Cuantificacin de compuestos por

cromatografa: Mtodo del Patrn

Interno

Apellidos, nombre

Fernndez Segovia, Isabel (isferse1@tal.upv.es)

Garca Martnez, Eva (evgarmar@tal.upv.es)

Departamento

Departamento de Tecnologa de Alimentos

Centro

ETSIAMN - Universitat Politcnica de Valncia

1 Resumen de las ideas clave

La cromatografa de gases y la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) son
dos tcnicas de separacin de analitos que permiten identificar y cuantificar un
gran nmero de compuestos. Para la cuantificacin de compuestos, existen
diversas tcnicas como la normalizacin de reas, el mtodo de patrn externo o
el mtodo de patrn interno. En este objeto de aprendizaje se va a describir cmo
llevar a cabo la cuantificacin de compuestos por el mtodo de patrn interno.

2 Introduccin
En las tcnicas de cromatografa de gases y HPLC, cuando se realiza un anlisis, se
obtiene un cromatograma. Un cromatograma es la representacin grfica de la
seal que da el detector al paso de los distintos analitos en funcin del tiempo. En
un cromatograma se observan una serie de picos que se corresponden con los
analitos detectados. Cada pico sale a un tiempo de retencin (tR) determinado y
tiene una altura y rea determinadas. El tR es el parmetro que se emplea para
llevar a cabo el anlisis cualitativo. Para hacer un anlisis cuantitativo se puede
utilizar la altura del pico o el rea, siendo ste ltimo el ms empleado por su
mayor precisin.

3 Objetivos
Los objetivos de este artculo son que el alumno sea capaz de:

Disear el procedimiento a seguir para cuantificar compuestos por

cromatografa en columna mediante el mtodo del patrn interno.

Cuantificar un compuesto presente en una muestra a partir de los

cromatogramas de los patrones y de la muestra.

4 Desarrollo
El anlisis de alimentos y el control de calidad requieren metodologas que sean
exactas, precisas, muy sensibles y con bajos lmites de deteccin. Por ejemplo, en
el campo de control oficial de alimentos, las concentraciones de algunos
compuestos txicos que es necesario determinar son de magnitudes muy bajas,
por lo que se requieren potentes tcnicas de anlisis que permitan la identificacin
y cuantificacin de estos compuestos. En este sentido la cromatografa de gases y
la cromatografa lquida de alta resolucin son dos de las tcnicas ms
adecuadas. Debido a la importancia de estos mtodos de anlisis, es necesario
saber disear procedimientos adecuados para la cuantificacin de compuestos
analizados por ambas tcnicas.

4.1 Preparacin de
cromatogramas

patrones

obtencin

de

los

Cuando se quiere cuantificar un compuesto presente en una muestra por el

mtodo del patrn interno, los pasos a seguir son los siguientes:
1. Preparar una serie de disoluciones de concentraciones crecientes, del
patrn correspondiente al compuesto a cuantificar. El intervalo de
concentraciones ha de ser similar a la concentracin del analito en la
muestra problema.
2. Aadir a cada uno de los patrones y a la muestra una misma cantidad o
concentracin de patrn interno. El patrn interno ha de ser un compuesto
de naturaleza similar al analito a determinar, pero que no est presente en
la muestra. Por ejemplo, en un anlisis de azcares en fresas un patrn
interno podra ser lactosa, ya que se trata de un azcar, pero no est
presente en las fresas.
3. Inyectar el mismo volumen en el cromatgrafo de cada una de las
disoluciones patrn que contienen el patrn interno, as como del extracto
de la muestra que tambin contiene el patrn interno. De esta forma
tendremos los distintos cromatogramas de los patrones (un cromatograma
para cada disolucin patrn) y el cromatograma de la muestra.

Ejemplo 1: Si se quiere determinar un analito cuya concentracin en el extracto de

la muestra, se espera que est comprendida en un margen de 350 a 550 mg/L, se
podran preparar e inyectar en el cromatgrafo 4 disoluciones patrn que adems
contuvieran una misma concentracin de patrn interno (p.i.), con las siguientes
concentraciones:

Patrn 1: 300 mg/L analito + 350 mg/L p.i.

Patrn 2: 400 mg/L analito + 350 mg/L p.i.
Patrn 3: 500 mg/L analito + 350 mg/L p.i.
Patrn 4: 600 mg/L analito + 350 mg/L p.i.

A la muestra se le adicionara patrn interno, de forma que la concentracin de

patrn interno en el extracto de la muestra fuera la misma que en las disoluciones
patrn y se inyectara en el cromatgrafo. As, la muestra tendra una
concentracin desconocida de analito y 350 mg/L de patrn interno:

Muestra: ? mg/L analito + 350 mg/L p.i.

Los cromatogramas obtenidos al inyectar cada una de las disoluciones patrn y la

muestra seran los que se muestran en las Figuras 1 a 5.

Figura 1. Cromatograma de la
l disolucin patrn 1 (300
300 mg/L analito + 350 mg/L p.i.).
p.i.

Figura 2. Cromatograma de la disolucin patrn 2 (400

(400 mg/L analito + 350 mg/L p.i.).
p.i.

En el cromatograma de cada disolucin patrn y en el cromatograma de la

muestra saldr el pico correspondiente al analito y el pico correspondiente al
patrn interno. En la Figura 5,
5 donde se muestra el cromatograma de la muestra,
adems del pico del analito
analito y del pico del p.i., se observan una serie de picos que
corresponderan a otros compuestos presentes en la muestra distintos del analito
que estamos cuantificando.
Tal y como se muestra en las Figuras 1-5,
1
el tR del pico del analito ser el mismo en
todos los cromatogramas;
cromatogramas el tR del pico del patrn interno ser distinto del tR del
analito y se mantendr constante en todos los cromatogramas. El
El rea de los picos
ser diferente dependiendo de la concentracin de analito;
a
; por tanto, el rea del
pico de analito ir aumentando conforme aumenta la concentracin en los

patrones (rea del patrn 1 < rea patrn 2< rea patrn 3 < rea patrn 4).
4) Dado
que la concentracin de patrn interno se mantiene constante en todas las
l
disoluciones patrn y en la muestra,
muestra el rea del p.i. debera ser similar en todos los
cromatogramas.

(500 mg/L analito + 350 mg/L p.i.).

p.i.
Figura 3. Cromatograma de la disolucin patrn 3 (500

Figura 4. Cromatograma de la disolucin patrn 4 (600 mg/L analito + 350 mg/L p.i.).
p.i.

Figura 5. Cromatograma de la muestra (? mg/L analito + 350 mg/L p.i.).

p.i.

4.2 Cuantificacin
uantificacin del analito
Cmo se puede cuantificar el analito en la muestra con los datos del
cromatograma?

En primer lugar hay que hacer una tabla que contenga los siguientes datos:
concentracin de analito,
analito, concentracin de patrn interno, rea del pico
del analito y rea del pico del patrn interno. Se calcular la concentracin
de analito/concentracin de p.i. y el rea del analito/rea del p.i.,
p.i.
incluyndose estos valores en la tabla.
Con estos datos se construir la recta de calibrado,
calibrado mediante la
representacin del rea del analito/rea del p.i. frente a concentracin
del analito/concentracin del p.i..
p.i.
Con la ecuacin de la recta podemos calcular
calcular la concentracin de
analito/concentracin
/concentracin del p.i. sustituyendo y por el rea del analito/rea
analito
del p.i. en el cromatograma de la muestra y despejando x que
corresponde a la concentracin de analito/concentracin
analito/concentracin de p.i.
p.i
La concentracin de analito se calcular multiplicando el valor obtenido
para x por la concentracin del p.i.
Vemoslo con un ejemplo.

Continuacin Ejemplo 1:
1 Siguiendo con el ejemplo anterior, supongamos que las
reas obtenidas han sido las que se muestran
mues
en la Tabla 1.
Representando rea del analito/rea del p.i frente a concentracin de
analito/concentracin de p.i. se obtiene la recta de calibrado que se muestra en
la Figura 6.

C analito
(mg/L)

rea
analito

C p.i.
(mg/L)

rea
p.i.

C analito/C p.i.

Area analito/rea p.i.

Patrn 1

300

450,7

350

905,7

0,86

0,50

Patrn 2

400

804,9

350

901,3

1,14

0,89

Patrn 3

500

1150,2

350

890,1

1,43

1,29

Patrn 4

600

1405,6

350

897,8

1,71

1,57

Muestra

1268,4

350

903,6

?/350

1,40

Tabla 1. Concentraciones y reas de los picos del analito y del patrn interno (p.i.)
obtenidas en los cromatogramas de los patrones y en el de la muestra.

2
y = 1,2611x - 0,5593
R = 0,993

A analito/A p.i.

1,6
1,2
0,8
0,4
0
0

0,5

1,5

2,5

C analito/C p.i.

Figura 6. Recta de calibrado obtenida con los datos de la Tabla 1.

Para calcular la concentracin en el extracto de la muestra se siguen estos dos
pasos:

En la ecuacin de la recta de calibrado se sustituye y por el rea de

analito/rea de p.i. obtenida en el cromatograma de la muestra
(1268,4/903,6 = 1,40) y se despeja x que es la concentracin de
analito/concentracin de p.i. en el extracto de la muestra:
C analito/C p.i. = x = (1,40+0,5593)/1,2611 = 1,56

La concentracin de analito se obtiene multiplicando el valor calculado

para x (1,56) por la concentracin de p.i. (350 mg/L):

C de analito en el extracto de la muestra = 1,56 * 350 (mg/L) = 544,8 mg/L

5 Cierre
A lo largo de este objeto de aprendizaje hemos visto cmo preparar una serie de
patrones para cuantificar un compuesto por cromatografa de gases o por HPLC,
utilizando el mtodo del patrn interno. Asimismo, se ha detallado qu parmetro
del cromatograma se utiliza para cuantificar y cules son los pasos a seguir en la
determinacin de la concentracin de analito en una muestra por este mtodo.

6 Bibliografa
[1] Nielsen, S.S: Food Analysis, Ed. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York,
2003, pg. 437460.

[2] Skoog, D.A.; Leary, J.J: Anlisis Instrumental, Ed. McGraw Hill / Interamericana
de Espaa, Madrid, 1994, pg. 674703.

[3] Valcrcel, M.; Gmez, A: Tcnicas Analticas de Separacin, Ed. Revert,

Barcelona, 1994, pg. 655676.