I.

INTRODUCCION

La absorcin de radiacin ultravioleta o visible proviene de la

excitacin de los electrones enlazantes y como consecuencia, las longitudes de
onda de los picos de absorcin pueden correlacionarse con los tipos de enlaces
que existen en las especies en estudio. La espectroscopia de absorcin molecular
es por tanto valiosa para la identificacin de los grupos funcionales de una
molcula.

Sin

embargo,

son

ms

importantes

las

aplicaciones

de

la

espectroscopia de absorcin ultravioleta y visible para la determinacin

cuantitativa de compuestos que contienen grupos absorbentes o tambin llamados
cromforos.
La espectrofotometra es una de las tcnicas experimentales ms
utilizadas para la deteccin especfica de molculas. Se caracteriza por su
precisin, sensibilidad y su aplicabilidad a molculas de distinta naturaleza
(contaminantes, biomolculas, etc) y estado de agregacin (slido, lquido, gas).
Los fundamentos fsicoqumicos de la espectrofotometra son relativamente
sencillos.
En esta prctica se determinara la absorbancia del bromocrosol
verde, se realizara distintas medidas con distintos volmenes; con la ayuda del
instrumento llamado espectrofotmetro.

I.1 Objetivos

Objetivo general

Determinar la concentracin del bromocrosol verde a travs del

espectrmetro visible.
-

Objetivos especficos

Determinar las concentraciones y absorbancias de cada una de

las muestras realizadas.

Construir la grfica de la relacin absorbancia vs concentracin.
Determinar la ecuacin de la grfica de la relacin absorbancia
vs concentracin.

II.

REVISIN DE LITERATURA

II.1 ESPECTROFOTOMETRA UV VISIBLE

La espectrofotometra de absorcin fue uno de los primeros mtodos
fsicos que se aplic al anlisis cuantitativo y la determinacin de estructuras, La
espectrofotometra UV-vis supera en costo y sencillez al resto de mtodos pticos

de anlisis cuantitativo y es tambin una tcnica auxiliar til para la elucidacin de

estructuras.
La regin del ultravioleta se divide en 2 partes: ultravioleta prximo o
cercano (que comprende de 200 a 400 nm del espectro electromagntico) y el
ultravioleta lejano o de vaco (10 a 200 nm). Este ltimo presenta el inconveniente
de que el oxgeno atmosfrico absorbe en esa regin y por ello no es considerado
en el anlisis por espectrofotometra UV - visible. La divisin entre las regiones
ultravioleta prximo y el visible (400 a 800 nm aproximadamente) se debe a que
el ojo humano slo puede percibir las radiaciones de onda por encima de 400nm
(OLSEN, 1990).

II.1.1 FUNDAMENTO
Como es sabido, las tcnicas espectroscpicas se basan en la
interaccin de la radiacin electromagntica con la materia. A travs de esta
interaccin las

molculas pueden pasar de un estado energtico (m), a otro

estado energtico distinto (l), absorbiendo una cantidad de energa radiante igual a
la diferencia energtica existente entre los dos niveles: El - Em. Para conseguir
esto, las molculas absorben un fotn de una radiacin tal que:

Estos trnsitos energticos son los que dan origen a los espectros
que, en definitiva no son mas que el registro de las distintas u(0k) a las que se
producen estos trnsitos energticos.
Debido a la existencia de diferentes tipos de energa de los electrones,
de los movimientos vibracionales de las molculas, de la rotacin de las mismas,

etc; las molculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnticas de un

rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de
espectroscopas segn las diferentes regiones. Un esquema podra ser el
siguiente:
Figura N1. Espectro de radiacin

La espectroscopa UV-Visible (espectros electrnicos), se debe a la

transicin de los electrones mas externos de los tomos de las molculas, desde
niveles fundamentales a niveles mas altos de energa.

II.2 LEY DE BEERT - LAMBERT

Cuando una onda electromagntica de cierta longitud de onda incide
sobre una sustancia, la fraccin de la radiacin absorbida es funcin de la
concentracin de la sustancia que atraviesa el rayo de luz y del espesor de la
muestra, que tambin se llama longitud de paso ptico. La compensacin de la
reflexin y la absorcin en la ventana puede evitarse definiendo I 0 como el poder
de radiacin que pasa a travs de una muestra testigo (blanco) contenida en la
misma celda de la muestra. La transmitancia T se define como la relacin de las
intensidades de la radiacin no absorbida I, y de la radiacin incidente, de esta
forma:

La absorbancia (A) es el logaritmo del recproco de la transmitancia

Si el porcentaje de T es 100T; el porcentaje de absorcin ser 100(1T). Las aplicaciones analticas del comportamiento de absorcin de las sustancias
pueden ser cualitativas o cuantitativas, como antes se ha mencionado. Las
primeras dependen del hecho de que una cierta especie molecular slo absorbe
luz en regiones especficas del espectro y en grado variable caractersticos de
dicha especie, al resultado se le llama espectro de absorcin de esa especie
molecular y es una huella dactilar para propsitos de identificacin. Las
aplicaciones cuantitativas dependen de la relacin entra la absorbancia y la
concentracin de la solucin.
A medida de que un haz de fotones pasa por un sistema de una
especie absorbente, el grado de absorcin con respecto a la distancia atravesada
es directamente proporcional a la potencia (o a la intensidad) del haz de fotones I.
La reduccin de la intensidad en la trayectoria x, -dI, puede escribirse
matemticamente de la forma siguiente.

Donde k es una contante de proporcionalidad caracterstica de la

naturaleza de la especie absorbente y de la energa de los fotones, e I representa
el poder de la radiacin a cualquier distancia x en el medio absorbente.
Reordenando la ecuacin anterior.

Este es el enunciado matemtico de que la fraccin del poder de

radiacin absorbido es proporcional al espesor atravesado. Si ahora se estipula
que I0 es el poder de radiacin a x=0, y que I representa el poder de la radiacin

transmitida que emerge del medio absorbente a x = l. La ecuacin puede

integrarse con respecto al total del trayecto de la radiacin.

Esta es la ecuacin de Lambert la cual indica que para una cierta

concentracin de sustancia absorbente, la intensidad de la luz transmitida
disminuye logartmicamente a medida que la longitud del trayecto aumenta en
forma aritmtica. Beer determin que al aumentar la concentracin del absorbente,
se produca el mismo efecto que un aumento proporcional en la longitud del
trayecto de absorcin de la radiacin. De esta forma, la constante de
proporcionalidad k es, a su vez, proporcional a la concentracin de la sustancia
que absorbe.

Por lo tanto la forma combinada de la ley es:

Donde a incorpora el factor de conversin del logaritmo base 10 a

logaritmo natural. Esta expresin es la ley de Lambert-Beer y se puede escribir
como:

Donde es el coeficiente de absortividad molar en unidades de L cm -1

y mol-1, l es la longitud del paso ptico (longitud de la celda) y C es la
concentracin de la sustancia absorbente en unidades de mol L -1.

Figura N2. Absorcin de la radiacin

Si se opera a una longitud de onda dada y con una cubeta de un

determinado espesor l, la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a
la concentracin molar de la muestra c, lo que constituye el fundamento del
anlisis espectrofotomtrico cuantitativo.
Existen, sin embargo distintos factores que afectan al cumplimiento de
la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes
de proceder al anlisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente
el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de
calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones.
La ley

de

Lambert-Beer puede tambin aplicarse al anlisis

cuantitativo de mezclas de dos o ms sustancias, siempre que sus respectivos

espectros de absorcin sean lo suficientemente distintos. El procedimiento se
basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva, de tal forma que la
absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. As,
para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiacin de una
misma longitud de onda, se cumplir que:

II.3 CARACTERSTICAS DE UN ESPECTROFOTMETRO UV - VISIBLE

La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un

espectrofotmetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de
difraccin) que controla la longitud de onda de la radiacin que se hace incidir
sobre la muestra. La radiacin no absorbida se detecta y mide convenientemente.
La absorbancia de la muestra se compara con la de una referencia que consta
estrictamente de disolvente.

II.3.1

INSTRUCCIONES
GENERALES
ESPECTROFOTMETRO

DE

MANEJO

DE

UN

Encendido de lmparas

Lmpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido instantneo.
Lmpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita un
calentamiento previo.

Adaptacin del espejo a la lmpara adecuada, atendiendo al rango de longitud de

onda de trabajo (slo en los espectrofotmetros no automticos).
Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente.
Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando Ajuste
del cero, hasta que aparezca cero en la pantalla.
Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia, que
normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando A-T.
Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.

Figura N3. Absorbancia/Transmitancia de la muestra

Las cubetas empleadas en el espectrofotmetro (1.00 cm de espesor)

deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras
esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario
por el carcter abrasivo de ste sino con un papel suave. Una de las aplicaciones
prcticas de mayor inters de la espectrofotometra de absorcin UV-Visible es la
del anlisis cuantitativo, basada en la aplicacin de la ecuacin de Lambert-Beer.
II.4 PUNTO ISOSBESTICO
En la mayora de los casos durante la duracin de una reaccin
qumica, una especie absorbente X se transforma en una especie absorbente Y
(en el caso que slo estn involucradas 2, para los casos en donde hay ms
especies se aplica el mismo concepto). Si los espectros de los componentes puros
X e Y se cruzan a una longitud de onda, cualquier espectro registrado durante la
reaccin qumica pasar por ese mismo punto, este punto se conoce como punto
isosbstico, este es una buena prueba de que existe ms de una especie.

En la figura se muestra un ejemplo de los espectros de absorcin

que corresponde al verde de bromocresol, se puede observar que hay una
longitud de onda en que los tres espectros se cortan, este es el punto isosbstico
y corresponde a la longitud de onda en que las dos formas tienen la misma
absortividad (HARRIS, 2007).

Figura N4. Espectros de absorcin del bromocrosol verde a diferentes valores

de pH, donde se observa el cambio de una especie a otra dejando evidencia el punto
isosbstico

III.

MATERIALES Y MTODOS

3.1 MATERIALES
- Bromocrosol verde 3gr.
- (4) Tubos de Ensayo
- (1) Matraz
- (1) Pipeta
- (1) Vaso precipitado de 250 ml
- (1) Gradilla
- Agua Destilada
- Libreta de apuntes
- Lapicero
3.2 Equipo

- Espectrofotmetro 1200 RS FARLAB

- Laptop
- Cmara digital
3.3 Software
-

Microsoft Excel 2013

Microsoft Word 2013

3.2 MTODOLOGA
3.2.1 TRABAJO DE LABORATORIO

Se comenz aadiendo al matraz 250 ml de Agua destilada, y luego se agreg 3

gramos de Bromocrosol verde y lo mezclamos hasta que se disuelva
completamente.

Luego se us 4 tubos de ensayo con su respectiva gradilla, y se agreg las

cantidades de 1, 2, 4 y 8 ml de la mezcla y agregamos agua destilada en cada uno
de los 4 tubos de ensayo hasta que en cada uno halla la cantidad de 10 ml
(agregamos 9, 8, 6, 2 ml de agua destilada respectivamente).

Posteriormente y previas explicaciones del docente a cargo, se encendi el

espectrofotmetro y se calibr colando agua en la cubeta transparente del
espectofrotmetro.

Finalmente se coloc cada muestra de los 4 tubos de ensayo en la cubeta

transparente del espectofrotmetro para medir la absorbancia.
- Trabajo de Gabinete

Con los datos obtenidos del trabajo de laboratorio de concentracin y absorbancia,

construimos una grfica de absorbancia vs concentracin en Microsoft Excel.

Al construir la grfica hallamos la lnea de tendencia generada por un ajuste de

curva lineal.

Con dicha ecuacin podremos determinar la concentracin para la absorbancia

requerida.

3.4 Consideraciones
- Si la muestra que analizamos con el espectrofotmetro no nos dio un
dato de absorbancia, no considerar para encontrar el ajuste de curva.
- Debido a que la cubeta transparente del espectofotrmetro solo
utiliza 3.5ml se tuvo que retirar 6.5ml del total del volumen

IV.

RESULTADOS

IV.1

Determinacin de la concentracin inicial

m = 3g (Bromocrosol verde)
v = 250 ml (Agua)
m
N1=
v
3g
N1=
= 0.012 g/ml
250 ml

IV.2

Volumen total
V1 = 1 ml (Mezcla) + 9 ml (Agua) = 10 ml
V2 = 2 ml (Mezcla) + 8 ml (Agua) = 10 ml
V3 = 4 ml (Mezcla) + 6 ml (Agua) = 10 ml
V4 = 8 ml (Mezcla) + 2 ml (Agua) = 10 ml
VT = 10 ml

IV.3

Determinacin de las distintas concentraciones

N1 * V1 = N2 * V2
Donde:
N1 = Concentracin inicial
V1 = Volumen de cada concentracin
N2 = Concentracin final
V2 = Volumen total

IV.3.1 Para la concentracin 1

N2-1 =

g
x 1 ml
ml
10 ml

0.012

= 0.000012 g/ml

IV.3.2 Para la concentracin 2

N2-2 =

g
x 2 ml
ml
10 ml

0.012

= 0.0024 g/ml

IV.3.3 Para la concentracin 3

N2-3 =

g
x 4 ml
ml
10 ml

0.012

= 0.0048 g/ml

IV.3.4 Para la concentracin 4

N2-4 =
IV.4

g
x 8 ml
ml
10 ml

0.012

= 0.0096 g/ml

Calculo de la absorbancia
Tabla N1. Concentracin y absorbancia de la muestra en estudio
CONCENTRACIN
N2-1 = 0.000012 g/ml
N2-2 = 0.0024 g/ml
N2-3 = 0.0048 g/ml
N2-4 = 0.0096 g/ml
N2-5 = x

ABSORBANCIA
1.294
1.424
1.938
No se efectu la lectura
1.540

Grfica N1. Representacin de la absorbancia vs concentracin

Absorbancia vs Concentracin

f(x) = 0.01x - 0.01

R = 0.95

Dada la siguiente ecuacin de la grfica, podemos hallar el valor de la

concentracin teniendo como dato la absorbancia.
y = 0.0071x 0.0088
Donde:
x = absorbancia
y = concentracin (g/ml)
Y = 0.0071 * (1.540) 0.0088
Y = 0.002134 g/ml
Por lo tanto, la concentracin N2-5 es 0.002134 g/ml

V.

DISCUSIN

Segn la Ley de Beer (WALTON, 2005); para la obtencin de la curva

de

calibracin,

se

representan

grficamente

las

absorbancias

las

concentraciones de las muestras, cuya relacin debe mostrar un comportamiento

lineal; concordando con el autor, obtuvimos una ecuacin lineal de las
concentraciones c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5=
0.000012g/ml, con sus respectivas absorbancias a1= 1.294, a2= 1.424, a3= 1.938,
a5=1.540.
Segn SIERRA (2010), se debe seleccionar la longitud de onda ms
adecuada para realizar las medidas que corresponden a un mximo de
absorbancia, con la finalidad de obtener los resultados dentro de los lmites
permitidos. Para la prctica se se escogi una longitud de onda de (240 nm) por lo
tanto el valor de R = 0.9549 de la ecuacin de la grfica de la relacin
absorbancia vs concentracin, concordando con el autor, puesto que se trabaj
dentro de la medida adecuada.

VI.

CONCLUSIONES

Se determin la concentracin del bromocrosol verde a travs de

espectrofotmetro visible, siendo este 0.000012g/ml para una absorbancia de
1.540.

Se determinaron las concentraciones de cada una de las muestras realizadas

siendo estas c1= 0.000012g/ml, c2= 0.00024g/ml, c3= 0.0048 g/ml, c5= 0.000012g/ml.
Se obtuvieron las absorbancias de cada una de las muestras, siendo stas a1=
1.294, a2= 1.424, a3= 1.938, a5=1.540.
Se determin la ecuacin de la grfica de la relacin absorbancia vs
concentracin, siendo esta y=0.0071x - 0.0088, a partir de la cual se calcul la
absorbancia teniendo como dato la concentracin.
Se determin que la relacin de la concentracin vs absorbancia es directamente
proporcional, es decir, a mayor concentracin mayor ser la absorbancia.
No se trabaj con la concentracin c4=0.0096 g/ml, debido a que el
espectrofotmetro no efectu la medicin.

VII.

RECOMENDACIONES

Diluir completamente la muestra.

 Vigilar que al momento del anlisis de la muestra en el espectrmetro, en la

habitacin no se produzca cambios bruscos en la circulacin de las masas de aire,
para que as no haya interferencia en el anlisis.
Esperar que el dato proporcionado por el espectrmetro se vuelva constante para
considerarlo valido.

VIII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

OLSEN E. 1990. Mtodos pticos de anlisis. Madrid, Espaa. Editorial Reverte

S.A. Espaa. 756 p.
HARRIS D. 2007. Anlisis qumico cuantitativo. 3 ed. Madrid, Espaa, Editorial
Reverte S.A. 418 p.

WILLARD H., et al.

1986.

Mtodos instrumentales de anlisis. Mxico D.F,

Mxico, Editorial Continental S.A. 593 p.

CONNOR, K. 1980. Curso de anlisis farmacutico. 1 ed. Madrid, Espaa,

Editorial Revert S.A. 228 p.
MIONES, J. 1978. Manual de tcnicas instrumentales. Mxico D.F, Mxico,
Crculo editor Universo. 146 p.
WALTON H. 2005. Anlisis qumico e instrumental moderno. 4 ed. Barcelona,
Espaa, Editorial Revert. 385 p.
UMHE.

2013.

Ley

de

Lambert-Beer

[En

lnea]:

(http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales/Miguel
_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05.htm, 4 de junio del 2015)

IX.

ANEXOS

Figura N5. Mezcla del bromocrosol verde

con agua

Figura N6. Pruebas para el anlisis con volmenes de 8ml, 4ml, 2ml, 1 ml
respectivamente

Figura N7. Espectrofotmetro

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA

DE LA SELVA

DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS

AMBIENTALES

ANALISIS INSTRUMENTAL

ESPECTROSCOPA DE RADIACIN UV-VIS

DOCENTE

: Ing. DIONISIO MONTALVO, Franklin

ALUMNOS

: BARRUETA PAUCAR, Mayori

CRISTANCHO ARIZA, Krystell
FERNNDEZ ESCOBAR, Angie
MANRRIQUE GUERRA, Luis
OSORIO PEDRAZA, Erick
POMA CATALN, Maribel

CICLO

: I - 2015
JUNIO 2015