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Bioinformtica
Consiste no desenvolvimento de:
Bancos de dados
Pesquisa de algoritmos em computador.
Programas de previso de genes.
Demais ferramentas analticas.
Objetivo: Dar sentido aos dados de DNA, RNA e sequncia de protenas.
Genmica Funcional
Caracteriza a funo das sequncias gnicas.
Metas:
1. Identificar o transcriptoma: Molculas de RNA transcritas.
2. Identificar o Proteoma: Protenas codificadas.
Funes das sequncias
Genes Homlogos: Genes evolutivamente relacionados.
Genes Ortlogos: Genes homlogos encontrados em espcies diferentes que
evoluram de um mesmo ancestral comum.
Genes Parlogos: Genes homlogos no mesmo organismo.
Desertos Gnicos
reas do genoma que so totalmente desprovidas de qualquer gene conhecido
ou de outras sequncias funcionais.
Comuns nos cromossomos humanos 4, 5, 13 (aprox. 40% de todo o
cromossomo).
O Genoma Humano
3,2 bilhes de pares de bases.
25% so transcritos em RNA.
Menos de 2% codificam protenas.
Protemica Estrutural
O conhecimento da estrutura das protenas sugere alvos para potenciais
frmacos que podem interagir com as protenas.
Procedimentos para elucidar estruturas proteicas:
1. Cristalografia de raios-X.
Consiste em produzir cristais de protenas, nos quais as molculas
estejam bem ordenadas para que o feixe de raios-X incidente sobre o
cristal seja difratado, gerando um padro de reflexes que, atravs da
anlise dos dados cristalogrficos, produzam um mapa tridimensional
de densidade eletrnica da molcula. Um modelo da protena com
sequncia conhecida deve ento ser modelado neste mapa.
2. Ressonncia Magntica Nuclear (RMN)
Consiste em analisar a intensidade do deslocamento qumico dos
spins dos tomos de hidrognio, nitrognio e
carbono dos aminocidos de uma protena em um campo magntico
esttico. Tem por objetivo o estudo das macromolculas envolvidas
em doenas infecciosas, degenerativas e cncer, at quanto certos vrus,
como o da dengue, febre amarela e o HIV, entre outros. Ou ainda
estruturas complexas de protozorios, agentes responsveis por
doenas, como a leishmaniose, a malria e a toxoplasmose. Todos esses
so estudos que podem chegar a nova forma diagnsticas, ou levar ao
desenvolvimento de frmacos. Um deles, que pode significar mais um
passo para a compreenso do cncer, tem como alvo a protena
p53, que se torna inativa na maior parte dos tumores malignos.
Gentica do Cncer
o Epidemiologia
Principal causa de morte entre 45-60 anos.
Incidncia no Brasil em 2014 (INCA): 576.000 novos casos.
Cncer
Grupo heterogneo de distrbios caracterizados pela presena de clulas que no
respondem aos controles normais da diviso. (Em situao normal, os eventos do
ciclo celular ocorrem em uma ordem fixa, ativando enzimas no tempo correto e
desativando-as logo aps o trmino do processo. Deve assegurar que cada estgio do
ciclo tenha terminado antes de iniciar o prximo.)
o Caminhos da clula durante a diviso celular: mitose, apoptose ou
mutao.
o Padro familiar: 5%.
o Fatores genticos: Mutaes do DNA irreversveis.
o Fatores epigenticos: Compostos que mudam a estrutura qumica do
DNA reversveis.
o Fatores ambientais: Agentes mutagnicos.
Causas do cncer
Proliferao, regulao e desenvolvimento.
Mudana da programao gentica celular.
o Alterao do crescimento e proliferao.
o Desdiferenciao celular.
o Instabilidade cromossmica.
o Clonagem celular.
o Mutao - Agentes cancergenos.
Biotecnologia
Tcnicas de Gentica Molecular
Tecnologia do DNA recombinante ou engenharia gentica: grupo de tcnicas
para localizar, isolar e estudar segmentos de DNA.
Aplicaes: Bioqumica, Microbiologia, Neurobiologia, Evoluo, Ecologia.
Biotecnologia: Tcnicas para o desenvolvimento de novos produtos.
Ex: Produo de frmacos, diagnstico e tratamento de distrbios hereditrios.
Manipulando o DNA
Enzimas de Restrio: Reconhecem e fazem cortes bifilamentares no DNA
em sequncias especficas de nucleotdeos.
So produzidas por bactrias.
A maioria reconhece uma pequena sequncia de 4 a 6 bp.
Sequncias palindrmicas: Podem ser lidas do mesmo modo para frente e ao
inverso.
Tipos de Enzimas de Restrio
Tipos I e III: Cortam o DNA fora das sequncias de reconhecimento.
Tipo II: Corta o DNA dentro da sequncia de reconhecimento.
Ex: EcoR-I, EcoR-II: Escherichia coli
Pvu-II: Proteus vulgaris
Cof-I: Clostridium formicoaceticum
E agora?
Em quantos fragmentos o DNA foi cortado?
Quais os tamanhos dos fragmentos resultantes?
Soluo: Eletroforese: Tcnica bioqumica padro para separar molculas por
tamanho e carga eltrica.
Anlise Molecular
Transferncia de Southern - Southern blot: Transferncia de DNA de um gel
para um meio slido.
Transferncia Northern Northern blot: Transferncia de RNA.
Transferncia Western Western blot: Transferncia de protenas.
Clonagem gnica
Produo de cpias idnticas (clone) de um pedao original de DNA.
Usa-se um Vetor de clonagem: molcula de DNA replicante e estvel para a
qual um fragmento de DNA exgeno pode ser ligado para introduo em uma
clula.
Vetor de clonagem
Caractersticas:
1. Ter uma origem de replicao.
2. Ser um marcador selecionvel pela clula alvo.
3. Ter um ou mais stios nicos de restrio para insero do DNA.
Ex: Plasmdeos, Cosmdeos
Reao em Cadeia de Polimerase(PCR)
Permite que os fragmentos de DNA sejam amplificados um bilho de vezes
em algumas horas.
Pode ser feita com pequenas quantidades de DNA.
Etapas:
1. Desnaturao
2. Anelamento
3. Extenso
PCR de Transcriptase Reversa
Amplificao convertendo RNA em cDNA, usando Transcriptase Reversa.
cDNA amplificado, ento, pela reao usual de PCR.
Usado para anlise de mRNA e de RNA viral.
Limitaes da PCR
1. Requer o conhecimento de parte do DNA alvo para a construo dos primers.
2. Risco de contaminao.
3. Preciso: um nucleotdeo incorreto incorporado a cada 20.000 bp.
4. No entanto, usada como tcnica diagnstica.
PCR em Tempo Real
Objetivo: determinar quantitativamente o cido nucleico presente na amostra.
A quantidade de DNA amplificado medida proporo que ocorre a reao.
Hibridizao in situ
Objetivo: Determinar a localizao cromossmica de um gene usando sondas
de DNA.
Tcnica: Hibridizao com fluorescncia in situ (FISH): Usada na
identificao de genes em cromossomos humanos.
Descobrindo Gene in silico
Com o crescimento na informao das sequncias, as informaes foram
armazenadas em bancos de dados.
Atualmente a busca por genes feita atravs desses bancos de dados.
Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrio - RFLP
Polimorfismos: Variaes em sequncias curtas de DNA.
Diferenas herdadas e usadas no mapeamento de diferenas genticas.
Usam-se enzimas de restrio.
Etapas:
1. Coleta de amostrar biolgicas que podem ser saliva, sangue, esperma e
cabelo com raiz, entre outros.
2. Extrao e purificao do DNA.
3. Corte com enzimas de restrio(tesouras moleculares que reconhecem e
cortam sequncias especficas de DNA).
4. Eletroforese: onde, atravs de uma corrente eltrica, so separados os
fragmentos de DNA por tamanho. A partir da, formada uma espcie de
cdigo de barras que a identificao individual e intransfervel de cada
indivduo.
Sequenciamento do DNA
Determina a sequncia de bases do DNA.
Qualquer fragmento de DNA a ser sequenciado deve primeiro ser amplificado.
As cpias do DNA-alvo so isoladas e divididas em quatro partes.
Partes do Sequenciamento de DNA:
1. Muitas cpias de primer complementar ao filamento do DNA-alvo.
2. Os 4 tipos de trifosfatos de desoxirribonucleosdeos (ddNTP).
3. Uma pequena quantidade de 1 ddNTP finalizador.
4. DNA Polimerase.
Fingerprint de DNA
Uso das sequncias de DNA para identificao de indivduos.
Usa microssatlites, que so sequncias de repeties especficas.
Procedimento similar ao RFLP.
Atualmente, usado na percia forense.
Aplicaes da Biotecnologia
Produtos farmacuticos: Insulina humana, Hormnio do crescimento, Fatores
da coagulao, etc.
Drogas de oligonucleotdeos: Usadas para o tratamento da AIDS e do cncer.
Testes Genticos.
Bactrias especializadas: Importantes nos processos industriais, tratamento de
gua e esgotos.