Professional Documents
Culture Documents
AGUSTN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA
QUMICA
GUA DE PRCTICA
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal
Ing. Karina Moran Medina
AREQUIPA PER
2014
PROLOGO
El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es
indispensable para el desarrollo de las ciencias de la salud
humana y animal, para el desarrollo de la agricultura y para el
ilimitado campo de los bioprocesos.
Los microorganismos han demostrado ser un enorme
potencial para la elaboracin de infinidad de productos tiles al
hombre, en la generacin de procesos productivos con menor
contaminacin del medio ambiente y con consumos de energa
muchos menores.
Los microorganismos son objetos de manipulaciones
genticas para que puedan producir sustancias diversas de gran
necesidad. Estos microorganismos pueden generar Enzimas que
a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos
bioprocesos.
El conocimiento de la microbiologa se hace imperiosa para
su aplicacin a diversas disciplinas del saber humano. La
presente Gua de Prctica se ha desarrollado con el objeto de
poner al interesado en el conocimiento sistematizado sobre las
tcnicas bsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio
para estudiantes de Ingeniera Qumica.
Los Autores
NDICE
PROLOGO
NDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES...........................................................
PRCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA............................................
PRCTICA 2 : MICROSCOPIA;
OBSERVACIN
DE
DE
UN
FROTIS
BACTERIANO:
ESPECIALES:
TINCION
MORFOLOGIA DE HONGOS....................................................
PRCTICA 5 : EQUIPO
MATERIAL
DE
LABORATORIO,
Recomendaciones Generales
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
PRCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA
I. OBJETIVOS
Desinfeccin y esterilizacin.
Manejo de objetos punzo cortantes.
Manejo y eliminacin de desechos
Ventilacin e iluminacin adecuadas
Limpieza y desinfeccin de ambientes
Ocular
Objetivo
10X
10X
10X
10X
45X
100X
Ejemplo:
Dimetro del
campo en micras
1500
400
150
11
IV. CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
12
PRCTICA
MICROSCOPIA: OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS
IN VIVO, COLORACION VITAL
I. OBJETIVOS
1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares.
2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in
vivo.
II. OBSERVACIN
UNICELULARES
IN
VIVO
DE
ORGANISMOS
Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en
posicin horizontal.
2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera
que la luz del Microscopio la atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de
iluminacin y poca visin de la muestra corrija ste defecto bajando el
condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen
caractersticas especiales y un fondo de partculas de tierra y cristales
grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de
pequeas escaleras en cuyo interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son
brillantes, amarillentas, poco mviles; van desde la forma de un barril
pequeo hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de
observacin. Son protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se
caracterizan por presentar su cuerpo rodeado de cilios. En su interior
observar el ncleo y vacuolas.
13
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello,
determinados colorantes (azul de metileno, rojo neutro) a muy baja
concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la observacin,
mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin
provocar alteraciones celulares ni destruir la bacteria.
15
EXAMEN EN FRESCO
Material
- Microscopio
- Lminas cubreobjetos
- Lminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Grmenes varios
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos
Metodologa
- Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca
una gota de lquido sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un
cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una
gota de suero fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la
ayuda del asa de kolle realizar una suspensin y colocar un
cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.
Grafique la Observacin y Resultados
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en
fresco o como tcnicas intermedias entre stas y las preparaciones
fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva teidas.
Material.
Microscopio,
Lminas
portaobjetos,
a
examinar,
Cubreobjetos, Solucin de azul de metileno (1/1000), Asas de platino,
Grmenes diferentes
Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno
(l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa
de kolle mezclar. Seguir el procedimiento (muestra liquida o
slida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.
16
17
V. CUESTIONARIO
-
18
PRCTICA
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL
I.
OBJETIVOS
.
Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes
procedimientos de coloracin.
II.
MARCO TEORICO
Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su
protoplasto posee un ndice de refraccin cercano al agua, se requiere
generalmente tinciones biolgicas para visualizarlos adecuadamente o
demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y
difieren uno de otro en cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a
la sustitucin de los tomos de hidrgeno por otras molculas. Algunos de
los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son: C=C,
C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de
radicales cromforos del compuesto.
2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES
PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de
espesor, pudiendo incluso alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las
paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las clulas de
cultivo antiguo.
GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas est
constituida principalmente por cadenas de peptidoglucano, a menudo
unidas por puentes peptdicos.
Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad de
cidos teicocos, polmeros de glicerol y ribitol unidos por grupos
19
20
Fijacin
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de
Bunsen, con la muestra hacia arriba.
- Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.
21
3.2.TINCIONES SIMPLES
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno
(solucin acuosa al 1%), Safranina (solucin acuosa 1%), Asas de
platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin, Xilol
TINCIN DE AZUL DE METILENO
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin
del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y
algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son as fcilmente diferenciables.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar
de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua
caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de
colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con
aceite de inmersin.
22
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
TINCIN DE SAFRANINA
Las bacterias aparecen de color rojo.
Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua
destilada para hacer un frotis.
- Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y
disuelva en la gota de agua (cuando el cultivo es medio liquido no
necesita de agua). Los frtices que se obtengan no deben ser ni
muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y
se deja actuar de unos 5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua
caiga directamente sobre el frotis, hasta quitar el exceso de
colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con
aceite de inmersin.
Grafique la Observacin y Resultados
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
23
3.3.COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin
de Gram, Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin,
Xilol
TINCIN GRAM
El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la
pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin
dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido a su naturaleza
qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el
cristal violeta, an luego del tratamiento con un decolorante orgnico,
tal como una mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se
denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en
su pared celular, pierden la coloracin primaria del cristal violeta
cuando son tratadas con el decolorante. El colorante secundario o de
contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que
han perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al
microscopio, habiendo fijado la safranina como contracolor a sus
paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin
del colorante por los diferentes microorganismos es variable, y
algunas estructuras como las esporas absorben el colorante con
dificultad son as fcilmente diferenciables.
Reactivos
- Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95
=
20 ml, Agua destilada csp=100 ml)
- Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0
g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de
bacterias Grampositivas y Gramnegativas sobre una lmina
portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama
suavemente para obtener la fijacin del frotis, con la finalidad de
que el material no sea arrastrado durante el proceso de tincin.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la
superficie con solucin de cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien
con agua de cao.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con
agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la
superficie con unas gotas del decolorante acetona-alcohol hasta no
arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10 segundos ms
o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como
decolorante , en este caso dar ms tiempo aproximadamente 1
minuto.
24
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
_______________________________________
IV. CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
11.
Explique el fundamento de la coloracin de Gram y
esquematice.
12.
A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
13.
Mencione tres razones por las que un microorganismo
grampositivo se observa gramnegativo.
14.
Dibuje la estructura del colorante cristal violeta
15.
Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos
grampositivos, bacilos, grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos
gramnegativos.
26
PRCTICA
COLORACION ESPECIAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS
I. OBJETIVOS
-
27
B. ETIOPATOGENIA
Se origina por hongos omnipresentes y oportunista que vive como
saprofitos en el suelo, vegetales en descomposicin, cualquier tipo de
materia orgnica como pintura fresca, alimentos enlatados abiertos, ropa
vieja, recipientes con agua sin usar, reactivos qumicos, paredes de
refrigeradores, sistemas de ventilacin, cuartos de hospital, lentes de
contacto blancos, en las capas altas de la atmosfera.
Las especies que actan como patgenos son termotolerantes. Tras la
exposicin a grandes cantidades de conidios, penetran por inhalacin o se
instalan de manera saprofitica en una cavidad pulmonar de cualquier
origen, como cavernas por TBC.
C. APLICACIONES INDUSTRIALES
En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y
panadera:
ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque
se usa Principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de
cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del
pncreas.
En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos
azucarados.
INVERTASA O SACARASA.
Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar
invertido) puede ser realizada por dos enzimas: la betafructosidasa, que
acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa, y la alfaglucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se
entiende generalmente por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es
producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae, Candida), mientras que
la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y
de hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.
La aplicacin de enzimas en los detergentes
Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que
permiten el trabajo de limpieza a bajas temperaturas y perodos ms cortos
de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los
materiales que constituyen las manchas, facilitando la remocin de estos
materiales y de forma ms efectiva que los detergentes convencionales.
Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por
hidrlisis, pero las lipasas son solubles en agua y los lpidos son
insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo ocurre en la interfase
entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que
permitan la remocin de manchas de grasas a bajas temperaturas de
lavado. Una combinacin de bsqueda y manipulacin gentica ha
conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en polvo.
28
2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las
estructuras del espora-cojinete.
Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos
de fales en forma de botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de
los fialides, con la espora ms joven en la base de la cadena, y son casi
siempre verdes.
La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del
penicillium. Algunos son no ramificado y llevan simplemente un racimo.de
fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un racimo de ramas, cada
cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una
segunda pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides.
Estos tres tipos de sistemas del cojinete de la espora (penicilli) se llaman
monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una
corona radial ancha y blanca, a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37
C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la superficie de la
29
III. PROCEDIMENTO
A. MATERIAL
Asa de kolle
KOH al O%
Mechero
Azul de lactofenol
30
Lminas portaobjetos
Lminas cubreobjetos
Microscopio
B. MATERIAL BIOLOGICO
C. REACTIVOS
C.l. Hidrxido de potasio al 10%
KOH
10 g
Agua destilada
100 ml
C.2. Azul de lactofenol.
Fenol
cido lctico
Glicerol
Agua destilada
20
20
40
20
g
g
ml
ml
31
C. PREPARACION
32
IV. RESULTADOS
A. ASPEGILLUS NIGER
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
B. ASPERGILLUS FUMIGATUS
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
33
C. ASPEGILLUS FLAVUS
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
D. PENICILLIUM
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
3. RHYZOPUS
34
EL GNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus
especies invaden lentamente los medios de cultivo.
EL GNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios
de cultivo. En este Gnero los esporangiforos nacen en los nudos de los
estolones, o sea sobre los rizoides.
EL GENERO ABSIDIA
Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre
rizoides.
APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia econmica, sntesis de productos industriales: produccin de
cidos lctico, ctrico, succnico, oxlico, etc. Y alimentos populares orientales:
su-fu y tem-pe
Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se
desarrolle. Una forma tpica o filamentosa, en medios slidos y otra forma
atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los medios lquidos y
que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de
mostos azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas
(amilasas).
35
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
b. MUCOR
36
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
37
c. ABSIDIA
Caracteres Macroscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
Caracteres Microscpicos
...........................................................
...........................................................
...........................................................
...........................................................
V. CUESTIONARIO
1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus?
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y
microscpicas) ? Dibuje.
4. Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium?
5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?
7. Qu es una enzima?
8. Dibuje e indique las partes del Penicillium?
9. Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium?
10. Cul es la estructura bsica de la Penicilina?
11. Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
12. Cmo sospecha Ud. Que el hongo que ha desarrollado en su placa de
cultivo se trata de un Zygomycete?
13. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
14. Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor,
Rhyzpopus y una Absidia?
15. Qu enfermedades producen estos hongos?
16. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?
38
PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN
I.
OBJETIVOS
Dispositivos
4.3
43
VI. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos
ejemplos?
2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales
antes del control microbiolgico, por qu?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en
funcionamiento el autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas
bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.
5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.
44
PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO
I.
OBJETIVOS
a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que
pueda llevarse a cabo un crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms
corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de
cualquier medio de cultivo.
NUTRICIONALES
DE
LOS
MEDIOS
DE
Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como
fuente de energa un gran nmero de componentes hidrocarbonados
diferentes.
B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la
gelatina o incluso protenas an ms complejas, como es el caso de los
extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que
corresponden a pptidos o polipptidos dependiendo de su complejidad
pero en cualquier caso son tambin protenas que estn parcialmente
hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una
peptona ppsica de carne.
La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar
la formacin de indol por parte de la bacteria debido al alto contenido de
triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin es utilizada para
estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos
protozoos.
La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente
para hongos y ciertos grmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco,
sales de amonio, aminocidos, etc.
2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS
MICROROGANISMOS
A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo
hacen mayoritariamente en forma de sulfatos, a veces en forma de
tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir de algn
aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.
B. FUENTE DE FSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma
de fosfato.
C. IONES METLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones
muy bajas. Por ej: el Sodio, el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo
de su concentracin pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso
del sodio que a concentraciones altas inhibe el crecimiento de un tipo de
microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de
Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del
Enterococus.
46
D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si
lo hacen, es muy lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta
adems una serie de componentes definidos que no son capaces de
fabricar por s solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a
corresponder a algn tipo de aminocido de bacterias muy exigentes o
incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido
nicotinico para el crecimiento de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y
grises del Haemophylus influenzae. Este medio contiene hematina
(factor X) y est enriquecido con otros cofactores, como el NAD (factor
V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para
crecimiento de Bordetella pertusis. Se observa colonias en gotas de
mercurio brillantes es fcil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del
complejo B para el crecimiento del Flavobacterium.
E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de
microorganismo por bloqueo de sus procesos metablicos.
Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia
bacteria.
La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento
bacteriano de los Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.
Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y
tipificacin de pruebas bioqumicas de las bacterias.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
desarrollo de las bacterias Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de
anilina y van a inhibir el crecimiento de los microorganismos
Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales
biliares y citrato de sodio, inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a
muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.
2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO
Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese
microorganismo.
- Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra
que considerar:
A. TEMPERATURA PTIMA
47
48
Microorganismo
Bacillus psichrophilus
Microcococcus cryophilus
Pseudomona fluorescens
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Neisseria gonorrhoeae
Thermoplasma acidophilum
Bacillus stearthermophilus
Sulfolobus acidocaldarius
Pyrococcus abyssi
Pyrodictium occultum
Pvrolobus fumarii
Candida scotti
Saccharomyces cerevisiae
Mucor pusillus
B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para
su crecimiento.
En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de
agua.
En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la
liofilizacin y cualquier mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de
conservacin.
C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH
ptimo de crecimiento.
- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.
La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de
pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos
alterando la membrana plasmtica o inhibiendo la actividad de las enzimas
y las protenas transportadoras.
El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como
consecuencia de los metabolitos que se producen por la degradacin de los
nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la fermentacin
glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica
49
50
Lmite
inferior
0
0.5
1.0
4.0-4.6
4.2
4.4
4.4
5.5-5.8
5.6
7.0-7.6
8.5
8.5
pH
ptimo
0.7
2.0-3.5
2.5
5.8-6.6
7.0-7.5
6.0-7.0
6.0-7.0
6.0-7.6
6.6-7.0
8.0-8.8
SD
10.6
Lmite
superior
SD
6.0
4.0
6.8
9.3
8.4
9.0
8.5-9.0
8.0
9.4
SD
11.5
D. PRESIN OSMTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque
existen muchas bacterias que pueden crecer a concentraciones algo
superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e
hipotnicos; este hecho es debido a su pared rgida que permite que el agua
no penetre en la bacteria y sta se rompa.
En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a
concentraciones muy altas de cloruro sdico; Ej: Staphylococus.
Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados
sobre los microorganismos, es de gran utilidad expresar cuantitativamente
el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la actividad de agua (aw).
Actividad del
Ambiente
Agua
1.00 (agua pura) Sangre
0.95
0.90
0.85
0.80
0.75
0.70
0.60
Pan
Jamn
Salami
Conservas
Lagos
salados
Pescado
salado
Cereales,
dulces
Chocolate
Leche
deshidratad
a
Microorganismo
Mayora de Gramnegativos
no halfilos
Bacilos
Grampositivos,
Basidiomycetes
Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor,
Rhizopus
Staphylococus, Saccharomyces
Penicillum
Halobacterium, Aspergillus
Actinospora
Aspergillus
Saccharomyces
Xeromyces
E. CONCENTRACION DE OXGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es
AEROBIO, mientras que otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
51
54
56
_________________________________________________________
AGAR MAC CONKEY
Composicin
Peptona de casena 17.0 g. Rojo neutro
0.03 g. Peptona de carne
3.0 g.
Cristal violeta
0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro
de sodio 5.0 g
Agar Agar
12.5 g. Agua destilada 1000 ml.
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripcin del Medio
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: _______________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composicin
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g.
, peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol,
24 mg.,
sacarosa,
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0
g
Agua destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripcin del Medio
58
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
MEDIO EMB.
Composicin
Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona,
azul de metileno, lactosa, sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua
destilada, 1000 ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripcin del Medio
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn
su
proporcin
___________________________________________
Segn
su
uso
o
___________________________________________
Segn
la
_____________________________________________
Segn
su
_____________________________________________
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composicin
59
en
agua
utilizacin
composicin
presentacin.
Extracto de levadura,.. g. ,
Cloruro de sodio.. g.
Triptonag
Agua destilada. ml
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________
Descripcin del Medio
Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________
V.
CUESTIONARIO
1.
61
PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I.
OBJETIVOS
-
ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se
utiliza para extender el inculo lquido previamente adicionado en la
63
HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que
esta sufra desecacin, deterioro o contaminacin. Sirve para extender
la muestra a travs del hisopo en el medio de cultivo. Se suele
comercializar ya estril listo para utilizar y desechables.
PIPETAS
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de
vidrio, reutilizables por esterilizacin o de plstico, generalmente
desechables.
Pueden
ser
graduadas
(contienen
volmenes
especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores
para pipeta tipo pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene
volmenes graduados son muy utilizados en bacteriologa y cuya
aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros
en un determinado medio de cultivo.
2.3.PREPAPACION DE INOCULOS
Un inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de
microorganismos problema. As pues, se debe partir, por un lado, de
un, cultivo puro y, por otro lado, de una concentracin adecuada de
microorganismos problema.
Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el
aislamiento mediante tcnicas especficas, como es el caso de la
siembra por estras en placa o por agotamiento, o la tcnica de la
placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento ms o
menos separado de los microorganismos. Es muy til usar medios de
cultivo enriquecidos especficos y diferenciales que permitan el
crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De
esta forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser
aislada y desarrollada como puro.
METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS
Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de
siembra estril. Si la muestra es lquida se tomar con pipeta
graduada o pipeta pasteur estril en cantidad suficiente y, en ambos
casos se homogenizar
2.4.PREPARACIN DE INCULOS
64
- ESTRIA MLTIPLE
Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente
estril y dicho inculo se depositar en el extremo superior de la
placa, extendindose de un extremo a otro de sta solo en la parte
superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa
repetiremos el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra
desde uno de los bordes donde qued la muestra hasta el otro extremo
superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de platino
sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma
direccin se repite la operacin hasta un total de cuatro o cinco veces,
que son los que tienen cabida aproximadamente en una placa,
teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar hacia el interior
de la misma.
El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia
de que cada vez que se va arrastrando y separando ms la muestra. Es
importante que para separar estas colonias se realice en cada estra
un flameado previo del asa de siembra.
66
67
2.
70
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
V.
CUESTIONARIO
72
PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS
I.
OBJETIVOS
-
74
75
SUPERFICIE
Lisa
Rugosa
Plegada
CONSISTENCIA (probarla con el asa)
Cremosa
Membranosa
COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento
producido
Difusible o no.
CARACTERSTICAS PTICAS
LUZ TRANSMITIDA (observar a travs de la colonia)
Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos
Observados a travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos
observados a travs de la colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)
Opaca
Brillante
CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de
la
bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al
agitar
Crecimiento en caldo Nutritivo
76
PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el
Texto, las figuras:
AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria
Forma
Borde
Elevacin
Superficie
Consisten
cia
Color
Luz
transmitid
a
Luz
reflejada
CALDO
Bacteria
Pelcula
Turbidez
77
Sedimento
78
MEDIO SEMISLIDO
Bacteria
Movilidad
IV. CUESTIONARIO
1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo
puro, joven, injuriado y envejecido.
2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en
caldo una caracterstica de forma de pelcula.
3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede
corresponder?
4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene?
5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de
hidratos de carbono?
79
PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO
I.
INTRODUCCIN
Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales,
absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetra
mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras que la
medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos
procedimientos se puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya
que, dentro de un rango, la luz absorbida o difractada por una suspensin
bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de clulas en
el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la
medida de la luz transmitida. Este aparato proporciona luz
monocromtica por medio de un filtro que permite slo el paso de la
longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una
suspensin bacteriana es medida por una clula fotoelctrica e
inversamente proporcional a la cantidad de bacterias. Normalmente la
multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz
transmitida (transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida
(absorbancia), ya que esta ltima es directamente proporcional al nmero
de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la
transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la
siguiente manera:
Absorbancia = 2 - log % de transmitancia
Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro.
Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de
turbimetria es muy til el uso de matraces con brazo lateral, ya que
permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar muestras del
cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.
II. OBJETIVOS
1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.
2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.
80
81
Fases de Crecimiento
Latencia
Exponencial
Estacionaria
Rezago
Adaptacin
Logaritmo
Divisn celular
Crecimiento
Nutrientes se agotan
Acumulan metabolitos txicos
Sesa crecimiento
Muerte
Declinacin
8,0
Turbidez
(densidad ptica)
Viables
0,75
D e n s i d a d p ti c a
L o g 1 0 o rg a n i s m o s
v i a b l e s /m l
9,0
0,5
7,0
0,25
6,0
5,0
0,1
Tiempo
V.
METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO
Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un
cultivo discontinuo (en un matraz en agitacin) normalmente
experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento: una fase de
latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de
muerte. Las clulas en fase de latencia, que proceden de una
alcuota de un cultivo anterior que ha sido transferida a un medio
nuevo, no crecen en seguida.
Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a
crecer a un ritmo rpido. La duracin de esta fase de latencia
depende de numerosos factores: la edad y genotipo del inculo, de la
temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y
nuevo, de la aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden
haberse formado en el cultivo viejo.
Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que
han entrado en la fase de crecimiento logartmica (log) o
82
83
V.
CUESTIONARIO:
1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con
medio de cultivo estril?
2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de
multiplicacin de una bacteria?
3. Identificar en la grafica las fases del desarrollo microbiano.
84
PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS
I.
OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de
contaje celular.
Cultivo de E. coli
Matraz
Cmara del Neubauer
Estufa
- Cultivo de levadura
- Pipetas
-Pipeta Pasteur
- Microscopio
IV. METODOLOGA
CARGANDO LA CMARA
Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea
cantidad de suspensin con una pipeta Pasteur. Deposita una gota
pequea en la superficie pulida de la cmara de recuento cerca del
extremo del cubre. La suspensin entrar en la cmara por
capilaridad. Una cmara adecuadamente llenada contiene clulas
solo en el espacio contenido entre el cubre y la cmara de recuento.
No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.
V.
CUESTIONARIO
87
PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE
DILUCIN EN PLACA
I.
OBJETIVOS
II. INTRODUCCIN
Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin
de colonias, la tcnica por vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en
cantidades conocidas se deposita en cajas petri estriles, se adiciona el medio
de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que
multiplicadas por el inverso de la dilucin que corresponda permite estimar el
nmero de microorganismos viable por gramo o mL de muestra, obviamente
con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y
tipo de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado
grupo de microorganismos. Esta tcnica permite la mayora de las veces
cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos.
SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y
1 ml segn los casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se
extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar
para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.
IV. METODOLOGA
SIEMBRA POR DILUCION
Preparacin de reactivos y medio de cultivo:
Solucin isotnica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua
destilada
Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del
reactivo.
Envolver cajas de Petri y pipetas..
Bajo condiciones estriles hacer las diluciones en la solucin isotnica estril,
de acuerdo a la figura 1.
Tomar 0.1 ml de la dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en
cajas de petri bajo condiciones estriles. Inocular de la misma manera con las
diluciones siguientes
Se realizar el conteo en placa por superficie.
Incubar las cajas en forma invertida a 30C, de 24 a 48 horas.
Considerar las siguientes reglas para la realizacin del reporte de la prctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de
30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y
no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el
nmero de colonias contadas se multiplica por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas
se multiplica por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por
el nmero de cuadros que ocupa la caja.
El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la
dilucin y considerar si la tcnica fue por vertido o por superficie (debido al
volumen de la muestra).
89
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos
al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49
se reporta 49
90
Fig. 1
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la
preparacin y dilucin de muestras.
Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones,
dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y
temperado a 45C, mezclar rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de
la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos segn:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre
30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de
dilucin utilizada. Reportar el resultado como numero de m.o. aerobios
mesofilos viables por gramo o mililitro, segn el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores
que 30 y mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y
computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la
relacin de los dos recuentos
V.
RESULTADOS
Reportar el nmero de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de
TODOS LOS EQUIPOS en una tabla con los resultados de todos los equipos
y discutir.
Presentar descripcin de morfologa de colonias y microscpica.
91
92
VI. CUESTIONARIO
1. Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el
aislamiento de microorganismos.
2. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de
microorganismos.
3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el
nmero de colonias por el inverso de la dilucin?
4. De los datos obtenidos en la prctica cules cree que sean congruentes
y cules no y porque?
5. Por qu la incubacin se realiza con las placas en posicin invertida?
6. Qu finalidad tienen las diluciones y donde se requerirn ms
diluciones, en muestra fresca o procesada, por qu?
93
PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM
I.
OBJETIVO
-
II.
FUNDAMENTO TERICO
La produccin agrcola basada en leguminosas es fundamental para la
alimentacin humana, especialmente si es en equilibrio con el ambiente.
Por ello la interaccin natural de estas plantas con una bacteria del
suelo a nivel de la raz, es ecolgicamente importante, como medida
para evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran
el suelo y contaminan el ambiente.
La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce
a su hospedero, lo infecta a travs de los pelos radicales para que en la
matriz de las clulas corticales induzca una meiosis y mitosis acelerada
que da lugar a un tejido hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical de
la leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se
ha transformado en un bacteroide, mientras que por la enzima llamada
nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio, que luego transfiere al
ribosoma
vegetal
para
la
sntesis
de
protenas
vegetales;
simultneamente por la fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en
carbohidratos que servirn como fuente de carbono y energa para
Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.
Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la
aplicacin de fertilizantes qumicos al suelo; incrementan el contenido
de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen el rendimiento en
las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de produccin
y la contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital para una
agricultura sustentable.
94
Trigonella
Trifolium
Alholva
Trbol
IV. METODOLOGA
1. Preparacin del Medio PSA
Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta
que las papas estn cocidas.
Filtrar la solucin de coccin y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de
sacarosa y 1.2 g agar agar autoclave 120C 15? Y proceder a
plaquear
2. Observacin Microscopia de Bacterias de Rhizobium
- Obtener los ndulos de Rhizobium de las races de alfalfa.
- Caracterizar los ndulos segn posicin en las races, color, forma,
tamao.
- Lavar con agua destilada los ndulos y realizar diseccin del ndulo
sobre un porta objeto y dejar caer el lquido interno para realizar
un frotis.
- Fijar el frotis de Rhizobium.
95
V. CUESTIONARIO
-
96
PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS
I.
FUNDAMENTO TEORICO
II. PROCEDIMIENTO
Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de
distinguir la presencia y cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias
contaminantes:
Escherichia
coli
Samonella
typhimurium Proteus
morganii
Enterobacter
aerogenes.
El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales
del agua contaminada en solucin fisiolgica, siguiendo el esquema
que se representa a continuacin:
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.9 ml ClNa 0.9%
97
MUESTRA
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
Pendiente
Alcalino
Alcalino
G de gas.
III. RESULTADOS
98
Ennegrecimient
o
S
No
destilada
100.0 ml
PREPARACIN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus
aforara a 100 ml con ms
agua.
4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN
A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
99
FORMULA:
Fucsina bsica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
PREPARACIN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a
ebullicin
2.- Aadir la fucsina bsica y disolver
3.- Aadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada
B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO
FORMULA
cido clorhdrico 3.0 ml
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIN
Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO
FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml
5.- MEZCLA CRMICA
Dicromatode potasio
cido sulfrico concentrado
Aguadestilada
20.0 gr
20.0 ml.
250.0 ml.
100
BIBLIOGRAFIA
BARRETO, Miriam. 1994. Manual Prctico de Microbiologa General.
Canoabo
CARPENTER, Philip.
1969.
Microbiologa.
2da Edicin.
Editorial
Interamericana, S.H. Mxico.
PELCZAR. 1990. Microbiologa. 2da Edicin. Editorial. Mc Graw-Hill. Mxico.
WALTER, W.G. 1980. Introduccin a la Microbiologa. Editorial
Continental. Mxico.
GRASSINI, Luis. 1967. Microbiologa Agraria. UCV-Facultad de Agronoma.
Caracas-Venezuela.
BLAIR, J. 1970. Manual Clnico de Microbiologa. Bethesda. AMERAtlas, Ronald M. Ecologa Microbiana y Microbiologa ambiental.
Pearson, Espaa, 2006.
FARRAS, Ramn Pars J. Bioqumica de los Microorganismos. Ed.
Revert, S.A., Espaa, 1997.
INGRAHAM, John L. Introduccin a la Microbiologa. Ed. Revert, S.A.,
Espaa, 2000.
JAY, James M. Microbiologa Moderna de los Alimentos, Ed. Acribia, S.A.
Espaa, 1992.
LEVEAU, J.Y. Microbiologa Industrial: Los microorganismos de inters
industrial. Ed. Acribia, S.A. Espaa, 2000.
OKAFOR, Nduka. Modern Industrial Microbiology and Biotechnology
Science Publishers, United States of America, 2007.
PRESCOTT, Lansing M. Microbiologa. McGraw Hill. Interamericana,
Espaa 1999.
TORTORA Gerard J. Introduccin a la Microbiologa. Ed. Acribia, S.A.
Espaa, 2002.
WAITES, Michael J. Industrial Microbiology: An Introduction, Blackwell
Science Ltd, Oxford, 2001.
WARD, Owen P. Biotecnologa de la Fermentacin, Ed. Acribia, S.A. Espaa,
1991.
101