Informe de Laboratorio #2

UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN
MACROPROCESO DE RECURSOS E INFRAESTRUCTURA ACADMICA

FORMATO PARA PRCTICAS DE LABORATORIO
Fecha: Abril de 2011
Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0
INFORME DE LABORATORIO PRCTICA N2

NOMBRE DE LA PRCTICA:
PRCTICA No.:2
Medicin de Viables o Diluciones Seriadas

ASIGNATURA:
BIOTECNOLOGA AMBIENTAL
INTEGRANTES DEL GRUPO
Lina Mara Rodrguez COD 1015438792
Daniela Ortiz Castillo COD
Mara Juliana Barbosa COD
Jorge Uriel Mndez
COD
CONTENIDO DE LA GUA
OBJETIVOS
Objetivo general
Medir el crecimiento microbiano de la cepa Pseudomona sp a travs de diluciones

seriadas en diferentes medios de cultivo.
Objetivos especficos
Realizar diluciones seriadas a partir de un cultivo madre de Pseudomona Sp a

diferentes concentraciones.
Evaluar la capacidad de crecimiento microbiano de la Pseudomona Sp utilizando la
siembra en placa en diferente medio de cultivo.CUAL PESTICIDA
RELACIONAR Determinar la poblacin del medio de cultivo y cantidad de colonias
a travs del mtodo de densidad ptica y recuento en placa.
INTRODUCCIN

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0
JUSTIFICACIN
Con esta prctica se pretende analizar el crecimiento bacteriano con agar nutritivo y
pesticida, observando como la bacteria (Pseudomona) es ms resistente a un agar que al
otro tambin este tipo de prcticas nos sirven mucho para aprender a hacer recuento, con
las diluciones seriadas tener datos ms exactos del conteo de dichas bacterias, mirar su
comportamiento en el momento del crecimiento e identificar sus caractersticas de forma y
tamao.
Las pseudomonas son bacterias que sirven para la biorremediacion de suelos que han sido
afectados por pesticidas ya que tienen la habilidad de usar diferentes substratos teniendo
en cuenta tambin los que son creados por el petrleo y sus derivados, es decir son
productoras de biosurfactantes. La poca resistencia que adquiere la bacteria a los
pesticidas puede ser factor de dos cosas la primera es que es un buen indicio puesto que
entre menos crezcan las bacterias, va a ver menos utilidad de pesticidas en cultivos, y al
disminuir el uso de estos se disminuye la problemtica en la salud humana; o la otra es que
el pesticida tenga mucha concentracin de qumicos y por eso no haya crecido en la
bacteria. En el agar nutritivo se esperaba crecimiento ya que la caracterizacin de este
agar es que crezca todo tipo de bacterias ese es su propsito pues es como una base para
los dems agares

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Versin: 4.0
MARCO TEORICO
Concentraciones Que son y para qu sirven?

Desde la perspectiva qumica y biolgica, la concentracin, describe la relacin que existe
entre el soluto (que es la sustancia que es capaz de disolverse) y el disolvente. Para saber
exactamente la cantidad de soluto y de solvente de una disolucin se utiliza una
magnitud denominada concentracin. (Profesor en linea , 2014).
Dependiendo de su concentracin, las disoluciones se clasifican en diluidas, concentradas,
saturadas y sobresaturadas.
Descripcin de una solucin, (Trujillo, 2004), Soluciones acuosas, Quimica General
La concentracin de un soluto es una propiedad intensiva y es una caracterstica

importante de cualquier tipo de solucin, desde el punto de vista analtico para la qumica,
como ambiental. En el mbito ambiental, es de vital importancia conocer la
concentraciones de contaminantes, tanto en aire, agua o suelo, y as conocer por medio
de este su toxicidad. , (Trujillo, 2004).
La concentracin se
puede clasificar en cualitativa y cuantitativa respectivamente:
(Trujillo, 2004).
Concentracin cualitativa (Trujillo, 2004). ( Mayor o menor concentracin) :
Diluidas
Saturadas
Concentradas
Sobresaturadas
Concentracin cuantitativa (Trujillo, 2004). ( Modo de expresarse)
Partes por milln ( billn , porcentaje peso a peso)
Moralidad

Molaridad
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Fraccin molar Normalidad
La utilidad de los clculos de concentracin y las
respectivas formas de expresarlos
cuantitativamente, nos permite dominar muchos de los sistemas de soluciones y a su vez

entender la relacin con sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas.
(Escuela de
KINESIOLOGIA, 2007).
La importancia de conocer sobre las concentraciones, nos permite cuantificar una solucin
madre, y est estrechamente relacionada
con las diluciones, a partir de las
concentraciones surgen estas, y; a su vez nos permite identificar la cantidad en la que esta
una cepa de un microorganismo y como esta, en mayor o menor concentracin responde a
diferentes condiciones fsicas qumicas y ambientales.
En el laboratorio las concentraciones son un mtodo eficaz, para la obtencin de resultados
con respecto a la cantidad evaluada, las cantidades a utilizar de soluciones, a travs de
esta se puede hallar concentraciones iniciales de una solucin madre, y as reconocer en
qu estado o cantidad parte en la solucin para otras. (Trujillo, 2004)
DILUCIONES SERIADAS

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Figura 2. Preparacin de las diluciones

Fuente: Tortora et al. 2007
Al acto de preparar diluciones se le llama diluir. (Ayala, 2015). Como consecuencia de esto
la concentracion va a cambiar, vamos a tener la misma cantidad de soluto pero en mas
disolvente. Para este proceso se necesitara entonces saber el volumen a tomar de solucion
madre, y por supuesto el volumen final al que queremos llegar.
Este procedimiento esta dada por etapas a seguir (Ayala, 2015) :
1. Se calcula la cantidad de volumen final al que se necesita llegar
2. Se calcula el volumen inicial
3. Se aade poco a poco la concentracion hasta llegar al volumen deseado.
Factor de dilucin (Ayala, 2015)
Este se expresa en terminos de volumen. Esta dada por el volumen que hay que aadir
de la solucin madre en razon o sobre el volumen final de la dilucin. Asi por ejemplo
tendremos un factor de dilucion de 1:2 , en lo que quiere decir 1ml de disolucin mayor
concentrada con 1 ml de solvente en razon de 2ml.
Las diluciones seriadas son diluciones que se preparan apartir de una solucion madre,
diluyendo esa concentracion a concentraciones mas pequeas(Brock, T, 1996)..
Las diluciones son comnmente expresadas como una unidad de la solucin siendo diluido
el nmero total de unidades de la solucin final. Por ejemplo 1ml de la solucin es
adicionado a 9ml del diluyente es decir 1:10 1/10 (se lee 1 en 10) El factor de dilucin es
una medida del grado en el que una solucin ha sido atenuada, este valor se puede
calcular dividiendo el volumen final obtenido/volumen de la alcuota. (Brock, T, 1996).
Las diluciones seriadas se pueden encontrar en diferentes campos de la ciencia como
biologa, microbiolgica, biotecnologa, qumica entre muchas ms, ya que en algunos
casos se necesita de cantidades muy pequeas de sustancias para experimentos, as
que este procesos nos permite realizar esto a partir de soluciones madre o soluciones
llamadas stock.
Las diluciones seriadas son importantes en el area de microbiologia, porque gracias a
estas se permite hacer aislamientos de microorganismos apartir de poblaciones densas y
a su vez calcular la cantidad aproximada de estos en una muestra, comunmente casi
nunca encontramos microorganismos asilados, este tipo de tecnicas nos permite realizar
aislamientos, en poblaciones mixtas. (Brock, T, 1996).

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En el campo de la biotecnologia son una herramienta util para reconocer y entender el

comportamiento de los microorganismo, su forma de crecimiento en diferentes medios,
para lograr utilizar este tipo de microorganimos para las distintas problemtica ambientales
en cuanto a manejo de contaminantes, dado a que se hacen a distintas concentraciones,
esto con el fin de saber la capacidad degradativay los posibles factores ambientales y
fisicos a los que se ven enfrentados para reducir y o ampliar su poder de crecimiento y
estabilidad en un medio de cultivo. (Brock, T, 1996).
GENERO PSEUDOMONA SP
Es un grupo muy diverso cuya taxonoma se ha simplificado. Son microrganismos

ubicuos (microorganismos que pueden estar en cualquier lugar: en el agua, en el suelo o
en el aire), son bacilos gramnegativo aerobios. Su forma es recta y curvada con
flagelacin polar, son capaces de degradas distintos compuestos, sin embargo no
pueden degradas polmeros o monmeros. Son de carcter mesfilo, poseen mega
plsmidos degenerativos, en donde se encuentran los genes para la degradacin de
distintos compuestos. Las bacterias de este gnero se encuentran en suelos, aguas y
ambiente. Son altamente resistentes a los antibiticos lo que los vuelve de cierta forma
peligrosos para el ser humano, al ser patgenos. (Academia.edu, 2014)
(Academia.edu, 2014)Genero Pseudomona Sp
Generalidades y caractersticas de la PSEUDOMONA SP

Son bacilos gramnegativos en donde se pueden encontrar tanto rectos como curvos.
Cuando son aislados pueden aparecer en cadenas o pares respectivamente. Algunos de
ellos poseen micro cpsulas y pigmentos que son solubles en agua. Estos pigmentos
tienen la funcin de capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del
microorganismo Utilizan compuestos orgnicos en descomposicin y tienen un papel
fundamental en la degradacin de estos mismos. Este tipo de microorganismos crecen
en medios simples. Tienen una temperatura de crecimiento ptima de 36C. En caldo
crecen en grandes cantidades formando un anillo de color verde azulado. En agar simple
forman colonias brillantes, de borde continuo o a veces ondulado con un centro opaco.
(Academia.edu, 2014).

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Su metabolismo es siempre respiratorio, esto quiere decir aerobio, pero hay ciertos
casos en donde se presentan como anaerobio, algunos usan NO-. Estos
microorganismos presentan una actividad metabolica especil y versatil, tiene la capacidad
de utilizar como fuente de carbono distintos sustratos. Un ejemplo de esto es la especie
Ps Cepacia que utiliza como nutriente mas de 100 compuestos quimicos diferentes y
tambien algunos microorganimos quimiolitotrofo que usan agua y CO como donador de
electrones. (Unavarra, 2014).
Medio de aislamiento para Pseudomona sp
(Gualoto ,2014, Medio de asilamiento)
No fermentan la glucosa. La forma en que asimilin azucares este tipo de microorganismo

esta dada por la via de Etner-Doudoroff ( ruta metabolica que cataliza glucosa o piruvato
son enzimas inusuales), y a su vez disponen de un ciclo de Acidos Tricarboxilicos.
Algunas especies de este genero (p.ej. Ps. aeruginosa), realizan procesos de
desnitrificacion (reduccion asimilatoria del nitrogeno). Es importante destacar que este
genero se caracteriza por sus procesos metabolicos variados, y a sus distintas sintesis de
enzimas capaces de catabolizar compuestos presentes en el medio, categorizandolas
como digestores aerobios de materiales animal y vegetal, impulsando al reciclaje
biologico de materia organica. (Unavarra, 2014).

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IMPORTANCIA AMBIENTAL Y BIOTECNOLGICA.

Debido a su variedad de procesos metablicos, las Pseudomonas, tienen una gran
importancia y utilidad para el tratamiento de contaminacin ambiental debido a
acumulacin de metales pesados y compuestos xenobioticos. Estos microorganismos
poseen estructuras (plsmidos) que son capaces de degradar total o parcialmente
compuestos orgnicos derivados del petrleo y rgano clorados-Fosfatados. La seleccin
adecuada de estas cepas, permiten reducir estos niveles de compuestos xenobioticos.
Tambin es til en la biodegradacin de hidrocarburos y compuestos orgnicos
dependiente de la estructura del hidrocarburo en cuestin. Como se mencionaba
inicialmente este tipo de microorganismos son tiles para el manejo de contaminacin por
metales pesados. Algunas bacterias de este gnero, presentan en su estructura enzimas
capaces de reducir cationes metlicos en formas neutras, bajando el contenido de
toxicidad. Tambin existe otro tipo de especies capaces de acumular metales pesados y
formarlos en cantidades grandes para hacer una precipitacin por floculacin, algunas de
esta especie son Zooglea. (Unavarra, 2014).
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS A UTILIZAR
Materiales y Equipos
Reactivos
Materiales Estudiante
gafas,
guantes,
Erlenmeyer (1)
200ml Agua Peptonada al Bata,
Pipeteador automtico y
puntas estriles para 1 ml.
(1 por grupo-10 grupos)
tapabocas por estudiante.

0.1% (para 4 grupos)
15 ml de Caldo Nutritivo con
cultivo bacteriano
(Pseudomona sp.)
Pipeteador (1 por grupo-10

En total).
Agua destilada
Pipetas de
2ml, 5ml,
estriles (1 por grupo10 en total)
10ml
Cajas de petri con agar
Tubos de ensayo (5 por

Grupo-10 grupos)
nutritivo
(4 por grupo- 10 grupos)
Cajas de Petri con Agar
gasolina
debidamente
esterilizadas (4 por grupo10 grupos)

Gradillas para tubo de
ensayo (1 por grupo-10 grupos)

Cdigo: GRL-006
Asas curvas para siembra (1 por

grupo-10 grupos).
Espectrofotmetro (1)
Celdas esterilizadas.
METODOLOGIA
Preparacin de disoluciones seriadas y siembra en placa
Versin: 4.0

Cdigo: GRL-006
(Biotechnologies UMB, 2015, Lab2)
Determinacin de poblacin por densidad ptica
(Biotechnologies UMB, 2015, Lab2)
Versin: 4.0

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0
Preparacin de diluciones seriadas y siembre en placa

Realice diluciones sucesivas sin olvidar trabajar siempre junto al mechero. Con una pipeta
estril de 2ml tome 1ml de la solucin madre o caldo nutritivo con el cultivo denso de
Pseudomona sp inicial y transfiralo a un tubo con 9ml de agua peptonada al 0.1%, de esta
manera usted obtendr la primera dilucin 10 -1, tome otra pipeta estril y transfiera 0.1ml
del tubo de la dilucin 10-1 al agar proporcionado (Agar nutritivo y agar Petrleo) y

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Versin: 4.0
distribuya con un asa curva la muestra de manera uniforme sobre la superficie de los
agares de manera independiente, utilizando la misma pipeta, transfiera 1ml de la dilucin
10-1 a otro tubo con 9ml de solucin salina agua peptonada al 0.1% obteniendo la
dilucin 10-2 ; utilice otra pipeta estril y realice el mismo procedimiento hasta realizar la
dilucin 10-4.
1 ml
1 ml
9 ml
Solucin madre
o stock
1 : 10
10-1
9 ml
9 ml
10-2
1 : 100
1 ml
1 ml
10-3
1 : 1.000
9 ml
10-4
1 : 10.000
Incube las cajas de agar nutritivo y de petrleo en posicin invertida, durante 24-48h, a
37C.
Determinacin de poblacin por densidad ptica
La densidad ptica de un medio de cultivo es proporcional a la masa celular a la
poblacin microbiana. ste mtodo se basa en la ley de Beer y Lambert y en este caso se
asume que la absorcin del rayo incidente es proporcional a la concentracin de clulas
presentes (Martnez, 1990). Despus de haber realizado las siembras realice las
mediciones espectrofotomtricas de cada una de las diluciones realizadas. Con ayuda del

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Versin: 4.0
espectrofotmetro realice la medicin de absorbancia correspondiente a cada una de las

diluciones realizadas y realice la grfica. Determine la absorbancia a 540nm de las
diluciones obtenidas utilizando como blanco el medio de cultivo sin inocular.
Recuento en placa
A partir del nmero de colonias de Pseudomonas presentes en el agar petrleo sembrado
con la dilucin 10-1, dilucin 10-2, dilucin 3 y dilucin 10-4 calcule la poblacin en cada una
de las diluciones realizadas informando en UFC/ml. ste clculo se realiza multiplicando el
nmero de colonias obtenido en cada caja por el inverso de la dilucin.
Ejemplo: Usted obtuvo 15 colonias en la dilucin 10-3 el nmero de UFC/ml ser igual a:
15 x 1000 = 15000 UFC/ml 1.5 x 104 UFC/ml
Sabiendo que se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por el inverso de la dilucin y
despus se multiplica por 10 (ajuste del volumen inoculado) para obtener el nmero de
UFC/ml de la muestra original.
Tcnica
Dilucin
sembrada
Nmero
Colonias
agar
en
de UFC/ml
el dilucin
por
10-1
10-2
10-3
10-4
Medicin Espectrofotomtrica:
DILUCIN
VALOR
540nm
ABSORBANCIA
10-1
10-2
10-3
10-4
Realice una grfica con los datos obtenidos Absorbancia vs Nmero de clulas
Recuerde revisar las cajas de petri con el agar gasolina y el crecimiento del
microorganismos.
BIBLIOGRAFA RECOMENDADA.
ALFONSO AVILA, Nury. Principios Bsicos para la Gestin Ambiental. Bogot: Arfo Editores, 2001.
ALCALDIA LOCAL DE KENNEDY. Los Humedales. Bogot: Jardn Botnico, 1999.

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0
Madigan, M. Martinko, J. Parker, J. 1998. Biologa de los microorganismos Brock. Prentice Hall. Espaa.
MAHECHA VEGA, Gilberto. Fundamentos y Metodologa para la Identificacin de Plantas. Bogot:
Lerner, 1997.
PIZANO DE MARQUEZ, Marta. Floricultura y Medio Ambiente: La Experiencia en Colombia. Bogot:
HortiTcnica Ltda., 1997.
Rittman, B. McCarty, P. 2001. Biotecnologa del medio ambiente. Mc Graw Hill. Espaa.
Scraag, A. 1997. Biotecnologa para ingenieros, sistemas en procesos tecnolgicos. Ed. Limusa-Noriega.
Mxico
ELABOR
REVIS
APROB
Firma
Firma
Firma
Nombre : Monika Echavarria
Nombre : Jenny Alarcn
Nombre :
Fecha: Julio 2015
Fecha: Julio 2015
Fecha:
INFORME DE LABORATORIO
(Para elaborar por el Estudiante)
ESTUDIANTES:
GRUPO:
CARRERA:
NOTA:

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0
Formule tres objetivos que desee cumplir con la Prctica de Laboratorio

El estudiante formular desde su conocimiento los objetivos para la realizacin de la prctica
Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Prctica de Laboratorio.
RESULTADOS
A partir de los resultados obtenidos se determina el nmero de colonias por dilucin y

medio de cultivo a las 24 y 48 horas de sembradas la cepa. Consigne los datos en la
siguiente tabla.
TIEMPO
24
48
Concentracin 1
Concentracin 2
Concentracin 3
Concentracin 4
CUESTIONARIO
Se observa que las Pseudomonas consumen la gasolina o el pesticida?

Consulte las rutas metablicas utilizadas por los microorganismos para la degradacin
de hidrocarburos alifticos y aromticos.
Consulte las rutas metablicas utilizadas por los microorganismos para la degradacin
de pesticidas.
Consulte otras tcnicas para el conteo de poblaciones de microorganismos.
CAUSAS DE ERROR Y ACCIONES PARA OBTENER MEJORES RESULTADOS:

Cdigo: GRL-006
Versin: 4.0
CONCLUSIONES
El estudiante realizara una serie enunciados que respondan a los objetivos que el mismo formul,
basados en el desarrollo de la prctica.
APLICACIN PROFESIONAL DE LA PRCTICA REALIZADA
BIBLIOGRAFIA
http://www.profesorenlinea.cl/Quimica/Disoluciones_quimicas.html
http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=3020
https://books.google.com.co/books?
id=FjkH2LJtHaoC&printsec=frontcover&hl=es#v=onepage&q&f=false
BROCK, T. (1996). Microbiologa 8. Ed. Prentice may. New
Jersey.
http://www.academia.edu/3641260/Pseudomona
http://es.slideshare.net/MiguelGualoto/biorremediacin-14939016

Informe de Laboratorio #2

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Medir el crecimiento microbiano de la cepa Pseudomona sp a travs de diluciones

Realizar diluciones seriadas a partir de un cultivo madre de Pseudomona Sp a

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Concentraciones Que son y para qu sirven?

Descripcin de una solucin, (Trujillo, 2004), Soluciones acuosas, Quimica General

La concentracin de un soluto es una propiedad intensiva y es una caracterstica

puede clasificar en cualitativa y cuantitativa respectivamente:

Concentracin cualitativa (Trujillo, 2004). ( Mayor o menor concentracin) :

Concentracin cuantitativa (Trujillo, 2004). ( Modo de expresarse)

Partes por milln ( billn , porcentaje peso a peso)

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Fraccin molar Normalidad

La utilidad de los clculos de concentracin y las

respectivas formas de expresarlos

cuantitativamente, nos permite dominar muchos de los sistemas de soluciones y a su vez

con las diluciones, a partir de las

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Figura 2. Preparacin de las diluciones

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En el campo de la biotecnologia son una herramienta util para reconocer y entender el

Es un grupo muy diverso cuya taxonoma se ha simplificado. Son microrganismos

(Academia.edu, 2014)Genero Pseudomona Sp

Generalidades y caractersticas de la PSEUDOMONA SP

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(Gualoto ,2014, Medio de asilamiento)

No fermentan la glucosa. La forma en que asimilin azucares este tipo de microorganismo

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200ml Agua Peptonada al Bata,

tapabocas por estudiante.

Pipeteador (1 por grupo-10

Tubos de ensayo (5 por

esterilizadas (4 por grupo10 grupos)

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Asas curvas para siembra (1 por

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Determinacin de poblacin por densidad ptica

(Biotechnologies UMB, 2015, Lab2)

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espectrofotmetro realice la medicin de absorbancia correspondiente a cada una de las

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Nombre : Monika Echavarria

Nombre : Jenny Alarcn

Fecha: Julio 2015

Fecha: Julio 2015

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Formule tres objetivos que desee cumplir con la Prctica de Laboratorio

Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Prctica de Laboratorio.

A partir de los resultados obtenidos se determina el nmero de colonias por dilucin y

Se observa que las Pseudomonas consumen la gasolina o el pesticida?

CAUSAS DE ERROR Y ACCIONES PARA OBTENER MEJORES RESULTADOS:

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