Pesquisa e
contagem de Listeria monocytogenes
Das cinquenta e duas amostras de peito de frango testadas (Tabela10), todas
deram resultados negativos pela metodologia PCR relativamente presena de
Listeria monocytogenes, cujo limite de deteco foi previamente estabelecido, o que
significa que em todas as amostras a concentrao inicial de Listeria monocytogenes,
era inferior a 1 bactria/g.
As contagens de Listeria monocytogenes pela metodologia clssica descrita em 4
foram inferiores a 10 ufc em 25g para todas as amostras testadas.
A pesquisa de Listeria monocytogenes em 25g pela metodologia clssica resultou
em dez amostras positivas no primeiro ensaio (n=20), uma amostra positiva no
segundo ensaio (n=20) e zero amostras positivas no terceiro ensaio (n=12) (Tabela
10).
No primeiro ensaio submetemos aos testes bioqumicos API Listeria, as colnias
suspeitas que cresceram no meio ALOA e posteriormente repicadas para meio TSA.
Paralelamente foi feita a identificao molecular por PCR destas mesmas colnias.
Obtivmos por ambos os mtodos, a confirmao da presena de Listeria
monocytogenes em 25g de amostra.
As amostras de frango das duas etapas de enriquecimento, em meio liquido
tambm foram testadas por PCR e na sua totalidade os resultados foram negativos
quanto presena de Listeria monocytogenes, o que significa que os valores de
contaminao por Listeria monocytogenes da carne de peito de frango so inferiores a
25bactrias/25g, visto a sensibilidade do mtodo ser de 1 bactria/g.
Face aos resultados obtidos pelo mtodo clssico, parece ter havido no primeiro
ensaio contaminaes cruzadas entre carcaas. Nos ensaios posteriores, pela mesma
metodologia, os valores foram baixos ou nulos, razo pela qual parece-nos no haver
populao residente de Listeria monocytogenes neste matadouro, nem na sala de
desmancha (onde se incluem todos os utenslios e equipamentos que contactam com
as carcaas de frangos antes e depois do abate e desmancha), pois se assim fosse
teriamos um isolamento consistente de Listeria monocytogenes nos restantes
ensaios, o que no ocorreu (Lawrence & Gilmour, 1994), nem na carne, nem nos
materiais que com ela contactarem (cones e caixas de transporte).
86
Bando
Amostra
contagem
(log ufc/g)
Aloa
(FI/2)2
Aloa
3
(FI)
TSA
Gram
Oxidase
Catalase
API
Listeria
PCR
NR
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N
ENSAIO I / 14 de Julho de 2008

Bando A
Frango de
regime
extensivo
Bando B
Frango de
regime
extensivo
Bando C
Frango de
produo
biolgica
Bando D
Frango de
produo
biolgica
Bando E
Frango de
regime
intensivo
P93
P94
P95
P96
P97
P98
P99
P100
P101
P102
P103
P104
P105
P106
P107
P108
P109
P110
P111
P112
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P122
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+ / Bast.
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N
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N
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N
N
NR
N
N
NR
ENSAIO II / 10 de Setembro de 2008

Bando F
Frango de
regime
extensivo
Bando G
Frango de
regime
extensivo
Bando H
Frango de
produo
biolgica
Bando I
Frango de
produo
biolgica
Bando J
Frango de
regime
intensivo
N
S
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S
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N
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P
NR
P
NR
NR
NR
NR
P
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P
NR
S
S
S
S
S
NR
NR
NR
NF
+ / Bast.
NR
+/Bast.
NR
NR
NR
NR
+ / Bast.
NR
+ / Bast.
NR
+ / Bast.
+ / Bast.
+ / Bast.
+ / Bast.
+ / Bast.
NR
NR
NR
NR
N
NR
N
NR
NR
NR
NR
N
NR
N
NR
N
N
N
N
N
NR
NR
NR
ENSAIO III / 13 de Outubro de 2008

Bando J
Frango de
regime
extensivo
Bando L
Frango de
regime
extensivo
Bando M
Frango de
regime
intensivo
Superficie
da
bancada
Caixa
Tabela 10: Resultados da contagem e pesquisa de Listeria monocytogenes em carne de peitos

de frango.
87
Legenda:
Bast.: Bastonetes
N: Ausncia de suspeita de existncia de Listeria monocytogenes
NR1: Provas no realizadas por inexistncia de colnias suspeitas nas placas de ALOA
P: Presena de Listeria monocytogenes
S: Suspeita de presena Listeria monocytogenes
L.m.: Resultado positivo para Listeria monocytogenes atravs do teste API Listeria
1
: Resultado de PCR negativo a partir dos meios Fraser e Fraser I e positivo a partir de colnias suspeitas, retiradas de placas
de TSA.
2
: Resultados correspondentes ao aparecimento de colnias caractersticas de Listeria monocytogenes em placas de ALOA por
sementeira a partir do meio Frase I/2 (Half Fraser).
: Resultados correspondentes ao aparecimento de colnias caractersticas de Listeria monocytogenes em placas de ALOA por
sementeira a partir do meio Frase I (Fraser One).
: Colnias caractersticas presentes em placas de TSA que cresceram a partir de colnias caractersticas repicadas das placas
de ALOA
Estes resultados (21%) so no entanto inferiores aos descritos por alguns autores.
Lawrence & Guilmour (1994) obtiveram resultados positivos pela tcnica de PCRMultiplex quanto presena de Listeria monocytogenes em 10 das 12 amostras (83%)
de carne de peito removidas manualmente da carcaa. Vitas et al. (2003) detectaram
a presena de L. monocytogenes em 57 das 158 amostras (36,1%) de carne de
frango colhidas em pequenas unidades de processamento de Navarra (Espanha)
atravs da metodologia clssica. Barbalho et al., (2005) avaliaram a presena de
Listeria monocytogenes num matadouro do Brasil, e s isolaram este agente em
14,3% das amostras, e apenas em carcaas embaladas prontas a seguirem o circuito
de distribuio, utilizando para isso um teste de susceptibilidade ao bacterifago
A511. Mena et al., (2005) obtiveram uma incidncia de 60% em amostras de carne de
frango crua recolhida nos produtores e retalhistas, em Portugal, testadas atravs da
metodologia mini-VIDAS usando anticorpos especficos para Listeria monocytogenes
(Tabela 11).
Mtodo Clssico
Pesquisa por PCR
Positivos (%)
Positivos (%)
Ensaio
1
Ensaio I (n=20)
50%
5%
Ensaio III (n=12)
0%
Total dos ensaios (n=52)
21%
Ensaio II (n=20)
1
Lawrence & Guilmour
83%
Barbalho et al.
14%
Mena et al.
60%
Vitas et al.
36,1%
88
Tabela 11: Anlise comparativa da frequncia de Listeria monocytogenes em carne

de frango, em diferentes estudos.
A identificao por PCR de colnias suspeitas retiradas da placa de TSA e
ressuspensas,
permite poupar algum tempo face ao mtodo convencional de
identificao alm de permitir que estas colnias possam ser conservadas por longos
perodos de tempo a -20C ou -80C para posteriores avaliaes e estudos (Lawrence
& Gilmour, 1994), o que vantajoso relativamente metodologia clssica. Alm disso,
as provas bioquimicas do API Listeria permitem alguma ambiguidade nos resultados,
tendo sido algumas estirpes de Listeria monocytogenes confundidas com Listeria
innocua por resultados duvidosos relativamente ao teste DIM (Differentiation /Innocua
/Monocytogenes), baseado na presena ou ausncia de arilamidase da galeria API
Listeria, o que j foi documentado por diversos autores (Rebuffo et al., 2005). Neste
trabalho sentimos por vezes alguma dificuldade na interpretao dos resultados das
cores do teste API Listeria pelo facto de a fronteira de cores ser em alguns casos
muito tnue. Seguindo o protocolo em que se extrai o DNA de colnias isoladas em
placa, poderemos evitar as substncias que podem inibir a reaco de PCR e que
esto presentes na matriz do alimento e nos meios de enriquecimento (Gouws &
Liedemann, 2005).
Os resultados das amostras testadas por PCR indicam um risco de listeriose
associado baixo, uma vez que so inferiores dose vulgarmente aceite como
infectante, menor que 100 clulas bacterianas para individuos suscptiveis (OIE,
2005; IFT, 2004; FDA, 2002) ou valores superiores para adultos saudveis (OIE,
2005), facto que corroborado pela elevada freqncia e distribuio deste
microrganismo em alimentos e nmero reduzido de casos de listeriose. Contudo foi j
referido nos EUA casos de listeriose associada a alimentos com teores de Listeria
monocytogenes inferiores a 0,3 ufc/g (Vitas, Aguado & Garcia-Jalon, 2004).
Os valores baixos de contaminao por Listeria monocytogenes , com a totalidade
das amostras de carne de frango a apresentarem valores infereriores a 1 bactria/g,
sugeridos por este estudo so indicativos de que neste operador econmico se
observam boas prticas de higiene e aplicao do plano de HACCP.
89
4. Pesquisa de Listeria monocytogenes em amostras de equipamento da sala

de desmancha
A colheita de amostras de superfcie de equipamento da sala de desmancha, foi
realizada no primeiro ensaio em cone de carrossel de desmancha, que revelou teores
de Listeria monocytogenes inferiores a 1 ufc/cm2. No terceiro e ltimo ensaio foram
colhidas amostras de superfcie de uma bancada de desmancha e do fundo de uma
caixa de transporte de carcaas, e tambm em ambos
os teores de Listeria
monocytogenes inferiores a 1 ufc/cm2. Segundo diversos autores (Cox et al., 1997;

Gksoy et al., 2004; Lpez et al., 2008), a contaminao das carcaas por Listeria
monocytogenes, ocorre durante o processo de abate e desmancha de frangos,
consequncia de uma maior manipulao. As amostras de peito de frango testadas no
presente estudo foram obtidas, tal como referido anteriormente, por desmancha
manual das carcaas, havendo por isso contacto ntimo com o equipamento.
Embora a legislao actual estabelea que a colheita de superfcies deva ser feita
em superfcies regulares, tambm foi testada a superfcie do cone de desmancha,
pois a rugosidade da superfcie pode favorecer a sua colonizao por bactrias
patognicas, nomeadamente Listeria monocytogenes. As estruturas analisadas que
contactam com as carcaas durante a desmancha e o transporte das mesmas,
estavam isentas de Listeria monocytogenes, corroborando os resultados obtidos para
as amostras de peito de frango. No entanto, as amostras colhidas (n=3) no so
estatisticamente significativas e por isso estes resultados so meramente indicativos.
90
Concluses
1. A metodologia baseada em PCR descrita neste trabalho, requer apenas 72 horas
at obteno de resultados o que significativamente menor, comparativamente com
o mtodo standard baseado na ISO, tem custos relativamente mais baixos e permite
testar um grande nmero de amostras em simultneo. O limite de deteco da
metodologia acoplada a PCR utilizada no presente trabalho tem uma sensibilidade de
1 bactria/g aps enriquecimento em Fraser I.
2. O teor mdio de Enterobacteriaceae em todas as amostras de carne de peito de

frango analisadas (n=52) foi de 3,4 log ufc/g, havendo por isso boas condies
higiosanitrias de todo o processo de abate e desmancha de carcaas. O sistema de
produo e o dia de colheita no influenciam significativamente os teores de
Enterobacteriacea, mas ao invs destes, exploraes avcolas de origem diferentes
originam contagens de Enterobacteriaceae significativamente diferentes.
3. A frequncia de isolamento de Listeria monocytogenes a partir de carne de frango

foi de 21%. No entanto nenhumas destas amostras deram resultados positivos pela
metodologia de PCR aplicada aos meios lquidos de enriquecimento.
4. As amostras de peitos de frango (n=52) avaliadas neste estudo pelo mtodo de

PCR, que se apresentaram negativas, tm teores de Listeria monocytogenes
inferiores a 1 bactria/g, e so por isso consideradas seguras para os consumidores.
No entanto, sabendo que so produtos refrigerados durante perodos considerveis
de tempo o que permite desenvolvimento desta bactria, fundamental informar os
consumidores, em particular os considerados de risco, que devem em ambiente
domstico evitar as contaminaes cruzadas entre os diferentes gneros alimentcios
e cozinhar bem este alimento.
5. Quanto garantia de ausncia desta bactria em carne de frango, no a

verificao da ausncia de Listeria monocytogenes atravs desta metodologia de
PCR utilizada ou outra metodologia que permite atingir esse objectivo mas sim a
aplicao de medidas proactivas ao nvel da produo, abate, desmancha,
distribuio e consumo.
91
Perpectivas futuras
As diversas metodologias baseadas na biologia molecular, vieram trazer um
contributo enorme segurana alimentar, tornando a pesquisa de agentes de
infeces de origem alimentar mais eficiente e mais clere. No que concerne
metodologia baseada em PCR, sabemos existirem diversas substncias que a podem
inibir , alm de poder ser influnciada pelo mtodo de extraco de DNA e ainda pelo
tipo e durao do processo de enriquecimento, o que denota desde logo a
necessidade de um estudo de cada tipo de alimento e da adaptao da metodologia
de forma especfica a cada matriz de alimento, para deste modo haver processos
standard para cada binmio agente patognico/matriz de alimento, e assim
podermos ter resultados mais comparveis e mais fiveis.
Sabemos hoje, que embora Listeria monocytogenes seja considerada patognica
para o Homem, existem na verdade dentro desta espcie, estirpes virulentas e
estirpes avirulentas, pelo que se impe uma pesquisa laboriosa em vrios matadouros
e outros complexos onde se manipule carne de frango e se faa PCR ou outra
metodologia molcular dirigidas para a diferenciao da virulncia das estirpes e em
simultneo uma caracterizao das estirpes existentes/residentes nestas estruturas
(matadouros e salas de desmancha), mas que necessita no entanto de mais
pesquisas molculares para se obter uma base gentica mais clara da virulncia e
patogenia desta bactria. Lpez et al.(2008) demonstraram haver variabilidade de
virulncia associada a genotipos diferentes e que ainda existem sub-tipos que podem
persistir durante anos nos locais de processamento de alimentos.
Para alm do referido, dever-se-ia fazer um estudo nacional da prevalncia desta
bactria nos bandos, uma vez que as aves podem carregar esta bactria no seu
intestino o que permite o acesso deste agente patognico s linhas de abate e
desmancha, para poder ser programado o abate dos bandos portadores para o fim e
ainda possibilitar o estudo de medidas de controlo efectivo desta bactria ao nvel dos
bandos.
Com as informaes recolhidas pelas propostas anteriores, poderia ser criada
ento uma base de dados referente a Listeria monocytogenes/ Listeriose, em parceria
com instituies nacionais como laboratrios de referncia e hospitais, resultando em
sistema de alerta rpido desta doena, estudo da prevalncia em animais e humanos,
anlise de risco e elaborao de cdigo de boas prticas para evitar por manipulao
domstica de alimentos os casos de listeriose e as contaminaes cruzadas.
92
Bibliografia:
Alvarado, C. (2006). Chapter 33 : Poultry Processing Quality. In : Handbook of Food
Science. Technology and Engineering Vol. 1, Ed. Hui. Y.Taylor & Francis. USA.
pp. 33-1 33-12.
Amagliani, G., Giammarini, C., Omiccioli, E., Brandi, G. & Magnani, M. (2007).
Detection of Listeria monocytogenes using comercial PCR kit and different DNA
extraction methods. Food Control, 18: 1137-1142.
Annimo, (2007a); Microbiologia Clnica; LABACVET.
Annimo b, SOP 13: esiRNA Silencing Resource preparation and application;
http://www.rnai.ngfn.de/dateien/RZPD_SOP13(2).pdf. Consultado em 10 de Janeiro
de 2008.
Annimo, (2008), Real Time PCR.
http://www.slideshare.net/labimuno/realtime-presentation/. Consultado em 10 de
Janeiro de 2008.
Annimo, (2007d). Listeria: The story so far. Food Engineering & Ingredients.
October. Special Issue:6-10.
www.labint-online.com/index.php?id=2071
Association of Poultry Processors and Poultry Trade in the EU countries
[AVEC]. (2008). Annual Report.
http://avecpoultry.synkron.com/graphics/archive/Annual_reports/Annual%20report%202008/AV
EC%20%2008%20%2805-09%29.pdf
Barbalho, T., Almeida, P., Almeida, R. & Hofer, E., (2005). Prevalence of Listeria spp.
at a poultry processing plant in Brazil and a phage test for confirmation of suspected
colonies. Food Control, 16: 211 216.
Barocci S., Calza, L., Blasi, G., Briscolini, S., De Curtis, M., Palombo, B., Cucco, L.,
Postacchini, M., Matteo Sabbatini, Graziosi, T., Nardi, S. & Pezzotti, G. (2007).
Evaluation of a rapid molecular method for detection of Listeria monocytogenes
directly from enrichment broth media. Food Control, 8: 750-756.
Berrang, M.; Lyon, C., Smith, D. & Northcutt, J. (2000). Incidence of Listeria
monocytogenes on Pre-scald and Post-Chill Chicken. Journal of Applied Poultry Res,
9:546-550.
Bierne, H. & Cossart, P. (2007). Listeria monocytogenes Surface Proteins: from
Genome Predictions to Function. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71
(2): 377397.
Brown, T., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis. 5th Edition. Blackwell Publishing,
UK.
93
Buhr, R. J., Berrang, E., Cason, A. & Bourassa V. (2005). Recovery of Bacteria from
Broiler Carcass Respiratory Tracts Before and After Immersion Scalding. Poultry
Science. 84:17691773.
Carson. A., Hinton, A., Jr. & Buhr, R. (2004). Impact of Feathers and Feather Follicles
on Broiler Carcass Bacteria. Poultry Science, 83:14521455.
Chambel, L., Sol, M., Fernandes, I., Barbosa, M., Zilho, I., Barata, B., Jordan, S.,
Perni, S., Shama, G., Adrio, A., Faleiro, L., Requena, T., Pelez, C., Andrew, P.
&Tenreiro, R. (2007). Occurrence and persistence of Listeria spp. in the environment
of ewe and cows milk cheese dairies in Portugal unveiled by an integrated analysis
of identification, typing and spatial temporal mapping along production cycle.
International Journal of Food Microbiology, 116: 52-63.
Chaturongakul,S., Raengpradub,S., Wiedmann,M. & Boor, K., (2008). Modulation of
stress and virulence in Listeria monocytogenes. Trends in Microbiology, 16,8:388396.
Cohen, N., Ennaji, H., Bouchrif, B., Hassar, M. & Karib, H. (2007). Comparative Study
of Microbiological Quality of Raw Poultry Meat at Various Seasons anf for Different
Slaughtering Process in Casablanca (Marocco). J. Appl. Poult. Res. 16: 502 508.
Cossart P. (2007). Listeriology (1926-2007): the rise of a model pathogen. Microbes
and Infections 9:1143-1146.
Cox, N.A., Bailey, J.S. & Berrang, M.E.(1997). The Presence of Listeria
monocytogenes in the Integrated Poultry industry. JJ. Appl. Poultry Res. 6:116
119.
Cox, N.A., Russel, S.M. & Bailey, J.S. (1998). The microbiology of stored poultry. In:
The microbiology of meat and poultry, Ed. Davies A. & Board R. Blackie Academic &
Professional, UK. Pp. 267-287.
Davies, A. & Board, R. (1998). The Microbiology of Meat and Poultry. 1st Edition.
Blackie Academic & Professional. UK.
Deciso da Comisso 2008/426/CE de 28 de Abril de 2008 que altera a Deciso
2002/253/CE que estabelece definies de casos para a notificao de doenas
transmissveis rede comunitria ao abrigo da Deciso n.o 2119/98/CE do
Parlamento Europeu e do Conselho.
Decreto-Lei n 28/96 de 2 de Abril. Transpe para a ordem jurdica nacional a
Directiva n.o 93/119/CE, do Conselho, de 22 de Dezembro, relativa proteco dos
animais no abate e ou occiso.
Denny, J. & McLauchlin, J., (2008). Human Listeria monocytogenes infections in
Europe na opportunity for improved european surveillance Jan-Mar 2008.
Eurosurveillance; vol. 13:1-3.
http://www.eurosurveillance.org/images/dynamic/EE/V13N13/art8082.pdf
Doyle, M. & Erickson, M. (2006). Reducing the Carriage of Foodborne Pathogens in
Livestock and Poultry. Poultry Science. 85:960973.
94
Dussurget, O., Pizarro-Cerda, J. & Cossart, P., (2004). Molecular Determinantes of

Listeria monocytogenes Virulence. Annu. Ver. Microbiol. 58:587 - 610.
European Food Safety Authority [EFSA]. (2004). Welfare Aspects of Animal
Stunning and Killing Methods, Scientific Report of the Scientific Panel for Animal
Health and Welfare on a request from the Commission related to welfare aspects of
animal stunning and killing methods.
European Food Safety Authority [EFSA]. (2007a). Information on specific zoonoses
Listeria. European Food Safety Authority Journal. 130:149-352.
European Food Safety Authority [EFSA] (2007b). The Community Summary Report
on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents, Antimicrobial Resistence and
Outbreaks in the European Union in 2006.
European Food Safety Authority [EFSA]. (2007c). Request for updating the former
SCVPH opinion on Listeria monocytogenes risk related to ready-to-eat foods and
scientific advice on different levels of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods
and the related risk for human illness - Scientific Opinion of the Panel on Biological
Hazards.
http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1178671312912.htm
European Food Safety Authority [EFSA]. (2008). Scientific Opinion of the Panel on
Biological Hazards on a request from the European Food Safety Authority on
foodborne antimicrobial resistance as a biological hazard. The EFSA Journal. 765, 187.
http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1178680093176.htm
Esteban, J., Oporto, B., Aduriz, G., Juste, R. & Hurtado, A., (2007). A survey of food
borne pathogens in free range poultry farms. International Journal of Food
Microbiology. 123:177-183.
Franciosa, G., Pourshaban, M., Gianfranceschi, M. & Aureli, P., (1998). Genetic
typing of human and food isolates of Listeria monocytogenes from episodes of
listerioses. European Journal Of Epidemiology. 14: 205-210.
Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health
Organization [FAO/WHO]. (2004). Risk assessment of Listeria monocytogenes in
ready-to-eat foods: interpretative summary.Microbiological risk assessment series:
no. 4.
Fraqueza, M.J., Ferreira, M.C. & Barreto, A.S. (2006a). Listeria monocytogenes in
turkey meat under modified atmosphere packaging with gas mixtures of argon or
carbon monoxide. Revista Portuguesa de Zootecnia. 13 (1): 19-35.
Fraqueza, M.J., (2006b), Estudo das caractersticas microbiolgicas, fisico-qumicas e
sensoriais de carne de peru embalada em atmosfera modificada. Tese de
doutoramento apresentada Faculdade de Medicina Veterinria da Universidade
Tcnica de Lisboa. Lisboa.
Food and Drug Administration [FDA], (1992); Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook: Listeria monocytogenes.
http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap6.html
95
Gaillard, L., Berche, P., Frechel, C., Gouin, E. & Cossart, P., (1991). Entry of L.
monocytogenes into cells is mediated by internalin, a repeat protein reminiscent of
surface antigem from Gram positive cocci. Cell. 65: 1127-1141.
Ghmann, S., Leimester-Wchter, M., Schlitz, E., Goebel, W. & Charaborty, T.,
(1990). Characterization of a Listeria monocytogenes specific protein capable of
inducing delayed hypersensitivity in Listeria immune mice. Molecular Microbiology.
4: 1091-1099.
Gksoy E., Kirkan S. & Kk F., (2004). Microbiological Quality of Broiler Carcasses
During Processing in Two Slaughterhouses in Turkey. Poultry Science 83:1427
1432.
Gouws, P. & Liedemann, I., (2005). Detection of L. monocytogenes in Food Products,
Food Technology and Biotechnology. 43(2): 201-201.
Gabinete de Planeamento e Polticas [GPP]. (2008). Anurio Pecurio 2006-2007.
Edio Castel - Publicaes e Edies, SA. Lisboa. Portugal.
Health Protection Agency [HPA], (2007). Identification of Enterobacteriacea.
National Standard Method BSOP. ID 16. Issue 2. UK
http://www.hpa-standardmethods.org.uk/documents/bsopid/pdf/bsopid16.pdf
Hagens S., (2008). Chief Scientific Officer, EBI Food Safety, looks at the latest
developments of the bacterium Listeria monocytogenes and the natural technology
that can destroy it. http://www.labint-online.com/index.php?id=2259
Herenda, D. & Franco, D. (1996). Poultry diseases and meat hygiene: a color atlas. 1st
Edition. Iowa State University Press. Iowa.
Hinton, A., Buhr, R. & Ingram K. (2000). Physical, Chemical, and Microbiological
Changes in the Crop of Broiler Chickens Subjected to Incremental Feed Withdrawal
Poultry Science, 79:212218.
Hubbert, W., Hagstad, H., Spangler, E., Hinton, M. & Hughes, K. (1996). Food Safety
and Quality Assurance: foods of animal origin. 2nd Edition. Iowa State University
Press. Iowa.
Holko I., Urbanov, J., Kantikov, M., Pstorov, K. & Kmet, V. (2002). PCR Detection
of Listeria monocytogenes in Milk and Milk Products and Differentiation of Suspect
Isolates. Acta Vet. Brno, 71: 125-131.
International Standard ISO 11290-1:1996. (1996). Microbiology of food and animal
feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes - Part 1: Detection method. Switzerland.
International Standard ISO 11290-1:1996/Amd 1:2004. (2004). Modification of the
isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data.
Switzerland.
International Standard ISO 11290-2:1996. (1996). Microbiology of food and animal
feeding stuffs - Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes - Part 2: Enumeration method. Switzerland.
96
International Standard ISO 11290-2:1996/Amd 1:2004. (2004). Modification of the

enumeration media. Switzerland.
International Standard ISO 16140:2003. (2003). Defines the general principle and
the technical protocol for the validation of alternative methods in the field of
microbiological analysis of food, animal feeding stuffs and environmental and
veterinary samples for the validation of alternative methods which can be used in
particular in the framework of the official control, and the international acceptance of
the results obtained by the alternative method. Switzerland.
International Standard ISO 18593: 2004. (2004). Specifies horizontal methods for
sampling techniques using contact plates or swabs on surfaces in the food industry
environment (and food processing plants), with a view of detecting or enumerating
viable microorganisms. Switzerland.
International Standard ISO 21528 2:2004. (2004). Microbiology of food and animal
feeding stuffs - Horizontal methods for the detection and enumeration of
Enterobacteriaceae - Part 2: Colony-count method. Switzerland.
Instituto Nacional de Estatstica [INE], (2007); Populao residente (N.) por Local
de residncia, Sexo e Grupo etrio (por ciclos de vida).
http://www.ine.pt/xportal/xmain?xpid=INE&xpgid=ine_indicadores&indOcorrCod=000
0611&selTab=tab0
Institute of Food Technologists [IFT]. (2004). Bacteria Associated with Foodborne
Diseases. A Scientific Status Summary of the Institute of Food Technologists.
Chicago,III.
http://members.ift.org/NR/rdonlyres/3DEA7A91-DF48-42CE-B19506B01C14E273/0/bacteria.pdf.
Instituto Nacional de Estatistica [INE], (2008). Boletim Mensal da Agricultura,
Pescas e Agro-indstria Janeiro e Outubro.
http://www.ine.pt/xportal/xmain?xpid=INE&xpgid=ine_publicacoes&PUBLICACOESp
ub_boui=32478703&PUBLICACOESmodo=2.
Instituto Nacional de Estatistica [INE], (2006). Boletim Mensal da Agricultura,
Pescas e Agro-indstria Junho de 2006. www.ine.pt.
Instituto Nacional Dr. Ricardo Jorge [INSA], (2008). Custos e implicaes das
falhas na Higiene e Segurana Alimentar.
Jersek, B., Majstorovic, T., Klun, N. & Mozina, S. (2005). Impact of enrichment
medium on PCR based detection of Listeria monocytogenes. Acta Agriculturae
Slovenica, 85-1:15-23.
Lambooij, E., Reimert, H., Van de Vis, J. & Gerritzen, M. (2008). Head to Cloaca
Stunnig of Broilers. Poultry Science. 87: 2160-2165.
Lawrence, L. & Gilmour, A. (1994). Incidence of Listeria spp. e Listeria
monocytogenes in a Poultry Processing Environment and in Poultry Products and
Their Rapid Confirmation by Multiplex PCR. Applied and Environmental
Microbiology, 60,12: 4600-4604.
97
Leclercq, A. (2004). Atypical colonial morphology and low recoveries of Listeria

monocytogenes strains on Oxford, PALCAM, RapidL.mono and ALOA solid media.
Journal of Microbiological Methods, 57: 252-258.
Levin, R. (2003). Application of the Polymerase Chain Reaction for Detection of
Listeria monocytogenes in Foods; A Review of Methodology. Food Biothechnology,
17, 2: 99-116.
Lima, M., (2008a). Editorial. Aves e Ovos, Setembro/Outubro: 31-33.
Lima, M., (2008b). Perspectivas da Fileira Avcola. Aves e Ovos, Maio/Junho: 3.
Lima, M., (2008c). Evoluo da Balana de Pagamentos nos Sectores da Carne de
Aves e dos Ovos. Observatrio dos mercados agrcolas e das importaes agro
alimentares. http://www.observatorioagricola.pt/rubricas/BalanaAvesOvos4.pdf
Lin, Y. & Chou, C. (2004). Effect of heat shock on thermal tolerance and susceptibility
of Listeria monocytogenes to other environmental stresses. Food Microbiology, 21:
605 610.
Liu, D. (2008). Preparation of Listeria monocytogenes specimens for molecular
detection and identification Review. Food Microbiology, 122: 229 242.
Liu, D., Lawrence, M., Austin, F. & Ainsworth, A. (2007). A Multiplex PCR for Speciesand Virulence-specific Determination of Listeria monocytogenes: A Multiplex PCR for
Species- and Virulence-specific Determination of Listeria monocytogenes - (Peer
Reviewed Journal). Journal of Microbiological Methods. 71(2):133-140.
Liu, D.; Ainsworth A., Frank, A., Austin, F. & Lawrence, M. (2004). Use of PCR
primers derived from putative transcriptional regulator gene for species specific
determination of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology,
91: 297-304.
Liu,D.; Ainsworth, F., Austin, F. & Lawrence, M. (2003). Characterization of virulent
and avirulent Listeria monocytogenes strains by PCR amplification of putative
transcriptional regulator and internalin genes. Jornal of Medical Microbiology,
52:1065-1070.
Lpez, V., Surez, M., Chico-Calero, I. Navas, J. & Martinez-Suarez, J. (2006).
Listeria monocytogenes en alimentos: son todos los aislamientos igual de
virulentos?. Revista Argentina de Microbiologa. 8, (4):224-234.
Lpez, V., Ortiz, S., Corujo, A., Lpez, P., Posa, D., Navas, K., Moreno, R. &
Martinez-Suares, J. (2008). Different Contamination Patterns of Lineage I and II
Strains of Listeria monocytogenes in a Spanish Broiler Abattoir. Poultry Science. 87:
1874-1882.
Lues, J., Theron,M.,Venter, P. & Rasephei. (2007). Microbial Composition in
Bioaerosols of a High-Throughput Chicken-Slaughtering Facility. Poultry Science,
86:142149.
98
Marcy, J. (2007). Work remains in battle to control Listeria.The National Provisioner,

February 2007: 86. www.provisioneronline.com
Mataragas, M., Skandamis, P.N. & Drosinos, E.H. (2008). Risk profiles of pork and
poultry meat and risk ratings of various pathogen/product combinations. International
Journal of Food Microbiology, 126:1-12
McLauchlin, J., Mitchell, R., Smerdon, W. & Jewell, K. (2004). Listeria
monocytogenes and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in
microbiological risk assessment of foods. International Journal of Food Microbiology,
92: 15-33.
Meira, A., (2002). Carne de Frango saudvel.
http://www.aviculturaindustrial.com.br/site/dinamica.asp?id=3037&tipo_tabela=negoc
ios&categoria=marketing
Mena, C., Almeida, G., Carneiro, L., Teixeira, P., Hogg, T. & Gibbs, P. (2004).
Incidence of Listeria monocytogenes in different food products commercialized in
Portugal. Food Microbiology. 21: 213-216.
Mengert, U. & Fehlhaber, K. (1996). Effect of premortal stress on the endogenous
microbial contamination of broiler carcasses. Berliner und Mnchener tierrztliche.
Wochenschrift. 109 (1): 28-31.
Molina, A. & Tobo, P. (2004). Srie Biologia molecular, Parte 2 Uso das tcnicas
de biologia molecular para diagnstico. Einstein. 2 (2): 139.
Mossel, D., (1995). Essentials of the Microbiology of foods: A textbook for advanced
studies. John Wiley & Sons. Chichester.
Mulder, R. (2008). Producing Microbiologically Safe Poultry Products. P O U L T R Y
PR O C E S S I N G W O R L D W I D E.
http://www.wattnet.com/Archives/Docs/599ppwa.pdf?CFID=25710&CFTOKEN=7403
0876
Murphy, N., McLauchlin, J., Ohai & C., Grant, K. (2007). Constrution and evaluation of
a microbiological positive process internal control for PCR-based examination of food
samples for Listeria monocytogenes and Salmonella enterica. International Journal
of Food Microbiology, 120:110-119.
National Center for Biotechnology Information [NCBI]. (2009). Polymerase Chain
Reaction. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechPCR.shtml
National Center for Biotechnology Information [NCBI]. (2009). Real Time
quantitative Reverse Transcription PCR.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechQPCR.shtml
Nichas, G. & Drosinos, E. (1999). Meat and Poultry Spoilage of Meat In Encyclopedia
of Food Microbiology. Academic Press. London. Nijdam E., Arens P., Lambooij E.,
Decuypere E. & Stegeman J. (2004). Factors influencing bruises and mortality of
broilers during catching, transport, and lairage. Poultry Science, 83(9): 1610-1615.
99
Nollet, L. & Toldr, F. (2006). Advanced Technologies for Meat Processing. Taylor
and Francis. USA.
Northcutt, J. & Russel, S. (2003). General Guidelines for Implementation of HACCP
in a Poultry Processing Plant. Bulletin 1155. The University of Georgia, Cooperative
Extension Service, College of Agricultural and Environmental Sciences, Department
of Poultry Science.
Northcutt, J., Smith, D., Ingram, K., Hinton jr. A. & Musgrove, M. (2007). Recovery of
Bacteria from Broiler Carcasses after Spray Washing with Acidified Electrolyzed
Water or Sodium Hypochlorite Solutions. Poultry Science. 86:22392244.
Office International des Epizooties [OIE] & Center for Food Security and Public
Health Iowa State University. (2005). Listeriosis.
http://www.cfsph.iastate.edu/Factsheets/pdfs/listeriosis.pdf
OGrady, J., Sedano Balbs, S., Maher, M., Smith, T. & Barry, T. (2008). Rapid real
time PCR detection of Listeria monocytogenes in enriched food samples based on
ssrA gene, a novel diagnostic target. Food Microbiology, 25: 75-84.
Orndorff, P., Hamrick, T., Smoak, I. & Havell, E. (2006). Host and bacterial factors in
listeriosis pathogenesis. Veterinary Microbiology, 114: 1-15.
Pamer, E. (2004). Immune responses to Listeria monocytogenes. Nature Reviews
Immunology, 4:812-823.
Popowska, M. & Markiewicz, Z. (2006); Characterization of Listeria monocytogenes
protein Lmo0327 with murein hydrolase activity. Archives of Microbiology, 186:6986.
Rantsiou, K., Alessandria, V., Urso,R., Dolci,P. & Cocolin,L. (2008). Detection,
quntification and vitality of Listeria monocytogenes in food as determined by
quantitative PCR; International Journal of Food Microbiology, 121: 99-105.
Rebuffo, A., Schmitt, J., Wenning, M., Stetten, F. & Scherer, S. (2005). Reliable and
Rapid Identification of Listeria monocytogenes and Listeria Species by Artificial
Neural Network Based Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Applied and
Environmental Microbiology, Vol 72, 2:994-1000.
Regulamento (CE) n. 1/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de
Dezembro de 2004, relativo proteco dos animais durante o transporte e
operaes afins e que altera as Directivas 64/432/CEE e 93/119/CE e o
Regulamento (CE) n. 1255/97.
Regulamento (CE) n. 853/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de
Abril de 2004 que estabelece regras especificas de higiene aplicaveis aos generos
alimenticios de origem animal.
Regulamento (CE) n. 889/2008 da Comisso de 5 de Setembro de 2008 que
estabelece normas de execuo do Regulamento (CE) n.o 834/2007 do Conselho
relativo produo biolgica e rotulagem dos produtos biolgicos, no que respeita
produo biolgica, rotulagem e ao controlo.
100
Regulamento (CE) n. 1441/2007 da Comisso, de 5 de Dezembro de (2007), que

altera o Regulamento (CE) n. 2073/2005 relativo a critrios microbiolgicos
aplicveis aos gneros alimentcios.
Rissi, D., Rech, R., Barros, R., Kommers, G., Langohr, I., Pierezan, F. & Barros, C.
(2006). Forma nervosa de listeriose em caprinos. Pesquisa Veterinria Brasileira.
26(1): 14-20.
Roche, M. & Gracieux, P. (2009). Poor detection of low-virulence field strains of L.
monocytogenes is related to selective media and is unrelated to PrfA. Food
Microbiology, 26: 21-26.
Rocourt, J., Hof, H., Schrettenbrunner, A., Malinverni, R. & Bille J. (1986). Acute
purulent Listeria seeligeri meningitis in an immunocompetent adult. Schweizer
Medizinische Fortbildungszeitschrift, 116:248251.
Rodrguez-Lzaro, D.; Jofr, A., Aymerich, T., Hugas, M. & Pla, M. (2004). Rapid
Quantitative Detection of Listeria monocytogenes by Real-Time PCR. Applied and
Environmental Microbiology, vol. 70; No. 10, 6299 6301.
Rodrguez-Lzaro, D., Pla M., Scortti M., Monz, H. & Vzquez-Boland, J. (2005). A
Novel Real-Time PCR for Listeria monocytogenes That Monitors Analytical
Performance via an Internal Amplification Control. Applied and Environmental
Microbiology,71(12): 90089012.
Rosenstraus, M., Wang, Z., Chang, S., Debonville, D. & Spadoro, J. (1998) An
Internal Control for Routine Diagnostic PCR: Design, Properties, and Effect on
Clinical Performance. Journal of Clinical Microbiology. 36(1): 191-197.
Rylander, R., Hsieh V. & Courteheuse C. (1994). The first case of sick building
syndrome in Switzerland. Indoor Environmental, 3:159162.
Rybicki, E. (2001). PCR Primer design and reaction optimisation.
http://www.mcb.uct.ac.za/manual/pcroptim.htm
Sergelidis, D. & Abrahim, A. (2009). Adaptative Response of Listeria monocytogenes
to heat and its impact on food safety. Food Control, 20: 1-10.
Simon, M.; Gray, D. & Cook, N. (1996). DNA Extration and PCR Methods for the
Detection of Listeria monocytogenes in Cold Smoked Salmon. Applied and
Environmental Microbiology, Vol 62, N 3: 822-824.
Skandamis, P., Yoon, N., Stopforth, J.D., Kendall, P.A. & Sofos, J.N. (2007). Heat and
acid tolerance of Listeria monocytogenes after exposure to single and multiple
sublethal stresses. Food Microbiology, 25, 294 303.
Soares, M., (2008). Avicultura Eficiente: Um Modo de Produo Responsvel. Aves e
Ovos. Janeiro/Fevereiro.
Socampestre, (2004). Frango de Agricultura Biolgica. Socampestre Noticias.
http://www.socampestre.pt/files/Revistas%20Socampestre/Revista3.pdf
Swaminathan, B. & Gerner-Smidt, P. (2007). Forum: The epidemiology of human
listeriosis. Microbes and Infection, 9: 1236-1243.
101
Talon, R., Lebert I., Lebert A., Leroy S., Garriga M., Aymerich T., Drosinos E., Zanardi
E., Lanieri A., Fraqueza M.J., Patarata L. & Laukova A. (2007). Meat Science. 77:
570579.
United States Department of Agriculture [USDA], (1999). Generic HACCP Model
for Poultry Slaughter. HACCP-5. Revision 1. Washington, D.C.
http://www.fsis.usda.gov/OPPDE/nis/outreach/models/haccp-5.pdf
Uyttendaele, M. & Debevere, J., (2006). Chapter 55: Rapid Methods in Food
Diagnosis. Handbook of Food Science, Technology and Engineering Volume 1.
Edited by Y.H.Hui. Taylor and Francis. USA.
Valk, H., Jacquet, C., Goulet, V., Vaillant, V., Perra, A., Simon, F., Desenclos, J.C. &
Martin P. (2005). Surveillance of Listeria infections in Europe. Euro Surveillence, 10
(10):.http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=572
Vazquez-Boland, J., Kuhn, M., Berche, P., Chakraborty, T., Dominguez-Bernal, G.,
Goebel, W., GonzaLez-Zorn, B., Wehland, J. & Kreft, J. (2001). Listeria
Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants. Clinical Microbiology
Reviewes, Vol. 14, No. 3: 584640.
Veerkamp, C., (1978). The influence of fasting and transport on yields of broilers.
Poultry Science, 57 : 634-638.
Veloso, G. (2007). Aves de capoeira. Apontamentos de Inspeco Sanitria II.
Faculdade de Medicina Veterinria Universidade Tcnica de Lisboa. Lisboa.
Vierstraete, A. (1999). http://users.ugent.be/~avierstr/
Vitas, A., Aguado, V. & Garcia-Jalon, I., (2004). Ocurrence of Listeria monocytogenes
in fresh and processed foods in Navarra (Spain). International Journal of Food
Microbiology. 90: 349-356.
Warriss, P., Bevis, E., Brown, S. & Edwards, J. (1992). Longer journeys to processing
plants are associated with higher mortality in broiler chickens. British Poultry
Science. 33. 201-206.
Whyte,T. (2002). Occupational exposure of poultry stockmen in current barn systems
for egg production in the United Kingdom. British Poultry Science, 43:364373.
William, T., Hagstad, H., Spangler, E., Hinton, M. & Hughes, K. (1996). Food Safety
and Quality Assurance: Foods of Animal Origin. 2nd Edition. Iowa State University
Press. Iowa.
Wilson, A., (2005). Wilsons practical meat inspection. 7th Ed. Blackwell Publishing
Ltd. UK.
World Health Oraganization [WHO], (2004). Food and Eealth in Europe: a new basis
for action. WHO Regional Publications European Series, N96.
Zhu, M.; Mendona, A., Ismail, H. & Ahn, D. (2008). Effects of Irradiation on Survival
and Growth of Listeria monocytogenes and Natural Microflora in Vacuum
Packaged Turkey Hams and Breast Rolls. Poultry Science, 87: 2140 2145.
102
103

Dissertação Parte3

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Avaliao da qualidade higio-sanitria da carne de frango: pesquisa de Listeria monocytogenes por PCR

diferentes metodologias passveis de detectar esta bactria em alimentos, bem como

Tabela 1: Produo da carne de frango (toneladas) registada entre 2001 e

As fortes medidas de combate e vigilncia da gripe aviria empreendidas por

2008 (Tabela 2). Em 2008, observa-se um aumento da produo e do abate de aves,

Tabela 2: Frangos de carne abatidos e aprovados para consumo pblico em Portugal

A integrao vertical da produo, a qual significa que a mesma empresa ou grupo

licenciamento, do bem-estar animal, da sanidade e da higiene, com responsabilidade

Figura 1: Evoluo da balana de pagamentos no sector da carne das aves, em

2. Sistemas de produo de aves

3. Abate e desmancha de frango

Perodo que antecede o abate

Aves de capoeira que no sejam pintos do dia:

rea em cm por kg*

Tabela 3: reas mnimas de cho e densidades aplicveis ao transporte de aves de

Durante o transporte, o stress causado leva a alteraes dos padres de excreo

3.1.4. Repouso e Descarga

Figura 2: Dependura de frangos no incio da linha de

Um dos mtodos utilizados na insensibilizao das aves a electronarcose em

Logo aps a insensibilizao deve ocorrer a sangria, realizada atravs da seco

A electronarcose causa um aumento da presso sangunea levando a

Figura 3: Exemplo de sangria manual em frangos de produo extensiva.

Para que ocorra a remoo das penas, as aves so submetidas a um escaldo

qualidade (Alvarado, 2006). Esta premissa tambm se aplica s restantes estapas do

Corte das cabeas e das patas

Figura 4: Carcaas de frango aps o corte da cabea pela articulao occipito

A lavagem por asperso aps a eviscerao contribui para uma reduo do

Figura 5: Exemplo de eviscerao manual de frangos.

Arrefecimento rpido das carcaas e refrigerao

Durante a refrigerao das carcaas, pretende-se que a temperatura dos

entre -2C e -1C, mas corresponde ao incio da congelao e por isso no

Depois de reduzida e estabilizada a temperatura das carcaas, elas so

4. Contaminao das carcaas durante o abate e desmancha

do equipamento usado para o escaldo, depena e

eviscerao; 3) dificuldade de lavar a cavidade toracoabdominal eficazmente aps a

e pode mesmo ser implicado na

contaminao de carne de aves de capoeira nas vrias etapas do abate e do

A potencial contaminao de alimentos e doenas de origem alimentar por

microrganismos nas diferentes etapas do processamento. Existe um declnio definitivo

Salmonella, resultado da ingesto de diversos serovares, em particular o

Campylobacter jejuni responsvel por um grande numero de gastroenterites

Listeria monocytogenes, geralmente causadora de doena em grupos de risco,

Escherichia coli, bactria causadora de diarreia no Homem .

cloacae, Serratia marcencens, Providencia alcalifaciens, Edwardsiella e Yersnia spp

5.2. Listeria monocytogenes

expresso de diversos genes pertencentes ao grupo responsvel pela virulncia das

caso da listeriose humana, o

procedimento habitual de pesquisa e contagem de L. monocytogenes claramente

que podem potencialmente ser utilizados para as diferenciar de estirpes no

Existe correlao entre ambas as metodologias, o DNA das estirpes

A Listeriose nos animais est mais associada a problemas de segurana alimentar

Figura 6: Manifestaes neurolgicas associadas listeriose em ovinos (adaptado de

Tabela 4: Frequncia de Listeria monocytogenes em animais de produo de alguns

O diagnstico pode ser feito atravs de isolamento de Listeria monocytogenes na

e rins em animais com

Tabela 5: Frequncia de Listeria monocytogenes em frangos em alguns pases da

processamento (OIE, 2005). Para alm da ingesto, a infeco pode tambm

Figura 7: Possveis evolues da infeco por Listeria monocytogenes aps ingesto

Alm da susceptibilidade do hospedeiro, a dose infectante depende de outros

elevadas de Listeria monocytogenes (IFT, 2004; Swaminathan & Gerner-Smidt, 2007).

de cometa e permitindo a propulso da bactria para a clula adjacente (McLauchlin

Figura 8: Listeria monocytogenes no interior da clula do hospedeiro (Pamer, 2004).

As estirpes virulentas de Listeria monocytogenes multiplicam-se no interior das