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Nota de aceptacin
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Firma del jurado
AGRADECIMIENTOS
A Dios.
A mis padres y mi familia por su apoyo desinteresado y compresin.
A la doctora Luz Stella Barrero, por darme la oportunidad de realizar este trabajo de
investigacin y por su orientacin.
A la doctora Silvia Restrepo por las sugerencias y las observaciones hechas a este
trabajo.
Al Doctor Rodrigo Martnez, por su asesora en gentica de poblaciones.
Al Doctor Victor Nuez, por la asesora en laboratorio y correccin del proyecto.
Al Ingeniero Ivan Valbuena, por sus comentarios y asesoras en el anlisis estadstico
Al Doctor Mario Lobo, por sus comentarios y sugerencias.
Al Doctor Germn Cortina (q.e.p.d), docente UPTC, por su colaboracin, apoyo y
correccin del proyecto.
A Yaneth Camargo, por su valioso apoyo en laboratorio.
A Alexandra Olarte, por la orientacin en laboratorio.
A Erika, Ivan, Zulma Cardenas, Natalia, Sandra Barrera, Diana Arias, Silvia, Mauricio y
Jennifer, por su apoyo y colaboracin.
A Sandra Hernndez, Diana Daz, Diana Gonzlez, por su compaa y apoyo.
A mi alma mater, la Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia.
A Colciencias por el apoyo financiero para el desarrollo del proyecto.
A CORPOICA, por la facilitacin de las instalaciones y equipos.
Y a todas las personas que de alguna u otra forma contribuyeron al desarrollo de este
proyecto.
CONTENIDO
pg.
RESUMEN........................................................................................................................... 10
INTRODUCCIN ............................................................................................................... 11
1. OBJETIVOS ................................................................................................................ 12
1.1 Objetivo General ....................................................................................................... 12
1.2 Objetivos Especficos................................................................................................. 12
2. MARCO TERICO......................................................................................................... 13
2.1 SOLANCEAS ......................................................................................................... 13
2.1.1 Descripcin. ........................................................................................................ 13
2.1.2 Importancia. ....................................................................................................... 13
2.2 GENERALIDADES DEL LULO Y DEL TOMATE DE RBOL........................... 13
2.2.1
Lulo (Solanum quitoense) Lam.................................................................... 14
2.2.1.1 Origen y distribucin. ................................................................................. 14
2.2.1.2 Clasificacin taxonmica. . ........................................................................ 15
2.2.1.3 Importancia. ................................................................................................ 16
2.2.1.4 Produccin Nacional. ................................................................................ 16
2.2.1.5 Cultivo......................................................................................................... 16
2.2.2
Tomate de rbol (Solanum betaceum) Cav. Sendt...................................... 17
2.2.2.1 Origen y Distribucin.................................................................................. 17
2.2.2.2 Clasificacin taxonmica. ........................................................................... 18
2.2.2.3 Importancia.. ............................................................................................... 19
2.2.2.4 Produccin Nacional. ................................................................................ 19
2.2.2.5 Cultivo. ...................................................................................................... 19
2.3.1 Diversidad Gentica ............................................................................................... 20
2.3.2 Medida de la variacin gentica......................................................................... 20
2.3.2.1 Estructura poblacional................................................................................. 21
2.3.2.2 Endogamia. ................................................................................................. 21
2.3.2.3 ndices de fijacin. ...................................................................................... 21
2.3.3 Distancias gnicas. ............................................................................................. 23
2.4 MARCADORES MOLECULARES ........................................................................ 23
2.4.1 Marcadores COS I. ........................................................................................... 25
2.4.2 Marcadores COS II. ......................................................................................... 25
2.4.2.1 Elaboracin de cebadores Universales COS II. . ....................................... 27
2.4.2.2 Ventajas de utilizar COS II en lulo y tomate de rbol. .............................. 27
2.5 CONOCIMIENTO Y USO DE LA VARIABILIDAD GENTICA DE
COLECCIONES DE GERMOPLASMA. ....................................................................... 28
2.5.1 Estado actual de la investigacin en lulo y tomate de rbol. .......................... 28
3. MATERIALES Y MTODOS ....................................................................................... 30
3.1 Localizacin .............................................................................................................. 30
3.2 Material Biolgico .................................................................................................... 30
3.3 Siembra de semillas.................................................................................................... 30
LISTA DE TABLAS
pg.
Tabla 1. Parmetros agroecolgicos y requerimientos edficos del cultivo de lulo. .......... 16
Tabla 2. Parmetros agroecolgicos ptimos en el cultivo de tomate de rbol. ................ 19
Tabla 3. Principales marcadores moleculares, utilizados actualmente en investigaciones
tanto en animales como en plantas....................................................................................... 24
Tabla 4. Composicin del buffer de extraccin general de ADN. ...................................... 31
Tabla 5. Condiciones de PCR para marcadores COS II utilizadas en este estudio............. 32
Tabla 6. Caractersticas de los loci polimrficos para lulo. ................................................ 37
Tabla 7. ndices de diversidad de acuerdo a Nei (1978) e ndices de fijacin de acuerdo a
Wright (1921) por cada accesin de lulo. ............................................................................ 38
Tabla 8. Aporte a la varianza total en el anlisis de componentes principales por accesiones
y locus en la poblacin de lulo............................................................................................. 41
Tabla 9. Caractersticas de los loci polimrficos para tomate de rbol............................... 45
Tabla 10. ndices de diversidad de acuerdo a Nei (1978) e ndices de fijacin de acuerdo a
Wright (1921) por cada accesin de tomate de rbol........................................................... 46
Tabla 11. Aporte a la varianza total en el anlisis de componentes principales por
accesiones y loci en tomate de rbol. ................................................................................... 47
LISTA DE FIGURAS
pg.
Figura 1. Fruto de lulo (Solanum quitoense) Lam .............................................................. 14
Figura 2. Distribucin de Solanum quitoense en Amrica. Fuente:.................................... 15
Figura 3. Fruto del tomate de rbol (Solanum betaceum) Cav. Sendt. .............................. 17
Figura 4. Distribucin de Solanum betaceum en Amrica.................................................. 18
Figura 5. rbol filogentico mostrando el grupo Euasteridae y plantas de relevancia sobre
las cuales pueden ser implementados los marcadores COSII debido a su proximidad
filogentica........................................................................................................................... 26
Figura 6. Diseo de cebadores Universales para especies de Euasteride I (UPA) en un
grupo COS II. (A)Alineamiento mltiple de especies de Euasteride I y el correspondiente
ortlogo de Arabidopsis. (B) Los iUPAs por lo general amplifican secuencias intrnicas,
mientras que los eUPAs amplifican por lo menos 400 pb de secuencias exnicas con o sin
la intervencin de intrones. .................................................................................................. 27
Figura 7. Bandeja de 124 alveolos con semillas de lulo y tomate de rbol bajo condiciones
de invernadero...................................................................................................................... 30
Figura 8. A. Electroforesis en gel de agarosa al 1 %, visualizando el ADN en lulo. Se
relacionan los 3 ltimos nmeros de cada accesin. B. Electroforesis en gel de agarosa al 2
%, de productos de PCR en accesiones de lulo utilizando un marcador COS II. Se
relacionan los dos ltimos nmeros de cada accesin seguido por el nmero de planta
excepto para las accesiones terminadas en 03 y 028............................................................ 35
Figura 9. Valores acumulados de los 4 componentes principales en Lulo. ........................ 40
Figura 10. rbol consenso de lulo, elaborado a partir de un bootstrap de 10000
repeticiones, utilizando el mtodo de agrupamiento UPGMA. ........................................... 42
Figura 11. A. Electroforesis en gel de agarosa al 1 %, visualizando el ADN en tomate de
rbol. Se relacionan los 2 ltimos nmeros de cada accesin, seguido por el por el nmero
de planta. Se observa que el buffer de extraccin de Fulton et al fue mas apropiado que el
de Partill et al, 2001. B. Electroforesis en gel de agarosa al 2 %, de productos de PCR en
accesiones de tomate de rbol, utilizando 3 marcadores COS II, Se relaciona el ltimo
nmero de cada accesin...................................................................................................... 43
Figura 12. Valores acumulados de los 4 componentes principales en tomate de rbol...... 47
Figura 13. rbol consenso de tomate de rbol, elaborado a partir de un bootstrap de 10000
repeticiones, utilizando el mtodo de agrupamiento UPGMA. ........................................... 48
LISTA DE ANEXOS
pg.
Anexo 1. Accesiones de lulo usadas en el anlisis de diversidad........................................ 57
Anexo 2. Accesiones de tomate de rbol usadas en el anlisis de diversidad. ................... 58
Anexo 3. COSII identificados a partir de geles y secuencia analizados para la seleccin de
marcadores polimrficos en lulo y tomate de rbol. En negrita se relacionan los marcadores
polimrficos para cada especie. ........................................................................................... 59
Anexo 4. Estimacin de la concentracin y calidad del ADN de lulo, a travs de la lectura
de absorbancia de rayos UV (260/280 nm).......................................................................... 60
Anexo 5. Allo (s) presentes en cada accesin de lulo. A cada alelo observado por locus se
le dio una connotacin numrica.......................................................................................... 61
Anexo 6. ndices de diversidad de acuerdo a Nei (1978) e ndices de fijacin de acuerdo a
Wright (1921) por cada loci analizado en lulo..................................................................... 62
Anexo 7. Matriz de distancias gnicas en lulo utilizando la mnima distancia de Nei (1978).
Se relacionan los dos ltimos nmeros de cada accesin. ................................................... 63
Anexo 8. Distribucin espacial de los grupos conformados por las accesiones de lulo en
Colombia. ............................................................................................................................. 64
Anexo 9. Estimacin de la concentracin y calidad del ADN de tomate de rbol, a travs de
la lectura de absorbancia de rayos UV (260/280 nm). ......................................................... 65
Anexo 10. Allo (s) presentes en cada accesin de tomate de rbol. A cada allo observado
por locus se le dio una connotacin numrica. .................................................................... 66
Anexo 11. ndices de diversidad de acuerdo a Nei (1978) e ndices de fijacin de acuerdo a
Wright (1921) por cada loci analizado en tomate de rbol .................................................. 67
Anexo 12. Matriz de distancias gnicas en tomate de rbol utilizando la mnima distancia
de Nei (1978). Se relacionan los dos ltimos nmeros de cada accesin. ........................... 68
Anexo 13. Distribucin espacial de los grupos conformados por las accesiones de tomate de
rbol en Colombia. ............................................................................................................... 69
RESUMEN
Especies frutales de la familia solancea, provenientes de la zona andina, pueden llegar a
convertirse en productos prominentes de consumo nacional y de exportacin. Entre estas, se
destacan el lulo (Solanum quitoense) y el tomate de rbol (Solanum betaceum) (Lobo et al.,
2002). Estas especies representan alternativas productivas para los pequeos agricultores,
poseen un alto valor nutritivo, y pueden ser utilizadas para la conservacin y regeneracin
de ecosistemas de ladera (Lentini, 2003). Peso a esto, su adopcin como cultivo por parte
de agricultores locales, presenta limitantes relacionados con la falta de sustento
tecnolgico, asociado con una oferta casi nula de materiales mejorados. Estos aspectos,
aunados al poco conocimiento de la variabilidad gentica de estas especies, disminuyen las
posibilidades de un mejoramiento gentico eficiente. As, se hace necesario conocer y
complementar la variabilidad gentica para direccionar adecuada y eficientemente su
mejoramiento. El presente estudio pretende contribuir al conocimiento de la variabilidad
gentica de estas especies a travs del uso de marcadores provenientes de Secuencias
Ortlogas Conservadas (COSII) en 32 accesiones de lulo y taxa relacionados y 30
accesiones de tomate de rbol y taxa relacionados. De los 30 marcadores COSII evaluados
para cada especie se seleccionaron 6 para lulo y 5 para tomate de rbol, por su alto nivel de
polimorfismo, con un total de 47 y 39 alelos respectivamente, y un promedio de 7.8 alelos
por especie. Se observ estructura poblacional en cada especie con valores altos de
homocigosis dentro de las accesiones (FIS = 0.46 para lulo y 0.90 para tomate de rbol), y
una alta diferenciacin entre las mismas (FST = 0.93 para lulo y 0.99 para tomate de rbol).
Estos resultados se pueden explicar por las barreras geogrficas entre las accesiones, la
adaptacin a diferentes nichos, modo de reproduccin de las especies, y, el tipo de
marcadores utilizados. El anlisis de componentes principales (ACP) y de distancias
gnicas concuerda con la alta estructura poblacional ya que para ACP la variacin total fue
explicada por bajos porcentajes (32.55% y 35.94% para lulo y tomate de rbol,
respectivamente) y para distancias gnicas se observ un amplio rango de variabilidad entre
accesiones (0.1 1 para lulo y 0.2 1 para tomate de rbol) y agrupamientos con bajos
valores de confiabilidad (bootstrap).
10
INTRODUCCIN
Desde su origen, el ser humano ha domesticado las plantas segn sus necesidades y
posibilidades, convirtindolas en su principal fuente de sustento. Durante este proceso de
domesticacin, el hombre seleccion de manera gradual, caracteres de inters alimenticio
y emprendi, sin saberlo, un proceso microevolutivo que contina hoy. A travs de este
evento se manifiestan algunas de las especies de mayor importancia a nivel global,
destacndose en este, el grupo de las Solanceas, que tiene como foco de diversidad el
neotrpico.
Este grupo representa uno de los taxa de mayor inters econmico, ya que algunas de sus
especies como el lulo (Solanum quitoense) y el tomate de rbol (Solanum betaceum),
constituyen importantes fuentes de alimento y son reconocidas por su gran potencial de
desarrollo y aceptacin. Adems, figuran como una alternativa en la conservacin de
ecosistemas intervenidos y reemplazo de cultivos ilcitos.
Pese a esto, poco se conoce acerca de la variabilidad gentica de estas especies,
disminuyendo las posibilidades de un mejoramiento eficiente en cuanto a caracteres de
resistencia, calidad y produccin. Hasta el momento se han adelantado estudios que
utilizan descriptores morfoagronmicos en lulo (Giraldo, 2005) y tomate de rbol
(Garca et al., 2002) y moleculares como AFLPs en lulo (Fory et al., 2004; Fory 2005;
Charry 2005; Barrera 2006). Dado que los AFLPs son marcadores de tipo dominante, es
decir, no distinguen el homocigoto del heterocigoto, se hace necesario utilizar
marcadores ms informativos (codominantes) que permitan una interpretacin ms
precisa de su diversidad, la identificacin de hbridos intra e inter especficos, o asistan
ms eficientemente los procesos de introgresin gnica.
El presente estudio pretende utilizar marcadores codominantes que permitan
complementar la caracterizacin de la variabilidad gentica de las colecciones
colombianas de lulo y tomate de rbol, la cual se encuentra depositada en el banco de
germoplasma de CORPOICA y cuenta con 153 accesiones de lulo y taxa relacionados y
75 de tomate de rbol y taxa relacionados. De stas, se tomaron 32 accesiones de lulo y
30 accesiones de tomate de rbol y se estudi su variabilidad gentica mediante el uso de
marcadores COSII o Secuencias Ortlogas Conservadas. Los COSII corresponden a un
nuevo tipo de marcadores moleculares, adecuados para estudios de taxonoma,
diversidad, filogenia y genmica comparativa en especies de la familia Solancea y taxa
relacionados.
11
1. OBJETIVOS
12
2. MARCO TERICO
2.1 SOLANCEAS
Las solanceas son una de las familias ms grandes de angiospermas, con 147 gneros y
2930 especies (Judd et al., 2002). Esta familia tiene una amplia distribucin mundial,
pero la concentracin ms grande de gneros y especies se encuentra en Sur y Centro
Amrica. Esto sugiere, que la familia se origin en esta parte del planeta, en la porcin
meridional de la Pangea denominada Gondwana (Hawkes, 1999), conformada por
Sudamrica, frica, Australia, India y la Antrtica. El centro de diversidad de este grupo
esta cerca al Ecuador, al acumular variaciones genticas adaptativas en diversos nichos
ecolgicos, durante las glaciaciones.
2.1.1 Descripcin. La familia comprende hierbas, arbustos o rboles, usualmente con
floema interno presente; diversas vellosidades, algunas veces con espinas. Las hojas son
alternas o espiraladas, frecuentemente en pares, simples, algunas veces profundamente
lobadas o incluso compuestas, enteras a aserradas, con venacin pinada, estpulas
ausentes. Inflorescencia generalmente terminal, algunas veces reducidas a una sola flor,
cimosas. Flores perfectas pequeas a muy grandes; cliz gamospalo; corola simptala,
rotada a tubular, (4)5(7) lbulos convolutos, imbricados o valvados; estambres
adheridos a la base del tubo de la corola, en igual nmero y alternos a los lbulos o
reducidos a anteras con dehiscencia longitudinal o por poros; ovario spero, bicarpelar,
generalmente bilocular, numerosos vulos en elaboradas placentas axilares; Fruto en
baya o cpsula (Judd et al., 2002).
2.1.2 Importancia. Las Solanceas han sido una de las familias ms importantes en el
abastecimiento de plantas tiles para la humanidad (Heiser, 1993). La mayora de sus
miembros son venenosos, debido a la presencia de tropano o alcaloides esteroides.
Tambin son fuente para la elaboracin de drogas y algunas poseen poderosos
narcticos, frutos comestibles y tiles en ornamentacin (Judd et al., 2002).
13
2.2.1
Tambin llamado Naranjilla (Heiser, 1993; Lentini 2003), Naranjillo entre otras (CCI,
2004), es una fruta tropical extica de clima fro moderado (Figura 1). En Colombia, las
variedades de lulo conocidas son la Septentrionale, que se caracteriza por tener espinas en
ramas y tallos y la Quitoense, conocida comercialmente como lulo de castilla (Ministerio
de Agricultura: Lulo, 2000).
2.2.1.1 Origen y distribucin. El lulo es originario de los bosques hmedos del
subtrpico, en las vertientes oriental y occidental de la cordillera de los Andes (Heiser,
1999). Actualmente este fruto se cultiva en Venezuela, Costa Rica, Ecuador, Nicaragua,
Panam, Per y Colombia (Figura 2), (International Plant Genetic Resources Institute,
2006). En este ltimo, los hbitats caractersticos del lulo generalmente estn en las
plantaciones marginales de caf en la zona cafetera (Eraso, 1991).
14
Plantae
Tracheobionta
Spermatophyta
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Asteridae
Solanales
Solanaceae
Solanoideae
Solaneae
Solanum
Leptostemonum
15
Seccin:
Lasiocarpa
Especie:
Solanum quitoense
Fuente: United States Department of Agricultura. Natural Resourses Conservation plants
database, International Plant Genetic Resources Institute, 2006.
2.2.1.3 Importancia. El lulo es un fruto comestible con un atractivo sabor agridulce, que
aunados con su apariencia, fragancia, sabor nico (Heiser, 1993), facilidad de cultivo,
produccin continua y altos rendimientos, han permitido que se difunda a lo largo de Sur y
Centroamrica (Bernal et al., 1998). La pulpa de los frutos es utilizada en bebidas como
jugos y yogurt, adems en helados, jaleas y pasteles (Heiser, 1993; Giraldo, 2005:
International Plant Genetic Resources Institute, 2006). El fruto, tambin es rico en
vitaminas A y C (Heiser, 1993) y elementos que confieren propiedades antioxidantes
diurticas, tonificantes, regeneradoras de tejidos y purificadoras de sangre entre otras
(Giraldo, 2005; Ministerio de Agricultura y desarrollo Rural, 2000).
2.2.1.4 Produccin Nacional. En Colombia, el rea sembrada de lulo es de 5.750
hectreas y su produccin es 47.736 toneladas por ao (datos registrados en 2003). No
obstante la produccin anual no suple completamente la oferta del producto, por lo que se
debe importar grandes cantidades (3.935 toneladas, datos registrados en 2003), desde el
Ecuador (CCI 2005).
2.2.1.5 Cultivo. El lulo, se cultiva en diferentes pisos altitudinales, siendo su hbitat ms
caracterstico la zona cafetera. Este crece en forma espontnea en el sotobosque exhibiendo
hojas de gran tamao con ngulos de insercin hacia abajo, para captar la luz que pasa a
travs de los rboles (Lobo, 2000). Este, crece en suelos ricos en materia orgnica,
consumiendo mucho nitrgeno y calcio. Cualquier deficiencia de estos elementos conlleva
a una mayor sensibilidad hacia el ataque de patgenos o disminucin en la produccin
(Eraso, 1991). En la Tabla 1, se citan los principales parmetros agroecolgicos y
requerimientos edficos ptimos para el cultivo de este frutal.
Tabla 1. Parmetros agroecolgicos y requerimientos edficos del cultivo de lulo.
Clima
Altitud
Temperatura
Precipitacin
Humedad
Suelos
Parmetros agroecolgicos
Fro
1600 m. 2400 m.
16 C 24 C
1500 mm 3000 mm.
80% 100%
Requerimientos Edficos
Hmedos, ricos en materia
orgnica, bien drenados.
16
Acidez
Pendiente
Textura
5.4 6
30% - 40%
Media, Franco arcillosa o franco
arenosa.
Fuente: Eraso, 1991; Giraldo, 2005; Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural 2005.
2.2.2
17
Plantae
Tracheobionta
Spermatophyta
Magnoliophyta
Magnoliopsida
Asteridae
Solanales
Solanaceae
Solanoideae
Solaneae
Solanum
18
Subgnero:
Bassovia
Seccin:
Pachyphylla
Especie:
Solanum betaceum
Fuente: United States Department of Agriculture. Natural Resourses Conservation plants
database;
International
Plant
Genetic
Resources
Institute,
2006
(http://plants.usda.gov/java/name).
2.2.2.3 Importancia. El tomate de rbol se caracteriza por ser una fruta altamente
nutritiva, rica en vitaminas A y C y en minerales como calcio, hierro y fsforo, con bajos
niveles de caloras. Adems, posee un alto contenido de pepsina, pH cido y sabor
agridulce, factores que lo hacen atractivo para el procesamiento industrial (Ministerio de
Agricultura y Desarrollo Rural, 2000). Los frutos maduros enteros se utilizan en la
preparacin de bebidas alcohlicas y la pulpa es utilizada en jugos, helados, tortas, entre
otras (International Plant Genetic Resources Institute, 2006).
2.2.2.4 Produccin Nacional. Segn datos del Ministerio de Agricultura, en el ao
2003, el tomate de rbol particip con el 4,1 % de la produccin de frutas frescas sin
contar el banano. El rea sembrada de este frutal es de 7.686 hectreas y su produccin
es de 140.228 toneladas por ao (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2005).
2.2.2.5 Cultivo. La zona de concentracin del tomate de rbol, est en la regin cafetera
ya que posee un clima templado y una altura ideal para su cultivo. Adems, este frutal es
considerado en dicha zona como una alternativa en la diversificacin de reas de
amapola, siendo esta un rea ideal para su produccin (Ministerio de Agricultura y
Desarrollo Rural, 2005). En la Tabla 2 se citan los principales parmetros agroecolgicos
y requerimientos edficos ptimos para el cultivo de este frutal.
Tabla 2. Parmetros agroecolgicos ptimos en el cultivo de tomate de rbol.
Clima
Altitud
Temperatura
Precipitacin
Humedad
Suelos
Acidez
Pendiente
Parmetros agroecolgicos
Medio y Fro
2000 m. 2400 m.
9 C 20 C
1500 mm 3500 mm.
70% 80%
Requerimientos Edficos
Buen drenaje interno y externo
5.5 6.5
Hasta 70%
19
Textura
H =1 ix
i =1
20
21
que se aparea aleatoriamente). Estos ndices pueden ser usados para medir el grado de
diferenciacin que ha ocurrido entre subpoblaciones (Hartl & Clark, 1997).
La diferenciacin entre estas, est directamente relacionada con los coeficientes de
endogamia, entre y dentro de poblaciones. La endogamia de una poblacin total (FIT) puede
ser dividida en endogamia de individuos con respecto a subpoblaciones (FIS), y endogamia
debido a la diferenciacin entre subpoblaciones relativo al total de la poblacin (FST)
(Frankham et al., 2004). Estos son descritos a partir de la siguiente formula:
1 - FIT = (1 - FIS) (1 - FST).
Nei (1977), demostr que los ndices de fijacin, pueden ser definidos usando las
heterocigocidades esperadas y observadas para la poblacin bajo investigacin (Nei 1987),
usando las siguientes ecuaciones:
FIS = 1- (HI/HS)
FST = 1- (Hs/HT)
FIT = 1- (HI/HT)
Donde HI es el promedio de la heterocigocidad observada en todas las subpoblaciones, HS
es el promedio de la heterocigocidad esperada en equilibrio de Hardy Weinberg, en todas
las subpoblaciones, y HT la heterocigicidad esperada en equilibrio de Hardy Weinberg,
para el total de la poblacin (Frankham et al., 2004).
As, FIS, es el coeficiente de endogamia, promediado a travs de todos los individuos de
toda la subpoblacin. FST, es el efecto de la divisin poblacional o endogamia. Con altos
porcentajes de flujo gnico entre subpoblaciones, el FST es bajo. Con bajos porcentajes de
flujo gnico entre subpoblaciones, la poblacin diverge y llega a ser endogmica,
incrementando los valores de FST (Frankham et al., 2004). As, los valores de FST entre
ciertos rangos, indican el nivel de diferenciacin gnica entre una poblacin:
22
23
Abrevia tura
RFLP
No
basadas
en PCR
Basadas
en PCR
Uso
Nombre
Polimorfismos de
Longitud de
Fragmentos de
Restriccin
Estudios de
diversidad y
filogenia,
origen y
evolucin
Estudios de
identidad
gentica,
identificacin
de variedades
y cultivares
Estudios de
diversidad
gentica,
filogenia,
regulacin
gnica y
evolucin.
Ventaja
Moderadamente
polimrficos,
especificidad de
locus, codominantes
y alta
reproducibilidad
Desventaja
Requiere
grandes
cantidades de
ADN, pocos loci
detectados por
ensayo,
procedimientos
laboriosos y
exigentes
Requiere
grandes
cantidades de
ADN y
procedimientos
laboriosos
VNTR
Repeticiones en
Tandem de
Numero Variable
SSR
Secuencias
Simples Repetidas
SCAR
Secuencia
Caracterizada de
Regin
Amplificada
Mapeo de
genes y
seleccin
asistida
Rpido, fcil de
utilizar, baja cantidad
de ADN, alta
reproducibilidad
Se necesita
conocer la
secuencia en el
diseo de
primers
CAPS
Secuencia
Polimrfica
Amplificada
Cortada con
Enzimas
Mapeo de
genes
Codominancia, baja
cantidad de ADN y
alta reproducibilidad
Requiere anlisis
con enzimas
Alto polimorfismo y
reproducibilidad
Se encuentran a lo
largo del genoma,
alta especificidad,
codominantes
Deteccin de
mutaciones en
genes
Alelos codominantes
y se requiere baja
cantidad de ADN
Procedimientos
laboriosos y
conocimiento de
secuencias para
elaborar los
primers
RAPD
ADN Polimrfico
Amplificado
Aleatoriamente
Diversidad
gentica,
caracterizacin
de
germoplasma,
estructura
gentica de
poblaciones
Alto numero de
fragmentos, requiere
poca cantidad de
ADN, procedimiento
rpido
Baja
reproducibilidad
ISSR
Secuencias Inter-
Estudios de
Bajas cantidades de
Al ser multiloci,
SSCP
24
Simples Repetidas
AFLP
Polimorfismos de
Longitud de
Fragmentos
Amplificados
identidad
gentica,
familiar,
taxonmicos
Identidad
gnica y
familiar,
estudios de
filogenia y
mapeo de
genes
ADN, distribucin
aleatoria a travs del
genoma, no se
requiere conocer la
secuencia para
elaborar los
cebadores
Alta abundancia
genmica y
reproducibilidad,
amplia gama de usos,
no se requiere
conocer la secuencia
en la elaboracin de
primers
25
Figura 5. rbol filogentico mostrando el grupo Euasteridae y plantas de relevancia sobre las
cuales pueden ser implementados los marcadores COSII debido a su proximidad filogentica.
Tomado de Wu et al,. 2006.
Para propsitos prcticos, cada gen COS II, est referido en un locus correspondiente en
Arabidopsis y con base en esto, los cebadores se disean a partir de exones conservados y
amplifican secuencias intrnicas y/o exnicas.
Los COSII poseen ventajas respecto a los COS I, ya que debido a que son basados en PCR
los resultados se pueden visualizar en un tiempo ms corto y pueden ser utilizados para
evaluaciones a gran escala high throughput. Dado su carcter conservado en diferentes
especies de la familia Solancea y especies relacionadas, los marcadores COS constituyen
herramientas tiles para la construccin de mapas genticos comparativos y para la
identificacin de loci conservados de importancia econmica (QTLs).
Los COS II poseen caractersticas que los diferencian de los COSI, tales como:
El mtodo utilizado para establecer ortologa entre las diferentes especies
seleccionadas como el tomate, papa, pimentn y caf, fue ms exhaustivo.
Los anlisis filogenticos soportan su clasificacin como ortlogos.
Se presentan como genes de una sola copia en estas especies.
El diseo de cebadores universales, pueden amplificar contrapartes ortlogas (exones
y/o intrones) de otras especies de solanceas relacionadas (Wu et al., 2006).
En general, los marcadores COS II, constituyen una herramienta que establece redes de
sintenia en especies de Euasteride I (tomate, papa, tabaco, caf, oliva) y dicotiledneas
relacionadas. Adems, representan un valioso apoyo en estudios de filogenia, taxonoma,
diversidad, evolucin y organizacin del genoma en las Solanceas (Wu et al., 2006;
http://www.sgn.cornell.edu/markers/cosii_markers.html).
26
2.4.2.1 Elaboracin de cebadores Universales COS II. Los cebadores universales para
especies del clado Euasteride I (UPA), fueron diseados a partir de una secuencia consenso
de un grupo de genes COS II (Figura 6), los cuales amplificaban tanto regiones intrnicas
(iUPA) como exnicas (eUPA) en la mayora, si no en todas las especies de Solanceas y
taxa relacionados analizados (Wu et al., 2006). Actualmente, se encuentran disponibles
cerca de 2869 genes COSII (http://www.sgn.cornell.edu/markers/cosii_markers.html).
27
28
tomate de rbol. Se obtuvo una amplificacin por PCR del 84.4% y 76.5%,
respectivamente, en cada especie, lo cual sugiere una alta homologa de genes COSII en
especies solanceas.
29
3. MATERIALES Y MTODOS
3.1 Localizacin
El trabajo se llev a cabo en el Laboratorio de Gentica Molecular Vegetal del Centro de
Biotecnologa y Bioindustria (CBB), de la Corporacin Colombiana de Investigacin
CORPOICA, sede Tibaitat, ubicada en el municipio de Mosquera, Cundinamarca.
3.2 Material Biolgico
El material biolgico, representa 30 accesiones de lulo y 2 taxa relacionados y 26
accesiones de tomate de rbol y 4 taxa relacionados, de la Coleccin Colombiana
manejada por CORPOICA seleccionados con base en su distribucin geogrfica y
atributos morfoagrnomicos con la asesora del curador y genetista de la coleccin en
CORPOICA, Dr. Mario Lobo (Anexos 1 y 2).
3.3 Siembra de semillas
Se tomaron 15 semillas por accesin, las cuales fueron tratadas con KNO3 al 2% durante
12 horas con el fin de estimular su germinacin. Posteriormente, se trasfirieron a bandejas
de 126 alveolos con turba autoclavada, previamente desinfectadas con hipoclorito de sodio
al 5%. En las bandejas, se sembr cada accesin con 5 repeticiones y 3 semillas por
repeticin. Las bandejas con las semillas fueron mantenidas en condiciones de
temperatura (25oC) luminosidad (12 horas luz, 12 horas oscuridad) constantes (Figura 7).
Para asegurar el xito de germinacin de semillas, la siembra se llev a cabo por
duplicado en dos ambientes. Uno de ellos corresponde a CORPOICA C.I. La Selva en
Rionegro, Antioquia y el otro en CORPOICA C.I. Tibaitat, Mosquera, Cundinamarca.
Figura 7. Bandeja de 124 alveolos con semillas de lulo y tomate de rbol bajo condiciones de
invernadero.
30
Composicin
Concentracin Final
Sorbitol
Tris - HCL
EDTA
Tris - HCL
EDTA
NaCl
CTAB
-
6.4%
0.1M
0.005M
0.2 M
0.05M
4M
20%
5%
0.2%
31
Concentracin
1X
1.5 mM
0.2 mM
0.1 M
0.1 M
1u
25 g/mL
32
et al.). Se utiliz el mtodo de la media aritmtica no ponderada (UPGMA) para realizar los
agrupamientos. El soporte estadstico del rbol consenso se realizo mediante
Bootstraping de 10000 repeticiones, utilizando los programas Gendist (Nei, 1978),
UPGMA, Seqboot y Consense del paquete PHYLIP 3.5 (Felsenstein, 1989).
33
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.2 LULO
34
A.
B.
35
36
Nmero
de
Alelos
10
Rango de
peso en
lulo (pb)
743-1594
Tipo de
polimorfismo
(InDel/Caps )
InDel
iUPA
544-675
InDel
TGGGGTTGGATGGAGTGGAAAG
AGTAGAGGTTACGAATTTCCTCTGC
iUPA
400-548
InDel
TCGATCTCCTCTTTCATGGCG
TTGAGGaCAATAcGAaCAATCTTC
AGGTgATGGACGGTTCAGATATAATG
AACtTCTTTAAAcTCagTCTTGCTTAC
iUPA
943-1067
InDel
iUPA
1679-1898
InDel
AAGAAgCAACTgGttGATGATTGGG
TCCTTtTTgGatCgGTAttCAAGGTA
iUPA
15
758-968
InDel
Primers (5-3)*
Tipo1
Crom.1
C2_At5g66530
ttCAGGaATGgCATTTGCAAGTGTG
aCCATTGAATACAGCATCTGGTCGAAC
iUPA
C2_At2g34470
TTgAGGGAaAAaTACAGTCTTGC
AagAACTCtCCATCtTCTTTCGTG
C2_At3g17040
C2_At2g43360
Locus
C2_At4g38810
C2_At4g37280
Promedio:
7.8
Total:
47
1
Datos obtenidos de la localizacin y anlisis de marcadores COS II en el genoma del tomate (Feinan et al., 2006, www.sgn.cornell.edu).
Datos obtenidos de la pagina www.arabidopsis.org/servlets/TairObject
37
Funcin
del gen2
Protena
de
la
familia aldosa 1epimerasa.
Protena accesorio
de
la
ureasa
(UREG).
Procesamiento de
ARN, regulacin de
la
traduccin,,
organizacin
y
biognesis
de
plastidos
Actividad biotina
sintetasa
Protena
de
la
familia de unin a
Calcio EF
Protena
de
la
familia
de
ensamblaje
de
cromatina MRG
Referencias
Witte, et al.,
2005.
Sane at al.,
2005
Arnal et al.,
2006
Accesin
HI1
HS2
H2
P(0.99)
Promedio
de
alelos/locus
FIS4
FIT5
FST6
06L089
0.03
0.30
0.33
0.50
0.34
0.96
0.94
06L080
06L090
06L063
06L061
06L068
05T1688028
06L093
06L054
06L075
06L069
06L070
06L081
06L094
06L053
06L062
06L064
06L066
06L071
06L072
06L074
06L078
06L082
06L084
06L085
06L088
06L091
06L095
06L097
06L098
06L099
04T14203
0.10
0.10
0.23
0.03
0.10
0.17
0.0
0.03
0.0
0.03
0.03
0.03
0.03
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.25
0.21
0.16
0.08
0.08
0.08
0.08
0.08
0.05
0.03
0.03
0.03
0.03
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.27
0.23
0.18
0.09
0.09
0.09
0.09
0.09
0.06
0.03
0.03
0.03
0.03
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.50
0.33
0.33
0.33
0.33
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.17
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0.66
0.40
0.46
0.41
0.60
0.51
0.40
0.41
0.41
0.42
0.42
0.42
0.42
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.41
0.96
0.96
0.97
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.95
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.96
0.95
0.96
0.96
0.94
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.93
0.92
0.93
0.92
0.93
0.93
0.93
0.93
0.92
0.93
0.92
0.46
0.93
0.93
Promedio
1
Hartl (1988), adjudica este tipo de resultados al alto ndice de endogamia dentro de
subpoblaciones y al bajo flujo gnico entre las mismas. Esto es consistente con la baja
38
39
hecho que los 6 marcadores analizados han sido asignados por estudios de homologa
con Arabidopsis como genes que codifican para diferentes protenas que participan en
rutas
metablicas
intracelulares
de
plantas
(Tabla
6,
http://www.sgn.cornell.edu/search/direct_search.pl?search=markers). En este estudio se
utilizaron regiones iUPA que amplifican intrones (Tabla 6), los cuales en principio no
son influidos por presiones selectivas; sin embargo, los iUPA pueden tambin
amplificar regiones exnicas que si estaran influenciadas por estas presiones. Segundo,
en 3 de los COSII utilizados se evidenci la presencia de alelos nulos, visualizados
como la no amplificacin del producto de PCR. Estos pueden ser debidos a mutaciones
en el sitio de alineamiento del cebador, a la presencia de grandes intrones o a problemas
inherentes a la reaccin de PCR. Los alelos nulos producen una baja estimacin de
heterocigotos debido a que no permiten su deteccin, lo cual puede contribuir a los altos
ndices de fijacin de alelos dentro de subpoblaciones y diferenciacin entre las mismas.
La presencia de alelos nulos se ha reportado tambin para SSRs (Varshney et al., 2005).
4.2.5
9.42%
Comp. 1
8.44%
7.6%
Comp. 2
Comp. 3
7.08%
Comp. 4
40
La Tabla 8, muestra que el primer componente aporta el 9.42% del total de la variacin
y est explicada por 5 marcadores y solo una accesin. Los otros 3 factores, muestran
que existe un mayor aporte de las accesiones que de los loci. Dado que el aporte de cada
factor a la variacin total es similar, loci y accesiones estn contribuyendo de manera
similar.
Tabla 8. Aporte a la varianza total en el anlisis de componentes principales por accesiones y
locus en la poblacin de lulo.
Accesiones
Locus *
Aporte a la
Variacin total
(%)
06L082
C2_At3g17040 (3)
C2_At2g43360 (7)
C2_At2g34470 (3)
C2_At4g37280 (7)
C2_At5g66530 (4)
9.42
06L064
06L098
05T1688028
C2_At2g34470 (2)
C2_At3g17040 (2)
8.44
C2_At3g17040 (1)
C2_At2g43360 (1)
7.6
Componente
06L068
06L085
06L098
05T1688028
06L064
06L070
06L071
06L072
06L074
06L075
06L085
06L094
06L097
C2_At4g37280 (9)
C2_At2g34470 (6)
C2_At4g38810 (2)
7.08
Total
32.55
* Cada cifra en parntesis, corresponde al nmero del alelo presente en ese locus.
41
El grupo B, est conformado por accesiones provenientes de Valle (3), Cauca (4), Norte
de Santander (1), Magdalena (1), Santander (2) y Per (1).
El grupo C rene accesiones provenientes de Antioquia (2), Valle (1) y desconocido
(1).
El grupo D est conformado por una sola accesin, proveniente del departamento del
Magdalena (Anexo 1).
No se presenta una relacin de los agrupamientos observados con sitios geogrficos
(Figura 10 y Anexo 8) o con alguna otra caracterstica registrada para estas accesiones.
Como se menciono anteriormente, los bajos valores bootstrap, las altos ndices de
diversidad y estructura poblacional dificultan la posibilidad de establecer grupos de
similitud confiables.
11
0.86
1.16
0.45
0.75
22.5
1.5
0.3
A
20
0.18
0.67
0.07
0.8
0.69
0.8
30
1.4
0.55
1.1
05T16802
0.09
0.57
0.15
16
3
12.1
16.2
26
04T14203
14
15
D
Figura 10. rbol consenso de lulo, elaborado a partir de un bootstrap de 10000 repeticiones,
utilizando el mtodo de agrupamiento UPGMA.
Los resultados observados en el presente estudio difieren de los obtenidos por Fory
(2005), quien reporta una baja variabilidad en las especies cultivadas de lulo (Solanum
quitoense) con un nivel de similaridad del 85 al 100% utilizando el coeficiente de Nei
(1978). En el presente estudio, utilizando el mismo coeficiente, se observa un ndice de
similitud entre 0.1 a 1.0 indicando una alta variabilidad en accesiones de lulo (Anexo 7).
Esta diferencia puede estar relacionada con el tipo de marcadores moleculares
utilizados. Fory utiliza marcadores AFLPs, los cuales son de naturaleza dominante,
mientras los COS II son de carcter codominante y son diseados a partir de exones
conservados para amplificar secuencias intrnicas, lo cual incrementa la probabilidad de
encontrar
mayor
polimorfismo
42
Partill et
al,.2001
Partill et al,.2001
B.
3g28050
1g71810
1g44760
43
44
C2_At1g71810
tcatGCAGATCCACATCCTGGAAAC
aGTgACaAAaTCCTTGGCCAATGC
iUPA
Rango de
peso en
tomate de
rbol (pb)
1112-1350
C2_At4g00090
AGATATTgGCcaCCAcTCATGGTTC
AGGcGACCATGCCATGTCCG
iUPA
1450-1740
InDel
C2_At4g32930
TCCTCtTcctattGGCAAGGGC
TGGACACTCcCCCTTtTCATCATAC
iUPA
11
1450-2513
InDel
C2_At3g15430
TCGtTTgAGGtCaaCTTtAATGGAGG
aGTTGTtTCaGGCCCaTGACCAAG
eUPA
1146-1210
InDel
C2_At1g44760
TTCTTCaTctgCTgCTcATCTTGC
AGAgGGtTTTTTCTGACCCAAGAC
iUPA
794-1120
InDel
Locus
Primers (5-3)*
Tipo
Crom.
Nmero
de
Alelos
Tipo de
polimorfismo
(InDel/Caps )
InDel
Promedio:
7.8
Total:
39
1
Datos obtenidos de la localizacin y anlisis de marcadores COS II en el genoma del tomate (Feinan et al., 2006, www.sgn.cornell.edu).
Datos obtenidos de la pagina www.arabidopsis.org/servlets/TairObject.
45
Funcin
del gen2
Protena de la
familia ABC1.
Contiene dominio
Pfam.
Protena de la
familia de la
transducina /
repeticin WD-40
Protena expresada
Caenorhabditis
elegans.
Protena de la
familia de
regulacin de
condensacin del
cromosoma
(RCC1)
Protena de la
familia de estrs
universal (USP)
Referencias
Ytterberg et
al.. 2006.
Tabla 10. ndices de diversidad de acuerdo a Nei (1978) e ndices de fijacin de acuerdo a
Wright (1921) por cada accesin de tomate de rbol
Accesin
HI1
HS2
H3
P(0.99)
Promedio
de
alelos/locus
06TA042
0.096
0.11
0.08
0.2
1.2
06TA001
06TA004
06TA007
06TA008
06TA009
06TA010
06TA011
06TA013
06TA014
06TA015
06TA016
06TA018
06TA020
06TA022
06TA023
06TA024
06TA025
06TA026
06TA028
06TA031
06TA032
06TA033
06TA034
06TA035
06TA039
06TA041
06TA045
06TA047
06TA050
Promedio
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
FIS4
FIT5
FST6
1
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
0.90
1
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
1
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
46
de varianza total es atribuible al azar. As, al igual que en lulo, el nmero de variables
utilizadas no son suficientes para explicar el total de la variacin. Adems, la
inexistencia de genotipos heterocigotos y la alta diferenciacin entre poblaciones debe
influir en estos resultados.
10.7%
Comp. 1
9.06%
Comp. 2
7.92%
7.82%
Comp. 3
Comp. 4
La Tabla 11, muestra que el primer componente aporta el 10.69% del total de la
variacin y esta explicada por 5 marcadores y 4 accesiones. De la misma forma los otros
3 factores, muestran que existen aportes similares de los loci y de las accesiones.
Tabla 11. Aporte a la varianza total en el anlisis de componentes principales por accesiones y
loci en tomate de rbol.
Componente
Accesiones
06TA001
06TA025
06TA039
06TA045
06TA025
06TA032
06TA045
06TA001
06TA039
06TA025
Locus *
C2_At1g71810 (1)
C2_At4g00090
(1,6,8)
C2_At4g32930 (8)
C2_At3g15430 (1,4)
C2_At1g44760 (8)
C2_At4g00090 (1,6)
C2_At4g32930 (8)
C2_At3g15430 (3)
C2_At1g71810 (8)
C2_At4g00090 (1,8)
C2_At4g32930 (8,9)
C2_At1g71810 (2,6)
C2_At1g44760 (4,5)
Aporte a la
Variacin
total (%)
10.69
9.06
7.92
7.82
Total
35.49
* Cada nmero en parntesis, corresponde al nmero del alelo presente en ese locus.
47
100
14
1.6
5.5
6. 8
2. 1
0.2
7.3
5. 1
0.5
1.6
13
3.6
4. 2
0.2
5. 9
9.1
0.2
3.1
13
8.3
0.14
3.2
13
Figura 13. rbol consenso de tomate de rbol, elaborado a partir de un bootstrap de 10000
repeticiones, utilizando el mtodo de agrupamiento UPGMA.
Los ndices de similitud entre accesiones fueron de 0.2 - 1 (Anexo 12). Los grupos
conformados para esta especie, poseen accesiones de diferentes departamentos dispersas
en los mismos, incluyendo los taxa relacionados. As, al igual que en lulo, no se
presenta una relacin de los agrupamientos observados con sitios geogrficos o con
alguna otra caracterstica registrada para estas accesiones.
48
5. CONCLUSIONES
Se analizaron 6 loci polimrficos para lulo y 5 para tomate de rbol, con un promedio
de 7.8 alelos por locus, indicado que los marcadores COS II poseen una alta capacidad
de detectar variacin allica en estas especies.
Las colecciones de lulo y tomate de rbol estudiados presentan un alto ndice de
diferenciacin entre subpoblaciones y una baja diferenciacin dentro de las mismas
determinado por los valores de diversidad (H) y de fijacin (FIS, FST).
El anlisis de componentes principales (ACP) y de distancias gnicas concuerda con la
alta estructura poblacional ya que para ACP la variacin total fue explicada por bajos
porcentajes y para distancias gnicas se observo un amplio rango de variabilidad entre
accesiones y agrupamientos con bajos valores de confiabilidad (bootstrap).
Los resultados de los anlisis de diversidad para las dos especies se pueden explicar por
las barreras geogrficas, adaptacin a diferentes nichos, modo de reproduccin de las
especies, y, el tipo de marcadores utilizados.
Los resultados indican que los marcadores COS II son ms adecuados para estudios de
diversidad entre poblaciones de lulo y tomate de rbol que dentro de las mismas, e
implican que las labores de colecta sean dirigidas a muestreos interpoblacionales.
Dada la alta diferenciacin gnica (polimorfismo entre accesiones observada con
marcadores COSII) se podra inferir una buena probabilidad de xito en la obtencin de
heterosis (vigor hibrido) en cruces F1 entre accesiones. Adicionalmente, este alto
polimorfismo puede tambin ser utilizado para la generacin de mapas de ligamiento
gentico entre accesiones acoplado con anlisis de QTLs en futuros programas de
seleccin.
49
RECOMENDACIONES
50
BIBLIOGRAFA
ARNAL, N. et al. 2006. The Arabidopsis Bio2 protein requires mitochondrial targeting
for activity. Plant. Mol. Bio. 62(3).
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TriticumAegilops complex using wheat ESTSSRs. Plant Sci. 166(2): 349356.
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Tecnolgica de Colombia. Facultad de Ciencias Bsicas. Escuela de Ciencias
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2002. Disponible en:<www.bios.co.uk>
51
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sessiliflorum) and their hybrid. En: GUSTAFSON, J. (edit.). 1993. Gene Conservation
and Explotation. New York: Plenum Press. p. 29-34.
53
54
55
56
ANEXOS
Especie
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. hirtum
06L064
S. quitoense
06L066
06L068
S. quitoense
S. quitoense
06L069
06L070
06L071
06L072
06L074
06L075
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
06L078
06L080
06L081
06L082
06L084
06L085
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
06L088
S. quitoense
06L089
06L090
06L091
06L093
06L094
06L095
06L097
06L098
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
S. quitoense
06L099
S. quitoense
05T1688028
04T14203
S. hirtum
S. quitoense
57
Origen
Pitalito, Huila
Per
Rionegro, Antioquia
Antioquia
Aguas Calientes,
Santander
San Antionio Sibundoy
Putumayo
Tenjo, Palmira, Valle
Villa Mor,
Pasto,Nario
Meseta Jamundi, Valle
Juntas, Popayn, Cauca
Juntas, Popayn, Cauca
Buenaventura, Valle
Timbo, Cauca, Cauca
La Oculta, Timba,
Cauca
Blgica, Dovio, Valle
Blgica, Dovio, Valle
Blgica, Dovio, Valle
Blgica, Dovio, Valle
Holanda
Palmar, Sierra Nevada,
Magdalena
Santa Rosa de Osos,
Antioquia
Desconocido
Antioquia
Costa Rica
Villa de Leiva, Boyac
Concepcin, Antioquia
Cienaga, Magdalena
Charala, Santander
Lecho, Yarumal,
Antioquia
Cicutilla, Norte de
Santander
Venezuela
Cali, Valle
Especie
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
06TA007
S. betaceum
06TA008
S. betaceum
06TA009
06TA010
06TA011
06TA013
06TA014
06TA015
06TA016
06TA018
06TA020
06TA022
06TA023
06TA024
06TA025
06TA026
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
06TA028
S. betaceum
06TA031
06TA032
06TA033
06TA034
06TA035
06TA039
06TA041
06TA042
06TA045
06TA047
06TA050
S. betaceum
S. betaceum
S. betaceum
S. hartwegii var racemosa
S. betaceum
S. betaceum
S. corymbiflora
S. diversifolia
S. betaceum
S. diversifolia
58
Origen
Caractersticas
Santa Rosa de
Osos, Antioquia
Nario
Nario
Fruto grande y sano,
cnico, planta de 2.50
m. Fruto con aristas.
Cauca
Fruto elipsoidal, rojo,
mediano.
Valle
Fruto color rosado,
ciclo vegetativo 12-16
meses, fruto en baya
comestible.
Antioquia
Fruto maduro amarillo.
Caldas
Semilla blanca.
Caldas
Fruto rojo, ovoideo.
Boyac
Tolima
Tolima
Antioquia
Tipo rojo comn.
Antioquia
Tomate amarillo
gigante.
Desconocido
Gigante pulpa roja.
Tolima
Frutos rojizos, con
estras oscuras
elpticas.
Antioquia
Apariencia a un mango.
Nario
Huila
Antioquia
Se cosecho tomate
albino.
Antioquia
Material resistente a la
antracnosis.
Antioquia
2 frutos
Antioquia
10 frutos
Nario
Tolima
Kenia
Ecuador
Brasil
Venezuela
Tesorito, Caldas
Desconocido
Tomate de rbol
C2_At1g26520
C2_At1g44760
C2_At1g50575
C2_At1g71810
C2_At2g06530
C2_At2g34470
C2_At2g39690
C2_At2g43360
C2_At3g10220
C2_At3g10020
C2_At3g11210
C2_At3g15430
C2_At3g16150
C2_At3g17000
C2_At3g17040
C2_At3g19630
C2_At3g21610
C2_At3g28050
C2_At3g58470
C2_At3g62940
C2_At4g00090
C2_At4g03210
C2_At4g12230
C2_At4g14110
C2_At4g24830
C2_At5g20180
C2_At4g32930
C2_At4g37280
C2_At5g62390
C2_At5g66530
59
Concentracin
(ng/L)
277.12
312.49
375.42
292.89
762.94
921.18
1032.8
587.16
346.96
878.59
265.63
311.51
423.79
402.64
641.95
225.21
567.43
568.92
336.40
329.69
544.83
564
1312.5
747.24
421.77
938.71
264.57
516.37
309.20
285.97
1668.8
2116.4
60
Calidad
(260/280 nm)
2.27
1.94
2.13
2.17
1.94
2.0
1.87
1.95
2.0
1.92
2.1
1.97
1.92
2.1
1.94
2.29
2.1
1.90
1.74
2.0
1.92
1.78
1.38
1.65
1.83
1.75
1.74
1.88
1.92
1.95
1.62
1.7
Anexo 5. Allo (s) presentes en cada accesin de lulo. A cada alelo observado por locus
se le dio una connotacin numrica.
Accesiones
06L089
06L090
06L080
06L068
06L063
06L054
06L069
06L061
06L081
06L075
06L070
06L093
06L094
05T1688028
06L062
06L064
06L066
06L053
06L071
06L072
06L074
06L078
06L082
06L084
06L085
06L088
06L091
06L095
06L097
06L098
06L099
04T14203
Total de
alelos
C2_At4g38810
3
1
3
1
4
4
1
3
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
2
4
2
1
3
2
2
1
1
4
1
3
4
3
C2_At3g17040
4
4
1, 4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
1
4
4
4
4
4
4
4
4
3
4
4
4
4
4
4
2
4
4
C2_At2g43360
6
4
4
5, 8, 3
3
3
3
3
8
5
5
5
3
1
5
3
4
2
5
5
5
6
7
2
1
7
3
5
4
8
8
4
C2_At2g34470
5, 2
4
3
4
4
4
5
4
4
5
4
4
4
1, 3
4
4
4
4
4
4
5
5
3
4
6
4
4
4
4
2
4
5
C2_At4g37280
3, 8, 5, 13
12, 4, 8, 14, 5
7, 9, 10, 11, 12
15
2, 5
9, 13, 14
7, 11
5, 2
7, 11
4, 9
5, 10
5
13, 10
6
10
6
5
9
4
4
4
10
7
10
9
4
10
5
11
15
3
13
C2_At5g66530
9, 1, 7
10, 8
6
9, 10
3, 8
5
7
6
7
6
6
2, 10
9
9
5
7
7
4
5
6
6
7
4
7
6
7
9
9
9
6
10
10
15
10
61
62
FST6
0.90
0.92
0.90
0.92
0.95
0.93
0.92
Anexo 7. Matriz de distancias gnicas en lulo utilizando la mnima distancia de Nei (1978). Se relacionan los dos ltimos nmeros de cada
accesin.
Acce.
53
54
61
62
63
64
66
68
69
70
71
72
74
75
78
80
81
82
84
85
88
89
90
91
93
94
95
97
98
99
62
03
53
54
61
62
63
64
66
68
69
70
71
72
74
75
78
80
81
82
84
85
88
89
90
91
93
94
95
97
98
99
62
0.6
0.6
0.4
0.5
0.5
0.6
0.6
0.2
0.3
0.6
0.5
0.5
0.5
0.5
0.4
0.5
0.6
0.5
0.5
0.5
0.3
0.5
0.6
0.6
0.3
0.5
0.5
0.5
0.7
0.6
0.6
0.7
0.6
0.3
0.5
0.6
0.7
0.6
0.3
0.5
0.5
0.7
0.5
0.5
0.8
0.7
0.5
0.6
0.3
0.6
0.7
0.7
0.5
0.8
0.3
0.7
0.5
0.5
0.5
0.4
0.7
0.7
0.5
0.8
0.3
0.3
0.8
0.8
0.6
0.7
0.8
0.8
0.8
0.6
0.7
0.3
0.3
0.3
0.8
0.8
0.6
0.6
0.7
0.8
0.8
0.6
0.6
0.3
0.3
0.3
0.0
0.7
0.8
0.8
0.5
0.8
0.5
0.5
0.6
0.3
0.8
0.8
0.8
0.7
0.6
0.7
0.7
0.3
0.7
0.6
0.7
0.5
0.7
0.6
0.5
0.7
0.5
0.5
0.4
0.6
0.7
0.6
0.6
0.7
0.6
0.5
0.5
0.6
0.6
0.5
0.5
0.7
0.7
0.6
0.7
0.6
0.8
1
0.8
1
0.9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0.6
0.8
0.5
0.6
0.6
0.5
0.6
0.5
0.5
0.6
0.7
0.5
0.5
0.7
0.7
0.6
0.5
0.7
0.3
1
0.7
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.5
0.7
0.7
0.5
0.4
0.8
0.5
0.7
1
0.7
0.5
0.6
0.6
0.5
0.6
0.3
0.3
0.5
0.5
0.7
0.5
0.5
0.7
0.7
0.5
0.7
0.5
0.8
0.5
0.8
0.7
0.6
0.4
0.7
0.6
0.7
0.6
0.6
0.6
0.6
0.7
0.7
0.6
0.6
0.4
0.4
0.6
0.7
0.7
0.7
0.7
0.4
0.5
0.5
0.4
0.4
0.4
0.2
0.4
0.5
0.5
0.5
0.5
0.7
0.7
0.6
0.4
0.5
0.9
0.6
0.7
0.4
0.5
0.5
0.5
0.5
0.3
0.4
0.3
0.5
0.3
0.5
0.6
0.7
0.7
0.8
0.8
0.5
0.7
0.7
1
0.5
0.8
0.5
0.6
0.4
0.5
0.6
0.5
0.3
0.5
0.5
0.3
0.2
0.6
0.3
0.5
0.5
0.6
0.6
0.6
0.7
0.6
1
0.6
0.8
0.5
0.6
0.3
0.5
0.5
0.4
0.4
0.5
0.4
0.3
0.5
0.3
0.5
0.6
0.7
0.7
0.8
0.8
0.6
0.7
0.6
1
0.6
0.8
0.5
0.5
0.4
0.1
0.4
0.7
0.5
0.5
0.5
0.4
0.7
0.5
0.3
0.8
0.3
0.5
0.3
0.7
0.6
0.8
0.7
0.7
1
0.7
0.8
0.7
0.5
0.5
0.5
0.3
0.5
0.5
0.6
0.6
0.5
0.6
0.5
0.3
0.3
0.5
0.7
0.7
0.7
0.8
0.8
0.7
0.5
0.6
1
0.7
0.8
0.5
0.6
0.2
0.3
0.5
0.3
0.5
1
1
0.6
1
0.9
1
1
0.8
1
0.8
1
0.8
0.8
0.8
1
0.5
0.8
0.8
1
0.8
1
0.6
0.9
1
1
1
1
1
0.7
0.5
0.6
0.7
0.4
0.7
0.7
0.6
0.8
0.7
0.7
0.5
0.8
0.8
0.8
0.7
0.5
1
0.7
0.8
0.7
0.7
0.6
0.7
0.5
0.7
0.5
0.7
0.8
0.8
0.9
0.9
0.8
0.9
0.6
0.8
0.6
0.8
0.9
1
1
1
0.9
0.8
0.8
0.9
0.9
1
0.8
0.8
0.7
0.7
0.6
0.8
0.6
0.8
0.6
1
1
0.8
0.8
0.6
0.8
0.8
0.8
0.7
0.8
0.7
0.8
0.8
0.8
0.7
0.6
0.7
0.3
0.8
0.8
0.8
0.8
0.8
0.4
0.6
0.8
0.7
0.7
0.8
0.7
0.8
0.7
1
63
Anexo 8. Distribucin espacial de los grupos conformados por las accesiones de lulo en
Colombia.
A
B
C
Fuente: www.ub.es/.../Colombia/dades/colombiamap.htm.
64
Concentracin
(ng/L)
896.10
431.51
318.30
175.04
216.16
522.29
170.23
320.40
967.05
237.47
658.51
148.76
270.06
665.18
503.98
589.93
564.03
380.10
354.31
391.50
630.62
233.12
602.50
611.21
672.34
463.74
228.24
1170.2
248.81
385.77
65
Calidad
(260/280 nm)
1.72
1.64
1.50
1.41
1.70
1.63
1.85
1.46
1.62
1.71
1.72
1.41
1.35
1.47
1.59
1.70
1.71
1.47
1.76
1.64
1.59
1.62
1.52
1.36
1.69
1.44
1.59
1.72
1.58
1.62
Anexo 10. Allo (s) presentes en cada accesin de tomate de rbol. A cada allo
observado por locus se le dio una connotacin numrica.
Accesin
06TA042
06TA001
06TA004
06TA007
06TA008
06TA009
06TA010
06TA011
06TA013
06TA014
06TA015
06TA016
06TA018
06TA020
06TA022
06TA023
06TA024
06TA025
06TA026
06TA028
06TA031
06TA032
06TA033
06TA034
06TA035
06TA039
06TA041
06TA045
06TA047
06TA050
Total de
alelos
C2_At1g71810
1, 6
8
6
5
6
6
6
5
6
7
6
5
5
6
5
4
2
7
5
5
5
4
3
3
8
6
6
7
6
6
C2_At4g00090
1
8
8
8
8
3
8
4
4
3
4
5
3
8
5
3
6
3
3
3
6
3
3
8
8
8
2
7
4
3
C2_At4g32930
8
9
7
9
3
3
3
2
3
3
3
5
2
1
4
3
6
6
3
4
5
4
5
9
9
3
4
4
4
3
C2_At3g15430
1
1
3
1
3
2
1
3
3
4
3
5
4
4
4
5
4
4
6
4
5
5
4
3
6
5
3
3
2
1
C2_At1g44760
8
2
1
4
4
4
4
4
5
6
4
4
4
3
4
4
5
4
4
4
5
4
4
4
8
8
2
7
3
7
66
67
FST3
1.0
0.99
0.99
0.99
0.99
0.99
Anexo 12. Matriz de distancias gnicas en tomate de rbol utilizando la mnima distancia de Nei (1978). Se relacionan los dos ltimos nmeros de cada
accesin.
Acce.
01
04
07
08
09
10
11
13
14
15
16
18
20
22
23
24
25
26
28
31
32
33
34
35
39
41
42
45
47
50
01
04
07
08
09
10
11
13
14
15
16
18
20
22
23
24
25
26
28
31
32
33
34
35
39
41
42
45
47
50
0,8
0,4
0,8
0,6
0,8
0,6
0,4
0,8
0,8
0,75
0,8
0,8
0,4
0,8
0,6
0,8
0,6
0,6
0,6
0,6
0,8
0,6
0,6
0,85
0,8
0,8
0,8
0,6
0,8
0,4
0,6
0,8
0,6
0,6
0,8
0,6
0,8
0,8
0,6
0,6
0,8
0,8
0,8
0,4
0,6
0,8
0,75
0,8
0,4
0,2
0,6
0,4
0,8
0,2
0,8
0,8
0,6
0,8
0,6
0,8
0,6
0,8
0,8
0,8
0,4
0,8
0,4
0,6
0,85
0,8
0,8
0,6
0,4
0,8
0,6
0,6
0,4
0,8
0,6
0,8
0,8
0,4
0,6
0,4
0,6
0,6
0,6
0,8
0,6
0,8
0,85
0,6
0,4
0,6
0,8
0,4
0,8
0,8
0,6
0,8
0,6
0,8
0,6
0,8
0,8
0,8
0,6
0,8
0,4
0,8
0,65
0,8
0,4
0,6
0,4
0,6
0,4
0,6
0,8
0,8
0,6
0,6
0,8
0,8
0,8
0,6
0,8
0,95
0,8
0,8
0,8
0,2
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,6
0,6
0,85
0,8
0,6
0,6
0,6
0,8
0,8
0,6
0,8
0,4
0,6
0,6
0,8
0,6
0,8
0,95
0,8
0,6
0,8
0,8
0,8
0,8
0,6
0,8
0,6
0,8
0,8
0,8
0,6
0,6
0,6
0,85
0,8
0,6
0,6
0,6
0,4
0,6
0,8
0,6
0,6
0,4
0,6
0,6
0,8
0,8
0,95
0,8
0,4
0,6
0,8
0,4
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,8
0,95
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,6
0,8
0,85
0,6
0,8
0,8
0,8
0,6
0,6
0,2
0,8
0,6
0,6
0,8
0,8
0,95
0,8
0,8
0,6
0,4
0,6
0,8
0,2
0,6
0,8
0,6
0,95
0,6
0,8
0,6
0,8
0,95
0,6
0,4
0,6
0,4
0,8
0,95
0,8
0,8
0,4
0,8
0,6
0,6
0,8
0,8
0,8
0,95
0,6
0,8
0,4
0,4
0,8
0,8
0,95
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,95
0,6
0,8
0,8
0,8
0,95
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,6
0,6
0,95
0,8
0,6
0,8
0,6
0,8
1
0,95
0,75
0,8
1
1
1
1
1
0,8
0,65
0,8
0,6
0,85
0,6
0,6
0,8
0,95
0,85
0,65
0,8
0,8
0,8
68
Anexo 13. Distribucin espacial de los grupos conformados por las accesiones de
tomate de rbol en Colombia.
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
Fuente: www.ub.es/.../Colombia/dades/colombiamap.htm.
69