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1. OBJETIVO
Establecer los lineamientos para la preparacin, esterilizacin, conservacin y
control de calidad de medios de cultivos, homogeneizados y reactivos en el
laboratorio de microbiologa.
2. GENERALIDADES Y DEFINICIONES
ASPECTOS A TENER EN CUENTA PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS DE
CULTIVOS.
Utilizar preferiblemente, los medios de cultivo deshidratados que ofrecen las
firmas comerciales, pero se pueden preparar en el laboratorio a partir de los
componentes especificados en la formulacin.
Los componentes que estn en pequeas concentraciones o son poco
solubles, es mejor aadirlos en forma de soluciones acuosas filtradas,
soluciones alcohlicas o alcalinas.
Los componentes como: hidratos de carbono, yema de huevo y sulfito sdico
deben prepararse a parte de los dems componentes del medio, y ser
aadidos al medio de cultivo base en condiciones aspticas.
Disolver los medios por calentamiento hasta ebullicin en constante agitacin.
Dejar enfriar los caldos a temperatura ambiente y los medios de cultivos a
50C, antes de utilizarlos.
Ajustar el pH del medio agregando solucin NaOH o HCl 0.1N segn el caso.
Si el pH obtenido es cido, agregar solucin NaOH hasta ajustar. Si el pH es
alcalino agregar solucin HCl hasta ajustar.
Dejar secar las placas con medios de cultivo, al lado del mechero con las cajas
de petri destapadas.
Cerrar muy bien los tubos y recipientes con soluciones o caldos de cultivo, para
evitar derramamiento por el efecto de la ebullicin.
Conservar los medios y reactivos en sus envases originales, a temperatura no
mayor a 30 C fuera de la exposicin a la luz y la humedad.
Conservar los medios y caldos de cultivos preparados, en la nevera entre 2 y 6
C de temperatura.
No utilizar los medios de cultivo deshidratados que presenten alteraciones de
color, que se observen apelmazados o que superen la vigencia establecida por
la casa comercial.
Seguir las indicaciones del fabricante para la rehidratacin y esterilizacin de
los medios de cultivo.
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4. MATERIALES Y EQUIPOS
Frascos de vidrio con tapa rosca
Agar SPC (Standard Plate Count)
Agar EMB (Eosin Metilen Blue)
Agar Bismuto Sulfito
Peptona Buferada
Caldo Brilla
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Vidrios de reloj
Autoclaves
Bao Serolgico
Mechero
Trpode
Plancha calentadora
Cajas Petri
Tubos de ensayo
Campanas de Durham
5. METODOLOGA
5.1.
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5.2.
Esterilizacin.
Seguir las instrucciones del proveedor; generalmente, la esterilizacin de un
medio de cultivo se realiza a 121C, 15 PSI durante 15 minutos, pero
existen medios que requieren condiciones especiales de esterilizacin.
Verificar el cumplimiento de los tiempos para alcanzar la temperatura de
esterilizacin, con el fin de evitar la degradacin de ciertos componentes del
medio.
Cuando se esterilizan volmenes grandes de medio de cultivo, la duracin
del calentamiento es ms elevada, y podra ocasionar degradacin de
algunos componentes.
Despus de culminado el proceso de esterilizacin, reducir la presin del
equipo paulatinamente para evitar que la ebullicin espontnea del medio
levante las tapas del recipiente y se genere derramamiento.
5.3.
5.4.
5.5.
Preparacin de homogenizados
Utilizar puntas o pipetas estriles, para tomar las alcuotas de muestras y
realizar las diluciones.
Utilizar para cada dilucin una punta o pipeta estril.
No preparar diluciones o placas fluidas bajo la luz solar directa.
Proteger los extremos de las pipetas, del contacto con la superficie de los
mesones, guantes, recipientes de muestras y de otros materiales, para
evitar contaminacin cruzada.
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Introducir las puntas o las pipetas a una profundidad no mayor de 2.5 cm,
en las muestras o en los tubos con diluyente.
Depositar las porciones de muestra ubicando la pipeta en un ngulo
aproximado de 45, con el extremo tocando el fondo de la caja de Petri.
Levantar la tapa de la caja Petri cuidadosamente para evitar el contacto de
los bordes con la pipeta.
Drenar la alcuota contenida en la pipeta durante unos segundos, afincando
la punta de la pipeta sobre un punto seco de la caja de Petri.
5.6.
Preparacin de diluyentes.
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