Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

CURSO: ANLISIS INSTRUMENTAL

PROFESOR: MS QF DAVID RUIDAS ROMERO

QUINCEAVA
SEMANA

Fundamentos
Instrumentacin
Optimizacin de la separacin cromatogrfica
Aplicacin de la HPLC

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

1. Fundamentos

Tcnica

L columna, cm

Dimetro de partcula, m

LC

50 500

150 200

HPLC

3 30

3 10

UPLC

Hasta 5

<2

LC: Liquid Chromatography

HPLC: High Performance Liquid Chromatography or
High Pressure Liquid Chromatography
UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

1. Fundamentos

CLASIFICACIN DE LAS TCNICAS DE CROMATOGRAFA LQUIDA

Mtodo Tcnica

Fase estacionaria

Tipo de equilibrio

LC

Reparto

Lquido adsorbido sobre un

slido

Distribucin entre
lquidos inmiscibles

Reparto con fases

enlazadas

Especies orgnicas enlazadas

a una superficie slida

Distribucin entre
lquido y superficie
enlazada

Adsorcin

Slido

Adsorcin

Intercambio inico

Resina de Int. Inico

Intercambio inico

Exclusin por tamao Lquido en intersticios de un

slido polimrico

Distribucin/Exclusin

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

1. Fundamentos

LC DE INTERCAMBIO INICO

Intercambiador inico (aninico)

Flujo de fase mvil

-+ + +
+- - + +
+- +
+
+
- +
+ + +-

- y + : Especies a separar

Las especies con carga negativa se unen a la resina que est

cargada positivamente, quedando retenidas.
Las especies con carga positiva son repelidas por la resina
siendo eludas de la columna.

EQUILIBRIOS DE INTERCAMBIO
Intercambiador catinico:
xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)xMx+ + xH+
slido

disolucin

slido

disolucin

Intercambiador aninico:
xRN(CH3)3+OH- + Ax- [RN(CH3)3+]xAx- + xOHslido

disolucin

slido

disolucin

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

1. Fundamentos

LC DE EXCLUSIN POR TAMAOS

Bolas de gel: fase estacionaria

Flujo de fase mvil

y : especies a separar

Las molculas ms pequeas penetran

en los intersticios o canales del gel,
viajando a menor velocidad

Las molculas ms grandes no pueden penetrar

en los canales del gel y por tanto viajan a mayor
velocidad.

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

COMPONENTES DE LA INSTRUMENTACIN
Depsitos de fase mvil

Bomba cromatogrfica

Sistema de inyeccin
Depsito
de residuos

Compartimento para la columna

cromatogrfica: Columna
Detector
6

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin
Columna
cromatogrfica

Detector
fluorimtrico

Vlvula de
inyeccin

Fase mvil
Bomba
cromatogrfica

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

SISTEMA DE BOMBEO

Proporciona presiones superiores

a 6000 psi.
Salida de disolventes libres de
impulsos.
Velocidades de flujo habituales de
0,1 5 mL/min.
Reproducibilidades de flujo de, al
menos, 0,5% (Ej. 2 mL min-1: 1,99
2,01 mL/min)

Resistencia a la corrosin .

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

SISTEMA DE INYECCIN:

- Muestreadores automticos
- Vlvulas de bucle de muestreo

Lazo o bucle de
inyeccin (5 500 L)

Salida hacia
la columna

Entrada de fase mvil

desde la bomba

Microjeringa

Orificio para inyeccin

mediante microjeringa

Palanca para
cambio de posicin
9

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin
Microjeringa

Microjeringa

A
residuos

Hacia la
columna
Entrada de
fase mvil

POSICIN DE
CARGA

Lazo de
muestra
Entrada de
fase mvil

Hacia la
columna

POSICIN DE
INYECCIN
10

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

MUESTREADOR AUTOMTICO

Brazo de
inyeccin

Bandeja
Lavado
Viales de
muestras

11

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

COLUMNA CROMATOGRFICA
Entrada

Guardacolumna

Fritas de
titanio poroso

Columnas: L=10-30 cm. D.I.= 4-10 mm.

Rellenos de tamao de partcula: 5-10 m.
N/m= 40000-60000

Microcolumnas: L=3-7cm. D.I.=1-4 mm.

Rellenos de tamao de partcula: 3-5 m.
N/m= 100000

Carcasa de
alumnio
anodizado
Columna principal
(plstico)

Fig.1

Frita de titanio
poroso
Salida

12

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

COLUMNAS DE LC
COLUMNA

PRECOLUMNA

Flujo de
fase mvil

13

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

TERMOSTATIZACIN DE LA COLUMNA

Columna

Compartimento
de
termostatizacin

14

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

SISTEMAS DE DETECCIN
Algunos de los detectores comerciales ms usados
Detector

Lmite de deteccin
aproximado, ng

Intervalo de linealidad en
decenas

Absorbancia

0,1 1

3-4

Fluorescencia

0,001 0,01

Electroqumico

0,01 - 1

4-5

Conductividad

0,5 - 1

ndice de refraccin

100 - 1000

Espectrometra de masas

0,1 - 1

15

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

2. Instrumentacin

ESQUEMAS BSICOS DE DETECTORES

ESPECTRMETRO DE ABSORCIN
VISIBLE-ULTRAVIOLETA

ESPECTRMETRO DE MASAS

Salida de flujo

Fuente de
iones

Entrada
de flujo

Fuente
de luz

Analizador
de masas

Identificacin:
Espectros de masas

Adquisicin
de datos

Abundancia

Detector

Detector
de iones

Fig.1
Entrada
de flujo

16

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

3. Optimizacin de la separacin cromatogrfica

A. SELECCIN DEL TIPO DE LC

Parmetros a considerar:

Aumento de la polaridad
Insoluble en agua

Soluble en agua

No polar

Inico
Polar no inico

Peso molecular
Solubilidad
Polaridad
Estructura qumica

Reparto

102
Adsorcin

(Reparto
en fase
reversa)

(Reparto
en fase
normal)

Intercambio
inico

Peso molecular

103

104
Exclusin

105
(En gel permeable)

(Filtracin en gel)

106

17

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

3. Optimizacin de la separacin cromatogrfica

B. SELECCIN DE LA FASE MVIL

Descartar los disolventes incompatibles por sus propiedades fsicas
Ajuste de la fuerza de los disolventes
Selectividad de los disolventes
Fase mvil ptima

18

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

3. Optimizacin de la separacin cromatogrfica

AJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES

Separacin de 8 compuestos
Fase mvil:
Mezclas agua (A)/acetonitrilo (B)
ELUCIN ISOCRTICA

19

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

3. Optimizacin de la separacin cromatogrfica

AJUSTE DE LA FUERZA DE LOS DISOLVENTES

ELUCIN EN GRADIENTE

20

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

3. Optimizacin de la separacin cromatogrfica

LC DE REPARTO
Tcnica

Fase
Fase
estacionaria mvil

Fase normal

polar

Fase reversa apolar

apolar

4>3>2>1

polar

1>2>3>4

Respuesta del detector

Polaridad de los compuestos

3
2

Inyeccin
Tiempo
21

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

4. Aplicaciones al anlisis de frmacos

LC DE REPARTO
Sulfonamidas

Fase reversa.
Elucin en gradiente con mezcla
ACN:agua.

PAHs, pesticidas, sulfonamidas, vitaminas, drogas y sus metabolitos, antibiticos,

esteroides, analgsicos, colorantes, cidos grasos, nucletidos .
22

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

4. Aplicaciones al anlisis de compuestos orgnicos

LC DE ADSORCIN : Fase estacionaria almina y slice

ORDEN EN TIEMPO DE RETENCIN DE MAYOR A MENOR
Olefinas
Hidrocarburos aromticos
Haluros, sulfuros
teres
Nitrocompuestos
steres, aldehdos, cetonas
Alcoholes, aminas
Sulfonas
Sulfxidos
Amidas
cidos carboxlicos

Obsrvese que los compuestos menos polares presentan mayor afinidad por la fase estacionaria
23

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

4. Aplicaciones al anlisis de aguas

LC DE INTERCAMBIO INICO
A

Anlisis y control de
calidad de aguas

D
24

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

4. Aplicaciones al anlisis de protenas

LC DE EXCLUSIN MOLECULAR

25

Asignatura: ANLISIS INSTRUMENTAL

Escuela: Farmacia y Bioqumica

26