Aislamiento de Microorganismos Amilolíticos y Producción de Amilasa en Cultivo Sumergido y Mediante Fermentación en Estado Sólido

CC4020 Laboratorio de Microbiologa industrial
24/06/2014
Laboratorio de Micologa y Biotecnologa
Villena, G.K. Departamento Acadmico de Biologa. Facultad de Ciencias
Universidad Nacional Agraria La Molina. Lima - Per
Aislamiento de microorganismos amilolticos y produccin de amilasa en cultivo

sumergido y mediante fermentacin en estado slido.
Bazo, Isamar1; Garca, Katherine 1; Gonzales, Jaime1- & Rodrguez, Angel1
1
Pregrado- biologa, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Agraria La Molina
Summary
Microorganisms with amylolytic activity were isolated from a sample of garden soil in the San
Luis , Lima-Peru, with enrichment in situ. Penicillium sp strain was selected. Which showed a
higher hydrolysis halo (9 mm) in a petri dish with isolation medium and cultured by a
submerged fermentation systems (FS) and into a fermentation system solid substrate (FSS) for
the production of extracellular amylases. The enzymatic activities obtained were ..... IU / ml and
...... IU / ml respectively in FS and FSS. Added to this, the volumetric productivity of the enzyme
in FS ( E = 32.3112 gL-1h-1) was lower than the productivity volumentrica FSS ( E =
150.4192 gL-1h-1), showing the FSS system has a significant advantage in the production of
enzyme over the FS system.
Resumen
Se aislaron microorganismos con actividad amiloltica a partir de una muestra de suelo de
jardn del distrito de San Luis, Lima-Per, con enriquecimiento in situ. Se seleccion una cepa
de Penicillium sp., la cual evidencio un mayor halo de hidrolisis (9 mm) en una placa Petri con
medio de aislamiento y se cultiv por medio de un sistemas de fermentacin sumergida (FS) y
en un sistema de fermentacin en sustrato slido (FSS) para la produccin de amilasas
extracelulares. Las actividades enzimticas obtenidas fueron de ..UI/ml y UI/ml en FS Y
FSS respectivamente. Adicionado a esto, la productividad volumtrica de la enzima en FS (
-1 -1
-1 E= 32.3112 gL h ), fue menor que la productividad volumentrica en FSS ( E =150.4192 gL h
1
), mostrando as el sistema FSS una ventaja significativa en la produccin de enzima sobre el
sistema FS.
Introduccin
El almidn es el principal polisacrido de reserva de los alimentos en la naturaleza y es la
principal fuente de carbohidratos en la dieta humana. La utilizacin de almidn para
aplicaciones industriales ha aumentado considerablemente en las ltimas dcadas (Rani,
2004). Las amilasas constituyen uno de los grupos ms importantes de enzimas industriales
que presentan varias aplicaciones en la industria de los alimentos, textil y en fabricacin de
etanol (Machado de Castro et al., 2010).
Las amilasas son enzimas extracelulares que se encuentran ampliamente distribuidas en
plantas, bacterias, hongos y animales, estas hidrolizan las molculas de almidn en polmeros
Aislamiento de microorganismos amilolticos y produccin de amilasa en
cultivo sumergido y mediante fermentacin en estado slido.

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compuestos de unidades de glucosa (Neerja et al., 2013). Las amilasas producidas por
microorganismos han sustituido con xito a la hidrlisis qumica del almidn dentro de esta
industria. La primera enzima producida industrialmente era una amilasa a partir de una fuente
fngica en 1894, que fue utilizada como una ayuda farmacutica para el tratamiento de
trastornos digestivos (Pandey et al., 2000). Dos clases importantes de amilasa han sido
identificadas en microorganismos, llamadas -amilasas y glucoamilasas. Las amilasas
(E.C 3.2.1.1) son enzimas que catalizan la hidrolisis de los enlaces glucosidicos internos los
1,4 y -1,6 en el almidn de bajo peso molecular dando como productos unidades de
glucosa, maltosa y maltotriosa; dentro del origen microbiano, las amilasas de origen fngico
han sido identificadas como ms estables que las bacterianas a escala comercial. Por lo tanto
los intentos para optimizar las condiciones de cultivo se han realizado sobre las cepas
adecuadas de hongos. Entre los gneros de microorganismos productores de amilasas
estn Aspergillus, Bacillus y Penicillium (Neerja et al., 2013). Por otro lado, Las glucoamilasas
(EC 3.2.1.3) de origen fngico atacan enlaces -1, 4, liberando molculas de D-glucosa en la
configuracin ; esta enzima tambin ataca enlaces -1, 6 en puntos de ramificacin en la
molcula de amilopectina, pero mucho ms lentamente que en un -1, 4 (Gomes et al., 2005).
La mayora de los procesos industriales se utilizan enzimas para hidrolizar el almidn en
glucosa, normalmente en un proceso de dos pasos: licuefaccin y sacarificacin. En la primera
etapa, el almidn se gelatiniza mediante un tratamiento trmico en exceso de agua a
temperaturas superiores a 110 C. Durante el tratamiento trmico, el almidn tambin se
hidroliza por una -amilasa termoestable, donde esta corta al azar los enlaces -1,4 de las
cadenas largas de almidn para obtener como producto las maltodextrinas, que se aade a la
suspensin de almidn justo antes del tratamiento trmico. Debido a las diferencias en la
escala de tiempo del proceso de gelatinizacin y licuefaccin enzimtica, la pasta de almidn
se enfra hasta a 95 C y se mantiene a esta temperatura durante 60-90 minutos para
completar la licuefaccin enzimtica. Despus de este paso en la segunda etapa, la mezcla se
enfra a aproximadamente hasta 60 C y las maltodextrinas producidas en la primera etapa
se hidrolizan completamente a la glucosa por una glucoamilasa, quien hidroliza los enlaces 1,6 del extremo no reductor de la cadena de dextrina, liberando la glucosa. El exceso de agua
se utiliza para facilitar la gelatinizacin y asegurar una mezcla suficiente durante la reaccin
(Van der Veen et al., 2006).


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Tradicionalmente, las amilasas han sido producidas por fermentacin sumergida (SMF)
utilizando un proceso de una sola va en solucin y mediante medio sinteticos, pero en los
ltimos aos los procesos de fermentacin en estado slido (SSF) se han utilizado cada vez
ms para la produccin de esta enzima (Kunamneri et al., 2005). SSF es un proceso que
implica el crecimiento de microorganismos (principalmente hongos) en sustratos slidos
hmedos en la ausencia de agua de flujo libre (Gutirrez-Correa y Villena, 2003). El sustrato
solido puede proveer no solo soporte sino tambin nutricin. Las bacterias, levaduras y hongos
pueden crecer en sustratos slidos y encontrar aplicaciones en los procesos de SSF mas los
hongos filamentosos son los mejores adaptados para SSF (Balkan y Ertan, 2007). La forma de
crecimiento de las hifas y la buena tolerancia a la baja actividad de agua a w) ms la alta
condicin de presin osmtica, hace a los hongos ms eficiente para la bioconversin de
sustratos slidos (Alva et al., 2007). Balkan y Ertan (2007) consideran que los principales
factores que afectan a la sntesis microbiana de la enzima en un sistema SSF incluyen la
seleccin de sustrato y microorganismo adecuado, tamao de partcula del sustrato, la
concentracin del inculo y el nivel de humedad del sustrato; en el SSF, la seleccin de
sustrato slido adecuado para el proceso de fermentacin es un factor crtico y por lo tanto
implica la proyeccin de un nmero de materiales agroindustriales para el crecimiento
microbiano y la formacin de producto, como salvado de trigo, hojas de maz, paja de centeno
y de la paja del trigo son algunos de ellos. SSF en comparacin con la fermentacin sumergida
es ms simple, requiere un capital inferior, tiene una productividad superior, los requerimientos
de energa son reducidos, medios de fermentacin ms simples y la ausencia de un riguroso
control de parmetros de la fermentacin, utiliza menos agua produce agua residual en
menores cantidades, tiene un control ms fcil de la contaminacin bacteriana y requiere de
bajo coste de procesamiento downstream (Saranja y Stella, 2013).
En el presente estudio se emple enriquecimiento in situ para aislar microorganismos
amilolticos. La cepa seleccionada se utiliz para la produccin de amilasas en dos diferentes
sistemas de fermentacin; el sistema de fermentacin sumergida en frascos agitados y
fermentacin en sustrato slido en salvado de trigo, adems de determinar el sistema con
mayor rendimiento.
Materiales y mtodos
Enriquecimiento in situ

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Se tom una muestra de suelo del distrito de San Luis, Lima-Per (-12.078588, -77.003300),
del cual se seleccion un rea de 1m 2 de suelo. Se retir el material vegetal y se removi el
suelo hasta 5 cm de profundidad. El enriquecimiento se realiz con 500 g de almidn de papa
(chuo) de manera uniforme y se aadi una vez cada 7 das por el periodo de dos semanas,
luego de 4 das del ltimo enriquecimiento se agreg 100 g cada da por el plazo de 3 das.
Asimismo, se mantuvo la humedad en el rea.
Muestreo
Se tom 100 g de suelo con tratamiento de enriquecimiento in situ y uno previo al tratamiento,
en un recipiente desinfectado y se guard en un lugar fresco, pero no refrigerado.
Aislamiento de microorganismo amilolticos
Se pes 10 g de suelo y se aadi a un matraz Erlenmeyer con 90 ml de agua destilada estril
(dilucin 100) y se agit por 10 minutos. Luego se realiz el mtodo de las diluciones
sucesivas. Finalmente, se tom 1ml de cada dilucin y se sembr por incorporacin en placas
petri con medio de aislamiento para hongos (10g almidn soluble, 0.5 g casena, 1.4 g
NH4NO3, 0.5 g K2HPO4, 0.5 g MgSO4, 0.1 ml tritn-x-100, 15 g agar, 1000 ml agua destilada y
tetraciclina 100 g/ml). Las placas fueron incubadas por 4 das a 30 C.
Seleccin e identificacin de hongos amilolticos
Terminado el periodo de incubacin, se utiliz una cmara de yodo metlico para observar los
halos de hidrlisis. Se seleccionaron cepas amilolticas en base a la amplitud del halo incoloro.
Las colonias se identificaron morfolgicamente hasta el nivel de gnero empleando el manual
de Barnett. Las colonias que presentaron mayor halo de hidrlisis se trasplantaron a tubos con
cua de Agar Papa Dextrosa (PDA) los cuales se incubaron a 30 C por 3 das.
Preparacin del inculo
Se seleccion la cua de la colonia con mayor halo de hidrolisis de almidn. Las esporas se
lavaron con 10 ml de solucin Twen 80 de 0.1% (v/v) y el recuento se realiz con la cmara de
Neubauer. Se diluy hasta alcanzar una suspensin de 1 x 10 5 esporas ml-1, la cual se us
como inculo.
Cultivo Sumergido (FS)

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Del inculo se tom 2.5 ml y se coloc en un matraz Erlenmeyer que contena 80 ml de medio
de produccin (20 g de almidn, 2.8 g NH 4NO3, 1 g K2HPO4, 0.5 g KCL, 0.03 g FeSO 4, 0.5 g
CaCl2, 1 g peptona, 1000 ml agua destilada, pH 6.5) el cual se incub en bao a 30 C con
agitacin a 175 rpm por 4 das.
Cultivo en Sustrato Slido (FSS)
Se aadi 2.5 ml de inculo a un matraz Erlenmeyer que contena medio de produccin 7.5 g
salvado de trigo con 99.1% de almidn, 6 g torta de soya molida, 15 ml solucin de sales
(KH2PO4 0.2%, MgSO4.7H2O 0.03%, CaCl2, agua de cao decantada). El frasco se incub a
30 C por 4 das.
Recuperacin de la enzima
Para el sistema (FS), la suspensin de enzimas se separ de la biomasa utilizando filtracin al
vaco. Adems se emple papel filtro de peso conocido. El producto de la filtracin se sec a
80 C por 2 das, la cantidad de biomasa se determin por diferencia de peso seco. Para el
cultivo (FSS) se aadi 69 ml de tampn acetato 50mM, pH 4.8, se agit homogneamente a
200 rpm por 20 min y por filtracin se separ el sobrenadante del precipitado.
Determinacin de la actividad amilasa y protenas solubles
Del sobrenadante obtenido de los dos sistemas de cultivo se determin la actividad enzimtica
mediante anlisis de azcares reductores liberados durante la hidrlisis de almidn, mtodo de
Miller, empleando DNS como reactivo. La determinacin de protena soluble emple el mtodo
de lowry. Se entiende por unidad enzimtica (UI) como la cantidad de enzima que libera 1mol
por minuto por ml de extracto enzimtico a 50C y pH 4.8.
Resultados
Enriquecimiento de suelo e identificacin de microorganismos amilolticos
En el estudio, el tratamiento de enriquecimiento favoreci el crecimiento de colonias con
capacidad amiloltica, ya que segn el recuento de colonias se obtuvo un total de 20, de los
cuales 2 presentaron alta actividad amiloltica con un halo de hidrlisis de 9 y 5mm; mientras


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que la muestra sin enriquecer, slo 16 colonias con dos colonias significativas cuyos halos de
longitud son 9 y 4mm.
A partir de estas colonias se aisl dos colonias con halo de 9mm y tomando en cuenta su
morfologa vegetativa se determin su pertenencia al gnero Penicillium sp.
As mismo, la cuantificacin de esporas con la cmara de Neubauer, despus del aislamiento,
determin un total de 12; por eso, el inculo con el cual se trabaj tuvo una concentracin de
10 5 esporas/ml
Figura1. A) Placa Petri con cultivo microbiano de suelo enriquecido de San Luis a una dilucin de 10 -3, sealando
colonia de la cepa amiloltica de Penicillum sp. Utilizada para produccin de amilasas. B) Placa Petri con cultivo
microbiano de suelo sin enriquecer de San Luis a una dilucin de 10 -3, sealndola colonia de la cepa amilolitica
Penicillium sp. C) Vista microscpica de Penicillium sp. A 400X proveniente de la cepa seleccionada de la placa A.
Produccin de amilasas en FS y FSS

La produccin enzimtica del sistema FSS present una mayor cantidad de unidades de
enzima por litro de medio, como muestra el Cuadro 1, el sistema
FS representa
aproximadamente el 21% del FSS.

Por otra parte, se puede apreciar que la cantidad de protenas secretadas en FSS es en 25%
de la apreciada en FS.
Cuadro 1: Produccin de amilasas de Penicillium sp.en sistemas FSS y FS tras 96 horas de
cultivo
Ttulo
enzima
de Protena
extracelular
Biomasa

Sustrato
consumido

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FS
FSS
3102
14440
U*L
U*L
g*L
g*L
0.202
0.051
2.01
-
g*L
-
22
-
g*L
-
Parmetros: ttulo de enzima=unidades enzimticas/litro de medio de fermentacin, Protena extracelular=gramos de protena/litro

de medio de fermentacin, Biomasa= gramos de biomasa/ litro de medio de fermentacin, Sustrato consumido=gramos de
glucosa consumida/litro de medio de fermentacin
A partir de los datos obtenidos se evaluaron parmetros de productividad para ambos sistemas
fermentativos. Estos resultados se muestran en el Cuadro 2. Se puede apreciar que la
productividad volumtrica de amilasa en el FS es el 21% de la reportada para FSS. Adems,
la actividad especfica de la amilasa en FS es del 5% de la atribuida para la FSS.
Cuadro 2: Comparacin de parmetros de productividad de amilasas de Penicillium sp. en

sistemas de FSS y FS tras 96 horas de cultivo
Parmetro
s
FS
FSS
evaluados
AE
3101.8792
UIL
72.059
YE/x
1541.3064
UIg
YE/s
140.9945
UIg
YE/Pr
15318.2700 UIg
YX/s
0.0915
gg
32.3112
UIL*h 150.4192
0.0210
gLh
E/X
16.0553
UIgh -
Ug
285041.0715 Ug
ULh
Para FS: AE (actividad enzimtica)=unidades de enzima/litro de medio slido, YE/x=unidades de enzima/gramo de biomasa
formada, YE/s=unidades de enzima por gramos de sustrato consumido, Y E/Pr=unidades de enzima/gramo de protena extracelular
producida, YX/s=gramo de biomasa producida /gramos de sustrato consumido, E=productividad volumtrica de amilasa,
X=productividad volumtrica de biomasa,
E/X
=productividad volumtrica especifica de amilasa. Para FSS: AE = Unidades de
enzima/gramos de sustrato inicial, YE/Pr= unidades de enzima/gramos de protena secretada, E =unidades de enzima/litro de
medio solido/hora
El sistema FS obtuvo una actividad especfica (Y E/Pr) que fue 18,6 veces inferior al del sistema
FSS. Mientras que en la productividad especifica fue 4,655 veces superior en FSS que en FS.
La actividad enzimtica de ambos sistemas no es comparable debido al medio de cultivo
distinto y su difcil extrapolacin.

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Los parmetros como YE/x, YE/s, YX/s, X y
E/X
no se compararon entre los sistemas de
fermentacin debido a su dificultad para determinar la biomasa del sistema FSS.

Discusiones
El aislamiento de microorganismos amilolticos a partir de muestras de suelo del distrito de
San Luis, Lima-Per, se realiz con el fin de evidenciar hongos capaces de producir amilasas
y proponer un proceso de produccin industrial
a pequea escala, con lo cual la
determinacin de parmetros facilita una mejor interpretacin del funcionamiento y efectividad

de la enzima de acuerdo al sistema utilizado. En consecuencia, el enriquecimiento es
necesario para proliferar a esos microorganismos especficos presentes en pequeas
cantidades que no se pueden detectar con facilidad si existen otros en mayor cantidad (Tortora
et al, 2007). Al proporcionar el sustrato y condiciones que favorecen el desarrollo de hongos
particulares, se puede apreciar un incremento de estos para su posterior aislamiento.
La identificacin y aislamiento de Penicillium sp es congruente con la teora, pues segn datos
conocidos, los hongos aislados fcilmente del suelo son: Aspergillus, Cladosporium, Fusarium,
Penicillium y Trichoderma. Estos hongos filamentosos son importantes porque establece una
malla de hifas que determinan la estructura del suelo (Sagardoy y Mandolesi, 2004) y muchos
de estos se utilizan actualmente en la produccin de enzimas amilasas, glucanasas,
degradadoras de contaminantes como arsnico en la biorremediacin, entre otros. As mismo,
la baja tasa reproductiva de Penicillium sp. no se relaciona con la informacin previa del
gnero, que debido a ser un patgeno oportunista, es considerado como un estratega r (Leigh,
2008), por esta razn, se atribuye este efecto a las condiciones de cultivo no ptimas para la
especie aislada.
Estudios realizados en produccin enzimtica con este tipo de sistemas han concluido que si
bien el sistema FS proporciona mayor control de factores ambientales como temperatura y
pH, el sistema FSS constituye una alternativa aprovechable, debido a que concentra los
metabolitos y los procesos de purificacin son menos costosos (Espinel y Lpez, 2009;
Saranraj y Stella, 2013). Adems, el soporte y sustrato usado en este sistema es semejante a
la textura del hbitat natural de Penicillium, lo cual genera un mejor rendimiento en la
produccin de enzimas (Espinel y Lpez, 2009).


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Por otra parte, se compararon los sistemas de fermentacin empleados para la produccin de
amilasas. De acuerdo a los resultados obtenidos, la mayor produccin de amilasas por el
hongo Penicillium sp. fue superior en el sistema de fermentacin en sustrato slido (FSS)
respecto al sistema sumergido (FS). Esto concuerda con estudios previos realizados utilizando
ambos sistemas de fermentacin (Moreira et al., 1999). La protena secretada en FSS es
menor a la de FS, y al confluir con el ttulo de enzima se puede apreciar que no toda las
enzimas secretadas en FS tienen actividad amiloltica, caso contrario, FSS presenta menos
enzimas que realizan mayor actividad enzimtica. Esto se debe a que el cultivo de
microorganismos sobre diferentes sustratos o soportes slidos depende de diferentes
parmetros y factores ambientales como son: el tipo de microorganismo y la cantidad de
inculo; la humedad y la actividad de agua; la aireacin y la transferencia de oxgeno; la
regulacin de la temperatura y del pH (Campos, 2008). Estos resultados se complementan con
el Cuadro 2, donde la productividad volumtrica E permite contrastar los razonamientos
anteriores, demostrando que FSS tuvo mayor eficiencia al degradar el almidn del medio.
Es importante mencionar que se debe tener en cuenta todos los parmetros que afectan a la
actividad ptima de la enzima. Las amilasas de Penicillium sp. muestran en estudios anteriores
rangos de pH, temperatura, sales y otros componentes; por ejemplo, Espinel y Lpez (2009)
contribuyen con datos particulares de Penicillium commune usando como sustrato Manihot
esculenta Crantz (yuca), entre ellos tenemos de la actividad enzimtica de -amilasa a partir
de 48 horas fue de 8,21 U/mL para la FFS y 6,15 U/mL para la FLS, con pH ptimo de 6 y
temperatura de 70 C; adicionalmente, se considera la disponibilidad del ion Ca+ y la
presencia de EDTA, debido a que este in est relacionado con interacciones adicionales
favorables que contribuyen a la neutralizacin de las cargas negativas en la de los dominios
estructurales A y B de la enzima. Al comparar con las caractersticas del Penicillium aislado, se
observa que el pH al cual fue sometido estuvo en el rango ligeramente cido a neutro, esto
concuerda no solo con el ensayo en P. commune, sino tambin con otros productores de
amilasas (Oliveira et al, 2011; Alva et al, 2007), en cuanto a la temperatura, no se puede
concluir sobre el tema, ya que en la prctica no se realiz diferentes tratamientos para
determinar un rango ptimo; pero se considera que se encuentra dentro del rango porque ha
sido apto para distintos gneros en sistemas FSS (Xu et al., 2008; Saranraj y Stella, 2013 )
A pesar de las ciertas ventajas en productividad que puede ofrecer el sistema de FSS, se
presenta desventajas que hacen que el sistema de FS siga siendo el ms utilizado a nivel

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industrial para la produccin de enzimas. Esto es debido a que al momento de escalar el

proceso de FSS a niveles industriales surgen diversos problemas de ingeniera a causa de
gradientes de humedad, temperatura, pH, O2, entre otros que surgen por la heterogeneidad del
sistema (Saranraj y Stella,. 2013).
Por ltimo, se concluye que el sistema FSS presenta mayor ventaja que el sistema FS con
respecto a la produccin de amilasas del microorganismo aislado Penicillium sp. y que este, es
un potencial productor de dicha enzima. No obstante, es necesario el estudio de este
microorganismo para condiciones industriales, ya que los factores que afectan a este sistema
son difciles de controlar.
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Produccin de amilasas en FS y FSS

aproximadamente el 21% del FSS.

Aislamiento de microorganismos amilolticos y produccin de amilasa en

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Parmetros: ttulo de enzima=unidades enzimticas/litro de medio de fermentacin, Protena extracelular=gramos de protena/litro

Cuadro 2: Comparacin de parmetros de productividad de amilasas de Penicillium sp. en

=productividad volumtrica especifica de amilasa. Para FSS: AE = Unidades de

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Los parmetros como YE/x, YE/s, YX/s, X y

no se compararon entre los sistemas de

fermentacin debido a su dificultad para determinar la biomasa del sistema FSS.

a pequea escala, con lo cual la

determinacin de parmetros facilita una mejor interpretacin del funcionamiento y efectividad

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industrial para la produccin de enzimas. Esto es debido a que al momento de escalar el

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