Universidad Andrs Bello

Facultad Ciencias Biolgicas

Departamento de Ciencias Biolgicas
Laboratorio de Microbiologa

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

MICROBIOLOGA
BIOL 150
2015

CARRERA: ENFERMERA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

!
1. Identificacin de la Asignatura
CURSO

: MICROBIOLOGA GENERAL

CDIGO

: BIOL 150

CARRERA

: ENFERMERA

TIPO DE ACTIVIDAD:

TERICO-PRCTICO

HORARIO DE CLASES: Seccin 1: Martes: 14:55-16:35 hrs (Mdulos 8-9),

Viernes: 13:05-14:45 hrs (Mdulos 6-7).
Seccin 2: Viernes: 10:20-12:00 hrs (Mdulos 3-4),
Lunes: 12:10-13:50 hrs (Mdulos 5-6).
Seccin 3: Viernes: 13:05-14:45 hrs (Mdulos 6-7),
Martes: 14:55-16:35 hrs (Mdulos 8-9).
HORARIO LABORATORIO:

Lu 1-2/ Ma 1-2 (08:30-10:10): SECCIONES 4-5-6-7-12-13.

Lu 3-4/ Ma 3-4 (10:20-12:00): SECCIONES 8-9-10-11-14-15.

2. Profesores
Prof. Coordinador de la asignatura: Dr. Rodrigo Villanueva (rodrigo.villanueva@unab.cl)
Profs. Encargados de Ctedra:
Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (paula.rodas@unab.cl, Seccin 1)
Dr. Rodrigo Villanueva/Dra. Paula Rodas (Seccin 2)
Dra. Pamela Machuca (pamela.mac@gmail.com, Seccin 3)
Prof. Coordinadora de Laboratorio: Mg. Camila Miranda (camila.miranda.c@gmail.com)
Profs. Laboratorio:
Mg. Karina Espinoza (karinafespinozag@gmail.com)
Mg. Valeska Herrera (vale.herrera@uandresbello.edu)
Mg. Luis Saona (lsaona@ug.uchile.cl)
Lic. Rhonda Veas (rh.veas@uandresbello.edu)
Lic. Pa Viera (pia.vierav@gmail.com)
Dra. Pamela Machuca (pamela.machuca.v@gmail.com)
Dr. (C) Ignacio Fuentevilla (iafuentevilla@gmail.com)
Secciones de laboratorios:
Seccin 4: Prof. Camila Miranda/Rhonda veas
Seccin 5: Prof. Rhonda Veas/Camila Miranda
Seccin 6: Prof. Ignacio Fuentevilla /Pa Viera
Seccin 7: Prof. Pa Viera /Ignacio Fuentevilla
Seccin 8: Prof. Pamela Machuca/ Karina Espinoza
Seccin 9: Prof. Karina Espinoza/Pamela Machuca
Seccin 10: Prof. Pa Viera /Rhonda Veas
Seccin 11: Prof. Rhonda Veas/ Pa Viera
Seccin 12: Prof. Valeska Herrera/Karina Espinoza
Seccin 13: Prof. Karina Espinoza/Valeska Herrera
Seccin 14: Prof. Camila Miranda/ Luis Saona
Seccin 15: Prof. Luis Saona/Camila Miranda

3. Cronograma de las actividades tericas

BIOL 1050T-1 y
BIOL 150T-3
Ma 4 de Agosto

BIOL 150T-2
Lu 3 de Agosto

Vi 7 de Agosto

Vi 7 de Agosto

Filogenia y Taxonoma
Morfologa y Agrupaciones

Ma 11 de Agosto

Lu 10 de Agosto

Fisiologa Bacteriana

Vi 14 de Agosto

Vi 14 de Agosto

Metabolismo y Crecimiento Bacteriano

Ma 18 de Agosto

Lu 17 de Agosto

Gentica Bacteriana I

Vi 21 de Agosto

Vi 21 de Agosto

Gentica Bacteriana II

Ma 25 de Agosto

Lu 24 de Agosto

Antimicrobianos y Resistencia I

Vi 28 de Agosto

Vi 28 de Agosto

Antimicrobianos y Resistencia II

Ma 1 de Septiembre

Lu 31 de Agosto

Relacin hospedero-parsito

Vi 4 de Septiembre

Vi 4 de Septiembre

Infecciones estafiloccicas

Ma 8 de Septiembre

Ma 8 de Septiembre

Ma 22 de Septiembre

Lu 21 de Septiembre

Infecciones Estreptoccicas

Vi 25 de Septiembre

Vi 25 de Septiembre

Infecciones por bacilos Gram +

Ma 29 de Septiembre

Lu 28 de Septiembre

Enterobacterias I

Vi 2 de Octubre

Vi 2 de Octubre

Enterobacterias II y bacilos no fermentadores

Ma 6 de Octubre

Lu 5de Octubre

Vi 9 de Octubre

Vi 9 de Octubre

Ma 13 de Octubre

Vi 16 de Octubre

Bacterias nutricionalmente exigentes. Neisserias,

Espiroquetas y otras ETS
TBC. Bacterias Especiales (Micoplasmas, Clamidias y
Rickettsias)
Micologa. Generalidades

Ma 20 de Octubre

Ma 20 de Octubre

Vi 23 de Octubre

Vi 23 de Octubre

Micosis superficiales y oportunistas

Ma 27 de Octubre

Lu 26 de Octubre

Micosis profundas patgenas

Drogas antifngicas

Vi 30 de Octubre

Vi 30 de Octubre

Virologa. Generalidades
Replicacin viral

ACTIVIDAD
Presentacin del Curso
Introduccin

SOLEMNE I
Mdulos 12 y 13

SOLEMNE II
Mdulos 12 y 13

Ma 3 de Noviembre

Lu 2 de Noviembre

Virus de importancia mdica I

Vi 6 de Noviembre

Vi 6 de Noviembre

Virus de importancia mdica II y III

Ma 10 de Noviembre

Lu 9 de Noviembre

Conceptos Generales de parasitologa y Enteroparasitosis

Nemtodos Intestinales I

Vi 13 de Noviembre

Vi 13 de Noviembre

Nemtodos Intestinales II
Cstodes Intestinales

Ma 17 de Noviembre

Lu 16 de Noviembre

Protozoos Intestinales
Helmintos Tisulares

Vi 20 de Noviembre

Vi 20 de Noviembre

Protozoos Tisulares

Ma 24 de Noviembre Ma 24 de Noviembre
Vi 27 de Noviembre

Vi 27 de Noviembre

Mi 9 de Diciembre

Mi 9 de Diciembre

SOLEMNE III
Mdulos 12 y 13
Artrpodos de inters mdico
Malaria, amebas de vida libre
EXAMEN
Mdulos 7 y 8

4. Cronograma de las actividades prcticas

Fecha

Seccin

ACTIVIDAD

10 Agosto

4-6-8-10-12-14

01. Presentacin del curso

11 Agosto

5-7-9-11-13-15

01. Presentacin del curso

17 y 18 Agosto

4-6-8-10-12-14

02. Procedimientos Bsicos

24 y 25 Agosto

5-7-9-11-13-15

02. Procedimientos Bsicos

31 Ago y 1 Sept

4-6-8-10-12-14

03. Morfologa Bacteriana

7 y 8 Sept

5-7-9-11-13-15

03. Morfologa Bacteriana

21 y 22 Sept

4-6-8-10-12-14

04. Muestras Clnicas Gram + y Flora Normal

28 y 29 Sept

5-7-9-11-13-15

04. Muestras Clnicas Gram + y Flora Normal

5 y 6 Oct 2014

4-6-8-10-12-14

05. Muestras Clnicas Gram y Antibiticos

19 y 20 Oct 2014

5-7-9-11-13-15

05. Muestras Clnicas Gram y Antibiticos

26 Octubre

4-6-8-10-12-14

06. Levaduras y Hongos Filamentosos

27 Octubre

5-7-9-11-13-15

06. Levaduras y Hongos Filamentosos

16 Nov 2014

4-6-8-10-12-14

07. Parasitologa

17 Nov 2014

5-7-9-11-13-15

07. Parasitologa

23 Nov 2014

Todas las secciones

00. Controles Recuperativos

23 Nov 2014

Todas las secciones

00. Revisin controles e informes

5. Requisitos de asistencia
La asistencia a clases tericas debe ser superior al 80%. La asistencia a los laboratorios debe ser
de 100%. La justificacin de inasistencia a alguna actividad se debe realizar en la Direccin de la Escuela de
Enfermera. Los alumnos debern presentar una fotocopia validada del certificado mdico o similar al
profesor encargado de ctedra o laboratorio (segn corresponda) dentro de los 7 das hbiles despus de
presentado el justificativo. Ms de un 20% de inasistencia (incluso justificada) equivale a la Reprobacin
automtica del curso.
La puntualidad para las actividades prcticas es indispensable, ya que los controles de entrada
se realizarn durante los primeros 10 minutos. El alumno que llegue al laboratorio despus de ese tiempo ser
calificado con nota 1,0. Si un alumno llega con un atraso superior a 30 minutos, no podr realizar la actividad
prctica y la situacin ser considerada como inasistencia.
No se permitirn cambios de seccin en los trabajos prcticos, cada alumno debe permanecer en
la seccin que le corresponde durante todo el semestre.
5. Condiciones para aprobar el curso:
El curso se aprueba con nota final igual o superior a 3.95, segn la planilla de clculo del sistema
en Intranet.
La nota de presentacin se calcular de acuerdo a los siguientes parmetros:
TERICO:
La ponderacin de la parte terica del curso corresponde al 70% de la nota de presentacin, segn:
Prueba Solemne I: 25%,
Prueba Solemne II: 25%,
Prueba Solemne III: 20%.
PRCTICO:
La ponderacin de la parte prctica del curso corresponde al 30% de la nota de presentacin, segn:
1) Controles de entrada: 70%,
2) Informes: 30%.
El promedio de las actividades sealadas con la ponderacin establecida corresponde a la nota de
presentacin.

PROMEDIO FINAL:
1) Nota presentacin: 70%
2) Examen Terico!Prctico: 30%
Los alumnos que sean sorprendidos en actividades irregulares (copia, uso de torpedos, plagio, etc) en
pruebas solemnes, controles de laboratorio, informes de laboratorio, pruebas parciales o durante el examen
final, sern evaluados con nota 1,0 en esa actividad. Particularmente, se considerar plagio la facilitacin y/o
utilizacin de informacin de otros grupos del curso, as como el uso de informacin de internet sin
citar con su respectiva referencia bibliogrfica.
Los alumnos que presenten bloqueos de cualquier tipo y no aparezcan en las listas oficiales tienen
como plazo mximo para regularizar su situacin el da Lunes 14 de Septiembre, de lo contrario no podrn
hacer ingreso a la sala de clases.
6. Prueba Recuperativa
Ante la inasistencia a una Solemne, se considerar el Examen como prueba recuperativa. Slo
tendrn derecho a Prueba Recuperativa aquellas inasistencias debidamente justificadas ante la Escuela
de Enfermera.
7. Condiciones de eximicin
Se eximirn del examen final SLO los alumnos que alcancen una nota 4,95 superior que NO
hayan obtenido ninguna nota roja en las pruebas solemnes ni en los controles e informes del laboratorio
(Condiciones establecidas que se rigen segn el Reglamento del Alumno de Pregrado, Artculo 40).
8. Metodologa de actividades acadmicas
El curso se desarrollar a travs de clases tericas presenciales, distribuidas en 4 horas semanales, con
uso de material audiovisual y guas de apoyo. Los trabajos prcticos se desarrollarn en los laboratorios de
microbiologa con actividades programadas para que cada alumno manipule material microbiolgico y
aprenda las tcnicas bsicas de la microbiologa, bajo la supervisin de dos profesores por sala.
Los controles son de tipo verdadero y falso, donde solo las preguntas falsas se responden de la
siguiente manera:
Pregunta1:
__F_ El pasto es azul.
Respuesta: El pasto es verde.
No se evaluaran como respuestas correctas si Ustedes justificaran que el cielo es azul. Porque no se le esta
preguntando por el cielo, sino que por el pasto.
Informes:
Durante cada trabajo prctico los alumnos debern entregar un informe de las actividades realizadas,
los resultados obtenidos y la correspondiente discusin de estos, para esto los alumnos realizaran un informe
pre-establecido, el cual se completara durante las secciones practicas de laboratorio. Los informes se deben
completar con los datos solicitados segn corresponda en cada actividad prctica. En los informes se
evaluarn los resultados obtenidos (si fueron realizados correctamente los objetivos del practico) y las
metodologas utilizadas. Los grupos de trabajo son de DOS PERSONAS, las cuales deben trabajar juntas
durante todo el semestre, SIN DERECHO A SEPARARSE.

Formas de citar las referencias en el informe:

En los informes la bibliografa debe ser escrita de forma correcta, segn su procedencia. Algunos
ejemplos:
1. Artculos en revistas: Nombre Autores, Ao de publicacin, Nombre Revista, Volumen, Pginas.
Ej: Woese, C.R., 1987, Bacterial evolution, Microbiol. Rev., 51:221!271.
2. Libros: Nombre Autores, Nombre Libro, Ao de publicacin, Edicin, Editorial, Pginas.
Ej: Madigan M. T., Martinko J. M., Dunlap P. V. y Clark D. P., Brock. Biologa de los Microorganismos.
2009, 12 ed., Editorial Pearson Educacin, 125 135.
3. Electrnicas: Temas principal, tema especfico, fecha de cuando se utiliz, direccin electrnica.
Ej: Parsitos Intestinales, Ascaris, sbado 1 de enero 2011,
http://www.hnt.cl/p4_hospital/site/pags/20040405111759.html
Las citas electrnicas deben provenir de sitios confiables como Universidades, Sociedades Cientficas,
Sitios de revistas electrnicas, etc. No se permitira la utilizacion de sitios como wikipedia, rincon del vago,
etc.
9. Eliminacin de nota:
No se eliminar ninguna de las notas obtenidas en las pruebas solemnes, ni en el laboratorio.
10. Normas de disciplina
Durante todas las actividades, los alumnos deben cumplir las siguientes condiciones:
- Disciplina: Las normas de orden y disciplina deben ser mantenidas durante todas las actividades.
Esto significa que no pueden hacer uso de telefona celular u otra forma de comunicacin mientras se
encuentren dentro de la sala de clases.
Los estudiantes no podrn salir/retirarse de la sala de clases sin previa autorizacin del profesor encargado.
En cuanto a las normas de respeto y sana convivencia, se exigir un lenguaje adecuado y un comportamiento
acorde a un estudiante universitario.

Participacin: Se espera participacin activa en clases teoricas y practicas, por lo que el alumno
debera tener conocimiento de los contenidos que se abordaran en la clase y de materias anteriores.
En todas las clases se realizarn interrogaciones orales sorpresas de materia del prctico
correspondiente o prcticos pasados, una buena respuesta conlleva a una evaluacin positiva, de lo
contrario una mala respuesta ser evaluada con puntaje negativo, reflejado dicho puntaje en el
control.
Evaluacin: Cada alumno es responsable de traer consigo lpiz, goma y corrector. No se aceptarn
prstamos entre los alumnos mientras se realice la evaluacin.

Queda estrictamente prohibido el uso de celulares dentro de la sala, por lo que se solicita apagar!"
silenciar estos previo al ingreso a las actividades del curso. Ademas, el uso de grabadoras, mp 3, mp4, etc.
durante las evaluaciones y revisiones de las solemnes y controles queda extrictamente prohibido.
La asistencia al laboratorio es obligatoria, y de la misma manera es obligatorio el
cumplimiento de las siguientes normas:
Asistencia con delantal blanco y calzado apropiado (cerrado).
En caso que el alumno(a) tenga pelo largo debe asistir al laboratorio con este tomado con un moo
tipo tomate.

No se puede ingresar al laboratorio con mochilas, bufandas, pauelos, etc

por lo que cada alumno debe llevar un candado para dejar sus pertenencias en las gavetas provistas p
or la universidad.

El incumplimiento de cualquiera de estas normas imposibilita al alumno de realizar el trabajo prctico.

Por otra parte, se exigir puntualidad en el horario de salida del trabajo prctico (10:00 a.m. y 11:50
a.m.), el cual tiene una duracin de 90 minutos. En caso de no cumplir con este horario, existir un
descuento en la nota de control del entrada del trabajo prctico que se est realizando. El descuento
ser de 0,1 puntos por cada minuto de retraso, el cual se puede extender hasta 10 minutos
(correspondientes al tiempo de recreo).

TRABAJO PRCTICO N1
PROCEDIMIENTOS BSICOS
NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN LOS TRABAJOS PRCTICOS DE MICROBIOLOGA
Durante el desarrollo de las actividades prcticas se debe mantener una serie de normas, cuyo propsito
fundamental es la preservacin de la salud del alumno, sus familias y la comunidad.
1. Cada alumno debe usar delantal blanco abrochado para evitar la contaminacin de sus ropas.
2. Al comenzar y al terminar las actividades, cada alumno debe lavarse las manos.
3. El alumno debe ingresar al laboratorio con el pelo tomado, se exige moo tipo tomate.
4. Est estrictamente prohibido comer, beber, fumar, masticar chicle, o llevarse cualquier objeto a la boca, por
el riesgo de contagio.
5. No ingresar bolsos, pauelos, bufandas o chaquetas a la sala de trabajos prcticos.
6. Las asas de platino deben ser esterilizadas antes y despus de su uso. Al enfriarla, evite salpicar, los
aerosoles son muy contagiosos.
7. Toda pipeta Pasteur utilizada debe ser sellada y desechada en las cajas de material cortopunzante.
8. Las placas de Petri slo deben abrirse en el momento de siembra y a una distancia menor a los 30 cm del
mechero Bunsen encendido.
9. Los tubos deben flamearse (la boca del tubo) antes y despus de ser utilizados.
10. Frente al derrame de un medio de cultivo o muestra debe informar al profesor, esto tambin se recomienda
frente a cualquier accidente como quemaduras, cortaduras o contacto con material contaminado.
11. Es de primordial importancia el cuidado del microscopio. ste slo debe encenderse al momento de la
observacin de su tincin. La que debe retirarse terminada la observacin (y ser eliminada donde corresponde),
y para limpiar el objetivo 100 x se utiliza solucin limpia lentes y papel tissue.
12. Las superficies de trabajo deben ser descontaminadas antes y despus de realizado el trabajo prctico, por
lo tanto en su bandeja Usted encontrara un aspersor con Etanol 70 % y algodn.
El estudio de bacterias, virus, parsitos y hongos potencialmente patgenos para el hombre, animales u otros
seres vivos, involucra riesgos dependientes del agente infecciosos y los procedimientos empleados. Las normas
de bioseguridad buscan reducir a un nivel aceptable el riesgo asociado a su manipulacin. Deben considerarse
para lograr que el personal que manipula estos agentes infecciosos en el mbito hospitalario estn
mnimamente expuestas a adquirir una enfermedad infecciosa o de otro tipo.

BIOSEGURIDAD: corresponde al conjunto de medidas protectivas, destinadas a proteger la salud de las

personas frente a los posibles riesgos asociados a los agentes biolgicos, fsicos o qumicos en el laboratorio,
como tambin indirectamente al ambiente.
AGENTE INFECCIOSO: todo microorganismo, incluidos los genticamente modificados, presentes en
forma latente y los portados por el personal de salud, capaces de originar cualquier infeccin, alergia o
toxicidad.
CONTROL DE LA CONTAMINACIN EN EL LABORATORIO
El laboratorio tiene importancia central en el diagnstico etiolgico, de modo que resulta fundamental evitar la
contaminacin de las muestras, ya sea desde el operador como desde las otras muestras (contaminacin
cruzada).
Con este fin, se debe trabajar con TCNICA ASPTICA y utilizando material ESTRIL. Algunos conceptos
que debemos conocer y manejar son:
DESINFECCIN: proceso que busca eliminar la mayora de los microorganismos patgenos, excepto esporas
y algunos virus, en objetos inanimados.
ASEPSIA: proceso que utiliza agentes qumicos para impedir infeccin de piel, mucosas u otros tejidos en
seres vivos. Los antispticos actan provocando muerte de los microorganismos patgenos o impidiendo su
multiplicacin.
SANITIZACIN O HIGIENIZACIN: Proceso que utiliza lavado mecnico o agentes qumicos para
REDUCIR el nmero de patgenos presentes en un objeto hasta niveles aceptables para la salud pblica.
ESTERILIZACIN: proceso fsico o qumico destinado a destruir TODA vida microbiana, incluyendo
esporas, en materiales u objetos inanimados.
TCNICAS DE ESTERILIZACIN
1.- Mtodos Fsicos
a) Calor
Es el mtodo ms usado, econmico y fcil de controlar. Proceso rpido al cual la totalidad de los
microorganismos resulta sensible.
Pasteurizacin: uso para prevenir infecciones asociadas a productos lcteos (Tuberculosis, Brucelosis,
Salmonelosis) y retrasar descomposicin de la leche.
Autoclave (vapor saturado a presin): Entre los mtodos de esterilizacin, es el ms efectivo y de menor costo;
es el mtodo de eleccin para instrumental mdico de uso repetido.

Llama y flameado: utilizado para esterilizar asas de siembra en el laboratorio. A travs del flameado se evita
la contaminacin de tubos y matraces., al someterlos directamente a la llama.
b) Radiaciones
Rayos ultravioleta (U.V): lesionan el DNA bacteriano, inhibiendo la correcta replicacin del DNA durante la
replicacin celular.
Se usa principalmente en ambientes de quirfanos, sala de prematuros, esterilizacin de superficies.
Radiaciones ionizantes: los rayos gamma principalmente, son utilizados para esterilizacin en fro de
materiales desechables como: jeringas, bisturs, catteres, prtesis, guantes de ciruga y equipos de transfusin.
2.- Mtodos Mecnicos
Ondas snicas y ultrasnicas: afectan el metabolismo bacteriano, produciendo desnaturalizacin de protenas
y muerte celular.
Filtracin: usado en el control de microorganismos presentes en sustancias lquidas o gases, mediante su paso
a travs de sustancias porosas denominadas filtros. Su utilidad principal es la esterilizacin de sueros o lquidos
que contengan protenas o metabolitos termolbiles.
3.- Mtodos Qumicos (antispticos y desinfectantes)
La penetracin de estos agentes es ms rpida en bacterias Gram positivo, debido principalmente a la presencia
protectora de la membrana externa en las bacterias Gram negativo.
Los agentes qumicos pueden causar ocasionalmente infecciones nosocomiales al encontrarse contaminados
con bacterias, siendo el gnero Pseudomonas el ms habitual. Esto es de suma importancia y para evitarlo es
imprescindible que el personal de salud cuente con un acabado conocimiento del tema.
El siguiente cuadro resume los principales agentes qumicos y su utilidad
AGENTE
Alcoholes 70%

ACCIN
Sobre formas vegetetivas (no esporas). Desnaturaliza
protenas.

APLICACIN
Piel y superficies inertes

Cloro

Bactericida. Acta oxidando grupos sulfhidrilos libres.

Yodo/povidona
yodada

Bactericida. Acta sobre formas vegetativas y esporas,

hongos y algunos virus. Interfiere procesos de oxido
reduccin y fosforilacin bacterianos.

tiles de cocina, chatas,

patos, baos,
unidades de dilisis
Piel heridas, material
quirrgico

TCNICAS BSICAS DE MICROBIOLOGA

El objetivo principal del prctico es la adquisicin de conocimientos bsicos en lo que respecta a la
manipulacin de cultivos bacterianos. Esto incluye manejo del concepto de esterilidad, siembra en medios
lquidos, en medios slidos (diferenciales, selectivos, etc) y siembra en condiciones anaerbicas.
El cumplimiento de las tareas en microbiologa clnica exige la realizacin de tres actividades: la primera
de ellas, aislamiento e identificacin de microorganismos, se inicia con el cultivo de las muestras de distinto
origen, en medios especficos y en condiciones definidas, y va seguido de examen microscpico y pruebas
bioqumicas al microorganismo aislado; la segunda actividad, involucra el conocimiento de la resistencia o
sensibilidad a antibiticos, biotipificacin y serotipificacin; y por ltimo, la tercera actividad involucra la
identificacin epidemiolgica o comparacin de los aislamientos de la misma especie con el fin de hacer el
control de la infeccin o anlisis de poblacin.
Para poder realizar la primera de estas actividades, es imprescindible contar con un cultivo puro que debe
ser mantenido en condiciones de laboratorio, para esto es necesario e indispensable emplear material
completamente estril (Tabla N 1).
Para poder mantener las bacterias en condiciones de laboratorio se utiliza otro procedimiento importante
en el rea de la microbiologa que es la siembra o cultivo. Esta consiste en colocar a los microorganismos en un
ambiente adecuado para que se desarrollen y multipliquen. En el laboratorio este medio ambiente lo
constituyen los medios de cultivo corrientes o bsicos y especiales, operacin que debe realizarse en forma
asptica.
Generalmente las muestras contienen una flora mixta, que se manifiesta por el desarrollo de distintas
especies bacterianas: algunas son saprfitas (flora normal) o contaminantes del proceso de muestreo y otras son
las que tienen un rol patgeno.
Obtener una cepa bacteriana aislada significa, por lo tanto, obtener un cultivo en estado de pureza,
condicin indispensable para poder estudiar sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas y lograr as su
identificacin correcta.
Si en la placa de agar ha crecido ms de un tipo de bacterias, se debe realizar el aislamiento de UNA
colonia a otro medio de cultivo semejante o a medios selectivos.
En el caso de los medios lquidos, una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se debe realizar un
aislamiento de UNA gota o UNA asada del cultivo a un medio slido para obtener colonias aisladas y puras
(Tabla N 2).
Si fuese necesario, las colonias se sometern a uno o ms re-aislamientos, hasta obtener cultivos puros, es
decir que todas las colonias sean similares, presenten la misma morfologa y microscpicamente correspondan
a un solo tipo de bacteria.
Slo en este momento se puede proceder a la identificacin de la especie bacteriana mediante el traspaso
de UNA sola colonia a una batera de medios de identificacin.

MORFOLOGA BACTERIANA: ANLISIS MACROSCPICO

Una etapa importante y bsica en el estudio de las caractersticas de una bacteria, es la observacin de su
morfologa. Como consecuencia del pequeo tamao que presentan no es posible distinguirlas a simple vista y,
debido a esto es que tenemos que estudiar poblaciones bacterianas, llamadas colonias. Para obtener estas
colonias es necesario proporcionarles a las bacterias los requerimientos necesarios de materia orgnica, iones
inorgnicos y factores de crecimientos entre otros a travs de un medio de cultivo. Cada colonia corresponde
en su origen a una sola bacteria que se ha multiplicado y desarrollado en un medio de cultivo slido,
hasta formar una poblacin que se represente como una colonia visible. Por lo tanto una colonia esta formada
por millones de bacterias.
El crecimiento de las bacterias en medios lquidos, no da origen a la formacin de colonias. El desarrollo
se evidencia mediante la turbidez del caldo, sedimento y otras caractersticas.
Cabe destacar que la morfologa macroscpica de las colonias (anlisis macroscpico) permite un
acercamiento en la identificacin de los gneros bacterianos que poseen caractersticas propias de desarrollo de
sus colonias, segn su forma, elevacin, margen, superficie, brillo, color y hemlisis (en agar sangre).
Muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas lo que hace imposible
diferenciarlas solo con la observacin macroscpica de estas por lo que se hace necesario adems una
observacin microscpica de las clulas que conforman estas colonias.
Esto datos proporcionan una orientacin sobre las pruebas bioqumicas para la identificacin definitiva de
las colonias.
En la siguiente figura se observan algunas caractersticas macroscpicas de colonias bacterianas,
frecuentemente utilizadas para la descripcin de una bacteria o microorganismo.

Figura N 1: Criterios macroscpicos para la descripcin de una colonia bacteriana.

No
Si

Directo a la llama del mechero

Qumica

Autoclave

Autoclave
Llama Mechero

Autoclave

Autoclave

Qumica

Pipetas aforadas de vidrio*

Pipetas aforadas de plstico

Pipetas Pasteur de vidrio*

Tubos estriles**

Placas Petri de vidrio

Puntas de Papel Absorbente

Placas Petri de plstico

Si

No

Si

Si

Si

No

Despus de ser utilizada

Desechable

Desechable

Re-utilizable

Re-utilizable

Desechable

Desechable

Re-utilizable

Re-utilizable

Tipo de material

** Cada vez que se destape un tubo estril, se debe flamear su boca y repetir la operacin inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este procedimiento pretende evitar
la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

* Este material se pueden encontrar en cilindros metlicos o envueltas en papel, ya estriles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en forma horizontal, destaparlo
y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera de no tocar su extremo inferior.

No

No

Si

No

Directo a la llama del mechero

Asa de platino

Antes de ser utilizada

Tipo esterilizacin

Esterilizacin

Material

Tabla N 1 : Material de uso comn en el Laboratorio de Microbiologa

ACTIVIDADES PRCTICAS (PRIMERA SESIN)

1. De medios Slidos a medios Slidos (tcnica de aislamiento en cuadrantes).

1.1. Desde placa Petri a placa Petri:
a. Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del microorganismo,
Grupo y Fecha).

b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilizacin.

c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan
colonias.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio, la
muestra se tomara una sola vez (Con solo tocar la colonia estar tomando la
cantidad de bacteria suficiente para poder sembrar).
e. Colocar la tapa de la placa sobre el mesn cerca del mechero.
f. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello:
i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la
placa. Flamear el asa.
ii. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector
contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Flamear el asa.
iii. A partir de las ltimas lneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario
de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.
iv. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener
cuidado de que cuando se hacen las estras en ii.) y iii.) no tocar las que ya se
encuentran en la placa.
g. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin.

Figura N 2: Siembra desde medio solido a medio solido (placa de Petri

2. De medios Slidos a medios Lquidos.

2.1. Desde placa Petri a tubo con medio lquido:
a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre microorganismo,
Grupo, Fecha).

b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilizacin.

c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio slido con la bacteria en estudio (Con
solo tocar la colonia estar tomando la cantidad de bacteria suficiente para
poder sembrar).
e. Flamear la boca del tubo con medio lquido.
f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente.
g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilizacin.

18 24 Hrs.

Figura N 3: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.

3. De medios Lquidos a medios Slidos

3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a placas de Petri:
a. Rotular la placa en el reverso (por donde se encuentra el agar) con los datos
correspondientes.

b. Flamear el asa en argolla (loop) para su esterilizacin.

c. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan
d.
e.
f.
g.

h.

colonias.
Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo e
introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, agitar suavemente el asa y retirarla.
Flamear y tapar la boca del tubo.
Colocar la tapa de la placa sobre el mesn cerca del mechero.
Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estras, para ello:
v. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig zag en un pequeo sector de la
placa. Flamear el asa.
vi. A partir del sector ya sembrado en la placa, deslizar el asa hacia el sector
contrario de la placa nuevamente en forma de zig zag. Flamear el asa.
vii. A partir de las ltimas lneas realizadas, deslizar el asa hacia el sector contrario
de la placa en forma de zig-zag. Flamear el asa.
viii. Repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar la placa. Tener
cuidado de que cuando se hacen las estras en ii.) y iii.) no tocar las que ya se
encuentran en la placa.
Tapar la placa y flamear el asa para su esterilizacin.

D
18 24 Hrs.
4.
Figura N 4: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a agar en placa Petri.

5. De medios Lquidos a medios Slidos (Zig-zag superficie).

5.1. Desde tubo de cultivo bacteriano lquido a tubo con Agar tendido:
a.
b.
c.
d.
e.
f.
g.
h.
i.

Rotular el tubo de agar con los datos correspondientes (Nombre del

microorganismo, Grupo y Fecha).
Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin.
Flamear el asa en punta para su esterilizacin.
Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y
enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar
suavemente para luego retirarla.
Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.
Introducir el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un slo movimiento, deslizar el
asa con movimientos en zig-zag ascendentes por la superficie del medio de cultivo.
Flamear y tapar la boca del tubo.
Flamear el asa para su esterilizacin.

Figura N 5: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar tendido.

6. De medios Lquidos a medios Slidos.

6.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con agar blando (Por pinchadura).
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin.
c. Flamear el asa en punta para su esterilizacin.
k. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar
el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para
luego retirarla.
l. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
d. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estril;
para ello:
i.- Destapar el tubo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el
medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo. ii.- Retirar el asa con
precaucin para producir el menor desgarro posible.
e. Flamear la boca del tubo y tpelo.
f. Flamear el asa para su esterilizacin.
g. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.
h. Ver ejemplo del procedimiento en la Figura N4.

Figura N 6: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar blando.

7. De medios Lquidos a medios Slidos.

7.1. Desde tubo con cultivo bacteriano lquido a tubo con agar semi tendido (Pinchadura
en el fondo y zig-zag en la superficie).
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitacin.
c. Flamear el asa en punta para su esterilizacin.
k. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y enfriar el
asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar suavemente para luego
retirarla.
l. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
d. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio estril; para
ello:
i.- Destapar el tubo estril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes, picando el medio
de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo.
ii.- Al retirar el asa con precaucin para producir el menor desgarro posible, en la superficie
tendida pasar el asa en forma de zig-zag.
e. Flamear la boca del tubo y tpelo.
f. Flamear el asa para su esterilizacin.

Figura N 7: Siembra desde cultivo bacteriano lquido a Tubo con agar semi tendido.

8.

Tcnicas de esterilizacin
7.1. Flameado

a. Dividir una placa por la mitad.

b. Tomar un asa y abrir una placa de agar nutritivo y deslizarla suavemente por una mitad del
agar. Cerrar la placa.

c. Flamear el asa para su esterilizacin, enfrela en la tapa y deslcela suavemente por la otra
mitad del agar.

d. Cerrar la placa.
e. Incubar la placa a 37C.

9.

Desinfeccin y Asepsia

8.1. Cloro
a. Dividir una placa de agar nutritivo en dos.
b. Tomar una trula estril y humedecerla en suero fisiolgico.
c. Deslizarla rpidamente por un sector del mesn de trabajo, alejado del mechero (ms de 30
cm).
d. Deslizarla suavemente sobre una mitad del agar nutritivo (Zig-Zag).
e. Humedecer la misma trula con la solucin de cloro, espere tres minutos.
f. Ahora pasar la trula por la otra mitad del agar (Zig-Zag).
g. Incubar la placa a 37C por 24hr.
8.2 Yodo

a.
b.
c.
d.

Dividir una placa en dos, por una mitad deslizar suavemente uno de sus dedos por el agar.
Tome un trozo de algodn con yodo y aplquelo en el dedo que utiliz, espere unos segundos.
Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
Incubar la placa a 37C.

8.3 Alcohol

a. Repita los pasos realizados para la actividad del cloro.

b. Escoja otro lugar del laboratorio de amplia exposicin.
c. Incubar la placa a 37C.

ACTIVIDADES PRCTICAS (SEGUNDA SESIN)

OBJETIVOS
1.

Comparar colonias bacterianas desarrolladas en distintos medios de cultivo slido (Placas de Agar).

2.

Describir colonias de acuerdo a criterios macroscpicos.

3.

Practicar preparacin de frotis bacterianos y el uso correcto del microscopio.

En la segunda sesin de trabajo prctico Ud. debe:

1. Observar y describir las colonias desarrolladas en la placa de agar, considerando los siguientes aspectos:
forma, borde, elevacin, superficie, caractersticas fsicas (textura, color y brillo) (Figura N1).

2. Observar el crecimiento bacteriano en los medios de cultivo lquidos y slidos sembrados en la primera
sesin. Describa lo observado.
3. Observar las placas de agar sometidas a los procesos de: esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Describa
lo observado en ambas mitades del agar.
4. Realizar anlisis de morfologa microscpica
4.1 Preparacin de frotis bacteriano a partir de una colonia.
a. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lmina (del tamao de una arveja).
b. Flamear el asa para su esterilizacin.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no exista crecimiento bacteriano.
d. Obtener una pequea muestra desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto, suavemente,
formando una capa delgada.
f. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque.
4.2 Tincin simple
a. Cubrir un frotis bacteriano con Azul de Metileno al 1%
b. Dejar reposar 2 minutos para permitir la difusin del colorante
c. Lavar suavemente con agua.
d. Secar con papel absorbente
e. Observar al microscopio con aumento de 100X oil (USAR ACEITE DE INMERSIN).
f. Describa lo que observa: forma, agrupacin, color.

MICROSCOPIO PTICO:

Sistema ptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecnico
o SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.
o REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico
que consigue el enfoque correcto.

USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO PTICO CON ACEITE DE INMERSIN

1. Colocar la preparacin sobre la platina del microscopio
2. Verificar que el condensador est arriba y el diafragma abierto, ya que el objetivo de inmersin requiere
mucha ms luz que los objetivos secos.
3. Enfocar primero con los objetivos secos en orden creciente (4x, 10x, 40x), eligiendo la zona de inters.
4. Colocar el revlver a mitad de camino, entre el objetivo 40x y el de inmersin 100x (lnea negra)
EVITANDO CUALQUIER CONTACTO DE LOS OBJETIVOS SECOS CON EL ACEITE DE
INMERSIN.
5. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin
6. Cuidadosamente colocar el objetivo 100x en contacto con el aceite, el objetivo deber estar
prcticamente tocando el portaobjetos, y el aceite deber ocupar este pequeo espacio
7. Observe con los oculares, y ajuste el foco utilizando slo el micromtrico
8. Una vez terminada la observacin microscpica, LIMPIAR CUIDADOSAMENTE EL OBJETIVO,
RETIRANDO EL ACEITE CON UN PAPEL LIMPIALENTES (PAPEL SUAVE) IMPREGNADO
EN XILOL.
9.- Una vez terminado el trabajo prctico su microscopio debe quedar limpio y apagado, con la platina
abajo y el revlver puesto con el objetivo menor (4x)

TRABAJO PRCTICO N2
MORFOLOGA BACTERIANA
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es una preparacin slida o lquida hecha especficamente para el crecimiento,
almacenamiento o transporte de bacterias. Los medios lquidos pueden ser usados en tubos de ensayo o en
botellas de vidrio. Los medios slidos se obtienen de una solucin de nutrientes solidificada con agar
(polisacrido obtenido de ciertas algas marinas que acta como agente gelificante) o gelatina y se usan en
placas Petri. El agar es el agente gelificante ms comnmente usado ya que no es atacado por la mayora
de las bacterias y no se funde a 37C (T usada para la incubacin de las bacterias).
Los componentes esenciales, cualquiera sea el medio de cultivo y la variedad de microorganismos que se
desea cultivar, son: agua, componentes nitrogenados (protenas, aminocidos y/o sales inorgnicas que
contengan nitrgeno) y fuentes de energa (carbohidratos, protenas o sales inorgnicas).
Algunos Medios de cultivo muy utilizados en clnica:
- Agar nutriente (corriente): Es un medio bsico usado con propsitos generales para el cultivo de
muchos tipos de bacterias. Puede enriquecerse o hacerse selectivo por la adicin de sustancias adecuadas.
- Agar sangre: Es un medio enriquecido y diferencial. Se prepara en base a agar nutriente enriquecido con
5-10% de sangre. Es usado para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, como Bordetella
pertussis (agente causal de tos convulsiva) y tambin para detectar hemlisis. Al calentar el agar sangre a
70-80C hasta obtener un color caf se obtiene otro medio de cultivo denominado agar chocolate, que es
ms apropiado que el agar sangre para el crecimiento de ciertos patgenos, como por ejemplo Neisseria
gonorrhoeae.
- Agar McConkey: Es un medio selectivo y diferencial, ya que contiene sales biliares y cristal violeta para
inhibir el crecimiento de Gram + (selectivo) y lactosa para distinguir aquellas bacterias que la fermentan de
las que no (diferencial). En agar McConkey las bacterias entricas que utilizan lactosa (tales como E. coli)
forman colonias rojas debido a que los productos acdicos que se forman a partir de lactosa afectan el
indicador de pH del medio (rojo neutro); en cambio, las especies entricas que no usan lactosa (por
ejemplo muchas cepas de Salmonella spp.) forman colonias incoloras.
Clasificacin de los medios de cultivo
1.- Segn estado fsico:
a. Slidos (solidificados por adicin de agar al medio lquido o de alguna protena coagulada).
b. Lquidos
c. Semislidos

2.- Segn contenido nutricional:

a. Corrientes: bajo contenido nutricio (ej.: caldo de carne, agar, gelatina).
b. Mejorados (o enriquecidos): por adicin al medio corriente de: sangre, protenas, hidratos de carbono,
extracto de rganos o levadura.
c. Sintticos y mnimos: Los primeros son medios de frmula perfectamente conocida, en la cual se
emplean concentraciones exactas de sus componentes. Obedecen a propsitos bien definidos. Los
segundos son tambin sintticos, pero a su frmula que no permite el crecimiento bacteriano se le adiciona
uno o dos sustratos o elementos, sobre los cuales se desea conocer la actividad de una bacteria en estudio,
sin interferencia de otro elemento. Al adicionar el sustrato, la bacteria crecer slo si esa sustancia es
utilizada.
3.- Segn su empleo con propsitos de diagnstico o taxonmicos.
a. Selectivos: Son aqullos que permiten, a la vez que evitan o retardan, el crecimiento de otros
microorganismos. La seleccin se efecta mediante el control de los ingredientes del medio. ej.: cristal
violeta es selectivamente bacteriosttico para las bacterias Gram positivo, por lo tanto este colorante puede
ser incorporado a un medio para examinar patgenos entricos que son predominantemente bacilos Gram
negativo. ej.: Agar sangre con azida de sodio, agar Petragnani.
b. Diferenciales: Son medios nutricios que contienen un sustrato y un indicador de pH que permiten
apreciar si fue o no metabolizado este compuesto, lo cual permite con un conjunto de pruebas de este tipo
clasificar una bacteria, es lo que se llama "Taxonoma sobre base de pruebas bioqumicas".
Muchos de estos medios slidos diferenciales contienen uno o ms hidratos de carbono fermentables y un
indicador adecuado para la determinacin de la produccin de cidos o compuestos alcalinos. ej.: citrato
(Simmons), agar triple azcar hierro (TSI). Los cambios producidos en el medio por un organismo o grupo
de organismos son caractersticos, diferencindolos de este modo de otras cepas o grupos. Los medios
diferenciales permiten identificar reacciones de fermentacin de los cultivos puros de bacterias o su
capacidad para utilizar productos nutritivos. ej.: Voges-Proskauer, caldo urea.
c. Selectivo-diferencial: Contienen en una sola frmula los elementos de los medios selectivos y
diferenciales. De esta forma es posible observar el proceso de aislar y clasificar.
Ej.: Medio N 110 para Staphylococcus, ste contiene 7.5% de NaCl, en circunstancias que la
concentracin salina de la mayora de los medios es 0,25 a 0,5 g%. Este ingrediente evita el desarrollo de
casi todas las dems bacterias.
Adems, las pruebas de la gelatina y la fermentacin del manitol permiten diferenciar las diversas cepas de
Staphylococcus.
Otro medio selectivo-diferencial es el agar McConkey.
MORFOLOGA BACTERIANA: ANLISIS MICROSCPICO
La observacin al microscopio de las bacterias nos permite conocer una serie de caractersticas
complementarias a la morfologa de colonia entre las que encontramos: forma, disposicin o agrupacin,
presencia o ausencia de estructuras (cpsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.

Existen numerosas tcnicas para la observacin microscpica de los microorganismos. En el laboratorio

son fciles de realizar las siguientes:
1. Observacin de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teir, se utiliza el microscopio de
fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarroll para hacer posible observar clulas pequeas sin
teir. Se basa en utilizar y aumentar la pequea diferencia de ndice de refraccin que existe entre las
clulas y el medio que las circunda. Esta diferencia puede ser usada para crear una imagen con mucho
mayor contraste que la que se obtiene en el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente
objetivo especial y en el condensador se inserta un diafragma especial; adems para aumentar el contraste
se insertan filtros verdes o azules.
a. En fresco: Este mtodo de examen permite observar el microorganismo al estado vivo y evita las
deformaciones artificiales de su morfologa que producen las tcnicas de coloracin. Su aplicacin ms
importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.
b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenmeno de Tyndall, de reflexin luminosa. Para la observacin se
sustituye el condensador de Abb por el condensador de fondo oscuro, o de ultra. Se ilumina la
preparacin en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos directamente sobre los microorganismos sin
penetrar en el objetivo del microscopio. Se emplea para la observacin de bacterias muy pequeas o de
aquellas que difcilmente se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el
medio.
c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un lquido y depositar una gota
de la suspensin sobre un cubreobjeto el cual se coloca sobre un portaobjeto, luego se procede a la
observacin microscpica.
2. Observacin de bacterias muertas:
a. Tincin simple: Se utiliza un slo colorante para revelar la presencia de microorganismos y su forma en
general. Son de poco uso en bacteriologa.
b. Tincin negativa: Se tie el fondo mientras que las clulas permanecen sin teir (transparentes),
observndose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de este tipo de tincin es la tincin de
cpsula en la que se usa tinta china.
c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como nucleoide, flagelo,
esporas, etc.
d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre s, tanto en su estructura fsica como en su
composicin qumica, de modo que reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Estas tinciones
se utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La Tincin de Gram es la tincin diferencial
ms importante usada en bacteriologa. Otra muy utilizada es la Tincin de Ziehl Neelsen.
Algunas estructuras bacterianas que pueden ser diferenciadas por mtodos de tincin son esporas
y cpsula:
a. Observacin de esporas: Esta tincin es un ejemplo de tincin especial. Algunos gneros bacterianos
como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a condiciones
ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan

por ser altamente resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin. La resistencia de la espora se debe
a la estructura proteica (rica en aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin las hace
resistentes a tincin. Por este motivo las esporas se tien en caliente.
b. Observacin de cpsula: se trata de una tincin negativa usando tinta china que permite determinar la
presencia de cpsulas polisacardicas.
El estudio macro y microscpico de una muestra bacteriana permite obtener una orientacin preliminar de
su identidad y dirige al desarrollo de pruebas bioqumicas especficas que permitirn una identificacin
ms certera y precisa.
La tcnica de mayor importancia en el rea de la microbiologa, es la tincin de Gram (Figura N 2), pues
divide a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo y Gram negativo. Adems permite
diferenciar forma (cocos, bacilos) y la agrupacin bacteriana (pares, cadenas, racimos).
La tincin de Gram consiste en teir un frotis de bacterias con cristal violeta, y luego tratarlas con una
solucin mordiente (fijadora) de Yodo-Ioduro. Todas las bacterias se tien en estas condiciones. Sin
embargo, slo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente decolorante como
etanol o una solucin decolorante de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram
positivo; las que se decoloran son Gram negativo y para observarlas debern teirse con un colorante de
contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se vern de color violeta y las Gram negativo de
color rojo o rosado.
La diferencia en la reaccin frente a la tincin de Gram se debe a la diferencia en la composicin
qumica de las estructuras externas de las bacterias (pared celular). Las bacterias Gram positivo tienen
una capa gruesa de peptidoglicn o murena, mientras que las Gram negativo tienen menor cantidad
de peptidoglicn y tienen una membrana externa (adems de la membrana citoplasmtica). La
explicacin ms aceptada es que, luego de la accin de la solucin decolorante, las bacterias Gram
positivo son capaces de retener el colorante gracias al peptidoglicn. En cambio, las Gram negativo,
pierden parte de los lpidos de su membrana externa por accin del decolorante (un solvente orgnico
como por ejemplo alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicn, hace que se
decoloren. Es importante destacar que la etapa crtica en la tincin es la de decoloracin, por lo que se
debe tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.
Tambin es importante sealar que las bacterias Gram positivo pueden observarse como Gram negativo en
algunas condiciones: en cultivos viejos (de ms de 24 48 horas), a pH cido y en condiciones de
decoloracin muy prolongada.
Un gnero bacteriano que representa una excepcin a la tincin de Gram (no se tien) es Mycobacterium
(bacilos cido-alcohol resistentes), cuyas especies, como M. tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae
(Bacilo de Hansen) deben ser teidos con la tincin de Ziehl Neelsen.
Son bacterias que se tien con dificultad, pero una vez teidas, el colorante no se libera, an por accin de
decolorantes enrgicos como una solucin de alcohol y cido clorhdrico. Esta resistencia se debe a la gran
cantidad de lpidos que tiene su cubierta, incluyendo cidos grasos de alto peso molecular que constituyen
entre el 20 y 40% del peso seco de la bacteria. El contenido inusualmente alto en lpidos le confiere a este

grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias tienden a formar grumos en medio lquido),
resistencia a la accin de anticuerpos y complemento, crecimiento lento debido a la dificultad de absorcin
de nutrientes a travs de esta pared celular lipdica.

Figura N 2: Tcnica Tincin Gram.

1. Cubra el frotis con Cristal violeta por 2 minutos
2. Agregue solucin de lugol por 1min.
3. Decolore con alcohol-acetona y lave con agua
4. Cubra con safranina 1% por 1min. Lave con agua y seque con papel

Unin de auramina-rodamina al cido

miclico de la pared (fluorescencia amarilla)

Permanganato de Potasio

cidos miclicos de pared (fucsia)

Unin cido-alcohol resistente de fucsina a

Tie la pared de Bartonella (fucsia)

Tie el DNA bacteriano (fluorescencia naranja)

cidos miclicos de la pared (fucsia)

Unin cido resistente de fucsina a escasos

Auramina Rodamina

Fucsina, Alcohol Acido, Azul de Metileno

Ziehl-Neelsen

Auramina / rodamina

Fucsina, Verde de Malaquita

(fluorescencia)

Naranja de Acridina

Gimnez

Anaranjado de acridina

Fucsina, Acido Sulfrico, Azul de Metileno

Kinyoun

Gram negativo se tien con contraste (rojo)

Alcohol Acetona, Safranina

Tie la espora (verde)

Gram positivo retienen cristal violeta (azul)

Cristal Violeta, Lugol,

Verde de malaquita, Safranina

PRINCIPIO

REACTIVOS

Tincin de esporas

Gram

TINCIN

TABLA N 1: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones

(mayor sensibilidad que Ziehl Neelsen)

Micobacterias

Micobacterias (BAAR*)

de Chlamydia

Bartonella spp, corpsculo elemental

Bacterias Gram lbiles

Nocardia (BAA lbiles)

Esporas de bacilos Gram Positivo

Gram Positivo y Negativo

Clasificacin bacteriana clsica:

UTILIDAD

Utilidad clnica de la tincin de Gram:

Este examen permite al clnico sospechar el agente causal de una infeccin, que muchas veces sirve de
base para el inicio de terapia antibitica.
La sensibilidad analtica (nmero mnimo de bacterias que la tcnica puede detectar) es de 100.000 bacterias
/ml de muestra.
La sensibilidad clnica (probabilidad que un paciente que tenga una infeccin tenga un test positivo) vara
segn tipo de muestra:
Lquido cefalorraqudeo (meningitis) : 75 %
Lquido pleural (empiema pleural) : 50-80%
Lquido peritoneal (peritonitis) : 25-50%
Lquido articular (artritis sptica) : 50%
Se debe solicitar en toda muestra clnica
De gran importancia en infecciones mixtas por bacterias aerbicas y anaerbicas, pues si bien los anaerobios
no crecen en los medios habituales, s se observan en la tincin de Gram.

ACTIVIDADES PRCTICAS
Primera sesin prctica
OBJETIVOS
1. Sembrar y describir colonias bacterianas desarrolladas en medios de cultivo slido (Placas de Agar) de
acuerdo a criterios macroscpicos.
2. Practicar diferentes tinciones de frotis bacterianos: tincin de Gram, tincin de cpsula y tincin de esporas.
3. Observar endosporas y su disposicin en formas vegetativas de Bacillus spp.
4. Observar la presencia de cpsula en Klebsiella spp.
SIEMBRA DOS BACTERIAS EN DISTINTOS MEDIOS SOLIDOS
1.- Siembre mediante tcnica de aislamiento dos de las muestras disponibles en el laboratorio tanto en agar
sangre como en agar McConkey y deje incubar a 37C por 24hrs.
OBSERVACIONES MICROSCPICAS
1. Tincin de Esporas.
Procedimiento:
a. Con el asa, colocar una gota de agua (del tamao de una arveja) sobre el portaobjeto.
b. Esterilizar el asa y obtener una pequea muestra desde la placa de Bacillus spp.
c. Mezclar la muestra con la gota de agua y fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).
d. No olvidar esterilizar el asa despus de usarla.
e. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y, a continuacin agregar solucin colorante Verde de malaquita. El
colorante tiene que atravesar las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.
f. Esta tincin se realiza en caliente: con una pinza de madera debe colocar la muestra encima de la llama del
mechero hasta observar emisin de vapor durante 3 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra
o se rompa el portaobjeto.
g. Si la emisin de vapor desde la muestra cesa, hay que reponer el colorante nuevamente.
h. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde de malaquita y el papel.
i. Cubrir el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 1min.
j. Lavar con agua.
k. Secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con lente de inmersin.

D
Papel
Absorbente

Verde Malaquita

Safranina

Figura N 3: Procedimiento Tincin de Esporas.

Figura N 8: Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus

NOTA: Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamao que las bacterias) son
pequeas esferas verdes. Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas ltimas se
determina si se encuentran al centro o hacia un extremo de la clula y, si la espora deforma o no al bacilo.

2. Tincin de Cpsula.
Procedimiento:
a. En una esquina del portaobjeto colocar una gota de Tinta china del tamao de una arveja.
b. Esterilizar el asa y tomar parte del cultivo de la bacteria Klebsiella spp.
c. Mezclar la tinta china con la bacteria, esterilizar el asa y repetir 3 4 veces (slo agregar la bacteria). La
Tinta china impide ver si la solucin tiene o no suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con
suficiente cultivo.
d. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con Tinta china; asegrese de esterilizar el asa
previamente y de enfriar sta en las paredes del tubo.
e. Realizar un frotis extendiendo la suspensin de manera que quede una capa delgada. Esto se realiza
tomando un cubreobjeto y, esparciendo la mezcla a lo largo del portaobjeto que contiene la mezcla Tinta chinabacteria. Ver figura.
f. Fijar suavemente en el mechero.
g. Durante 3 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.
h. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersin.

F
E

Fucsina

Bacteria
s
Cpsula
Figura N 9: Procedimiento Tincin de Cpsula.

Segunda sesin prctica

1. Anlisis Macroscpico
Analisis macroscpico de las siembras en agar sangre y agar MacConkey, segn los criterios enlistados en la
figura N1.
2. Anlisis Microscpico mediante tincin de Gram
1. Realice tincin de Gram a las muestras que Ud. sembr y observe al microscopio.
Preparacin de frotis bacteriano a partir de una colonia.
a. Flamear el asa para su esterilizacin.
b. Colocar con el asa una gota de agua en el centro de la lmina (aprox. 0,5 cm de dimetro).
c. Flamear el asa para su esterilizacin.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequea muestra desde la placa.
f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del portaobjeto.
g. Fijar el frotis exponindolo a la llama del mechero hasta que se seque.
Tincin frotis mediante Gram
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no est demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta y dejar en reposo por 2 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solucin de Lugol. Dejar con Lugol por 1 min.
d. Lavar el lugol alternativamente con alcohol-acetona y agua dejando escurrir suavemente, hasta que se
decolore completamente. (Debe primero lavar con el decolorante alcohol-acetona y luego con agua)
e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
2. Observar en el microscopio ptico con aumento de 100X y aceite de inmersin. Caracterizar segn criterios
microscpicos (afinidad tintorial, morfologa y agrupacin) los microorganismos.

TRABAJO PRCTICO N3
FLORA NORMAL Y MUESTRAS CLNICAS DE
BACTERIAS GRAM POSITIVO
Como en la mayora de los animales, el organismo humano posee lugares que normalmente se
mantienen estriles y otros donde cohabitan, tambin normalmente, una gran diversidad y una cantidad
sorprendente de microorganismos, an en las personas ms sanas. La sangre, el lquido cefalorraqudeo, la
mdula sea y las vas areas inferiores (bronquios y alvolos), entre muchos otros, carecen de
microorganismos debido a los mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos,
vagina, odos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la flora normal
(microbiota comensal) del ser humano.
La colonizacin microbiana del individuo, comienza con el nacimiento. Los primeros
microorganismos en establecerse son aquellos transferidos desde la vagina materna y del rea perineal, hacia la
piel, la boca, la nariz y regin farngea del nio. Las biotas caractersticas de stas y otras reas, se desarrollan
posteriormente y probablemente se derivan y seleccionan de diversas fuentes ambientales.
Zona del intestino inferior: Rico en gran cantidad de sustancias alimenticias, que favorecen el crecimiento de
saprfitos.
Zona boca, regin orofarngea y vulva: Con sustancias provenientes del exterior o acumulacin de restos
celulares, o bien gran cantidad de pliegues que favorecen la existencia de anaerobios.
Zona de la piel: Que difiere de los otros ambientes por su menor humedad y alto contenido lipdico, que tiende
a seleccionar una biota algo diferente.
Se debe enfatizar que los anaerobios estrictos exceden en nmero a las formas facultativas y aerobias por un
factor de 10 a 100 o ms. Existe una interaccin permanente entre los componentes de la flora y el hospedero,
que provoca fluctuaciones en la biota, tanto cualitativas como cuantitativas. Los efectos de estas fluctuaciones
incluyen los beneficiosos, inaparentes, hasta los perjudiciales.
Algunos de los microorganismos ms frecuentemente encontrados en los cultivos de las diferentes regiones del
cuerpo y, que se consideran integrantes de la flora normal, son: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, bacterias coliformes como Escherichia coli, Proteus
mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, bacteroides, espiroquetas, lactobacilos y, clostridios como Clostridium
tetani.
La flora transitoria de la piel se encuentra representada principalmente por bacterias Gram positivo, como
Streptococcus del grupo A, Staphylococcus aureus y, flora fngica como Candida albicans.
Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa a travs de la nasofaringe, la
trquea y los bronquios; la mayora de estos microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y
deglutidos. As, los senos nasales, la trquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estriles. La

nasofaringe es el hbitat natural de bacterias y virus patgenos que causan infecciones en la nariz, garganta,
bronquios y pulmones.
Algunas personas se convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos descargando estos
microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.
Normalmente existe un equilibrio entre los microorganismos de la flora y el hospedero; sin embargo este
equilibrio puede romperse por:
- Aumento de la masa crtica
- Traslado desde el sitio original
- Ruptura de barreras mecnicas por traumatismos.
Esto produce una proliferacin e invasin de los microorganismos, dando origen a una infeccin endgena. Por
lo general, se requieren algunos determinantes para que se produzcan estas enfermedades, como son:
- Deficiencia en el estado inmunitario del husped.
- Tratamiento inmunosupresor o con corticoides.
- Cirugas.
- Uso de antibiticos.
Como ejemplos de infeccin endgena se pueden mencionar:
- Infeccin urinaria por Enterobacterias.
- Endocarditis bacteriana por microorganismos de la boca (Streptococcus grupo viridans)
- Diarrea por sobreinfeccin de Clostridium difficile, debido al uso prolongado de antibiticios.
ETAPAS DEL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO
Para llegar a la identificacin de una bacteria es necesario seguir una serie de pasos. El primero implica la toma
de muestra, siguiendo los procedimientos adecuados segn la sospecha clnica.
El segundo paso corresponde al examen microscpico directo, con o sin tincin.
El tercer paso es el aislamiento del agente, para lo cual se debe disponer de medios de cultivo adecuados donde
la muestra y las bacterias, que sta pudiese o no contener, puedan encontrar los nutrientes y factores adecuados
para propiciar su crecimiento y desarrollo.
El cuarto paso consiste en identificar el agente, para ello se recurrir a determinar su morfologa bacteriana
como su posible agrupacin, y se aplicar distintas pruebas bioqumicas y fisiolgicas destinadas a conocer sus
caractersticas metablicas.
Por ltimo se debe realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana.

TOMA DE MUESTRA
EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO
(Gram o Ziehl-Neelsen)
AISLAMIENTO DEL AGENTE
IDENTIFICACIN FISIOTAXONMICA DEL AGENTE
Tincin: Morfologa y agrupacin
Pruebas Bioqumicas
SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA
INFORME
SELECCIN, RECOLECCION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA ESTUDIOS
MICROBIOLGICOS
En la recuperacin del o los microorganismos causantes de la infeccin, lo ms importante es la correcta
recoleccin de una muestra para su estudio microbiolgico.
Esta recoleccin comprende cuatros pasos importantes:
1.

Seleccionar el sitio anatmico ms adecuado para tomar la muestra.

2.

Usar la tcnica ms apropiada.

3.

Poner la muestra recolectada en un envase que favorezca la viabilidad de los microorganismos

causantes del proceso infeccioso, y que adems impida la filtracin o derrame de la muestra,
como medida de proteccin para el personal que posteriormente la manipula.

4.

Enviar la muestra en forma rpida y expedita al laboratorio, y en el caso de que esto no sea
posible, asegurarse que sea almacenada a la temperatura y en los medios de transporte adecuados.

Una muestra mal recolectada puede inducir a error en el aislamiento del microorganismo etiolgico real, y la
recuperacin de contaminantes puede llevar a indicar una antibioticoterapia incorrecta y a veces incluso
perjudicial. Debe recordarse entonces, que la calidad del trabajo realizado en el laboratorio no puede ser
superior a la calidad de la muestra recibida.
Ya que el proceso de toma de muestra se inicia al lado del paciente siendo ste parte activa, es necesario
explicarle el porqu del procedimiento y el tipo de tcnica a realizar, para lograr as su colaboracin y
participacin, lo que lleva a la obtencin de la muestra en ptimas condiciones.
Recoleccin y transporte de la muestras:
Preparacin del sitio. En todos aquellos casos en que la muestra se obtenga con aguja o por aspiracin, se
debe desinfectar la piel. Esto se logra limpiando la piel con alcohol al 70%, seguido por povidona yodada, la

que se deja actuar un minuto (esperando que se seque). Si el paciente presenta hipersensibilidad al yodo, se
debe usar solo alcohol.
Volumen. Si es posible obtener muestras lquidas (mediante aguja o aspiracin) no debieran usarse trulas. El
volumen de muestra que se enva al laboratorio es generalmente menor de lo requerido. No existe consenso
sobre los volmenes mnimos para cada tipo de muestra.
Envase y aparatos recolectores. Existen diferentes mtodos de recoleccin, desde la trula hasta aparatos
recolectores de muestra.
Las trulas deben ser de un material que no inhiba el crecimiento bacteriano (alginato de calcio o polyster).
stas, luego de tomada la muestra, se introduce en un envase estril con un medio de transporte. Para muestras
lquidas, lo ms adecuado es usar envases plsticos estriles, o tubos con tapa rosca.
Tcnicas de recoleccin. Con el fin de obtener una muestra ptima para la recuperacin del agente etiolgico
es necesario seguir las instrucciones dadas ms adelante.
Medio de transporte. No deben usarse trulas sin medio de transporte (excepto para ciertas tcnicas
especficas) porque esto lleva a la desecacin de la muestra y a la prdida de la viabilidad bacteriana. Los
medios de transportes recomendados cuando se usan trulas, en el caso de las secreciones, son del tipo tampn
(Stuart, Amies). Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es til para suprimir
cambios oxidativos en el medio de transporte,. De esta manera se favorece la viabilidad de los
microorganismos durante su envo al laboratorio.
PROCEDIMIENTOS DE ENFERMERIA EN LA TOMA DE MUESTRAS MICROBIOLOGICAS DE
DISTINTAS ZONAS ANATOMICAS
INFECCION TRACTO URINARIO (ITU)
(Orina, secrecin uretral y prosttica)
UROCULTIVOS
Muestra Miccional: Realizar aseo perineal prolijo, separando los labios en la mujer y retrayendo el prepucio
en el varn durante el procedimiento. Eliminar el primer chorro de orina, a fin de arrastrar mecnicamente la
flora externa del tracto genitourinario.
Recibir 2 a 3 ml del segundo chorro en receptculo estril y sin interrumpir la miccin. Tener presente de
poner un tapn vaginal en la mujer a fin de evitar contaminacin con la flora vaginal.
Con el objeto de no alterar el recuento bacteriano la muestra debe ser sembrada dentro de las primeras dos
horas de tomada. Debe mantenerse refrigerada a 4C y trasladarla manteniendo la cadena de fro.
Muestra por puncin de catter urinario: Desinfectar el sitio de puncin del segmento proximal del catter
con alcohol 70%, aspirar con jeringa estril entre 2 a 5 ml de orina, vaciar en tubo estril y transportarla al
laboratorio de la misma forma que la muestra miccional.
Muestras por puncin suprapbica: Antisepsia de la piel en el sitio de puncin, aspirar con tcnica asptica
entre 2 a 5 ml de orina y proceder a su traslado al laboratorio de igual forma que los casos anteriores.

Secrecin uretral: Previo aseo genital, exprimir uretra y recibir la secrecin en trula estril, colocar en medio
de transporte y enviar a estudio. La muestra debe tomarse a primera hora de la maana o despus de una hora
de orinar.
Secrecin prosttica:
La tcnica de recoleccin es exprimir la prstata a travs de un masaje prosttico por va rectal e impregnar una
trula estril con el fluido obtenido. Colocar en medio de transporte.
INFECCION RESPIRATORIA INFERIOR (IRI)
(Neumona, TBC)
TOMA DE MUESTRAS NO INVASIVAS
Previo a la toma de muestra, realizar aseo bucal y posterior a tos voluntaria profunda recoger la muestra en
receptculos estriles o placa de Petri, Enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible mantenerla
refrigerada transitoriamente a 4 C por no ms de dos horas. Es recomendable facilitar la expectoracin con
kinesiterapia respiratoria o drenaje postural. En pacientes intubados realizar la aspiracin endotraqueal con
sonda estril y tcnica asptica, introducirla evitando su contaminacin con grmenes exgenos y aspirar
depositando el contenido en tubo estril para su estudio que puede ser cualitativo o cuantitativo. Este ltimo
tiene mejor perfil de especificidad, por cuanto se debe de rigor al momento de realizar el diagnstico etiolgico
en pacientes conectados a ventilacin mecnica.
TOMA DE MUESTRAS INVASIVAS
Cuando se trata de identificar el agente etiolgico de neumona nosocomial, las muestras que tienen mejor
rendimiento; pero tambin mayores riesgos para el paciente, son aquellas tomadas por broncoscopas (lavado
broncoalveolar, aspirado telescopado protegido), Toracocentesis y Biopsia.
Lavado bronqueoalveolar: Realizar el procedimiento a travs de broncoscopa y con tcnica asptica aspirar
entre 15 a 50 ml de lavado. Transportarlas de inmediato en tubo estril al laboratorio para su estudio.
Aspirado telescopado protegido: Por broncoscopa introducir cepillo a travs del catter protegido frotar la
zona alterada y enviar en tubo estril de inmediato al laboratorio para estudio semicuantitativo. *
Toracocentesis: Realizar el procedimiento con tcnica asptica, aspirar 10 ml si es posible. Transportar de
inmediato al laboratorio para su estudio.
Biopsia pulmonar: realizar el procedimiento con tcnica asptica, enviar un trocito de tejido en tubo estril o
en medio de transporte con caldo especfico. Trasladar la muestra de inmediato para su estudio.
*Corte recomendado para cultivos cuantitativos en secreciones respiratorias para neumona es:
Con recuento > 10 elevado a 6 UFC/ml en muestra por aspirado traqueal
Con recuento > 10 elevado a 3 UFC/ml en muestra por cepillado protegido
Con recuento > 10 elevado a 4 UFC/ml en muestra por lavado bronqueoalveolar
INFECCION RESPIRATORIA ALTA (IRA)
Secrecin farngea: Deprimir la lengua y frotar con trula estril amgdalas, pilares anteriores y pared
posterior de la faringe. Colocar en el medio de transporte y enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible
la muestra se mantiene transitoriamente a temperatura ambiente.

Secrecin nasal: Introducir trula estril ms o menos 2,5 cms en mucosa nasal, rotar y colocar en medio de
transporte. Enviar al laboratorio de inmediato o mantener la muestra transitoriamente a temperatura ambiente
INFECCION DE HERIDA OPERATORIA (IHO)
(Superficial, profunda abscesos cerrados)
Infeccin superficial: son aquellas que comprometen dermis, epidermis y celular subcutneo.
Infeccin profunda: son aquellas que incluyen fascia y msculo, pudiendo comprometer o no cavidades u
rganos.
Toma de muestra superficial: Limpiar la herida con suero fisiolgico o Ringer, frotar con trula estril el
centro y los bordes internos de la superficie cruenta, colocar en medio de transporte y enviar al laboratorio para
su siembra y estudio
Toma de muestra profunda: Limpiar la superficie cruenta con suero fisiolgico o Ringer, tomar la muestra
con trula de la parte ms profunda de la herida, colocar en medio de transporte y enviarla al laboratorio.
Si se sospecha anaerobios: Desinfectar con antispticos la superficie y los bordes de la herida, aspirar de la
zona profunda de la herida 0,5 ml de secrecin y enviar en la misma jeringa sellada al laboratorio, teniendo la
precaucin de eliminar toda burbuja de aire de su interior.
Si no es posible aspirar material, introducir trula en lo ms profundo de la herida y colocarla en tioglicolato.
De mayor rendimiento que lo anterior es tomar un trocito de tejido (6 mm) con pinza estril y dejarlo caer en el
tioglicolato o en suero fisiolgico e incluso en tubo estril sin ningn preservante.
Abscesos cerrados: Desinfectar el sitio de puncin con antisptico, aspirar material en lo posible 10 ml y
vaciar a tubo estril para enviar al laboratorio. Si se sospecha de anaerobios enviar en la misma jeringa sellada,
eliminando todo el aire remanente.
COMENTARIO
Las muestras de pus tienen muy mal rendimiento, ya que el pH cido de este material destruye rpidamente los
microorganismos, siendo difcil su aislamiento posterior a la siembra.
INFECCIONES SUPERFICIALES DE PIEL Y MUCOSAS
Secrecin conjuntival: Limpiar la superficie externa del ojo con suero estril, frotar con trula humedecida el
borde interno de la conjuntiva y colocarla en el medio de transporte para su envo al laboratorio.
Secrecin tica: Limpiar el canal auditivo con jabn antisptico, tomar la muestra con trula estril y
colocarla en el medio de transporte para su envo al laboratorio.
Secrecin umbilical RN: Tomar muestra directa de la zona umbilical sin previa limpieza, colocar en medio de
transporte y enviar al laboratorio.
COMENTARIO.
Las muestras tomadas por puncin ocular u tica deben ser enviadas en la misma jeringa o en caldo de cultivo
tioglicolato.

INFECCIONES GINECO OBSTETRICAS

Endocervix: Previo aseo genital, introducir trula hacia el canal cervical y rotar, colocar la trula en medio de
transporte y enviar al laboratorio. Si se sospecha de Neisseria gonorrhoeae (gonococo), inocular en placa de
Thayer Martin en Z la que debe ser solicitada previamente al laboratorio para su siembra inmediata. Enviar al
laboratorio en receptculo con una fuente que consuma oxigeno.
Endometritis: A travs de especulo y previo aseo genital, aspirar muestra con jeringa con catter protegido.
Enviar de inmediato en la misma jeringa tapada o dejar caer el exudado en tioglicolato. NO REFRIGERAR.
Douglas: Aspirar por puncin del fondo de saco vaginal previo aseo genital. Enviar en la misma jeringa tapada
como para estudio de anaerobios.
Secreciones vaginales: Para estudio bacteriolgico y de hongos. A travs de un especulo frotar con trula
estril la mucosa vaginal e impregnarla de flujo de los fondos de saco, colocar en medio de transporte y enviar
al laboratorio.
Para Trichomonas, introducir suero fisiolgico tibio, recoger y vaciar en tubo estril de 3 a 5 ml. Enviar de
inmediato al laboratorio.
Lquido Amnitico: Obtener por puncin, previa desinfeccin con antisptico y enviar al laboratorio en la
misma jeringa o en tubo estril entre 5 a 10 ml de muestra.
Placenta y tejidos fetales: Durante el acto quirrgico, obtener tejido o aspirados. Enviar en tubo estril o caldo
tioglicolato como para estudio de anaerobios.
Trompas y ovarios: Obtener muestra durante la ciruga y enviar tejido o aspirado de la misma forma que para
estudio de anaerobios.
COMENTARIO
En caso de Endometritis Puerperal, los cultivos microbiolgicos no son necesarios para su notificacin ya que
es suficiente el criterio clnico, por otra parte la etiologa es polimicrobiana y predecible.
En caso de brotes de endometritis puerperal, los cultivos se realizan a fin de detectar Streptococcus beta
hemolitico grupo A u otro agente no habitual.
MUESTRAS DE FLUIDOS, CAVIDADES NORMALMENTE ESTERILES Y CATETERES
Lquido cefalorraqudeo
Previa desinfeccin de la zona con antisptico y con tcnica asptica, obtener entre 2 a 3 ml de muestra y en
tubo estril enviar de inmediato al laboratorio, si no es posible enviarla al momento, transitoriamente debe
mantenerse a temperatura ambiente. NO REFRIGERAR.
Lquido asctico
Aspirar idealmente 10 ml de muestra a travs de puncin abdominal con tcnica asptica, vaciar a frasco de
hemocultivo y simultneamente 1 ml en tubo estril seco para tincin en laboratorio.
Lecha Materna
Limpiar el pezn previo a extraccin de la muestra, descartar los primeros ml y recoger entre 2 a 5 ml en tubo
estril. Enviar de inmediato al laboratorio.
Cateter

La cateterizacin venosa se define como la insercin de un catter biocompatible en el espacio intravascular,

central o perifrico, con el fin de administrar soluciones, medicamentos, nutricin parenteral, medios de
contraste y realizar pruebas diagnsticas, entre otros.
Para cultivar catteres vasculares, existen 2 tcnicas.
1.- Cortar de forma asptica la punta del catter e introducirla en un tubo con caldo corriente. Esta tcnica tiene
la desventaja de que no es posible realizar el recuento de colonias, y por lo cual, no se puede asegurar que en
un cultivo positivo en estas condiciones, no corresponda a una contaminacin con flora de piel.
2.- Cortar de forma asptica la punta y el segmento intracutneo del catter. Introducir en un frasco o tubo
estril y enviar al laboratorio antes de 2 horas. En el laboratorio y usando una pinza estril, hacer rodar el
catter sobre una placa de agar sangre, al menos 4 veces hacia adelante y hacia atrs (tcnica de Maki). Es una
tcnica semicuantitativa que permite realizar el recuento de colonias y, basndose en este recuento, determinar
con mayor exactitud si un cultivo positivo corresponde a contaminacin con flora de piel o a infeccin
relacionada con el catter.

Figura N 10: Catter venoso central tunelizado. Catter venoso central implantable.
INFECCION GASTRO INTESTINAL (IGI)
Coprocultivos
Introducir trula limpia en la zona ms alterada de las deposiciones recin emitidas (mucus o sangre) y
colocarlas en el medio de transporte (tubo tapa roja). Las muestras pueden tomarse directamente del recto, del
paal o receptculo limpio.
Para leucocitos fecales: Enviar deposiciones frescas en tubo limpio y seco sin medio de transporte. Las
muestras tomadas por rectoscopa o colonoscopas tienen mayor rendimiento, por cuanto de ser posible es
recomendable obtener las muestras de esta forma.
Para Clostridium difficile: Enviar 5 a 10 ml de deposiciones recin emitidas en tubo o frasco limpio y seco.
Aspirado gstrico en RN
Aspirar por sonda nasogstrica de 1 a 3 ml de contenido y colocar en tubo estril. Slo se justifica esta muestra
en las primeras 24 horas de vida.

FISIOTAXONOMA DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

La fisiologa bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a travs de las alteraciones
que se producen en el medio de cultivo. Estas manifestaciones han permitido establecer diferencias entre ellas,
las que han sido utilizadas en su clasificacin en diferentes gneros y especies.
Las tcnicas de identificacin bioqumica de las bacterias diferencian gneros y especies bacterianos
en base a la deteccin de:
a. Utilizacin de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol, Sorbitol, Citrato.
b. Formacin de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano: Indol, CO2, cido
sulfhdrico (H2S), Acetilmetilcarbinol.
c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa.
d. Sensibilidad a compuestos qumicos o antibiticos: Bacitracina, Optoquina, Novobiocina.
Para cocceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos ltimos mtodos, en cambio para
bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.
En este trabajo se analizarn dos de las Familias de Bacterias Gram positivo ms importantes, como son las
Micrococcaceae y Streptococcaceae (figura 1).
La Familia Micrococcaceae comprende los gneros Micrococcus, Staphylococcus y Planococcus. Son
bacterias Gram positivo, esfricas (cocos) agrupadas en racimo. Son catalasa positivo, reaccin que diferencia
la Familia Micrococcaceae de otros cocos Gram positivo como Streptococcus.

Agrupacin de
algunas cocceas
Gram +

Las especies del gnero Micrococcus son saprfitas, se encuentran habitualmente en la piel de mamferos, en
el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del gnero

Staphylococcus que son aerobios o anaerobios facultativos. Otra caracterstica que diferencia ambos gneros,
es la propiedad de Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no as los Micrococcus que no tienen
esta propiedad (Tabla 1).
Las principales especies del gnero Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus aureus es patgeno para el hombre. Produce una variedad de toxinas y enzimas responsables
de su patogenicidad. Algunas enzimas son:
a. Hialuronidasa: Rompe el cemento celular facilitando la invasin de los tejidos por las bacterias.
b. Fibrinolisina: Disgrega cogulos de fibrina.
c. Coagulasa: Secretadas al medio extracelular y otras permanecen unidas a membrana, coagulando el plasma.
d. Nucleasas: Hidrolizan DNA.
Las toxinas producidas por S. aureus causan los sntomas asociados a las enfermedades estafiloccicas. Estas
toxinas son:
a. Alfa toxina: hemolisina que produce lisis total de los glbulos rojos. Es una protena antignica de peso
molecular 30.000.
b. Leucocidina o toxina de Panton - Valentine. Causa desgranulacin de los leucocitos y macrfagos.
c. Exfoliatina: producida por algunas cepas. Causa el sndrome de piel quemada.
d. Enterotoxinas: producida por algunas cepas. Causan intoxicaciones alimentarias.
Aislamiento y Caracterizacin:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depende de si la muestra es un alimento o una
muestra clnica.
Para muestras clnicas como pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:
a. AGAR SANGRE: medio enriquecido y diferencial que contiene sangre desfibrinada de cordero o conejo.
Permite el abundante desarrollo de las especies de Staphylococcus y adems visualizar la produccin de
hemolisinas, por lisis de los glbulos rojos alrededor de las colonias (figura 2).
S. aureus: produce halos de hemlisis completa alrededor de las colonias, producida por la alfa toxina.
S. epidermidis : no produce hemlisis o lo hace dbilmente.
Micrococcus: no produce hemlisis.

Tipos de hemlisis en agar sangre

b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN: medio selectivo y diferencial que contiene
manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es
decir, son capaces de crecer en esta concentracin de NaCl. Adems se evidencia la fermentacin de manitol,
la que se observa por el viraje del indicador a amarillo.
S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla (producto de la fermentacin)
S. epidermidis: generalmente no fermenta el manitol
Micrococcus: no fermenta el manitol.
En ambos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar mediante tincin de Gram la
presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y caractersticas en medios selectivos se realiza
las pruebas bioqumicas para confirmar el diagnstico. Si se sospecha que la colonia corresponde a
Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de COAGULASA.
La enzima es un activador del fibringeno a fibrina, adems, la pared de Staphylococcus aureus posee receptor
de fibringeno lo que permite la formacin de puentes entre bacteria y bacteria, formndose un cogulo.
Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.
sta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas, segn el tipo de enzima:
a) Tcnica en tubo: detecta la coagulasa libre. Consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo
lquido de Staphylococcus. La reaccin positiva se observa como la aparicin de un cogulo a las 4 horas.
b) Tcnica en portaobjeto: detecta la coagulasa unida a membrana. A partir de un cultivo de Staphylococcus
en medio slido, se hace una suspensin abundante sobre una gota de agua. Esta suspensin debe ser lo ms
homognea posible. Sobre sta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reaccin
positiva se observa como aglutinacin de las bacterias a los 20 segundos. Comercialmente, existe un kit de
aglutinacin, que ser empleado en el laboratorio.
Test comercial de aglutinacin: sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus. La
metodologa consiste en poner una gota de un reactivo latex sobre un crculo de la tarjeta; a continuacin se

emulsiona sobre sta la colonia sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formacin de grumos
visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo includo en el kit (figura 3).

Partculas de latex con

anticuerpo
Anticuerpo (Antgeno especfico)

Bacterias

Aglutinacin de las partculas

= reconocen el antgeno bacteriano.(protena A)

A su vez el Gnero Streptococcus corresponde a cocos Gram positivo, anaerobios facultativos que se disponen
en pares o cadenas y son catalasa negativo reaccin que los diferencia de la Familia Micrococcaceae. Bajo
ciertas condiciones de cultivo las clulas son ovoides o alargadas. Se encuentran en diferentes superficies y
mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies
son utilizadas en la industria lechera para la elaboracin de quesos, leches fermentadas y yoghurt
(Streptococcus lactis).
Los miembros del gnero Streptococcus se clasifican de acuerdo a:
1.- ACTIVIDAD HEMOLTICA: segn el tipo de hemlisis que presenten al ser cultivadas en placas de agar
sangre de conejo o de cordero.
a) Beta hemolticos: producen halos limpios de hemlisis alrededor de las colonias.
b) Alfa hemolticos: producen halos de hemlisis incompleta de color verdoso (S. viridans) alrededor de las
colonias.
c) Gama hemolticos: no producen hemlisis
2.-SEGN CONSTITUCIN ANTIGNICA DE LA PARED CELULAR: clasificacin de Lancefield. Se
basa en la composicin qumica y antignica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite
clasificar a los Streptococcus spp. en grupos serolgicos que van desde la A hasta la U.
Ambas clasificaciones se asocian entre s, as tenemos por ejemplo estreptococos beta hemolticos del grupo
A como Streptococcus pyogenes, que es el ms patgeno del gnero.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patgeno. Es el agente
causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Adems provoca enfermedades
sistmicas como fiebre puerperal y escarlatina.

Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este gnero, agente causante de
neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esfrico, tiene forma de cabeza de lanza
(lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cpsula. Es habitante normal de la faringe del
hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En agar sangre S.
pneumoniae presenta alfa hemlisis y las colonias son planas con forma de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium). Existen
otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les conoce con el nombre
de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente son no hemolticos y pueden
crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH bsico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que otros
estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminacin fecal.
Aislamiento y Caracterizacin:
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efecta sembrando la muestra sobre una placa de agar sangre.
Streptococcus pyogenes presenta las siguientes caractersticas:
1. Hemlisis en placa de agar sangre. Se observa hemlisis limpia alrededor de las colonias, las cuales son
muy pequeas.
Se debe confirmar mediante tincin de Gram la presencia de cocos Gram positivo en cadena, ya que otras
especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se
realiza pruebas adicionales para confirmar el diagnstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los Streptococcus spp. beta hemolticos del grupo A (Streptococcus
pyogenes) son sensibles a Bacitracina, esta prueba se realiza en forma similar a un antibiograma. Otros
Streptococcus spp. tambin son sensibles, sin embargo no son beta hemolticos.
b) Pruebas serolgicas. El diagnstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante reacciones
serolgicas con antisueros especficos para el antgeno superficial.
c) Bilis/Esculina, NaCl 6,5%:
Los Enterococcus crecen en presencia de NaCl 6.5%, toleran las salas biliares y pueden hidrolizar la esculina.
Estas propiedades se pueden usar para distinguir los Enterococcus de otros cocos Gram (+) catalasa-negativo.
En la prueba positiva, el tubo donde est el medio se torna de color chocolate oscuro, caracterstico al
desdoblar la bilis esculina.

d) Test de CAMP. La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del
fenmeno
La mayora de los Streptococcus grupo B producen una protena extracelular difusible (factor CAMP), la que
acta sinrgicamente con la beta-hemolisina producidas por algunas cepas de Staphylococcus aureus causando
la hemlisis de los eritrocitos. Sobre una placa de agar sangre se inocula los Streptococcus en estudio trazando
estras perpendiculares a una estra central de Staphylococcus aureus. Tras la incubacin se observa la
presencia de una zona hemoltica en forma de punta de flecha en el rea de interseccin, donde el factor CAMP
y la beta-hemolisina han difundido (prueba de CAMP positiva). Aproximadamente el 95% de los
Streptococcus del grupo B y de forma ocasional unas cepas de otros grupos son CAMP-positivos.

Test de susceptibilidad a agentes antimicrobianos:

Mtodo de Difusin en Agar o Kirby-Bauer
Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos antimicrobianos. Este mtodo
cualitativo se basa en la inoculacin del microorganismo sobre una placa de agar donde se coloca discos de
papel filtro estriles impregnados con una concentracin conocida de antibitico.
Para que los resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas condiciones de
laboratorio:
a) Concentracin de bacterias que se siembra. Requiere uso de estndares de turbidez: Mac Farland 0.5
b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mller-Hinton o agar Mller-Hinton Sangre para Streptococcus
c) Concentracin del antimicrobiano en el disco: caracterstica para cada antimicrobiano.
d) Temperatura (37C), tiempo de incubacin (16-24 horas) y atmsfera de incubacin (en O2)
A partir de una colonia aislada (es absolutamente necesario un cultivo puro), se prepara una suspensin
bacteriana con una turbidez equivalente a un Mac Farland 0.5. La siembra de la suspensin debe ser
homognea sobre el agar (figura 4).
El antibitico en los discos difunde radialmente durante la incubacin de tal manera que a medida que se aleja
del disco, la concentracin disminuye. En un punto determinado, la concentracin del antibitico no podr

inhibir el crecimiento del microorganismo, producindose entonces una zona circular de inhibicin (halo de
inhibicin) alrededor del disco. El dimetro del rea de inhibicin puede ser convertido a las categoras de
susceptible, intermedio o resistente de acuerdo a las tablas publicadas por el National Committee for
Clinical Laboratories Standars (NCCLS).

Figura N 11: Antibiograma mediante la tcnica de

difusin con discos

Bacitracina: Se siembra una placa de agar sangre homogneamente. Se coloca un disco de bacitracina, se
incuba 16-24 horas y despus se mide el tamao del halo.
Se considera sensible cuando existe un halo de inhibicin 10 mm de dimetro y resistente cuando el halo de
inhibicin es < 10 mm de dimetro.
Micrococcus es sensible a bacitracina.
Staphylococcus es resistente a bacitracina.
Optoquina: compuesto qumico que pone a prueba la fragilidad de la membrana celular bacteriana. A bajas
concentraciones (5g/ml) permite diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otros Streptococcus
hemolticos. El disco de Optoquina se deposita en una placa de agar sangre, sembrada homogneamente con la
colonia sospechosa. Se incuba a 37C por 24 horas. Si el halo es 14 mm, corresponde a Streptococcus
pneumoniae.
Novobiocina: antibitico activo por va oral. Se utiliza para el tratamiento de infecciones por S. aureus e
infecciones urinarias resistentes a otros frmacos. Es bacteriosttica e interfiere con la sntesis de la pared
bacteriana. Este frmaco se utiliza muy poco debido a que su uso est asociado a una alta incidencia de
reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes. Se considera sensible cuando existe un
halo de inhibicin 16 mm de dimetro y resistente cuando el halo de inhibicin es < 16 mm de dimetro.
Amoxicilina / cido Clavulnico: esta asociacin se indica para el tratamiento a corto plazo de infecciones
bacterianas en las siguientes localizaciones, cuando se sospecha que estn causadas por cepas resistentes a
Amoxicilina y productoras de beta-lactamasas. En otras situaciones, debera considerarse la Amoxicilina sola.

Infecciones del tracto respiratorio superior; en particular sinusitis, otitis media, amigdalitis recurrente. Estas
infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella
catarrhalis y Streptococcus pyogenes.
Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas de bronquitis crnicas,
bronconeumonia. stas son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y
Moraxella catarrhalis.
Infecciones del tracto genitourinario e infecciones abdominales, en particular cistitis (especialmente cuando
sea recurrente o complicada, excluyendo prostatitis), aborto sptico, sepsis plvica o puerperal y sepsis
intraabdominal. Son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente Escherichia coli,
Staphylococcus saprophyticus spp. y Enterococcus spp.)
Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de animales y abscesos dentales
con celulitis diseminada que son a menudo producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y
Bacteroides spp. Algunas cepas de estos grmenes producen beta-lactamasas, de modo que no responden a
Amoxicilina sola.
NOTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar

(-)

R
Staphylococcus
saprophyticus

Test de Novobiocina

Staphylococcus
Coagulasa negativo

S. Coagulasa negativo
No saprophyticus

Staphylococcus aureus

(+)

Micrococcus

Enterococcus

Bilis positivo
NaCl positivo

Streptococcus
grupo viridans

Optoquina
resistente

Streptococcus
pneumoniae

Optoquina
sensible

Hemlisis
Alfa

Enterococcus

Bilis Esculina
NaCl 6,5 %

Test de Latex

Streptococcus
Grupo A, B, C,
D, F, G

Hemlisis
Gamma

Hemlisis
Beta

Observar Hemlisis

Streptococcus
S

Test de Bacitracina

Test de Coagulasa

Negativo

Bacilo en empalizada

Bacilos finos

Bacilos Grandes
Esporulados
Bordes netos

Aspecto Tincin Gram

Catalasa positivo

Catalasa

Positivo

Bacilos

Cocaceas

TABLA DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Corynebacterium sp

Listeria

Bacillus sp

ACTIVIDADES PRCTICAS
Objetivos
1. Conocer la importancia de una buena toma de muestra
2. Conocer y practicar el procesamiento microbiolgico de cocceas Gram positivo aisladas a partir de
muestras clnicas as como de flora normal
3. Realizar pruebas bioqumicas para la identificacin de cocceas Gram positivo
4. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras clnicas.
5. Realizar estudios de susceptibilidad a agentes antimicrobianos.

Primera sesin prctica

I. MUESTRAS CLNICAS
1. Observe la placa sembrada con su muestra clnica. Describa macroscpicamente las colonias bacterianas.
Observe si se trata de cultivos puros.
2. Realice una tincin de Gram y describa microscpicamente su muestra. Observe al microscopio con
aumento 100X oil.
Recuerde que en el caso de cocceas Gram + es de suma relevancia conocer la agrupacin bacteriana y
el tipo de hemlisis para el diagnstico.
3. Realice las pruebas bioqumicas correspondientes segn la tabla de identificacin de bacterias Gram
positivo.
a. Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que descompone el H2O2 en H2O y O2. La enzima se
encuentra en la mayora de las bacterias que contienen citocromo. La excepcin es Streptococcus que no puede
descomponer el H2O2. El test permite diferenciar Staphylococcus, Micrococcus y Listeria, todos ellos catalasa
+, de Streptococcus, catalasa -.
Procedimiento Prueba de la catalasa
a) Ponga sobre el portaobjeto una gota de H2O2
b) Con un palillo desechable tome la colonia en estudio y agrguela a la gota en el portaobjeto. La aparicin
rpida y sostenida de burbujas (antes de 20 segundos) indica test (+).
Precauciones: no tocar ni sacar agar sangre al tomar la colonia ni usar asa de platino, ya que estas sustancias
dan falsos positivos.
c) Anote lo observado y compare con su resultado del Gram.
d) Elimine el portaobjeto y el palillo en los recipientes respectivos

Figura N 12: reaccin de la enzima Catalasa en presencia de Peroxido de hidrgeno.

b. Coagulasa: Busca la presencia de la enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus.
Procedimiento Prueba de la Coagulasa:
a) Tome una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas marcadas.
b) Con un palillo plstico tome varias colonias desde el agar.
c) Mezcle con la solucin de anticuerpos del Test de aglutinacin (plasma de conejo).
d) Espere unos minutos agitando constantemente con el palillo.
e) Si existe la presencia de cogulos (apariencia de leche cortada), la reaccin es positiva. Si se ve siempre
homogneo, la reaccin es negativa.
f) Anote lo observado e identifique al patgeno presente en su muestra.
c. Test de CAMP para Streptococcus
Permite confirmar la presencia de Streptococcus tipo B por la produccin de una zona de hemlisis
caracterstica cuando crece en la proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se denomina punta de lanza
(Ver figura adjunta)

Figura 13: Test de CAMP positivo

Procedimiento Test de CAMP:
a) Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una nica estra en el centro a partir de un cultivo de
Staphylococcus aureus.
b) Perpendicular a la estra original, realice con el asa una o ms estras con su muestra clnica. Incubar a 37C
por 24 horas.

d. Identificacin de Streptococcus hemoltico por aglutinacin con ltex:

Consiste en la identificacin de los distintos grupos de Streptococcus hemoltico grupo A, B, C, D, F y G.
Procedimiento prueba de aglutinacin con ltex:
a) Agregue 1 gota de cada reactivo de ltex en cada uno de los 6 pocillos de la tarjeta de aglutinacin.
b) Tome dos a tres colonias hemolticas que quiera identificar. Recuerde que deben pertenecer a un cultivo
puro y al Gram ser cocceas Gram (+) en cadenas.
c) Mezcle y agite circularmente las colonias en cada pocillo de la tarjeta durante UN MINUTO
4. Realice el Test de difusin por disco. Sensidiscos.
a) Con el asa tome una colonia aislada desde la placa de Agar sangre y simbrela en el tubo de suero
fisiolgico estril hasta que quede turbio. Compare con el standard 0,5 Mac Farland.
b) Tome la trula estril y (sin flamearla!!!!) sumrjala en el caldo recin inoculado. Flamee la boca del tubo y
cierre.
c) Deslice la trula sobre toda la superficie del agar Mller-Hinton (Staphylococcus) o agar Mller-Hinton
Sangre (Streptococcus). Al terminar elimine la trula en el recipiente apropiado.
d) Tome la pinza estril y flamela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos (5 en total) y
distribyalos homogneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de ella ni
demasiado cerca entre s.
e) Incubar a 37C por 24 horas.
RECUERDE que la eleccin de los sensidiscos depender del patgeno que haya identificado en su muestre
clnica.
Nota: Asegrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfre en la tapa de la placa antes de
sacar uno. NO FLAMEE los frascos con los sensidiscos.
Trate de no tocar el agar al poner los discos, slo djelos caer desde cerca y presinelos suavemente contra el
agar con la pinza (sin hundirlos!!!).
II. FLORA NORMAL
1. Para el estudio de flora normal tmese una muestra bucoranfingea, nasal o de piel con una trula estril
previamente humedecida con suero fisiolgico y simbrela en agar sangre. Slo el primer cuadrante se siembra
con la trula y el resto con asa previamente flameada para poder obtener colonias aisladas. Incube esta placa a
37C por 24 horas.

Segunda sesin prctica

Resultados siembra flora norma
1. Escoja la colonia aislada y ms representativa de su cultivo. Descrbala macroscpicamente y
microscpicamente.
2. Sugiera un posible agente presente en su muestra, dependiendo, por ejemplo de la zona de la muestra,
caractersticas de crecimiento y sus observaciones.

Lectura e interpretacin del Test de Sensidiscos

a) Observe los halos de inhibicin y mida el dimetro de estos para determinar si la bacteria es susceptible,
intermedio o resistente con respecto a los antibiticos dispuestos en el agar. Compare con la Tabla adjunta,
segn corresponda.
b) Anote sus observaciones.
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Staphylococcus spp (Agar Mueller Hinton)
DROGA
CONTENIDO
SENSIBLE
INTERMEDIA
RESISTENTE
DEL DISCO
(Halo en mm)
(Halo en mm)
(Halo en mm)
Oxacilina
11-12
1 g
13
10
Eritromicina
14-22
15 g
23
13
Clindamicina
15-20
2 g
21
14
Vancomicina
30g
15
Bacitracina
0,05 unidades
10
< 10
Novobiocina
16
16
5 g
Amoxicilina /
20
19
20 / 10 g
A. Clavulnico

Observaciones
Para S. aureus

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus -hemolticos y Enterococcus (MuellerHinton con sangre de cordero)
DROGA
CONTENIDO
SENSIBLE
INTERMEDIA
RESISTENTE
DEL DISCO
(Halo en mm)
(Halo en mm)
(Halo en mm)
Penicilina
10 unidades
20-27
28
19
Eritromicina
16-20
15 g
21
15
Clindamicina
16-18
2g
19
15
Vancomicina
30g
17
Optoquina
5 g
14
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Streptococcus pneumoniae (Mueller-Hinton con sangre de
cordero)
DROGA
CONTENIDO
SENSIBLE
INTERMEDIA
RESISTENTE
DEL DISCO
(Halo en mm)
(Halo en mm)
(Halo en mm)
Penicilina
1 g de oxacilina
20
Eritromicina
16-20
15 g
21
15
Trimet/sulfame
16-18
1.25/25.75g
19
15
Vancomicina
30g
17
Optoquina
5 g
14

TRABAJO PRCTICO N4
FISIOTAXONOMA DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

El grupo de las Enterobacterias, nombre comn utilizado para referirse a la Familia

Enterobacteriaceae, incluye a bacilos Gram (-), aerobios y anaerobios facultativos, la mayora de ellos mviles
mediante flagelos pertricos, que como caracterstica microbiolgica fenotpica comn tienen la capacidad de
fermentar la glucosa y reducir los nitratos a nitritos.
Tienen como hbitat el intestino de animales inferiores y del hombre. Tienen adems una amplia distribucin
en el ambiente, se encuentran en el suelo, agua, plantas y algunas especies de esta familia, como Proteus spp.,
cumplen una funcin ecolgica importante: inician en el ambiente la degradacin de la materia orgnica y por
este comportamiento se relaciona con un ciclo de vida netamente ambiental, son saprfitos.
Entre las numerosas especies que constituyen esta familia, encontramos algunos grupos que en su relacin con
el hospedero humano son comensales, como es el caso de Escherichia coli, un constituyente importante de la
microbiota intestinal normal aerobia, especialmente a nivel de la porcin distal del intestino delgado y
fundamentalmente a nivel del intestino grueso. En esta localizacin la presencia de E. coli resulta en un
beneficio para el hospedero, pues como parte de su metabolismo se sintetizan vitaminas y tambin participa en
la degradacin de cidos y sales biliares. Debido a la presencia masiva de E. coli a nivel intestinal, su deteccin
se utiliza como marcador de contaminacin fecal, por ejemplo se ha establecido un ndice coli para evaluar
la calidad microbiolgica del agua potable o de alimentos. Si el ndice coli sobrepasa la norma considerada
aceptable significa que existe contaminacin fecal e indirectamente se deduce que el agua o el alimento, segn
sea el caso, puede contener patgenos intestinales.
Otros integrantes de este grupo en cambio son patgenos intestinales como son gneros Salmonella, Shigella,
Yersinia y un subgrupo de E. coli con factores de virulencia especficos que afectan el intestino y por ello se
denominan E. coli diarreognicos. Estos grupos o gneros bacterianos causan infecciones gastrointestinales
que pueden expresarse clnicamente como diarrea acuosa, diarrea con sangre (tambin denominada diarrea
enteroclica o sndrome disentrico) y en algunos casos a partir de la infeccin intestinal estas bacterias pasan
al torrente sanguneo y se puede producir una infeccin sistmica o bacteremia, como por ejemplo la fiebre
tifoidea (Salmonella enterica serovar Typhi).
En el laboratorio de Microbiologa el anlisis de una muestra clnica o ambiental sigue, por lo general, la
siguiente secuencia:
a) Toma de muestra
b) Siembra y obtencin del microorganismo aislado (cultivo puro)
c) Observacin de morfologa macroscpica
d) Tinciones y observacin de morfologa y agrupacin microscpica.

e) Identificacin fisiotaxonmica (reacciones metablicas especficas) con batera bioqumica convencional y

Sistema estandarizado API 10S
f) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.
La fisiotaxonoma bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a distintos medios de
cultivo a travs de las alteraciones que producen en estos medios. Estas alteraciones, son producidas por
enzimas especficas de las diferentes bacterias, ya que no todos los microorganismos poseen los mismos
requerimientos nutricionales y las mismas rutas metablicas. De este modo esta tcnica taxonmica se basa
principalmente en la deteccin de:
a) Utilizacin de distintas fuentes de carbono.
b) Formacin de productos finales.
c) Presencia de enzimas.
d) Sensibilidad a productos qumicos o antibiticos.
La identificacin de una cepa bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes ensayos bioqumicos que
generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un
sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara
una caracterstica bioqumica como la presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de
enzimas o va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores,
etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Para llevarlas a cabo, se puede utilizar diversos sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador,
etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de distintos microorganismos. Por ejemplo,
se debe suplir con factores de crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos
azcares cuando se sabe que el microorganismo en estudio es exigente.
A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin,
comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas
convencionales, ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos o pequeos
compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean cdigos numricos para la
interpretacin de resultados.
I. Batera bioqumica convencional para diagnstico microbiolgico
1. Agar tendido corriente: medio slido nutritivo, que permite observar posible pigmentacin en las colonias.
2. Agar Urea de Christensen: medio slido en el que se puede observar la presencia de la enzima Ureasa, ya
que contiene adems de nutrientes bsicos:

Triptona.

Urea.

Indicador de pH fenolftaleina.

Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias, que poseen la enzima ureasa, de degradar urea a
amonaco y CO2. Esta reaccin es fcilmente evidenciable, porque el pH vara hacia alcalino debido al efecto
del amonaco. Este cambio se observa por viraje del indicador de pH como Fenolftalena (Figura 1)

Figura 14: Resultados medio Urea

3.- Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene, adems de sales minerales:

Fosfato de amonio.

Citrato de sodio, como nica fuente de carbono.

Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).

En este medio slo pueden desarrollarse aquellas bacterias que poseen la enzima Citrato Permeasa, la que les
permite transportar el citrato a travs de la membrana citoplasmtica.
Una vez en el interior de la clula, el in citrato es metabolizado a travs del ciclo de los cidos tricarboxlicos
(Figura N 15)

Figura N 15: Resultados medio Citrato

4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azcares (hidratos de carbono) a travs de varias rutas metablicas.
Los productos finales de estas reacciones dependern de cada bacteria, del azcar utilizado y de la ruta
metablica. En general estos productos sern cidos (frmico, pirvico, lctico, etc.) y gases (CO2, H2).
Existen muchos medios de cultivo que se han diseado con el objeto de detectar la produccin de cido y gas a
partir de distintos azcares.
El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para el crecimiento de
las bacterias y que permite visualizar la utilizacin de azcares. Contiene adems de nutrientes como extracto
de carne, extracto de levadura, peptona, etc:

Glucosa al 0,1%

Lactosa al 1,0%

Sacarosa al 1,0%

Citrato de amonio.

Hierro.

Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH cido; Rojo pH alcalino).

a. Si la bacteria inoculada es fermentadora slo de glucosa usar sta y se obtiene slo una pequea cantidad
de cido, la que en las primeras 8 a 12 horas de incubacin es suficiente para convertir ambas porciones
(tendido y profundo) a un color amarillo. Dentro de las prximas horas, sin embargo, la glucosa sobrante es
completamente agotada y la bacteria comienza la degradacin oxidativa de los aminocidos en el tendido del
tubo, donde hay oxgeno, lo que lleva a la liberacin de aminas que neutralizan las pequeas cantidades de
cido presente en el tendido, y en 18 a 24 horas este tendido cambia a pH alcalino y vuelve a color rojo. En la
porcin profunda (anaerbica) del tubo, la degradacin de aminocidos es insuficiente para neutralizar el cido
formado, y el medio permanece amarillo. Si el TSI es inoculado con un organismo fermentador de glucosa y

lactosa o sacarosa, an cuando la glucosa se agota en las primeras 8 a 12 horas, la fermentacin contina ya
que el organismo es capaz de usar lactosa o sacarosa. As, a las 18 a 24 horas, ambas porciones estn amarillas.
b. Si se produce gas se observar como quiebres en el agar o separacin de la columna de agar del fondo del
tubo.
c. Para la deteccin de H2S, el cual es incoloro, el medio incluye un indicador. El tiosulfato de sodio es la
fuente de tomos azufre en la mayora de los medios usados para la produccin de H2S. Sales de fierro (Sulfato
ferroso y citrato frrico amoniacal) incorporadas en el medio de cultivo reaccionan con sulfuro de hidrgeno
para producir un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso) este reacciona con la sal de hierro dando sulfato
ferroso, un compuesto insoluble de color negro. (Figura 16)

Figura N 16: Resultados medio TSI

C: Control negativo
1: Desaminacin (+), fermentacin glucosa, lactosa y sacarosa (-), produccin de H2S (-).
2: Desaminacin (+), fermentacin glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), produccin de H2S (-).
3: Desaminacin (+), fermentacin glucosa (+), lactosa y sacarosa (-), produccin de H2S (+).
4: Desaminacin (+), fermentacin glucosa, lactosa y sacarosa (+), produccin de H2S (-).
5: Desaminacin (+), fermentacin glucosa, lactosa y sacarosa (+), produccin de H2S (+).
5. Agar LIA: Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre algunos aminocidos,
desaminndolos o decarboxilndolos. Ejemplo de estas reacciones enzimticas son: decarboxilacin de Lisina
y desaminacin de Lisina.
Otro efecto de las bacterias sobre aminocidos azufrados es la remocin del grupo -hSH2, produciendo H2S
(reaccin que se observa tambin en el medio TSI).
Este medio contiene adems de nutrientes como peptona y extracto de levadura:

Aminocido lisina

Aminocidos azufrados

Glucosa

Citrato de hierro y amonio

Indicador de pH prpura de bromocresol (Amarillo a pH cido, morado a pH alcalino).

a. La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo cido por lo que el pH baja y el indicador vira a amarillo.
Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se mantendr esta coloracin amarilla (reaccin K/A,
negativa). Si la bacteria PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la
lisina dando como producto CO2 y una diamina (alcalina), entonces el indicador vira nuevamente hacia el lado
alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado (reaccin K/K, positivo). Si la bacteria es capaz de
desaminar a la lisina, la superficie se ver roja y el fondo amarillo (reaccin R/A).
b. Si la bacteria produce H2S ste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso (negro). (Figura 17)

Figura N 17: Resultados medio LIA

6. Medio MIO: Permite observar motilidad, presencia de la enzima ornitina descarboxilasa y produccin de
indol.
a. Si el crecimiento bacteriano se observa como el enturbamiento completo del medio, la reaccin es positiva.
Si slo se limita al pinchazo, es negativa.
b. La enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios aminocidos en algunas
bacterias. La reaccin positiva se observa por el color morado del tubo; en cambio, si la reaccin es negativa el
medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).
c. La presencia de indol, se evala agregando una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reaccin positiva
ser la aparicin de un aro rojo sobre la superficie del medio (Figura N 18).

Figura N 18: Resultados medio MIO (Los pares estn organizados sin y con reactivos de Kovacs)
1: Motilidad (-), ornitina descarboxilasa (-), indol (+) (anillo fucsia)
2: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (-) (anillo amarillo)
3: Motilidad (+), ornitina descarboxilasa (+), indol (+).
2. Sistemas comerciales usados en la identificacin de Enterobacterias
2.1- API 10S: Sistema de identificacin estandarizado para Enterobacterias y otros bacilos Gram negativo,
como algunos no fermentadores (Pseudomonas, Acinetobacter) que utiliza 11 pruebas bioqumicas que usan
sustratos deshidratados.
2.2- SensIdent: Es un sistema semiautomatizados que permite identificar bacilos Gram negativo
fermentadores y no fermentadores de glucosa. La identificacin se hace mediante pruebas bioqumicas las que
vienen liofilizadas en placas de microtitulacin y se rehidratan con la suspensin bacteriana.
2.3 VITEK: Es un sistema automatizado (Bio-Merieux). La identificacin de los bacilos Gram negativo
fermentadores y no fermentadores de glucosa se hace a travs de pruebas bioqumicas que vienen incluidas en
tarjetas de identificacin. Los tiempos de incubacin varan entre 2 y 15 horas. El sistema vitek determina si
cada pocillo es positivo o negativo midiendo la turbidez mediante un lector ptico. Cuando finaliza el periodo
de incubacin, las reacciones son analizadas automticamente y la identificacin es impresa.
3. Oxidasa
Busca la presencia de la enzima citocromo oxidasa y consiste en colocar directamente la colonia sospechosa en
el extremo de una varilla que contiene un reactivo oxidable. La reaccin es positiva cuando aparece un color
prpura despus de 1 min.
Esta prueba es positiva para Neisseria spp. y para bacilos Gram negativo no fermentadores, y es negativa para
Enterobacterias.

4. Susceptibilidad a Antibiticos
Los antibiticos son agentes teraputicos producidos por organismos vivos, que inhiben o destruyen a los
agentes infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad estn indicados para apoyar la terapia antimicrobiana de
tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las que la identidad del microorganismo no es suficiente
para predecir en forma confiable su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa
que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos
ms comnmente usados.
Los mtodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son mtodos que determinan in vitro la
sensibilidad de los microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos bajo condiciones especficas y
estandarizadas.

ACTIVIDADES PRCTICAS
Objetivos
1. Realizar pruebas bioqumicas convencionales para la identificacin de bacterias Gram negativo.
2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de productos intermediarios o
finales, debido a la accin bacteriana.
3. Realizar test comercial API 10S, para la identificacin de bacterias Gram negativo.
4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusin en agar.
5. Identificar el agente etiolgico (Gnero y especie) presente en una muestra clnica.

Primera sesin prctica

Actividades
1. Observe las placas de Agar Mc Conkey sembradas y describa las colonias bacterianas. Verifique si se trata
de cultivos puros.
2. Realice una tincin de Gram a su muestra. Observe al microscopio y describa.
3. Siembra de Batera Bioqumica Convencional y sistema de identificacin comercial API 10S. No olvide
anotar el nmero de muestra.
4. Realice prueba de susceptibilidad (Antibiograma).
3a. Pruebas bioqumicas convencionales
Cada grupo contar con una batera convencional compuesta por 6 tubos. Para sembrar la batera se debe
seguir las siguientes indicaciones:
a. Flamear el asa para su esterilizacin.
b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mc Conkey con la muestra a estudiar.
c. Flamear la boca del tubo con caldo estril o suero fisiolgico, sumergir el asa con cuidado y agitar. Repetir
hasta una densidad igual a 0.5 Mc Farland.
d. Flamear el asa para su esterilizacin. El caldo recin sembrado ser utilizado como inculo para sembrar
toda la batera.

e. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servir para hacer una comparacin
con el resultado final.
f. Para cada tubo de la batera el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada en las paredes del tubo antes
de sumergirla en el caldo inoculado.
Posteriormente siembre en los medios teniendo en cuenta que:
1. Los medios semitendidos (Agar TSI y LIA) se deben sembrar en profundidad y en superficie, es decir,
atravesndolos hasta el fondo con el asa en punta, y luego en zig-zag por la superficie.
2. Los medios tendidos (Agar Citrato, Agar Urea y Corriente) se siembran slo en la superficie, es decir, se
realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).
3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inculo dentro del tubo con el medio.
4. Los medios semislidos (agar MIO) se siembran slo en profundidad con un asa en punta, pinchando el agar
hasta la mitad del tubo aproximadamente.
3b. Siembra y Lectura de API 10 S
1. Prepare una suspensin bacteriana en 5 ml de suero fisiolgico, hasta una medida de densidad igual a 0.5
Mac Farland (estndar)
2. Con una pipeta Pasteur estril, inocule cada una de las celdas de la galera hasta el menisco, tal y como se
muestra en la figura adjunta (lnea azul). Evite la formacin de burbujas en los micropocillos, pues interfiere
con sus resultados.
3. Llene la prueba CIT hasta la cpula
4. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S, despus de inocular, llene las cpulas con aceite mineral, para crea
un ambiente microaeroflico.
5. Coloque la galera en la cmara de incubacin, a la que debe colocarle previamente agua para crear un
ambiente hmedo. Que NO quede un exceso
6. Cierre la cmara e incube 18 a 28 horas a 37C.

4. Test de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, mtodo de difusin en agar o Kirby-Bauer

Se utiliza para determinar la sensibilidad in vitro de las bacterias a los distintos antimicrobianos. Para que los
resultados sean confiables y reproducibles es necesario estandarizar algunas condiciones de laboratorio:
a) Concentracin de las bacterias que se siembran: Requiere uso de estndares de turbidez: Mac Farland 0.5
b) Medio de cultivo utilizado: Agar Mueller-Hinton
c) Concentracin del antimicrobiano en el disco: vara para cada antimicrobiano.
d) Temperatura (37C), tiempo de incubacin (16-24 horas) y atmsfera de incubacin (en O2)
Una vez que se obtiene una colonia aislada (es absolutamente necesario que no exista mezcla de bacterias), se
prepara una suspensin bacteriana a una concentracin conocida (1 a 2 x 108 UFC/mL) llevando a una turbidez
equivalente a un Mac Farland 0.5.
a. Tome una trula estril y (sin flamearla!!) sumrjala en el caldo con el inoculo. Flamee la boca del tubo y
cierre.
b. Deslice la trula mojada sobre toda la superficie del agar Mller-Hinton. Una vez que termine, elimine la
trula.
c. Deje secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.
d. Tome la pinza y flamela brevemente. Tome con cuidado cada uno de los sensidiscos y distribyalos
homogneamente en la placa, cuidando de que no queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado
cerca entre si.
e. Incube a 37C durante 16 hrs.

Segunda sesin prctica

LECTURA E INTERPRETACIN DE LA BATERA.
Una vez que la batera es sembrada, se incuba a 37C para que los microorganismos crezcan y produzcan los
cambios en los distintos medios. Posteriormente los resultados se leen y se comparan con las Tablas de
Resultados adjuntas.
Lectura Batera Bioqumica
Agar Urea
Reaccin positiva : El agar se torna fucsia.
Reaccin negativa : El agar no cambia de color.
Agar Citrato
Reaccin positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).
Reaccin negativa : El agar permanece de color verde (neutro).
Agar TSI
Utilizacin de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K
Fondo amarillo (pH cido). Se anota A
Utilizacin de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH cido). Se anota A/A

Reaccin negativa : El tubo no vara de color. Se anota K/K.

Produccin de gas : Ruptura de la columna de agar. Indica reaccin positiva
Produccin de H2S : Ennegrecimiento del agar. Indica reaccin positiva
Agar LIA
Decarboxilacin de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K
Decarboxilacin de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K
fondo amarillo (cido). Se anota como A
Desaminacin de lisina positivo : superficie roja. Se anota R
fondo amarillo. Se anota A
Desaminacin de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A
Produccin de H2S : ennegrecimiento del agar. Indica reaccin positiva
Medio MIO
Motilidad positiva : crecimiento bacteriano produce opalescencia del medio.
Motilidad negativa : crecimiento bacteriano limitado al pinchazo con el asa.
Presencia de indol : reaccin positiva, aparicin de un aro rojo en la superficie del medio, al agregar el reactivo
de Kovacs.
Presencia enzima ODC: el medio se observa de color morado, indicando reaccin positiva
: el medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo), indicando reaccin
negativa.
Agar Corriente : reaccin positiva si existe coloracin de las colonias.

A
AG
AG
A
AG
AG
AG
AG
V
AV
AV
AG
-

Shigella dispar

Salmonella typhi

Salmonella paratyphi A

Salmonella paratyphi B

Salmonella gallinarum

Citrobacter freundii

Klebsiella pneumoniae

Enterobacter aerogenes

Enterobacter hafniae

Serratia marcescens

Serratia rubidae

Proteus vulgaris

Proteus mirabilis
Pseudomonas
aeruginosa*

AG
V
(+)
+/-/+

= Acido-Gas (utilizacin del substrato y produccin de gas)

= Variable
= Positivo despus de 3 4 das
= Generalmente positivo
= Generalmente negativo

Alcaligenes faecalis*
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

+/-

Shigella flexneri

AG

Escherichia coli

-/+

(+)

Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato

+/-

+/-

H 2S

+/-

+/-

Motilidad

Indol

-/+

+/-

V-P

Resultados ms frecuentes de algunas pruebas bioqumicas para la familia Enterobacteriaceae

-/+

-/+

-/+

R-M

Pigmento Urea

Citrobacter freundii

Salmonella Arizonaa

Escherichia coli

Positivo

Enterobacter spp.
Klebsiella spp.

Negativo

a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente

b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.

Nota : Todos producen gas de glucosa.

Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli
Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er da

Negativo

Positivo

Indol

Lisina Descarboxilasa Positivob

Indol Negativo

Lisina Descarboxilasa

Negativo

Positivo

Produccin de H2S

Fermentacin de Glucosa Positivo

Fermentacin de Lactosa Positivo
Lisina Desaminasa Negativo

TABLA I

Proteus vulgaris

Proteus morganii

Negativo

Nota: P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato

Todos producen un poco de gas de Glucosa
Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia

Proteus mirabilis

Negativo

Proteus rettgeri
Providencia spp.

Positivo

Indol Positivo

Indol

Positivo

Lisina Descarboxilasa Negativo

Lisina Descarboxilasa Negativo

Citrato

Negativo

Positiva

Produccin de H2S

Fermentacin de Glucosa Positivo

Fermentacin de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Positivo

TABLA II

Salmonella Typhi
Salmonella Arizona

Salmonella Paratyphi B

Positivo

Citrobactera
Serratia

Indol Negativo
Citrato Positivo

Positivo

Positivo
Shigella spp.
Yersinia enterocolitica

Negativo
Salmonella Paratyphi A
Shigella spp.

Indol

Citrato Negativo

Negativo

a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo

Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de
Glucosa

Edwarsiella

Citrato

Citrato
Negativo

Negativo

Negativo

Citrato Positivo

Indol

Positivo

Negativo

Lisina Descarboxilasa

Lisina Descarboxilasa

Positivo

Negativa

Positiva

Produccin de H2S

Fermentacin de Glucosa Positivo

Fermentacin de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Negativo

TABLA III

Interpretacin API 10
Antes de realizar la interpretacin del tes comercial API 10, debe agregar los siguientes reactivos en sus
correspondientes posillos:

TDA (Triptofano-desaminasa): agregue una gota del reactivo TDA. Coloracin marrn oscura indica
positivo.

IND (Produccin de indol): Agregue una gota del reactivo de James. Coloracin rosa indica positivo.

NO2 (Produccin de nitritos): Agregue una gota del reactivo NIT1 y NIT 2 en el tubo GLU. Espere 2
a 3 minutos. Una coloracin roja indica positivo.

Realice aparte el test de oxidasa.

Registre todas las reacciones en la hoja de resultados que le entregar su profesor.

Codifique el conjunto de reacciones obtenidas en un perfil numrico. Sume los nmeros de cada
grupo si las reacciones son positivas Se obtienen 4 dgitos que corresponden al perfil numrico.
Busque el perfil numrico en el catlogo que tendr su profesor o en un software.

Registre sus resultados en la cartilla y gurdelo para pegarlo en su informe .

TEST

REACCIONES

POSITIVO

NEGATIVO

ONPG

Beta galactosidasa

Amarillo

Incoloro

GLU

Fermentacin /oxidacin

Amarillo,amarillo/ gris

Azul, azul/verdoso

Amarillo

Azul, azul/verdoso

Naranja

Amarillo

Rojo/naranja

Amarillo

glucosa
ARA

Fermentacin/oxidacin
arabinosa

LDC

Enzima lisina
descarboxilasa

ODC

Enzima ornitina
descarboxilasa

CIT

Utilizacin del citrato

Azul/verde, azul

verde plido/amarillo

H2S

Produccin de H2S

Depsito/lnea negra

Incoloro/gris

URE

Enzima ureasa

Rojo/naranja

Amarillo

Lectura e interpretacin Antibiograma

Luego de la incubacin del antibiograma, se produce la difusin del antimicrobiano en el agar y si la bacteria
es sensible, se produce la inhibicin del desarrollo en forma de halo. Si la bacteria es resistente habr
desarrollo hasta el disco mismo (6mm) o con halos de inhibicin disminuidos.
Estn definidos para cada grupo de bacterias los halos de inhibicin que permitirn clasificar a las bacterias en
Sensibles, Intermedias o Resistentes.
f. Observe y mida el dimetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

NOTA: Los diversos tamaos de los halos de inhibicin producidos por antibiticos diferentes para una
misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de
inhibicin de 30mm para Penicilina no indica mayor sensibilidad que un halo de 20 mm para
Tetraciclina.
Interpretacin de los halos de Inhibicin para Enterobacteriaceae (Mueller-Hinton):
DROGA
Ampicilina
Gentamicina
Cloranfenicol
Ciprofloxacino
Cefotaxima
Tetraciclina
Ceftazidima
Amoxicilina /
c. Clavulanico
Carbenicillin para
Especies de Proteus
E. coli
Carbenicillin para
P. aeruginosa
Ceftazidima para
P. aeruginosa
Clindamicina
Ciprofloxacino

CONTENIDO
DEL DISCO
10 g
10 g
20 g
5 g
30 g
30 g
30 g

SENSIBLE
(Halo en mm)
17
15
18
21
26
15
21

INTERMEDIA
(Halo en mm)
14 16
13 14
13 17
16 20
23 25
12 14
18 20

RESISTENTE
(Halo en mm)
13
12
12
15
22
11
17

20 / 10 g

18

14 17

13

100 g

23

18 22

17

100 g

17

14 16

13

30 g

18

15 17

14

2 g
5 g

21
21

15 20
16 20

14
15

Interpretacin de los halos de Inhibicin para Bacilos Gram (-) no fermentadores (Mueller-Hinton):
DROGA

CONTENIDO DEL

SENSIBLE (Halo en INTERMEDIA (Halo en RESISTENTE

DISCO

mm)

mm)

(Halo en mm)

Ceftazidima

30g

18

15-17

14

Gentamicina

10g

15

13-14

12

Ciprofloxacino

5g

21

16-20

15

TRABAJO PRCTICO N5
LEVADURAS Y HONGOS FILAMENTOSOS
OBJETIVOS
1.- Conocer y caracterizar la morfologa macroscpica de las colonias de hongos unicelulares (levaduras) y
pluricelulares (filamentosos).
2.- Conocer la morfologa microscpica de hongos unicelulares (levaduras) y pluricelulares (filamentosos).
MARCO TERICO
El ser humano est constantemente expuesto a la propagacin de organismos eucariontes como son los
hongos.

La mayora tolera esta exposicin sin secuelas, pero algunos desarrollan una hipersensibilidad

alrgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a la colonizacin de hongos y porque la
virulencia inherente en estos microorganismo es muy baja.
Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infeccin puede desencadenar enfermedades que, si
no son debidamente controladas, pueden llevar a un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se
aprovechan de la debilidad del hospedero se les denomina hongos oportunistas. Hongos como Candida
(Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus arrhizus) son
ejemplos de ellos.

TALO (cuerpo macroscpico)

Unicelular

Pluricelular

Micelio

Levaduras
Sifonado
Colonias semejantes a las
bacterianas

Septado

Colonias algodonosas,
lanosas, aterciopeladas

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en Agar Sabouraud, cuyo contenido en
glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es cido (pH 5,6) para impedir la contaminacin
bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30C por un tiempo que depende de la especie fngica (levaduras y
hongos ambientales, 48 horas aproximadamente, hongos dermatofitos, 15-30 das).

Hongos Unicelulares (Levaduras)

Las levaduras son organismos fngicos unicelulares que generalmente se reproducen asexualmente
por yemacin. Los criterios usados para el diagnstico son fundamentalmente morfolgicos (macroscpicos y
microscpicos).
Las levaduras normalmente prosperan en hbitat con abundante azcar, tales como frutas, flores e
incluso la corteza de los rboles. Algunas de ellas viven en simbiosis con animales, especialmente insectos.
Las levaduras ms importantes desde el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la
especie Saccharomyces cerevisiae.
Candida spp.:

En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras, son parte de la

flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas sanas de la cavidad oral, vagina,
tracto gastrointestinal y rea rectal. Sin embargo, cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos
pueden llegar a la sangre e invadir pulmones, bazo, riones, hgado, corazn y cerebro. Este gnero se
caracteriza por un aspecto macroscpico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia pastosa (Figura
N 19).

Figura N 19: Observacin microscpica de una muestra de esputo en que se ponen de manifiesto las
levaduras en yemacin y las pseudohifas de las especies de Candida.

Hongos Filamentosos:
Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados.

Los hongos sifonados son generalmente

multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con tabiques que son prolongaciones de la
membrana citoplasmtica (ej. Aspergillus, Dermatophytos).

1) Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium), como patgenos
oportunistas (ej. Aspergillus) y como patgenos (ej. Dermatophytos).
Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a ste gnero son extremedamente frecuentes
en el medio ambiente y de crecimiento rpido (48 hr). En contraste con la mayora de las infecciones
producidas por Candida, la aspergilosis se adquiere de fuentes exgenas.

Estos microorganismos se

identifican por sus caractersticas morfolgicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o

pulverulentas, coloreadas (crema, verde, caf y negras). Microscpicamente presentan hifas septadas de
las que nace una prolongacin no septada (conidforo), el cual se dilata en su extremo distal (vesculas)
rodendose all de clulas conidiognicas (filides). Las filides producen conidios los que se disponen en
forma de cadenas. El conjunto vescula, filide y conidios se conoce como cabeza aspergilar (Ver
Figura N 20).
De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. fumigatus y A. flavus son las que
con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son ubicuitarios en el ambiente y no forman parte de
la flora normal del ser humano, aunque pueden producirse colonizaciones transitorias. La aspergilosis est
asociada con problemas respiratorios como la dilatacin crnica de la va area hasta un colapso de un
segmento pulmonar.

Figura N 20: Estructura microscpica de especies de Aspergillus

Penicillium:

Estos microorganismos son ubicuitarios en el medio ambiente y suelen aislarse en muestras

de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio, desarrollndose en 3-4 das. En 1929, Sir
Alexander Fleming observ que una especie de Penicillium haba contaminado su cultivo de Staphylococcus
aureus, destruyendo las bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo.
observacin casual llev al descubrimiento de la penicilina.

Esta

Los hongos que petenecen a este gnero se caracterizan por la produccin de conodiforos en el
extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en superficies, como una placa de agar,
germinan y crecen rpidamente produciendo colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.
P. marnefeii es la nica especie patgena de Penicillium y es causa de infecciones espontneas del
sistema retculoendotelial, afectando vasos linfticos, pulmn, hgado, bazo y hueso. Ver figura N 21.

Figura N 21: Aspecto microscpico de Penicillium.

2) Hongos sifonados.
Zigomicetos:

Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en cuadros de

zigomicosis. Macroscpicamente presentan un micelio algodonoso. Microscpicamente, forman hifas

aseptadas y se reproducen asexualmente produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver
Figura N 22). Las enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis
rinocerebral.

Esta infeccin se origina en los senos paranasales y puede afectar rbita y el paladar,

extendindose hacia el cerebro.

En pacientes inmunodeprimidos puede afectar el pulmn, el tracto

gastrointestinal y los tejidos subcutneos.

Figura N 22:
Aspecto microscpico de hongos sifonados.

I.- Estudio Clnico

El reconocimiento del hongo como agente de infeccin se inicia por la sospecha clnica del Mdico al orientar
su diagnstico hacia una micosis. Este se sustenta gracias al examen fsico, la historia clnica y en infecciones
profundas, se agrega el apoyo de imgenes, fundamentalmente el Scanner. Frecuentemente, en micosis
oportunistas los signos y sntomas clnicos no son especficos, siendo indistinguibles de una infeccin
bacteriana. Muchas veces, la presencia de factores predisponentes o de riego y la pobre respuesta al tratamiento
antibacteriano, es seal que ndica la posible presencia causal de agentes fngicos, sospecha que debe ser
indicada en la solicitud de examen para que el profesional de laboratorio oriente la bsqueda y aislamiento del
hongo siguiendo la metodologa apropiada.
II.- Toma y Transporte de Muestras
La recoleccin y transporte del material clnico depende en gran parte de la sospecha clnica, tejido afectado,
tipo de lesin y estado general del paciente. Esta etapa es fundamental para el xito del diagnstico. Debe
asegurarse una cantidad suficiente de muestra que permita realizar todos los exmenes de laboratorio. La
calidad de la muestra est directamente relacionada con la sensibilidad y rendimiento del examen en el
laboratorio.

Si el paciente se encuentra bajo tratamiento antifngico, se recomienda suspender el tratamiento, por lo menos
2 semanas antes de la toma de muestra. Esto se orienta principalmente a pacientes portadores de micosis
superficiales o cutneas y las consideradas no graves.
III.- Procedimiento General del Diagnstico de Laboratorio
En general, el examen microscpico directo (EMD) y el cultivo pueden ser realizados para todas las muestras
clnicas que se reciben. Estos exmenes forman parte del mtodo directo de identificacin de hongos y se
recomienda en todas las micosis. La microscopa proporciona informacin vital y frecuentemente una
inmediata corroboracin del diagnstico presuntivo al observar el agente fngico en el material clnico. Los
hongos filamentosos se presentan en parasitismo como hifas que pueden ser cenociticas (poco septadas) o
septadas, hialinas o dematiancias (oscuras) segn el tipo de hongo. Algunas levaduras presentan caractersticas
microscpicas particulares en parasitismo, lo cual orienta su identificacin.

a)

El EMD puede ser realizado en frotis, fijndose la muestra al portaobjetos y usando la tincin de
Gram o Giemsa, para poder observar con el objetivo de inmersin (100X). Lo ms frecuente, es la
preparacin al fresco con soluciones clarificadoras con o sin colorantes como KOH 10 o 20%.
Adems, se emplea la tinta de China para observar la presencia de cpsula en levaduras del gnero
Cryptococcus, observndose con objetivos de 10X y 40X de aumento. En muestras de tejido, adems
puede solicitarse examen histopatolgico donde se ver adems la reaccin tisular.

b)

El cultivo primario del hongo es realizado en varios tubos o placas de Petri conteniendo los medios
de cultivo segn la sospecha clnica. Las micosis causadas por hongos filamentosos se incuban
generalmente a 25C y el tiempo de incubacin depender de la sospecha clnica. As, en las
dermatofitosis o tias los medios se incuban hasta por 30 das, debido a que estos hongos demoran
aproximadamente 20 das en crecer y presentar sus estructuras micromorfolgicas caractersticas que
permitirn su diagnstico a nivel de especie. Sin embargo, los hongos filamentosos oportunistas como
Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., mucorales y dematiaceos, entre otros, crecen ms
rpido, obtenindose colonias entre los 5 a 10 das de incubacin. Las levaduras crecen mejor a 37C
y sus colonias se obtienen entre las 24 y 72hrs dependiendo de la especie.

1.- HONGOS FILAMENTOSOS

Examen Microscpico de la Colonia
A partir del hongo filamentoso aislado in vitro, se realiza una preparacin microscpica para observar las
caractersticas morfolgicas del organismo, buscando principalmente las estructuras reproductivas, ya que son
stas las que permitirn identificar el agente. Muchas veces, como consecuencia de la fragilidad de estas
estructuras, se logra aproximar el diagnstico a nivel de gnero o grupo de hongos, por tal motivo se requiere
de un cultivo especial cuyo propsito es estimular la produccin de clulas reproductivas en medios pobres y
conservar su agrupacin con respecto a las hifas a partir de un microcultivo. (no se realizar)
2.- IDENTIFICACIN DE LEVADURAS
a) Prueba Fisiolgica de Produccin del Tubo Germinativo
Este examen es realizado para identificar la presencia de C. albicans. En condiciones determinadas de cultivo
in vitro, esta levadura desarrolla un tubo fino que no se libera ni presenta punto de constriccin en el punto
de unin con la clula madre. Se inocula la levadura en un tubo conteniendo plasma o suero humano y se
incuba a 37C por 2 a 3 hrs. Debido a lo rpida, fcil y barata, esta tcnica se encuentra implementada en la
gran mayora de los laboratorios. Sin embargo, es recomendable acompaarla siempre con estudios en
microcultivo, para comprobar la identificacin de C. albicans, ya que se han descrito casos de falsos positivos
y negativos.
b) Prueba Fisiolgica de Filamentacin
Este examen es realizado para identificar la presencia de Candida sp.. En condiciones determinadas de cultivo
in vitro, estas levaduras desarrollan filamentos (pseudohifas) a partir de la clula madre. Se inocula la
levadura en un tubo conteniendo plasma humano y se incuba a 37C por 24 hrs.

c) Pruebas Bioqumicas
El estudio bioqumico de levaduras comprende principalmente el anlisis de asimilacin de hidratos de
carbono conocido como Auxanograma, sometindose a la cepa en estudio a diferentes azcares dependiendo
del gnero de levadura que se sospeche. Este examen se complementa con asimilacin de fuentes de nitrgeno,
fermentacin de azcares denominado Zimograma e hidrlisis de urea. El auxanograma y la asimilacin de
nitratos son incubados a 25C hasta por 3 das. Entretanto, el zimograma e hidrlisis de urea se incuba a 37C.
El perfil bioqumico obtenido ser comparado con los datos en las tablas de identificacin respectivas, segn el
gnero de levadura sospechado, permitiendo reconocer la o las especies que presentan el patrn bioqumico
determinado.
d) Sistemas Comerciales de Identificacin de Levaduras
En virtud de trabajo y experiencia que se requiere para leer e interpretar los resultados bioqumicos realizados
por el mtodo estndar, la industria ha desarrollado progresivamente nuevos sistemas para facilitar y disminuir
el tiempo de identificacin de las especies de levaduras de inters clnico. La mayora de los sistemas
disponibles en el mercado son galeras que contienen distintos nutrientes y reactivos deshidratados en los
pocillos que, al ser inoculados e incubados correctamente proporcionan lectura de fcil interpretacin, las
cuales, en su mayora generan un cdigo numrico de varios dgitos que son interpretados por registros propios
de cada empresa. El primer inconveniente observado por los laboratorios es la necesidad de contar con
disponibilidad de otra estufa de cultivo, ya que algunos de estos sistemas se incuban a 30C por 24 y 48hr.
Sistema comercial

Productor

- Api Candida

BioMrieux

- ID 20C e ID 32C

BioMrieux

- Fungichrom I

International Microbio

En resumen, a partir del diagnstico clnico los pasos importantes que favorecen el aislamiento e identificacin
del hongo son:
- Apropiada recoleccin del material clnico y rpido transporte al laboratorio
- Inmediato y oportuno procesamiento de la muestra
- Adecuada eleccin de la o las soluciones en el examen microscpico directo
- Correcta seleccin del o los medios de cultivos
- ptimo procedimiento de inoculacin e incubacin
- Adecuada realizacin, lectura, anlisis e interpretacin de las tcnicas de identificacin

ACTIVIDADES PRCTICAS
1.- Observacin y descripcin de cultivos de levadura.
1.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscpico: Describa, tal como lo haca para colonias bacterianas, forma, color, aspecto
de la superficie, borde, elevacin y brillo de las colonias. Anote lo que observe.
b) Examen microscpico: Realice una tincin Gram tradicional. Es decir, realice un frotis con la colonia
de levaduras en una gota de agua y contine con el protocolo por usted. conocido. Observe con
inmersin y dibuje lo que observa.
Nota: La tincin Gram es slo una tcnica de tincin. Las levaduras no son Gram + ni Gram -. Recuerde
que la caracterstica de ser Gram+ o Gram- est relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas
bacterianas.
c)

Observacin de tubo germinativo y filamentacin en Candidas:

1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota del cultivo de Candida que se le entregar (*)
2. Cubra con un cubreojeto.
3. Observe al fresco en aumento de 40X y dibuje lo observado

(*) Para esta prueba la levadura a estudiar se siembra en un tubo con plasma humano y se cultiva a
37C por 4 horas para observar tubo germinativo y por 24 horas para observar filamentacin. Recuerde
que slo C. albicans presenta tubo germinativo a las 4 horas, mientras que varias especies de Candida
presentan filamentacin a las 24 horas.
d) Tincin de cpsula:
1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china.
2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparacin con otro portaobjeto.
3. Seque suavemente en la llama del mechero
4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos.
5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersin en 100X

Figura N 23: Cpsula de Cryptococcus spp.

2.- Observacin, y descripcin de hongos filamentosos.

2.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscpico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa, polvorienta, lanosa) en anverso
y reverso. Anote lo que observe.
b) Examen microscpico: Para esto se realizar un examen al fresco.
Examen al Fresco:
1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto.
2.- Flamee un asa en punta, enfre cerca del mechero y obtenga un pequeo trozo del hongo (sin sacar
agar). DEBE USAR MASCARILLA.
3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un cubreobjeto.
4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersin, ni aplastando la muestra).
5.- Reconozca las estructuras microscpicas reproductivas de cada especie y dibuje.

Recuerde: el principal criterio para la identificacin de estos microorganismos es el morfolgico, por

lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

PSEUDOHIFAS O HIFAS
CON BLASTOCONIDIAS

Candida sp.

PSEUDOHIFAS O HIFAS
BLASTOCONIDIAS Y
CLAMIDOCONIDIAS

Candida albicans

ASIMILACIN/ FERMETACIN
DE AZCARES
(API 32 U OTRO))

FILAMENTACIN (+)

Candida albicans

TUBO GERMINATIVO (+)

TUBO GERMINATIVO

LEVADURAS

CULTIVO
POSITIVO

API 32, PROBABLE

Trichosporon o
Geotrichum

HIFAS CON ARTROCONIDIAS

TUBO GERMINATIVO (-)

API32, probable
Rhodotorula o
Torulopsis

CPSULA (-)

CPSULA (+)

Cryptococcus sp.

FILAMENTACIN (-)

TRABAJO PRCTICO N6
PARSITOS
1.- Reconocer formas infectantes y parsitos adultos de inters clnico.
2.- Observar las caractersticas ms importantes de estos parsitos.
MARCO TERICO
Se define como parsito a todo ser vivo, vegetal o animal, que pasa toda, o parte de su existencia, a
expensas de otro ser vivo (hospedero), del cual vive causndole o no dao, que puede ser aparente o
inaparente, y con quien tiene una dependencia obligada y unilateral. Existen diversos tipos de parasitismo:
1. Parasitismo obligatorio: los parsitos necesitan para vivir hacer vida parasitaria. Este estado puede ser
permanente, permanente estacionario, peridico o temporario.
2. Parasitismo facultativo: son seres de vida libre que en circunstancias favorables hacen vida parasitaria.
3. Parasitismo accidental: no son parsitos verdaderos, pero ocasionalmente pueden serlo.
4. Parasitismo extraviado: parsitos de los animales que anormalmente pueden encontrarse en el hombre.
5. Parasitismo errtico: cuando la localizacin del parsito, en el husped, no es en el rgano o tejido
habituales.
Ciclos de vida del parsito:
1. Ciclos directos (monoxnicos): son aqullos en los que no hay la presencia de un hospedero intermediario.
Pueden ser cortos -donde la forma emitida es la infectante- o largos, donde la forma emitida necesita un
determinado tiempo en el medio (generalmente el suelo) para transformarse en infectante. En general, los
parsitos con ciclos directos cortos son cosmopolitas y los directos largos estn condicionados por las
situaciones climticas.
2. Ciclos indirectos (heteroxnicos): son los que necesitan un hospedero intermediario para completar su ciclo.
La presencia de estas parasitosis en un rea determinada depende de la existencia de dicho hospedero
intermediario.
Caractersticas ms importantes de los parsitos:
Resistencia al medio exterior: para enfrentar los factores climticos y algunos agentes qumicos, los huevos,
quistes o larvas se protegen con cubiertas proteicas que los hacen resistentes.
Patogenicidad: est relacionada con la morbilidad y la mortalidad. Algunos parsitos son patgenos por s
mismos, y otros lo son dependiendo de las caractersticas del hospedero; sto hace que un mismo parsito
pueda o no producir enfermedad. Por esta razn existen el portador sano y los parsitos oportunistas, que se
manifiestan en pacientes inmunocomprometidos.

Autoinfeccin: es la forma para que el parsito permanezca por ms tiempo en el hospedero. Puede ser
autoexoinfeccin, en la que est en el exterior un tiempo muy corto (por ejemplo oxiuriasis); o
autoendoinfeccin, en la que se multiplica dentro del husped, y la recontaminacin se hace en el interior del
mismo (por ejemplo teniasis).
Prepatencia: es el tiempo que transcurre entre la entrada del parsito al hospedero y la demostracin de la
presencia de ste, o de sus formas de desarrollo, ya sea por la observacin directa, estudios bioqumicos,
cultivos, etc.
Viabilidad: es importante que las formas emitidas al exterior por el parsito sean viables a travs de
estructuras resistentes, tanto al medio como a los huspedes intermediarios. Se asegura de esta forma la
continuidad del ciclo y su permanencia.
Diapausa: es el estado en que muchas veces las larvas de los parsitos permanecen en el organismo del
husped en forma latente -encapsuladas o formando quistes- para evadir la respuesta inmunolgica.
Longevidad: la longevidad de un parsito admite dos formas: longevidad verdadera, cuando permanecen
muchos aos en un organismo (por ejemplo Trypanosoma cruzi, agente etiolgico de la enfermedad de
Chagas); o perpetundose -por medio de la autoinfeccin- aunque el parsito tenga vida muy corta.
Fecundidad: la capacidad para emitir determinada cantidad de formas parasitarias que le sirve al parsito para
perpetuarse. Es til conocerla, ya que a travs de ello (por ejemplo, en los helmintos, postura diaria de huevos),
es posible hacer el clculo aproximado del nmero de parsitos que infectan al husped.
Prevencin de las parasitosis
La Organizacin Mundial de la Salud estableci que, dado que las parasitosis son patologas con alto
componente social, podran ser controladas pero difcilmente eliminadas. Las medidas de prevencin estn
vinculadas a la modificacin de los hbitos, la educacin y el bienestar de la poblacin. Incluyen:
1.

Disminuir el fecalismo a travs de medidas de saneamiento bsico, como facilitar el acceso al agua
potable, la correcta eliminacin de heces, etc.

2.

No utilizar excrementos como abono para el cultivo de hortalizas, ni aguas servidas para riego.

3.

No consumir carnes o verduras crudas.

4.

Controlar los vectores mecnicos (moscas, cucarachas) y los vectores biolgicos (vinchuca, mosquitos
etc.).

5.

Desparasitar peridicamente a los animales domsticos, sobre todo perros y gatos.

6.

Prevenir las parasitosis congnitas a travs del control de la mujer embarazada.

7.

Evaluar marcadores de parasitosis en dadores de sangre y donantes de rganos.

8.

Modificar hbitos de convivencia del hombre con los animales para evitar el contacto con las heces de
los mismos.

9.

Promocionar la lactancia materna, ya que se ha comprobado que sta protege contra determinadas
parasitosis, principalmente las que originan diarreas.

10. Evitar el hacinamiento, que facilita el contagio persona a persona.

11. Hervir el agua de consumo por un minuto, utilizando esta modalidad como norma, especialmente
cuando la ingieran lactantes y nios.
12. No caminar descalzo o con calzado abierto en suelos de tierra o arena, sobre todo hmedos.
13. Utilizacin de guantes y calzado cerrado siempre que se trabaje con la tierra.
14. Antes de utilizar abono o turba de ro comercial rociar el material con agua recin hervida.
15. Tratar de evitar que los nios jueguen en areneros o patios de tierra. Si ello no fuera factible,
establecer un lugar delimitado para ellos, al que se rociar peridicamente, si es posible en forma
diaria, o en los perodos de clima clido y despus de las lluvias, con agua recin hervida.
16. Colocar los juguetes de los nios al sol las veces que se pueda, ya que la mayora de las formas
parasitarias no resisten a la desecacin y temperaturas superiores a 50C.
LABORATORIO DE PARASITOLOGIA
OBTENCIN DE LA MUESTRA
CONDICIONES GENERALES

Los parsitos intestinales del hombre son protozoarios y/o helmintos, tambin llamados gusanos
intestinales. Estos helmintos pueden ser cilndricos (nemtodos), anillados o segmentados (cstodos).

Para observar los trofozotos, quistes u ooquistes de los protozoarios as como las larvas y huevos de
helmintos se debe usar un microscopio. La mayor parte de los helmintos adultos son macroscpicos y
su morfologa puede estudiarse directamente, con ayuda de un estereoscopio o una lupa.

Las formas evolutivas de los protozoos intestinales se eliminan por las heces (trofozoto, quiste,
ooquiste y espora), segn la especie involucrada.

Los helmintos intestinales adultos (progltidas de Taenia sp., Enterobius vermicularis y Ascaris
lumbricoides) pueden salir al exterior espontneamente o despus del tratamiento.

Los helmintos intestinales se eliminan con las heces.

Los mtodos de diagnstico de los parsitos intestinales pueden ser: directo o por concentracin de los
elementos parasitarios que se eliminan en las heces.

En las heces podemos encontrar formas adultas y microscpicas (huevos, larvas, trofozoitos, quistes,
ooquistes y esporas) de los parsitos intestinales; por ello, es importante obtener una buena muestra
fecal, as como la conservacin ptima del espcimen.

La muestra debe ser obtenida (entre 3 y 6 gramos) lo ms fresca posible (mximo 90 minutos, si se
busca Entamoeba histolytica), y depositada en un frasco de boca ancha con tapa rosca y rotulada
correctamente con los datos de identificacin.

La muestra debe obtenerse antes del uso de medicamentos antiparasitarios, o hasta 2 a 5 das despus
de su administracin.

Las heces depositadas en el suelo no son las recomendadas para el diagnstico, debido a que pueden
contaminarse con formas biolgicas, como por ejemplo: larvas similares a los enteroparsitos del
hombre, larvas de nemtodos, huevos de caros o insectos, etc.

Si el paciente no es regular en la evacuacin de sus deposiciones y ha evacuado en la noche anterior al

examen, se recomienda guardar la muestra en una refrigeradora o en un lugar fresco no expuesto a la
luz solar, para que no se alteren las formas parasitarias. Cuando la muestra va a demorar en llegar al
laboratorio varias horas o das, se recomienda adicionarle lquido fijador y/o conservador (PAF, PVA,
formalina 10%, SAF, acetato de sodio, etc.).

MUESTRA PARA EXAMEN PARASITOLGICO

Comprende las siguientes muestras: heces, bilis o jugo duodenal, esputo, secrecin, biopsia o preparaciones
histolgicas, siendo heces la ms frecuente.
EXAMEN DIRECTO MACROSCPICO
Fundamento.
Permite observar directamente las caractersticas morfolgicas de los parsitos adultos, enteros o fraccionados,
as como los cambios en las caractersticas organolpticas de las heces eliminadas, (color, presencia de sangre
y/o moco, consistencia, etc.).

Figura N 24. Ascaris lumbricoides macho adulto (der.) y progltido grvido de Taenia solium (4X) (izq.),
coloracin: Tionina
EXAMEN DIRECTO MICROSCPICO
Fundamento.
Buscar, principalmente en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas mviles de parsitos de tamao
microscpico (trofozotos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli,
etc.; as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercoralis, Ancylostoma duodenale, Necator
americanus, Trichostrongylus sp., Paragonimus, Fasciola, etc.).
Ejemplos

Figura N 25: Trofozoito de Giardia

lamblia con solucin lugol.

Figura N 26: Huevos operculados de

Paragonimus peruvianus (izq.) y Fasciola
hepatica (der.) en muestra fresca

DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO PARASITOLOGA

La recoleccin correcta de las muestras es esencial para un examen de heces confiable. Se recomienda
realizar un seriado coproparasitolgico, una muestra fresca en solucin formolsal. Debe entregarse a cada
paciente tres frascos o recipientes plsticos de boca ancha con cierre adecuado, Se puede solicitar al paciente
que tres das antes de iniciar la recoleccin no ingiera manteca, frutas de hollejo, verduras de hoja y
legumbres.Puede ingerir carnes magras, pastas, dulces, papa. Esta dieta previa no es un requisito estricto. Se
debe suspender la ingesta de purgantes oleosos y sustancias radio opacas.
Recoleccin de materia fecal en conservantes:
Seriada coproparasitolgica:
Se indica la recoleccin de un mnimo de una muestra (tamao de una cucharada de postre) de cada deposicin
en tres das alternos. Se le indica al paciente que defeque en una bacinica, o en un recipiente de boca ancha,
limpio y seco, o sobre superficie plstica o papel no absorbente de donde tomar la porcin para colocarla en
un frasco grande con formolsal al 5%.
Examen macroscpico de las heces remitidas:
Cuando las heces frescas son recibidas en el laboratorio deben ser examinadas bajo luz lo que permite
observar directamente las caractersticas morfolgicas de los parsitos adultos, enteros o fraccionados, as
como los cambios en las caractersticas organolpticas de las heces eliminadas, (color, presencia de sangre y/o
moco, consistencia, etc.).
Examen microscpico de heces:
La aplicacin de los mtodos de concentracin permite detectar elementos parasitarios que estn presentes y se
examina una cantidad mayor de heces en menor volumen.

ACTIVIDADES PRCTICAS
Las actividades del laboratorio de parasitologa consistirn en la observacin de elementos
parasitarios conservados en soluciones fijadoras y disecados y/o observacin de diapotecas segn
disponibilidad de cada laboratorio.

EJEMPLOS DE ELEMENTOS PARASITARIOS QUE PUEDEN ENCONTRARSE EN UN SERIADO

DE DEPOSICIONES