Captulo 5

Testes Laboratoriais
Aplicados Imunologia Clnica
Ana Lgia Bender
Carlos Alberto von Mhlen

TESTES SOROLGICOS OU
IMUNOENSAIOS
Os imunoensaios so tcnicas para a deteco ou
quanticao de antgenos ou anticorpos, podendo
utilizar reagentes marcados ou no marcados. Os
ensaios com reagentes no marcados possuem sensibilidade de deteco menor, pois necessrio que se
forme grande quantidade de imunocomplexos para
que se processe a visualizao do fenmeno.
A imunoqumica disponibiliza mtodos simples, rpidos e sensveis aplicveis s anlises na
rotina laboratorial. Os mtodos imunoqumicos
normalmente no requerem equipamentos caros e
preservam as caractersticas do material biolgico.
A utilizao de sistemas de marcao de reagentes
torna possvel a amplicao do sinal nal e deteco atravs de instrumentos (fotometria, uorimetria
ou luminometria), elevando a sensibilidade ordem
de atomol ou zeptomol (10-19 /10-21 ).
Nas ltimas dcadas os imunoensaios se tornaram a tecnologia padro em medicina laboratorial.
Houve grande desenvolvimento na tecnologia de
produo de anticorpos e antgenos empregados,
bem como dos analisadores automatizados. Esses
avanos tecnolgicos agregaram baixa variabilidade
inter e intra-ensaios (CV = coeciente de variao)
e rapidez na realizao dos testes.
Apesar do aumento nos processos automatizados
nos laboratrios clnicos, a interveno humana

requerida em vrias fases do processo analtico

e ps-analtico, principalmente no que se refere
validao dos resultados. O processo de validao
chave na preveno de erros (impreciso e inexatido) e interpretao dos resultados.
Neste captulo relacionamos os princpios dos
imunoensaios mais utilizados em diagnstico laboratorial.

REAES DE PRECIPITAO
As reaes de precipitao envolvem a combinao de antgeno solvel com anticorpo solvel para
produzir complexos insolveis que so visveis. As
tcnicas de precipitao comearam a ser utilizadas
h aproximadamente 100 anos por Rudolf Kraus em
Viena e em 1905 Bechhold apresentou seus experimentos sobre a precipitao em gis.
Heidelberger e Kendall em 1935 descreveram a
curva parablica que mostra a quantidade de precipitado (imunocomplexos Ag-Ac) quando adicionada
quantidade crescente de antgeno a uma quantidade
constante de anticorpo (Fig. 5.1). A reao entre o
antgeno e o anticorpo reversvel e obedece a uma
constante de associao (Ka). Dentre vrios fatores
fsico-qumicos e imunolgicos que interferem na
reao, as concentraes relativas do antgeno e do
anticorpo um dos mais importantes. Quando as
quantidades de antgeno e anticorpo so equivalentes
(zona de equivalncia) h a formao mxima de
precipitado, decrescendo medida em que um dos

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dois reagentes est em excesso: pr-zona ou zona

de excesso de anticorpo e ps-zona ou zona de excesso de antgeno. Em virtude da reversibilidade da
reao, o excesso de um dos reagentes pode induzir
dissociao do precipitado formado, causando
erros de interpretao dos resultados. Esta situao
prevista e minimizada durante os processos de
padronizao dos ensaios.

reatividade). A densidade da linha de precipitao

e a distncia em relao ao orifcio da amostra
pode dar alguma indicao da concentrao do anticorpo. Estas reaes continuam sendo utilizadas
por alguns laboratrios devido a sua especicidade, principalmente no diagnstico de infeces
causadas por fungos e para a deteco de alguns
auto-anticorpos.

Fig. 5.1 Curva de formao de imunocomplexo em funo da quantidade de antgeno adicionada. (Fonte:http://www.uoguelph.ca/mbnet/323IMMUN/C2_AGAB.)

A reao de precipitao, em tubo de ensaio,

pode ser utilizada, por exemplo, para a deteco
de imunoglobulinas do soro humanao que se precipitam a baixas temperaturas (crioglobulinas)
(Fig. 5.2).

Imunodifuso Radial Dupla

Tambm chamada de difuso de Ouchterlony,
um mtodo semi-quantitativo baseado na premissa
que quando ambos os reagentes (um antgeno desconhecido e molculas de um anticorpo poliespecco) so colocados a difundir em um meio suporte,
o ponto onde os reagentes se encontram e formam
pode ser visualizado como uma linha ou banda de
precipitao (Fig. 5.3).
Esta reao estritamente qualitativa ou semiquantitativa (resultado expresso como a mxima
diluio da amostra do paciente que apresente

Fig. 5.2 Prova de precipitao simples demonstrando presena de crioglobulinas no soro direita, em paciente com infeco pelo vrus da hepatite C.

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Fig. 5.3 Reaes de imunodifuso radial simples e dupla. (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB.)

Imunodifuso Radial Simples

a variao quantitativa da imunodifuso radial
dupla. Nesta tcnica o anticorpo uniformemente
distribudo no gel e o antgeno (amostra teste)
aplicado em um orifcio. A amostra teste difunde radialmente no gel, formando um halo de precipitao
circular em torno do orifcio da amostra (Fig. 5.3).
A difuso depende do tamanho do orifcio,
temperatura, consistncia do gel, concentrao
do anticorpo includo no gel, tempo de difuso e
outros parmetros. O dimetro do halo de precipitao formado proporcional concentrao do
analito pesquisado na amostra. Pela comparao do
dimetro do halo da amostra-teste com padres de
concentrao conhecida (curva padro), estabelecese a concentrao do analito na amostra. Esta tcnica
pode ser utilizada principalmente na quanticao
de protenas como imunoglobulinas, fatores do complemento, protenas de fase aguda, cadeias leves e
protenas de transporte.

TCNICAS ENVOLVENDO
SEPARAO ELETROFORTICA
Nestas tcnicas ocorre a migrao de partculas
carregadas em um solvente condutor sob a inuncia

de campo eltrico. O movimento das molculas em

um campo eltrico depende principalmente da sua
carga, que por sua vez determinada pelo pH do
suporte. Como as molculas de protenas se tornam
ionizadas, migram ao eletrodo com carga oposta
(para o polo positivo, se a carga de superfcie for
negativa ou vice-versa). Esse o princpio da separao eletrofortica de misturas complexas, como
as protenas do soro (Fig. 5.4). Deste modo, a eletroforese de protenas adotada para separao em
mtodos como imunoeletroforese e imunoxao.

Imunoeletroforese
Combina a eletroforese em gel, seguida da
imunodifuso e precipitao das protenas. um
procedimento em duas etapas que primeiro envolve
a separao eletrofortica das protenas, seguida de
imunodifuso de cada componente, a partir do seu
centro de difuso, contra o anti-soro especco, formando uma linha ou arco de precipitao na regio
de equivalncia. Assim, a caracterizao de uma
substncia feita a partir de suas propriedades eletroforticas (mobilidades diferentes devido a cargas
eltricas diferentes), coecientes de difuso e propriedades imunolgicas (especicidade). O sistema
de imunodifuso que se obtm aproxima-se de uma

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Permite a identicao de gamopatias biclonais e

de doena de cadeias pesadas e leves, auxiliando no
diagnstico e na monitorizao de outras doenas
linfoproliferativas.

Fig. 5.4 Eletroforese de protenas sricas. Da esquerda para a direita, as

fraes albumina, 1, 2, e -globulinas. (Figura cedida pelo Laboratrio
de Patologia Clnica do Hospital So Lucas da PUC RS.)
Fig. 5.5 Eletroforese com imunofixao. SPE a eletroforese de referncia
dupla difuso bidimensional e, portanto, os padres
de precipitao obtidos podem ser interpretados
como nas tcnicas de dupla difuso .
A imunoeletroforese pode ser utilizada para
deteco de protena-M (monoclonal). tecnicamente mais fcil e de menor custo quando comparada tcnica de imunoxao, no entanto no
to sensvel.

Imunofixao
A imunoxao deve ser realizada quando um
pico ou banda encontrada na eletroforese de protenas sricas ou quando h suspeita de gamopatia
monoclonal. A imunoxao combina a eletroforese
e a imunoprecipitao. um procedimento em dois
estgios: primeiro a amostra aplicada em seis posies diferentes do gel de agarose e as protenas so
separadas por eletroforese de acordo com a carga.
Aps, soros monoespeccos para IgG, IgA, IgM,
cadeia kappa e cadeia lambda impregnados numa
ta de papel ou acetato de celulose so colocados
individualmente sobre cada posio, seguidos da
aplicao de soluo xadora de protenas. Se o
antgeno complementar estiver presente em propores adequadas na amostra, os complexos formados
precipitam e so xados no gel, o que permite sua
identificao com o auxlio de um corante (Fig.
5.5). O teste utilizado na deteco precoce de
gamopatias monoclonais, na interveno teraputica em casos novos e na recorrncia de mieloma.

e, a seguir, cada campo foi analisado com o anti-soro respectivo (anti-IgG, antiIgA, anti-IgM, anti-kappa e anti-lambda). Notamos neste paciente a presena
de protena M monoclonal em IgM-kappa. (Figura cedida pelo Laboratrio de
Patologia Clnica do Hospital So Lucas da PUC-RS).

TCNICAS ENVOLVENDO
A DISPERSO DA LUZ

Nefelometria
Uma caracterstica importante das solues coloidais a sua pronunciada disperso da luz. Quando
um feixe de luz incidente atravessa um meio contendo
partculas, estas interferem com a passagem da luz,
fazendo com que seja dispersa em todas as direes.
Este fenmeno, conhecido como efeito Tyndall, no
altera o comprimento de onda da luz incidente e
independente do tipo de partcula (Fig. 5.6).
Os ensaios nefelomtricos se baseiam no princpio de que um imunocomplexo em soluo dispersa
luz em vrios ngulos em relao luz incidente.
Um nefelmetro utiliza uma fonte de luz de alta
intensidade que incide em uma cubeta contendo os
imunorreagentes.
A quantidade e a natureza da disperso dependem
da forma e do tamanho das partculas, da concentrao, do comprimento de onda e do ndice de refrao
do meio. A nefelometria totalmente automatizada,
de realizao fcil, rpida e precisa, principalmente
se forem utilizados nefelmetros que subtraiam
rudos, como os causados por lipemia ou hemlise,

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Fig. 5.6 Esquema do princpio fsico da nefelometria e da turbidimetria.

e que garantam leitura na regio de excesso de anticorpo. Medidas acuradas s podem ser feitas nesta
regio porque onde existe relao linear entre a
concentrao da substncia e a densidade tica.
Dentre as aplicaes mais comuns temos as determinaes de protenas especcas como alfa-1-antitripsina, alfa-1-glicoprotena-cida, alfa-2-antiplasmina,
IgG, IgA, IgM, C3, C4, apolipoprotenas, beta-2microglobulina, anti-estreptolisina O, protena C
reativa ultrassensvel e fator reumatide.

Turbidimetria
Este teste est sujeito s mesmas condies dos
sistemas nefelomtricos. O sinal de deteco a
absorbncia e no a intensidade de luz dispersa (Fig.
5.6). No necessita de aparelhagem especial. As
reaes podem ser medidas em espectrofotmetros
simples utilizados em bioqumica. Pode ser utilizada
para medidas quantitativas de drogas ou biomarcadores no soro, plasma ou urina.

REAES DE AGLUTINAO
A ligao cruzada com produo de agregados
ocorre quando um anticorpo reage com um antgeno

multivalente presente em uma partcula (insolvel).

A partcula insolvel pode ser um antgeno insolvel
nativo, antgenos expressos em clulas (por exemplo, antgenos eritrocitrios) ou partculas cobertas
com antgenos (por exemplo, partculas de ltex).
As reaes de aglutinao tm boa sensibilidade e
podem ser analisadas por inspeo visual, no entanto
so mais sujeitas a resultados falso-positivos devido
aglutinao inespecca.

Reao de Aglutinao Direta

Nesta reao utilizam-se partculas antignicas
insolveis em sua forma ntegra ou fragmentada:
hemcias, bactrias, fungos e protozorios podem
ser aglutinados diretamente por anticorpo. So realizadas diluies em srie do anticorpo frente a uma
quantidade constante do antgeno. Aps um perodo
de incubao a aglutinao se completa e o resultado
geralmente expresso como a mxima diluio em
que ocorre a aglutinao (Fig. 5.7). Exemplos de
reaes de aglutinao direta: tipagem de grupos
sanguneos (antgenos especcos), reao de PaulBunnel-Davidson (antgenos heterlos), teste de
Widal para salmoneloses, teste de aglutinao para
toxoplasmose e tripanossomase.

Fig. 5.7 Reao de hemaglutinao. (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB.)

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Reao de Aglutinao Passiva ou

Indireta
Nas reaes de aglutinao passiva ou indireta,
as hemcias e as partculas inertes (bentonita, ltex,
sepharose, leveduras, gelatina) podem ser sensibilizadas por adsoro passiva. Isto pode ser feito
atravs de contato direto com antgenos solveis,
por adsoro via agentes qumicos solveis, por
adsoro com agentes qumicos, (p. ex. cido tnico
ou cloreto de cromo) e por conjugao atravs de
ligaes qumicas covalentes. Estes processos de
adsoro fornecem reagentes estveis. Devido
grande diversidade de antgenos que podem se ligar
s clulas ou partculas, a aplicao dos testes de
aglutinao passiva muito variada.

Reao de Inibio da Aglutinao

As reaes de inibio da aglutinao so baseadas na competio entre antgenos particulados e
solveis por um nmero limitado de stios combinatrios em molculas de anticorpos. A inibio da
aglutinao um indicador de reao positiva. Um
exemplo de tcnica de inibio da aglutinao a
testagem para a presena do hormnio da gonadotrona corinica (hCG) como teste de gravidez.

Teste de Aglutinao do Ltex

Partculas de ltex so esferas de poliestireno
utilizadas como suportes na adsoro de protena
solvel e antgenos polissacardicos, funcionando
como sistema indicador da reao antgeno-anticorpo. O teste pode ser empregado na pesquisa de
antgenos ou anticorpos. A aplicao mais comum
na deteco de fator reumatide IgM, dirigido contra
isotipos de IgG, IgA1, IgM ou IgE.

Teste de Aglutinao de Cristais de

Colesterol
O teste do VDRL (Veneral Disease Research
Laboratory) emprega cristais de colesterol que so
sensibilizados com lecitina e cardiolipina para a
pesquisa de anticorpos cardiolipdicos da slis ou
na presena de auto-anticorpos da sndrome anti-fosfolpide primria ou secundria, neste caso em geral
associada ao lupus eritematoso sistmico.

Coaglutinao
Nos testes de coaglutinao estaloccica, cepas
de Staphylococcus aureus mortos e intactos so
usadas para visualisao. A parede celular desses

microrganismos contm protena A, que se liga

poro Fc do anticorpo IgG, deixando a poro
Fab livre para reagir com o antgeno especco. As
reaes de coaglutinao so mais susceptveis
aglutinao inespecca. A aglutinao visvel das
partculas de Staphylococcus aureus indica a reao
antgeno-anticorpo.

ENSAIOS LTICOS

Reao de Fixao do Complemento

A presena de anticorpo especco no soro do
paciente detectada atravs da utilizao de antgeno, complemento e eritrcitos. Se o anticorpo est
presente, este ir se ligar ao antgeno especco. O
imunocomplexo formado ativa a cascata do complemento pela via clssica e haver consumo de complemento. Na segunda etapa, adiciona-se o sistema
indicador da reao que consiste de hemcias de
carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo
anti-hemcias de carneiro obtido em coelhos). A
medida da atividade hemoltica do complemento
no sistema indicador permite determinar a presena
ou no de antgeno ou anticorpo na mistura inicial
e sua quantidade. A atividade hemoltica pode ser
quanticada empregando-se diluies seriadas da
amostra a ser analisada. Tanto o anticorpo como o
antgeno no podem ter atividade anticomplementar,
isto , ativar o complemento separadamente.
Em laboratrios de Sade Pblica a reao de
xao do complemento usada para tipagem de
isolados virais.

Ensaio de Neutralizao
semelhante reao de xao do complemento, mas aplicvel somente em certas situaes
patognicas onde o anticorpo a ser medido dirigido
contra uma hemolisina (toxina bacteriana capaz de
lisar diretamente os eritrcitos). Nestas situaes, a
hemolisina e os eritrcitos reagentes so adicionados e, se o anticorpo hemolisina est presente, a
lise dos eritrcitos no ocorrer. A quanticao
realizada pela diluio seriada da amostra

ENSAIOS COM MARCADORES

FLUORESCENTES
Fluorocromo (ou uorforo) uma substncia
que absorve luz de comprimento de onda menor e
emite luz de comprimento de onda maior quando
excitado, fenmeno conhecido como uorescncia.

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

A liberao de energia na uorescncia imediata. Os uorocromos so molculas orgnicas com

comprimento de onda de excitao caracterstico.
O intervalo de tempo entre a absoro de energia e
a emisso da uorescncia muito curto, da ordem
de nanosegundos.

antgenos em tecidos biolgicos (material de bipsias, vrus, bactrias, clulas etc.), raramente
quantitativa. Essa tcnica muito utilizada para a
pesquisa de vrus respiratrios (inuenza, parainuenza, vrus sincicial respiratrio e adenovrus).

Reao de Imunofluorescncia Indireta

Testes fluorescentes homogneos de

modulao direta
So baseados na capacidade da molcula de
uorescena em emitir luz polarizada em um plano
aps excitao. O sinal emitido modicado quando o antgeno marcado se liga ao anticorpo, como
por exemplo no sistema Fluorescense Polarization
Immunoassay (FPIA). Neste, um composto marcado com uorescena (normalmente um frmaco
ou droga) compete com o composto no marcado,
da amostra analisada, pelo stio de ligao em um
anticorpo especco. Quanto menor a quantidade do
composto na amostra, maior a quantidade de composto marcado ligado ao anticorpo especco em
soluo, com reteno da luz polarizada incidente.
Este ensaio adequado para a deteco de molculas
pequenas e muito utilizado para a monitorizao
teraputica ou dosagem de drogas de abuso, sendo
rpido e reprodutvel.

Testes Fluorescentes Heterogneos

(Fig. 5.8)
Reao de Imunofluorescncia Direta
a deteco direta de antgenos usando anticorpo antgeno-especco marcado com substncia
uorescente. Pelo fato de ser utilizada para detectar

No teste de imunouorescncia indireta o anticorpo presente na amostra do paciente reage com

um antgeno especco xado em uma lmina de
microscopia. Um passo de lavagem realizado e
um anticorpo anti-humano (conjugado) marcado
com substncia uorescente adicionado. Aps um
segundo passo de lavagem, para remover o conjugado no ligado, a observao de uorescncia ao
microscpio indicativa da presena do anticorpo
em estudo na amostra do paciente. O conjugado
isotipo-especco, sendo assim possvel distinguir
reaes condicionadas pela presena de IgG, IgA
e IgM.
A imunouorescncia indireta o teste de referncia na sorologia de muitas doenas, como as
infecciosas e auto-imunes (Figs. 5.9 e 5.10). sensvel, especca em sua reao molecular, reprodutvel
e de padronizao e execuo simples. O mesmo
conjugado pode ser utilizado em sistemas diferentes.
A necessidade de microscpio de uorescncia, a
qualidade do sistema de iluminao empregado a
subjetividade na leitura podem ser fatores limitantes.
O teste muito utilizado para a pesquisa de autoanticorpos em doenas difusas do tecido conjuntivo,
nas vasculites sistmicas (ANCA) e no diagnstico
de infeces pelo Treponema pallidum, Tripanosoma
cruzi, para as diversas Chlamydiae, entre outros.

Fig. 5.8 - Testes fluorescentes heterogneos: em (a) imunofluorescncia direta (IFD), em (b) imunofluorescncia indireta (IFI) com anticorpo antiisotipo e em (c),
IFI com protena A marcada com substncia fluorescente. (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB)

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CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

Fig. 5.10 - Imunofluorescncia indireta positiva para borreliose de Lyme. Soro

de paciente contendo anticorpos IgM, na fase aguda da doena.

aplicao so a quanticao de populaes celulares (CD4+, CD8+), identificao de antgenos

leucocitrios como HLA B27, HLA DR4 e imunofenotipagem.

Ensaios de Citometria de Fluxo Baseado em

Partculas Multiplex
Fig. 5.9 - Imunofluorescncia indireta em clulas de epitelioma humano (HEp2) mostrando padro nuclear pontilhado grosso e clulas em metfase igualmente
decoradas, caractersticas da presena de auto-anticorpos anti-centrmero. Estes
auto-anticorpos so vistos na esclerose sistmica, cirrose biliar primria e em
alguns casos de sndrome de Sjgren.

Citometria de Fluxo
a aplicao das tcnicas de imunouorescnica
na identicao de determinadas clulas em suspenso, ou seja, na identicao de antgenos em clulas
vivas. Quando uma suspenso de clulas marcadas
colocada em um separador de clulas ativado por
uorescncia (FACS), o aparelho determina a intensidade da uorescncia de cada clula. As clulas
so separadas conforme sua emisso uorescente
caracterstica. Esta tcnica permite, alm da anlise
fenotpica e funcional de subpopulaes celulares, o
isolamento de diferentes populaes celulares com
distintos antgenos de superfcie corados por diferentes anticorpos uorescentes (Fig. 5.11).
A citometria de uxo ferramenta diagnstica
e prognstica na avaliao de doenas malignas e
benignas, transplante de rgos e tecidos, imunodecincias primrias e adquiridas. Exemplos da

Ensaio desenvolvido recentemente que combina a citometria de uxo com microesferas. Vrias
destas microesferas so produzidas por diferentes
empresas. Um destes sistemas consiste de 100 diferentes tipos de microesferas produzidas de forma
uniforme, com propores e nveis de uorescncia
do vermelho e laranja (detectado em um equipamento FACScan) distintas. Cada microesfera forma
a base de um ensaio individual, eis que apresenta
endereo espectral especco, usando a uorescncia
verde para analisar os resultados (FL1). Assim, um
primeiro feixe de laser l qual a esfera especca
que est passando pelo detector, e o segundo feixe
l a reao em sua superfcie. Este sistema facilita
o desenvolvimento de ensaios multiplexados, que
simultaneamente medem diferentes analitos em um
pequeno volume de amostra (Fig. 5.12). Eles so
rpidos, no requerem lavagem para separao da
fase livre daquela ligada e podem ser realizados em
menos de 2 horas.

ENSAIOS DE IMUNOHISTOQUMICA

Imunoperoxidase
um ensaio semelhante imunouorescncia
indireta em que a presena de anticorpo identi-

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

Fig. 5.11 - Esquema de separao de populao de clulas expressando ou no antgenos A e B marcados, identificados por anticorpo marcado com molcula
fluorescente. Aps anlise computadorizada as populaes celulares so representadas graficamente em funo da fluorescncia emitida aps marcao. (Fonte:
http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/C2_AGAB).

Fig. 5.12 - Representao esquemtica dos reagentes utilizados no ensaio de citometria de fluxo baseado em partculas Multiplex. As linhas azuis representam a
luz excitatria incidente, as linhas das demais cores, os padres de emisso.

cada visualmente no substrato antignico. Contudo,

na imunoperoxidase indireta, em vez de o conjugado
ser um anticorpo marcado com uma substncia uorescente, o conjugado marcado com uma enzima
(principalmente peroxidase), que reage com o seu
substrato correspondente produzindo um produto
que pode ser visto em um microscpio tico, e eliminando teoricamente o custo do microscpio de
imunouorescncia.

Imunocitoqumica
Envolve a avaliao microscpica computadorizada aps ensaio de imunouorescncia ou imunohistoqumica em material de bipsia. H aumento
na especicidade com a remoo da subjetividade
do observador, podendo ser realizada a avaliao
quantitativa atravs da anlise de cor, intensidade e
concentrao.

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CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

ENSAIOS COM MARCADORES

RADIOATIVOS

Radioimunoensaio
Os testes radioativos utilizam um reagente
marcado, antgeno ou anticorpo, para quanticar
o antgeno ou o anticorpo da amostra. O composto
desconhecido pode ser determinado pela medida da
radioatividade emitida. O termo radioimunoensaio
(RIE) utilizado usualmente quando o componente
marcado o antgeno e ensaio imunorradiomtrico
(IRMA) quando o componente marcado o anticorpo. O radioistopo mais utilizado o iodo-125. A
sensibilidade do mtodo da ordem de nanogramas
ou picogramas.

Radioallergosorbent Test
o nome dado para o mtodo in vitro que detecta
anticorpos IgE (ou IgG) alergeno-especcos. Uma
matriz de carboidratos (chamada sorbent) revestida
de alergeno, podendo ser detectados utilizando antianticorpo marcado com um radioistopo.

ENSAIOS LUMINESCENTES

Ensaios Quimioluminescentes
So baseados na emisso de luz produzida em
algumas reaes qumicas de oxidao, aqui incluidos agentes quimioluminescentes derivados biologicamente. A emisso de luz pode ser detectada ou
medida utilizando-se luminmetros com tubos fotomultiplicadores, diodo de silicone em estado slido
ou lme fotogrco como detector. As reaes de

quimioluminescncia mais utilizadas envolvem reaes de oxidao do luminol e do isoluminol, steres

de acridina e decomposio catalisada pela fosfatase
alcalina de adamantil 1,2-dioxetano aril-fosfato. So
altamente sensveis e o nvel de deteco da ordem
de atomol ou zeptomol .

Eletroquimioluminescncia
A eletroquimioluminescncia, tambm chamada
de quimioluminescncia eletrogerada, envolve reaes de transferncia de um eltron na superfcie
de um eletrodo com gerao de composto instvel
(excitado) que emite um fton de luz (Fig. 5.13).
Ocorre como uma reao de oxidao-reduo em
ciclo. O sistema mais utilizado envolve a aplicao
de voltagem em um eletrodo na presena de um luminforo eletroquimioluminescente como o rutnio
Ru(bpy)32+ em presena da tripropilamina (TPA).
A eletroquimioluminescncia encontra aplicao
em imunoensaios e anlise de DNA. Este sistema
utilizado para a dosagem de hormnios, marcadores
tumorais, marcadores cardacos e deteco de anticorpos em algumas doenas infecciosas.

ENSAIO COM MARCADORES

ENZIMTICOS

Enzimaimunoensaio
o termo genrico para um grande nmero de
testes que permitem ensaios quali- e quantitativos,
para a deteco tanto de antgenos quanto de anticorpos. Estes testes usam o produto da mudana de
cor da interao da enzima com o seu substrato para
medir a reao entre o antgeno e o anticorpo.

Fig. 5.13 - Esquema da reao de eletroquimioluminescncia. A micropartcula magntica (fase slida) suporta a estrutura do imunoensaio, em que o marcador
a molcula de rutnio. O marcador participa de uma reao de oxidao-reduo com a tripropilamina (TPA). (Fonte: Roche do Brasil Diviso Diagnstica.)

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

Enzyme Multiplied Immunoassay Technique

(EMIT)

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

(Fig. 5.14)

um teste de enzimaimunoensaio homogneo

(fase nica) em que o antgeno a ser medido compete, com um antgeno marcado com enzima, por
um nmero limitado de anticorpos. O anticorpo
reagente tem a capacidade de bloquear a atividade
enzimtica ao ligar-se ao antgeno marcado, impedindo a formao do produto ao ser adicionado o
substrato. O antgeno marcado livre resultante da
competio com o antgeno da amostra reage com o
substrato e forma um produto corado proporcional
concentrao de antgeno presente na amostra.
um teste similar ao FPIA, com ampla aplicao no
monitoramento teraputico e pesquisa de drogas de
abuso. Pode ser utilizado sangue total, soro ou urina.
A vantagem do EMIT sobre o FPIA que pode ser
facilmente adaptvel a analisadores automticos de
parmetros bioqumicos. Em nosso meio o sistema
EMIT tem sido utilizado na dosagem de ciclosporina
em transplantados.

Trata-se de tcnica imunoenzimtica sensvel, heterognea (mltiplas fases), para a quanticao de

antgenos ou anticorpos. Um dos reagentes imobilizado na fase slida, enquanto outro pode ser ligado
a uma enzima, com preservao tanto da atividade
enzimtica como da imunolgica do anticorpo.
A fase slida pode ser constituda por partculas
de agarose, poliacrilamida, dextrano, poliestireno,
etc. Placas plsticas so as mais difundidas por
permitirem mltiplos ensaios e automao. O teste
detecta quantidades extremamente pequenas de antgenos ou anticorpos, podendo ter elevada preciso
se os reagentes e os parmetros forem bem padronizados. Para a pesquisa de antgeno o anticorpo especco correspondente imobilizado fase slida. Os
conjugados enzimticos devem ser preparados com
anticorpos de alta anidade e muito puricados. Os
substratos cromognicos empregados pela degra-

Fig. 5.14 - Esquemas dos testes enzimticos heterogneos do tipo indireto (a), sanduche (b) e captura (c). (Fonte: http://www.uoguelph.ca/mbnet/ 323IMMUN/
C2_AGAB.)

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CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

dao enzimtica do origem a produtos solveis

coloridos, cuja determinao feita medindo-se a
densidade tica da soluo por espectrofotometria.
Para a peroxidase, o substrato o perxido de hidrognio e os cromgenos ou doadores de hidrognio
mais utilizados so a ortofenilenodiamina (OPD),
cido 5-amino-saliclico, ortotoluidina, 2,2-diazino
do cido etilbenzotialino sulfnico (ABTS) e tetrametilbenzidina (TMB).
ELISA Direto uma tcnica para a medida de
antgeno baseada na competio entre o antgeno
da amostra e o antgeno marcado com enzima pelo
anticorpo. ELISA Indireto, ou ensaio imunomtrico,
mede a concentrao de anticorpo usando o antgeno
ligado fase slida, onde o anticorpo da amostra se
ligar. O imunocomplexo ser evidenciado pelo antianticorpo marcado com enzima (pode ser istipoespecco: IgG, IgA, IgM) e a subseqente adio
do substrato/cromgeno. A especicidade do ensaio
de ELISA indireto para a deteco de anticorpos
da classe IgM em doenas infecciosas limitada,
ocorrendo resultados falso-positivos devido interferncia do fator reumatide na presena de anticorpos IgG especcos. O uso de imunoadsorventes
comerciais pode minimizar este problema.

separao, transferidas para uma membrana de

nitrocelulose onde cam imobilizadas. Essa membrana utilizada como suporte slido para um
ensaio imunoenzimtico, semelhante ao mtodo da
imunoperoxidase.
Essa tcnica pode ser empregada para a pesquisa
de antgenos ou de anticorpos, sendo um importante
auxiliar no diagnstico de doenas infecciosas e
auto-imunes. Utilizando-se este teste, pode-se determinar se h antgeno ou anticorpo na amostra e qual
a sua especicidade, se o preparado puro ou no,
quais protenas esto sendo reconhecidas por um
anticorpo, distinguir diferentes pers de anticorpos
de acordo com a fase da doena ou infeco ou, de
acordo com a presena ou no de infeco, diferenciar entre cepas patognicas e no patognicas.
tambm utilizado como teste conrmatrio na
investigao de doenas infecciosas e auto-imunes
(Fig. 5.15).

ELISA com Captura de IgM

A presente seco pretende apresentar os ensaios

disponveis para avaliar laboratorialmente aspectos
importantes da funo imunolgica, como a resposta
imune celular e as funes de quimiotaxia e exploso oxidativa de clulas fagocticas. Estes temas
foram assim distribudos:

Avaliao da Imunidade Celular
Avaliao da funo das clulas T:
Contagem absoluta de linfcitos.
- Contagem das subpopulaes de linfcitos.
- Anlise funcional dos linfcitos (a citometria
de uxo na avaliao da ativao e proliferao dos linfcitos).
- Teste cutneo de hipersensibilidade tardia
(delayed-type hypersensitivity-test DHT).
- Produo de citocinas.
- Ensaios de citotoxicidade.

Alguns Exemplos da Aplicao Clnica dos Testes
de Avaliao da Imunidade Celular
Avaliao das Funes Fagocticas: Oxidao e
Quimiotaxia
Indicaes clnicas para os ensaios de avaliao da funo fagoctica.
Procedimentos laboratoriais:
Isolamento de neutrlos e moncitos.

Foi desenvolvido para solucionar o problema

descrito da interferncia do fator reumatide na presena de anticorpos IgG especcos. Neste ensaio,
anticorpos anti-IgM so adsorvidos fase slida,
capazes de xar todos os anticorpos de istipo IgM
da amostra do paciente. Aps, o antgeno adicionado, ligando-se ao anticorpo especco da amostra
anteriormente imobilizado. Um segundo anticorpo
anti-antgeno marcado com enzima adicionado e,
subseqentemente, o substrato/cromgeno, resultando em um produto corado de intensidade proporcional concentrao de IgM especca presente na
amostra. Esta tcnica o mtodo de escolha para a
deteco de anticorpos IgM especcos.

Enzimaimunoensaio com Micropartculas (MEIA)

uma tcnica imunoenzimtica em que o suporte slido consiste de pequenas micropartculas em
suspenso lquida.

[G]TCNICAS DE
IMUNOELETROTRANSFERNCIA

Western Blotting
um procedimento em que as protenas so
separadas pelo tamanho por eletroforese e, aps

IMUNIDADE CELULAR E
FUNES FAGOCTICAS

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

Fig. 5.15 - Western Blot de soros de crianas com diagnstico de lupus eritematoso sistmico juvenil. Em 1, soro controle negativo, em 2 e 3, soros controle positivos,
conforme indicado. Entre 4 e 17, fitas com reaes individuais de auto-anticorpos. Perceber a presena de auto-anticorpos contra proteina P ribossomal (rRNP) em
4 a 7, bem como a grande variedade de bandas representativas da presena de mais de um auto-anticorpo nos casos juvenis de lupus. Em 18, soro reagindo com o
antgeno NOR-90 (human upstream binding factor), proveniente de criana com fenmeno de Raynaud.

Ensaio de atividade microbicida.

Ensaio de quimiotaxia.
Ensaio em lmina do NBT.
Ensaio com a diclorouorescena.

gentica um componente cada vez mais importante

da testagem e interpretao diagnstica. O papel do
laboratrio de imunologia clnica o de traduzir os
novos rumos da pesquisa em testes relevantes para
a investigao individual do paciente1.

Imunofenotipagem.
Passos na investigao da funo fagoctica.

AVALIAO DA IMUNIDADE CELULAR

A compreenso do sistema imune melhorada
pela deteco de anormalidades discretas em pacientes com suspeita de decincia imune. Estes avanos
vieram de estudos da funo e diferenciao celular
normais, da deleo gnica experimental e da anlise detalhada das sndromes de imunodecincias
humanas. Novas abordagens experimentais tm
ajudado a elucidar os mecanismos e bases funcionais
da desregulao imune em pacientes com mutao
gentica primria (congnita) do sistema imune ou
infeces secundrias (adquiridas). Em geral, as
decincias imunes no podem ser distinguidas pela
apresentao clnica das infeces. A informao

Quando Fazer a Avaliao da

Imunidade Celular?
Os testes que avaliam a funo celular podem ser
caros e demorados. A escolha do teste depende da
suspeita clnica. Existem poucos testes totalmente
especcos e os seus resultados devem ser interpretados com cautela.
A deciso de investigar a resposta imune em
um paciente normalmente comea devido a uma
aumentada suscetibilidade a infeces, aumento na
gravidade de infeces comuns ou por reao atpica
a imunizaes. Desta forma, os testes de triagem
iniciais devem incluir a presena de infeco pelo
HIV.
Alteraes imunes podem acompanhar muitas
entidades clnicas, incluindo doenas malignas e
tratamento da hemolia, doenas hematolgicas,

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CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

trombocitopenia auto-imune, doenas linfoproliferativas, hemoglobinopatias e anormalidades cromossmicas, como por exemplo a sndrome de DiGeorge
e a sndrome de Down. Doenas auto-imunes como
a doena mista do tecido conjuntivo, o lpus eritematoso sistmico, o diabetes tipo 1, a esclerose
amiotrca lateral, a esclerose mltipla e a miastenia
gravis podem estar associadas a alteraes imunes
celulares.

Avaliao da Funo das Clulas T

Os testes de triagem para a avaliao da funo
das clulas T so freqentemente seguidos por testes
adicionais para completar a avaliao da imunidade
celular. Dada a complexidade destes testes complementares, eles normalmente s so disponveis em
grandes centros com laboratrios especializados de
imunologia.
Os testes disponveis para a avaliao das clulas
T incluem:

Contagem absoluta de linfcitos.

Contagem das subpopulaes de clulas T.

Anlise funcional das clulas T.

Teste cutneo de hipersensibilidade tardia (delayed-type hypersensitivity DHT).

Produo de citocinas.

Ensaios de citotoxicidade.

ser detectada por citometria de uxo utilizando-se

anticorpos anti-HLA-DR ou anti-HLA-DQ. uma
marca caracterstica da decincia de molculas de
MHC classe II1 (Tabelas 5.1 e 5.2).
A citometria de fluxo muito utilizada para
avaliar o estado funcional dos leuccitos, e praticamente todos os aspectos de sua vida (e morte) so
acessveis atravs da tcnica. A citometria de uxo
disponibiliza a imunofenotipagem multiparamtrica,
ensaios funcionais celulares, achados moleculares da
superfcie celular, alm de processos intracelulares
como a produo de citocinas e a fosforilao de
protenas. A visualizao e quanticao direta de
clulas T antgeno-especcas utilizando a tecno-

Tabela 5.1. Imunofenotipagem: Subpopulaes de

Linfcitos
Painel bsico em sangue perifrico (sangue total, lisado de
clulas vermelhas)
CD45/CD14
Controles isotipo imunoglobulinas de rato
CD3/CD19
CD3/CD4
CD3/CD8
CD3-/CD56 e 16
Painel de ativao: isolado de clulas mononucleares

Contagem Absoluta de Linfcitos

As clulas T constituem 3/4 do pool de linfcitos
circulantes, assim, uma diminuio substancial na
quantidade de linfcitos T circulantes resulta em
reduo na contagem dos linfcitos. um dado
facilmente obtido.
bom lembrar que a contagem absoluta de linfcitos difere signicativamente entre bebs, crianas
e adultos. Assim, importante avaliar a contagem
absoluta de linfcitos na faixa referencial idadeespecca.

CD45/CD14
Controles isotipo imunoglobulinas de rato
CD3/CD25 (Receptor de interleucina 2 IL-2-R)
CD3/HLA-DR

Tabela 5.2. Painel de Ativao de Clulas T5

Componentes

Valores de Referncia

CD2

75% a 92%

Contagem das Subpopulaes de Linfcitos

CD3

63% a 84%

A funo imune diferencial realizada por citometria de uxo, em que os linfcitos T so separados
pela expresso do seu receptor CD3. Este receptor
essencial para a ativao da populao de clulas T.
Linfcitos B so identicados pela sua imunoglobulina de superfcie (detectada por anticorpos monoclonais como anti-CD19 e anti-CD20). A expresso
de molculas do MHC de classe II tambm pode

CD69 e CD3

0% a 2%

CD25 2 CD2

0% a 5%

CD71 e CD2

0% a 8%

HLA-DR e CD3q

1% a 9%

Receptor de clula T(TCR)

59% a 84%

Receptor de clula T (TCR)

0% a 10%

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

logia do tetrmero peptdeo-MHC, em combinao

com os ensaios funcionais, proporciona o estudo de
subpopulaes de clulas T especcas que sejam
de interesse.

Anlise Funcional dos Linfcitos (a Citometria

de Fluxo na Avaliao da Ativao e Proliferao
dos Linfcitos )
Uma metodologia baseada na citometria de uxo
pode ser utilizada para avaliao dos linfcitos nas
vrias fases do seu ciclo celular. Em geral, a anlise
do ciclo celular realizada pela medida do nvel de
intensidade de uorescncia emitida aps a marcao do DNA. A marcao mais utilizada com
iodeto de propdio (a intensidade de uorescncia
proporcional quantidade de DNA na clula). Utilizando um complexo modelo matemtico, possvel
medir o percentual de clulas contendo DNA entre
2n e 4n , o que se correlaciona com o percentual de
clulas na fase S do ciclo celular. Os linfcitos
do sangue perifrico geralmente esto na fase de
repouso do ciclo celular, com menos de 5% das
clulas na fase S.
Alguns laboratrios tm substitudo o ensaio com
a incorporao da timidina triciada por uma combinao de ensaios de induo de marcadores de superfcie celular e a medida do percentual de clulas
nas vrias fases do ciclo celular aps ativao.

Teste Cutneo de Hipersensibilidade Tardia

(Delayed-type Hypersensitivity Test DHT)
O procedimento in vivo mais utilizado para avaliar a imunidade celular o teste cutneo simples.
Um teste cutneo positivo a uma resposta tipo hipersensibilidade tardia implica numa resposta imune
celular intacta, bem como uma intacta quimiotaxia
monoctica. Embora os testes cutneos sejam facilmente realizveis, os resultados negativos so de
difcil interpretao, especialmente em crianas pequenas. Um teste cutneo no to sensvel quanto
um ensaio de estimulao linfocitria in vitro.
O DHT utiliza antgenos aos quais o indivduo
tenha sido previamente exposto, como por exemplo
o toxide tetnico, os antgenos da Candida albicans e da caxumba etc. A falha na resposta pode
reetir disfuno nas clulas T (anergia das clulas
T, Tabela 5.3). Quando o teste cutneo for utilizado
para avaliar a imunidade celular, deve-se atentar
para o fato de que o paciente seja inoculado com
um antgeno ao qual certamente tenha sido exposto
anteriormente, caso contrrio, um teste negativo se

dar no pela anergia da clula T, e sim pelo fato da

falta de exposio anterior. Normalmente indicada
a aplicao de mais de um tipo de antgeno no DHT
para superar este tipo de problema.
O DHT depende da preparao do antgeno
(qualidade), aplicao e interpretao da resposta
(avaliao), o que requer treinamento cuidadoso dos
prossionais envolvidos na sua realizao.
A resposta cutnea ao veneno de hera e outras
reaes de hipersensibilidade de contato so equivalentes ao teste cutneo DHT.

Tabela 5.3. Causas de Anergia no Teste Cutneo

Falta da histria antignica adequada, quando o painel
aplicado no inclui ativadores de amplo espectro
Imunodeficincia primria
Infeces virais
M nutrio
Doena granulomatosa crnica
Neoplasias

Produo de Citocinas
O estudo dos mecanismos imunolgicos de desenvolvimento de auto-imunidade, alergias, doenas
hematolgicas e imunodeficincias impossvel
sem uma avaliao quali-quantitativa da produo
de citocinas. Em um nmero de doenas do sistema
imune, a quanticao de citocinas no soro e no
meio de clulas sangneas estimuladas essencial
para determinar o estgio imunopatogentico do
desenvolvimento de uma doena, para escolher a
imunoterapia adequada e estimar a eccia da imunocorreo especca.
Conseqentemente, o desenvolvimento de novos
mtodos para estimar o nvel de citocinas em meio
siolgico ou meio de cultura de clulas importante no somente na pesquisa, mas tambm na prtica
mdica.
Existem kits comerciais disponveis para a
dosagem de citocinas atravs de metodologia imunoenzimtica (ELISA), radioimunoensaio (RIA),
quimioluminescncia (CLIA) ou eletroquimioluminescncia (ECLIA). Atualmente, esto disponveis em laboratrios de referncia a dosagem das
seguintes citocinas: IL-1, receptor antagonista de
IL-1, IL-2, receptor solvel de IL-2, IL-3, IL-4, IL-

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CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

5,IL-6, IL-7,IL-8, IL-9, IL-10,IL-11, IL-12, TNF-

e IFN-. Tambm esto disponveis as dosagens de
e -quimiocinas (molculas com funo de recrutamento e ativao de leuccitos), prostaglandinas
e leucotrienos.
Alteraes nas cadeias proticas dos receptores
especcos das citocinas podem estar associadas a
infeces recorrentes por microrganismos oportunistas, como o Mycobacterium avium.

Ensaios de Citotoxicidade
A atividade citotxica de linfcitos T, clulas
matadoras naturais (NK) e clulas matadoras ativadas por citocinas usualmente testada atravs
de ensaios radioativos, que detectam a liberao de
contedos citoplasmticos aps a desintegrao da
clula-alvo agonizante. Em contraste a esta avaliao indireta da citotoxicidade, foi descrito um ensaio
de uorescncia baseado na anlise direta qualiquantitativa por citometria de uxo de dano celular
a um nico nvel celular. Nesta tcnica, clulas-alvo
so coradas com PKH-26, corante lipoflico que se
integra membrana celular e permite a distino
entre clula-alvo e clula efetora. Aps 3 horas
de incubao in vitro, uma outra colorao com
anexina V-FITC (ann-FITC) e iodeto de propdio
(PI) permite a discriminao entre clulas vivas,
em apoptose ou necrticas. A anlise de dados
realizada primeiramente nas clulas-alvo PKH-26
positivas, seguida da anlise das subpopulaes annFITC e PI positivas. O percentual de citotoxicidade
na populao de clulas PKH-26 calculado pela
subtrao de clulas-alvo ann-FITC ou PI positivas
no-especcas, medida em controles apropriados
sem a clula efetora.
A colorao da membrana da clula-alvo como
clulas de melanoma primrio ou blastos leucmicos
revelou impregnao alta e estvel do PKH-26, sem
alterar a viabilidade ou imunogenicidade das clulas.
Usando linfcitos T citotxicos antgeno-especcos,
foi demonstrado que a tcnica com citometria de uxo sensvel e se correlaciona com o ensaio padro
de liberao do cromo 51, sendo o novo ensaio mais
simples e altamente reprodutvel.
Similarmente, a protena fluorescente verde
enriquecida (enhanced green fluorescent protein
EGFP) foi utilizada para avaliar a citotoxicidade
de clulas matadoras naturais (NK) sobre clulas de
eritroleucemia humana (linhagem K562) por citometria de uxo. Esta nova tcnica para avaliao de
citotoxicidade de clulas NK mostrou forte associao tcnica padro que utiliza marcao radioativa

com Cr51, sem a necessidade de pr-colorao ou

pr-marcao das clulas-alvo.

ALGUNS EXEMPLOS DA APLICAO

CLNICA DESTES TESTES
SOFISTICADOS DE AVALIAO DA
IMUNIDADE CELULAR
O monitoramento da resposta celular imunoterapia do cncer pode ser avaliado. Muitos ensaios
clnicos esto testando a viabilidade de estimular o
sistema imune para tratar o cncer. A eccia desta
abordagem ser determinada pelo desfecho, no qual
a avaliao da magnitude e atividade da resposta
imune um importante ponto intermedirio no desenvolvimento destas estratgias imunoterpicas.
Outra aplicao clnica so os ensaios com clulas NK no prognstico do diabetes tipo I. O diabetes
tipo 1 uma doena caracterizada pelo distrbio na
homeostasia da glicose, que resulta da destruio
auto-imune de clulas produtoras de insulina no
pncreas. O ataque auto-imune ainda no est totalmente caracterizado, mas exibe componentes tanto
da alterao dos auto-antngenos quanto da falha nos
mecanismos de autotolerncia.
Decincias nas clulas NK tm sido identicadas em modelos animais de diabetes tipo 1. O
trabalho de Poulton e Baxter, citado abaixo, sugere
um relacionamento similar em humanos, podendo
existir associao entre decincias em clulas NK
e diabetes tipo 1. Os autores descrevem mtodos
apropriados para a avaliao clnica das clulas NK
e discutem os passos necessrios na testagem e validao de ensaios com clulas NK como um fator
prognstico no diabetes tipo 1.
Estudos de laboratrio so essenciais para a avaliao do estado funcional imune. O uso prudente
destes testes requer, contudo, que no somente
sejam usados de maneira organizada, comeando
com os testes simples de triagem, mas que tambm
sejam selecionados de acordo com os indcios clnicos obtidos no histrico e exame fsico do paciente.
Alm disso, os resultados so relativamente fceis
de interpretar quando esto claramente normais
ou totalmente anormais. A diculdade reside em
determinar o atual grau de disfuno imune quando
os resultados esto na zona indeterminada. Nestas
situaes, uma combinao de testes laboratoriais
freqentemente ajuda a esclarecer o status imune
funcional, e a interpretao deve ser feita por um
especialista em desordens imunes.

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

As avaliaes de disfunes na imunidade humoral so muito mais compreendidas e os ensaios

para sua avaliao mais facilmente disponveis
nos laboratrios. Com o desenvolvimento da imunoterapia e a manipulao da imunomodulao,
os testes de avaliao da imunidade celular sero
cada vez mais necessrios para monitorar a eccia
e estimar o grau de interveno durante a terapia.
Com estes recursos, deveremos estar cada vez mais
familiarizados

AVALIAO DAS FUNES

FAGOCTICAS: OXIDAO E
QUIMIOTAXIA
A disfuno fagoctica, atribuda aos leuccitos
mononucleares (moncitos/macrfagos), polimorfonucleares ou ambos, classicada como intrnseca
ou extrnseca.
Os defeitos intrnsecos so devidos, em parte,
a decincias herdadas em enzimas-chave da via
glicoltica ou da hexose-monofosfato. Estas rotas
metablicas so responsveis pela produo de
radicais de oxignio como mecanismo microbicida,
tanto nos polimorfonucleares (PMN) quanto nos
mononucleares. Outros defeitos intrnsecos esto
associados a decincias das molculas de adeso
da superfcie celular (CD11b, CD18), necessrias
migrao da clula ou fagcito.
Os defeitos extrnsecos que comprometem a
funo fagoctica incluem hipogamaglobulinemia,
decincias de complemento, doenas auto-imunes,
imunodecincia adquirida e vrias terapias imunossupressoras.

Indicaes Clnicas para os Ensaios

de Avaliao da Funo Fagoctica
As situaes clnicas em que algum tipo de
avaliao das funes dos moncitos/macrfagos
ou neutrlos necessria muito variada, indo
de um paciente peditrico com histria de infeco
cutnea crnica, abscesso perinatal ou episdios
mltiplos de pneumonia a um adulto com processo
retardado de cicatrizao. Com o advento da terapia
com citocinas, um auxiliar terapia ps-radiao e
quimioterapia para doenas malignas, ou no tratamento da imunodecincia adquirida, novos testes
de laboratrio so necessrios para avaliar a eccia
do tratamento. O pacientes peditricos com suspeita
de disfuno neutroflica so primeiramente triados
para avaliao da exploso oxidativa intacta pelo
teste simples em lmina do nitroblue tetrazolium

(NBT) ou o ensaio com diclorouorescena (DCF)

por citometria de uxo. Se o resultado for anormal,
realiza-se o ensaio de avaliao microbicida, que
abrange todos os componentes dos processos fagocticos e serve como teste funcional denitivo para
o diagnstico da doena granulomatosa crnica
(CGD). O transplante de medula ssea nos pacientes
com doena granulomatosa crnica simplesmente
seguido periodicamente pelo teste do NBT ou pelo
ensaio DCF, para monitorar o bom xito inicial e
sustentado do enxerto.
A terapia com citocinas como uma forma de
aumentar os mecanismos de defesa est se tornando um procedimento freqente em pacientes com
predisposio transitria ou crnica s infeces.
Alguns exemplos incluem pacientes sob tratamento
de doenas malignas ou tratados com terapia antiviral imunossupressora para a sndrome da imunodecincia adquirida (SIDA/AIDS). Nestes casos,
a avaliao da modulao positiva (upregulation)
de moncitos/macrfagos ou neutrlos realizada
atravs da presena de marcadores de superfcie
como Ia, CD11b, CD64(FcR I), CD16 (FcR III) e
CD 18 porque estes marcadores tm um papel importante na resposta inamatria e no mapeamento
imune. Eles esto freqentemente deprimidos em
pacientes secundariamente imunocomprometidos.

Procedimentos Laboratoriais
Isolamento de Neutrfilos e Moncitos
Este procedimento realizado para o isolamento
de moncitos e neutrlos que sero usados nos
ensaios de quimiotaxia e atividade microbicida.
Princpio: Amostra de sangue total heparinizado submetida a gradiente de densidade em
Ficoll/Hypaque sob centrifugao. As clulas
mononucleares (linfcitos e moncitos) situam-se
na interface plasma/Ficoll-Hypaque. Estas clulas
mononucleares so cuidadosamente aspiradas. O
plasma e o Ficoll/Hypaque remanescentes so aspirados, permanecendo no tubo as clulas vermelhas
e polimorfonucleares. As clulas mononucleares
so depositadas em frascos cobertos com gelatina,
seguindo a aderncia dos moncitos. As clulas
mononucleares que no cam aderidas (linfcitos)
so cuidadosamente decantadas. Posteriormente,
os moncitos sero soltos da gelatina atravs de
aspirao.
Os eritrcitos e polimorfonucleares so ressuspensos e adicionado Dextran 500 a 1%. Aps
centrifugao, as clulas vermelhas sedimentam e

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90

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

os polimorfonucleares permanecem em suspenso.

O sobrenadante, rico em polimorfonucleares, cuidadosamente aspirado.

comparados com valores de controles obtidos com

fagcitos-controle avaliados em paralelo.

Desta forma, obtm-se clulas mono e polimorfonucleares separadas para serem utilizadas nos testes
especcos.

Ensaio em Lmina do NBT

Ensaio de Atividade Microbicida

Princpio: O ensaio microbicida h muito tempo
considerado o melhor teste funcional para avaliao da funo fagoctica. O teste baseado na adio
de concentraes conhecidas de bactrias opsonizadas a neutrlos ou moncitos isolados, seguida
de incubao a 37C com amostragem da reao
em intervalos de 30 min at 2 horas. As amostras
ento so colocadas em placas com gar-sangue,
seguida de incubao por 12 a 18 h (overnight) a
37C, para visualizar as bactrias viveis atravs do
crescimento visvel das colnias. As colnias so
contadas. O nmero de colnias em cada frao de
tempo plotado em um grco semi-log. Alternativamente, o percentual de bactrias mortas em cada
frao de tempo determinado pela reao com
misturas contendo somente bactrias opsonizadas.
Uma reao controle bactria-polimorfonuclear deve
proporcionar morte bacteriana superior a 90% em 2
horas de incubao.

Ensaio de Quimiotaxia
Princpio: A migrao de moncitos e neutrlos
em resposta a um estmulo quimiottico especco
o primeiro passo crucial na seqncia de eventos
principais da resposta inamatria aguda e crnica.
Receptores de superfcie celular para vrias funes
de estmulo so expressos na membrana celular.
Estes eventos resultam na migrao dirigida de fagcitos ao local da inamao.
Este ensaio mede a migrao radial de moncitos ou neutrlos na agarose, em resposta a um
gradiente quimiottico criado pela difuso de um
quimioatraente na agarose. Aps permitir a migrao
direta em direo ao quimioatraente e a migrao
randmica na direo oposta do quimioatraente
aplicado, os moncitos ou neutrlos so xados e
corados com Giemsa. Aps secagem, a distncia da
migrao e a orientao randmica da migrao dos
fagcitos corados e xados determinada por microprojeo (40 ). A rede de migrao determinada
por subtrao da distncia randmica de migrao
(em centmetros) da migrao direta em direo
ao quimioatraente. Os valores dos pacientes so

Princpio: Um importante mecanismo microbicida dos fagcitos normais sua habilidade em

gerar radicais txicos de oxignio na fagocitose,
principal mecanismo celular de morte bacteriana.
Um destes radicais de oxignio, o superxido (O2),
facilmente detectado na fagocitose estimulada pela
reduo do NBT a sua forma insolvel (formazan).
O formazan observado em microscopia ptica
como grnulos azuis no citoplasma do fagcito
estimulado. A quantidade de NBT reduzido diretamente proporcional quantidade de superxido
produzido pelos fagcitos estimulados. A decincia
dos fagcitos em enzimas-chave da via da hexosemonofosfato est prejudicada na sua capacidade de
gerar superxido.
Interpretao: No teste do NBT com estmulo
de fagocitose utilizando-se o Phorbol 12-myristate,
13 acetate (PMA), a amostra controle produz 99%
a 100% de clulas polimorfonucleares positivas,
enquanto o controle em repouso (sem estmulo) seria
entre 5% e 40% de clulas positivas.
Pacientes com doena granulomatosa crnica
ligada ao X no apresentam clulas positivas no
teste do NBT com estmulo com PMA, enquanto
os heterozigotos produziro entre 30% e 70% de
clulas positivas sob estmulo do PMA. Pacientes
com doena autossmica recessiva produziro 100%
de clulas positivas, com uma marcada reduo na
quantidade de formazan depositado no citoplasma
de cada clula, que pode freqentemente levar a
uma interpretao equivocada no diagnstico. Os
carreadores heterozigotos da doena autossmica
recessiva no so distinguidos dos indivduos-controles normais.

Ensaio com a Diclorofluorescena (Ensaio DCF)

Princpio: O perxido de hidrognio um importante produto microbicida da exploso oxidativa
dos fagcitos estimulados. Este composto derivado
da dismutao do superxido produzido pela via
da hexose monofosfato. O perxido de hidrognio
pode ser medido pela oxidao do composto nofluorescente 2,7-diclorofluorescena (DCFH) a
um composto uorescente 2,7-diclorouorescena
(DCF). A forma no-polar e no-uorescente do
DCFH 2,7-diclorouorescena diacetato (DCFHDA). O DCFH-DA prontamente se difunde atravs

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

da membrana citoplasmtica dos fagcitos e retido

dentro da clula por clivagem do grupamento acetila
por enzimas citoplasmticas ao no-uorescente,
ionicamente carregado, DCFH. A estimulao da
exploso oxidativa do DCFH ligado aos fagcitos
leva produo de perxido de hidrognio que oxida
o DCFH a uma forma uorescente, a molcula de
DCF. A quantidade de DCF presente no citoplasma
de DCFH ligado, em fagcitos estimulados, pode ser
rapidamente detectada por citometria de uxo.
A vantagem deste ensaio a sua capacidade
em avaliar fagcitos em amostras de sangue total,
assim evitando os efeitos estimulatrios encontrados nos procedimentos de puricao das clulas.
Alm disso, volumes extremamente pequenos de
sangue total (0,2 mL) so necessrios para a avaliao, o que faz deste ensaio o ideal para pacientes
peditricos.
A amostra consiste de sangue total anticoagulado
com EDTA (idealmente 0,5 mL). Deve-se colher
simultaneamente amostras do paciente e de um
indivduo-controle normal. As amostras podem ser
mantidas temperatura ambiente e avaliadas em at
24 horas aps a coleta. Este fato torna o teste exeqvel nas situaes em que necessrio enviar as
amostras a laboratrios-referncia distantes.

tos a infeces. As terapias com citocinas podem ser

utilizadas na induo de uma regulao positiva na
expresso de receptores de superfcie. Um exemplo
a terapia com interferon-, que leva a um aumento
na expresso de CD64 (FcRI) em moncitos, o que
reetido como um aumento na atividade microbicida, bem como nas respostas linfoproliferativas ao
antgenos.
Estas novas terapias com citocinas tm levado
ao desenvolvimento laboratorial de ensaios que so
utilizados ao monitor-las.
A anlise multiparamtrica por citometria de uxo de subpopulaes de clulas a partir de amostras
de sangue total avalia quantitativamente a expresso
de receptores de membrana na superfcie de moncitos e neutrlos. Esta metodologia no somente
detecta a presena ou ausncia de receptores, mas
tambm avalia a regulao da expresso destes receptores em resposta a vrios estmulos. A tcnica
utiliza mltiplos anticorpos monoclonais marcados
com diferentes uorocromos que identicam a expresso do receptor de subpopulaes especcas de
fagcitos derivados da amostra de sangue total, no
sendo necessrio o passo demorado de isolamento e
puricao das populaes celulares.
Os principais receptores celulares avaliados so
CD14, CD11b, CD18, CD64, CD32 e CD16.

Imunofenotipagem
Moncitos/macrfagos e neutr los tm um
importante papel nos mecanismos de defesa imune
inata e na regulao da resposta imune adaptativa
celular e humoral. Estes mecanismos efetores
so mediados atravs de importantes molculas
de adeso e receptores celulares na membrana
citoplasmtica dos fagcitos. Os receptores para
a poro Fc da imunoglobulina IgG (CD16,
FcRIII; CD32, FcRII; CD64, FcRI), bem como os
receptores para os componentes do complemento
(CD11b, receptor C3bi) tm um papel crucial na
ligao de antgenos imunocomplexados superfcie das clulas fagocticas, assim auxiliando o
processo fagoctico e a eliminao dos patgenos.
Alm disso, a expresso de molculas de adeso
na superfcie das clulas, tais como o CD18, essencial para a migrao dos fagcitos aos locais da
inamao. Estes mesmos receptores encontrados
em moncitos/macrfagos servem para realizar
a internalizao dos antgenos, o que contribui
para o processamento e posterior apresentao s
clulas T imunorregulatrias.
Pacientes com deficincias nos receptores de
membrana (CD11b, CD16, CD18) esto predispos-

Passos na Investigao da Funo

Fagoctica
1. Contagem diferencial l e morfolgica de leuccitos.
2. Se forem observadas neutropenia ou anormalidades morfolgicas, so indicados os ensaios
de avaliao fagoctica funcional (imunofenotipagem: expresso de receptores de membrana
e molculas de adeso por citometria de uxo e
avaliao da exploso oxidativa atravs do teste
de NBT ou DCF).
3. Avaliao da quimiotaxia.
A avaliao funcional dos fagcitos uma tima ferramenta na investigao de pacientes com
infeces recorrentes e histria de anormalidade
gentica nas funes fagocticas. Porm, os testes
disponveis algumas vezes falham em demonstrar
estas anormalidades. Isso de deve sensibilidade
de cada teste, observao das condies de coleta
e tempo transcorrido at a realizao do ensaio. O
diagnstico ser resultado dos achados clnicos,
avaliao gentica e funcional da imunodecincia
envolvendo funo fagoctica.

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CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

DOSAGEM DE CITOCINAS
INTRACELULARES
As citocinas so polipeptdeos secretados por
uma variedade de clulas em resposta a vrios estmulos, mediando efeitos autcrinos, parcrinos e
endcrinos, que so pleiotrpicos e redundantes.
As citocinas imunologicamente relevantes so
principalmente aquelas formadas por clulas imunes (monocinas e linfocinas) e/ou inuenciam a sua
funo.
O estudo dos mecanismos imunolgicos do desenvolvimento de doenas auto-imunes, alrgicas,
hematolgicas e imunodecincias impossvel sem
uma estimativa quali e quantitativa da produo de
citocinas. Em inmeras doenas do sistema imune, a
quanticao de citocinas no sangue e em meios de
cultura de clulas sangneas estimuladas essencial
para determinar o estgio imunopatogentico do
desenvolvimento da doena, a escolha da imunoterapia apropriada, bem como estimar a eccia da
imunocorreo especca.
A princpio, as citocinas so detectveis em trs
nveis:
1. Pelo uso da reao em cadeia da polimerase
(PCR), a expresso do RNA mensageiro dos
genes das citocinas pode ser detectada e, com
novas tcnicas, at mesmo quanticada.
2. Atravs de bioensaios e enzimaimunoensaios podemos estimar a sntese de protenas. A deteco
da produo intracelular de citocinas pode ser
avaliada atravs de tcnica imunocitolgica ou
imunoistolgica.
3. Deteco da formao de citocinas pela anlise
dos produtos da atividade das citocinas.
Sennikov e cols., citados abaixo, descreveram
um mtodo empregando eletroquimioluminescncia (ECLIA) desenvolvido pela IGEN (EUA) para
a dosagem de interleucinas (IL-1, IL-4 e IL-10
e IFN) sricas e em meios de cultivo de clulas
mononucleares. Outros imunoensaios enzimticos
e quimioluminescentes tambm esto disponveis
no mercado para a dosagem srica e em meios de
cultivo de citocinas e seus receptores solveis.
A demonstrao da sntese de citocinas habitualmente requer o isolamento de clulas. Esta
abordagem permite a disseco dos mecanismos
moleculares e celulares reguladores da resposta imune, mas tem limitaes para aplicaes em grande
escala, como monitoramento imune em pesquisas
clnicas para avaliao de novas vacinas ou agentes

imunoteraputicos. Para evitar os problemas relacionados com o uso de clulas puricadas, culturas
de sangue total foram desenvolvidas especialmente
para o estudo da rede de citocinas humanas em nvel
de protena ou gene. A medida de citocinas via RNA
mensageiro (mRNA) de clulas mononucleares em
sangue perifrico foi descrita por Stordeur e cols.3
por PCR, sendo muito sensvel e atrativa, principalmente quando a metodologia PCR real time
utilizada.
A citometria de uxo tambm tem sido empregada na avaliao da imunidade celular. O mapeamento
de eptopo por citometria de uxo uma abordagem
muito moderna que no somente identica os eptopos das clulas T, mas simultaneamente permite
a anlise detalhada da resposta das subpopulaes
das clulas T, incluindo a linhagem e expresso de
marcadores de ativao, dentre outros. O sistema
mais freqentemente utilizado baseado na identicao de citocinas intracelulares em clulas T
ativadas, seguindo estimulao com peptdeos ou
pools de peptdeos. Um ensaio mais recentemente
desenvolvido analisa a proliferao de clulas T
medindo a diminuio na colorao do ster de succimidil-carboxiuorescena diacetato (CFDA-SE)
em clulas proliferadas5.
O fascnio do uso da citometria de uxo para o
mapeamento de eptopos consiste na grande versatilidade deste sistema no que diz respeito ao nmero
de parmetros que podem ser obtidos em uma nica
medida, isto : marcador de linhagem celular, marcador de ativao na superfcie e internamente clula.
Hoffmeister e cols., citados abaixo, descreveram um
sistema baseado na deteco da produo rpida de
citocinas em clulas T ativadas em curto prazo (to
curto quanto 6 horas) ensaio ex vivo. Neste sistema, alm da rapidez, a resposta CD4 e CD8 pode
ser medida no mesmo ensaio e no mesmo tubo de
teste. O uso da colorao com o CFDA-SE simples
e rpido. A intensidade de colorao desta protena
perdida em aumentos regulares, medida que h
passagem ao prximo estgio de diviso celular. O
CFDA-SE um corante no-txico, uorescenarelacionado, que capaz de penetrar na clula com
o auxlio de suas duas cadeias acetato laterais. Uma
vez dentro da clula, o grupo acetato removido
pelas esterases intracelulares e a carboxiuorescena resultante sai em uma velocidade muito lenta,
seguindo a ligao covalente das aminas livres das
protenas citoplasmticas, formando ligaes amino
muito estveis.
A disponibilidade de tcnicas ecientes capazes
de avaliar a imunidade celular tm disponibilizado

CAPTULO 5 TESTES LABORATORIAIS APLICADOS IMUNOLOGIA CLNICA

estudos em diversas reas. Assim, Pnoskaltsis e

cols. descrevem a quanticao e produo de citocinas circulantes por clulas mielides e linfides
circulantes na leucemia mielide aguda, enquanto
Brown e cols. avaliaram a expresso de marcadores
de superfcie e a produo de citocinas intracelulares em clulas T de vias areas de crianas com
e sem asma7.
Nas doenas auto-imunes, as citocinas pr-inamatrias como IL-1 e TNF- tm um papel central
nos processos inamatrios crnicos. Laufer e cols.
descreveram um ensaio de triagem in vitro para a
deteco de inibidores da sntese de citocinas prinamatrias (drogas antiartrticas e modicadoras
da doena).
A identificao e quantificao de citocinas,
tanto na forma secretada, quanto intracelular atravs de tcnicas rpidas, com alta sensibilidade e
especicidade, aliada possibilidade de testagem
em grande escala, podem fornecer uma importante
ferramenta de avaliao do status imune e ampliar
o uso de imunomoduladores. Constituem um novo
arsenal disposio do clnico para caracterizar defeitos de funo do sistema imunolgico. Este novo
arsenal disposio do clnico pode ser revisado de
forma abrangente no excelente captulo de Massey
& McPherson9.

LEITURA RECOMENDADA

Testes Sorolgicos ou Imunoensaios

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