Biorremediacin

Leonardo Erijman
Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa
2do cuatrimestre 2012

El problema de la contaminacin
Hay una presencia creciente de sustancias
txicas, tales como compuestos alifDcos
halogenados, hidrocarburos aromDcos, bifenilos
policlorados y otros compuestos orgnicos e
inorgnicos que contaminan agua, aire y suelo

Algunas sustancias llegan al ambiente en bajas

concentraciones, pero son sujetas a
bioacumulacin o biomagnicacin durante su
paso por la cadena alimentaria
2

Que hacer?
IdenDcar el problema
Establecer la naturaleza y el grado del riesgo
Decidir la mejor accin de remediacin
Ventajas de la biorremediacin
Menor costo que otras alternativa
Costo de incineracin para todos los sitios (EEUU) $1.7.1012
Se trata en general de una solucin permanente
Muchas veces se logra mineralizacin en lugar de una simple
transferencia entre fases
3

Anlisis previos
Un requisito previo en cualquier estrategia de remediacin
es la caracterizacin del siDo, respecto a los factores que
puedan afectar el proceso

La biorremediacin es un procedimiento que debe ser
aplicado con rigor cienQco, ajustando especcamente las
condiciones para cada caso parDcular para minimizar las
limitaciones cinDcas y ambientales.

Por lo tanto, los costos iniciales para caracterizacin del
siDo, evaluacin de facDbilidad pueden ser mayores a los
costos asociados con tecnologas ms convencionales
4

Diagrama de biorremediacin

Bioremediation

in situ

Engineered

Biostimulation

Adding Oxygen
-Bioventing
-Biosparging

Adding Oxygen
and Nutrients

ex situ

Intrinisic

Landfarming

Bioreactor

Bioaugmentation

Adding Oxygen,
Nutrients and Bacteria

Biorremediacin in situ:
1. BioesDmulacin

Ranking de accidentes de barcos

petroleros

35 Exxon Valdez 1989 Costa de Alaska

49 000

Jernelov, A. The Threats from Oil Spills: Now, Then, and in the Future, AMBIO (2010) 39:353366

Mayor derrame de petrleo

1.200.000 tn (Golfo Prsico, 1991)

8

Biodegradacin de petrleo

Biodegradacin de petrleo
asfaltenos
resinas
aromDcos
nakenos

saturados

n-alcanos
isoprenoides

Los compuestos presentes en el petrleo crudo fueron

formados hace 85-180 millones de aos
Se liberan regularmente de los depsitos subterrneos.
Hay cientos de especies de bacterias, arqueas y hongos que
desarrollaron la capacidad de uDlizar hidrocarburos como
fuente de carbono y energa para el crecimiento.
Los degradadores de petrleo son ubicuos, aunque representan
slo una fraccin minoritaria de la comunidad microbiana antes
de los derrames
10

Derrame del Exxon Valdez (1989)

42 millones de litros

Atlas & Hazen, Environ Sci Technol (2011) 45, 6709-6715"

Bioremediacin in situ
Ensayos en microcosmos

Tiempo: 114 das; dimetro: 30.5 cm; profundidad: 91.4 cm deep)

Bragg et al. (1994) EecDveness of bioremediaDon for the Exxon Valdez oil spill. Nature 368: 413418.

Bioremediacin in situ
Dependencia de nutrientes

La velocidad de degradacin es funcin de la relacin

N/[petrleo] y la fraccin de hidrocarburos polares
Bragg et al. (1994) EecDveness of bioremediaDon for the Exxon Valdez oil spill. Nature 368: 413418.

Bioremediacin in situ
Degradacin de PAH

Bragg et al. (1994) EecDveness of bioremediaDon for the Exxon Valdez oil spill. Nature 368: 413418.

Bioremediacin in situ
BioesDmulacin

15

Atlas & Bragg, Microbial Biotechnology (2009) 2, 213-221"

BioesDmulacin

La bioremediacin no aumenta la extensin de la degradacin

La bioremediacin aumenta la cin0ca de degradacin
16

Bioremediacin in situ
Exxon Valdez

17

Derrame del PresDge

Galicia, 2002

60,000 tn petrleo

18

Derrame del PresDge

Galicia, 2002

Gallego et al, Org Geochem 37: 1869- 188419

(2006)

Reduccin en la diversidad de la
macrofauna

de la Huz et al. 2005 Estuarine, Coastal and Shelf Science 65: 19-29

20

Limitaciones de la bioremediacin

El ataque sobre HMW-PAHs opera por co-metabolismo

Aumento en la viscosidad del residuo remanente
Gallego et al, Org Geochem 37: 1869- 1884 (2006)
21

Bioremediacin on site
Inuencia de agua dulce

La acDvidad microbiana se maniesta en reas especcas en las que

la humedad, los niveles de nutrientes y la diversidad de
microorganismos se manDenen con un ujo leve agua dulce
La corriente debilita la adhesin del petrleo y aumenta
drsDcamente la biodegradacin
Gallego et al, Org Geochem 37: 1869- 188422
(2006)

 Exxon Valdez 20 aos despus

PAH no accesible

La mayor parte de PAH fue eliminado

No hay deciencia de nutrientes

No hay posibilidad de
ms bioremediacion

Los ensayos en microcosmos no Dene en cuenta los factores geolgicos.

Por lo tanto no indican directamente el potencial real de tratamiento in
situ, sino el mximo de biorremediacin consistente con la composicin
del petrleo
23
Atlas & Bragg, Microbial Biotechnology (2009) 2, 213221

Aumentar la porosidad por desnitricacin

El nitrato es usado como

fuente de C por los
degradadores de petrleo
y como aceptor de e- por
los microorganismos
hetertrofos que crecen
sobre la materia orgnica
de los sedimentos
24

Biorremediacin in situ:
2. Atenuacin natural
Tecnologa relaDvamente simple
Puede ser llevada a cabo con mnima disrupcin del siDo
Suele requerir Dempos ms prolongados que otros mtodos
Requiere un programa de monitoreo de larga duracin
La duracin afecta el costo
Si las velocidades de atenuacin son muy lentas la pluma los
contaminantes pueden migrar
25

AcDvidades de remediacin en el golfo

de Mxico

26

Derrame de petrleo Golfo de Mxico

(2010)

Ac0vidad cien7ca en las primeras etapas

Documentar las condiciones previas al impacto
Monitoreo del movimiento del petrleo
Monitoreo del dao en los recursos naturales
Decisiones tcnicas para contener el derrame

27

Uso de dispersantes

636 millones litros de petrleo

5.000.000 litros dispersante!

OD ?

Corexit
Solvente: 2-butoxiethanol (2-BE) o eter de petrleo
Detergente: sulfonato orgnico
Estabilizante: propylene glicol
Otros componentes (anDcongelantess, etc)

Objetivos
Bajar la tensin superficial
de la interfase agua-aceite
Formar microgotas que
queden suspendidas para la
biodegradacin de las
fracciones solubles liberadas
28

Compromiso en el uso de dispersantes

Schmidt, CW 2010 Environmental Health PerspecBves 118, A339-A344

Compromiso en el uso de dispersantes

OD ?

Schmidt, CW 2010 Environmental Health PerspecBves 118, A339-A344

Caracterizacin de las comunidades

microbianas autctonas

Como parte de la caracterizacin del siDo para

determinar la estrategia de remediacin apropiada
Como parte del monitoreo del progreso y la
efecDvidad del proceso de remediacin

31

Monitoreo de la densidad y acDvidad

microbiana

Aumento en
densidad celular en
la pluma

Descenso en OD sugiere
catabolizacin de HC

32

Hazen et al., 2010 Science 330. 204-208

Genes para la degradacin aerbica

de PAH
nah: nakaleno 1,2 dioxigenasa

Los genes que codican para la degradacin de PAH son ms abundantes en la pluma, y
algunos son nicos

Lu et al., 2011 Microbial gene funcDons enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 10

33

Genes para la degradacin

anaerbica de PAH

Aunque hay oxgeno presente, tambin hay enriquecimiento en genes que codican para
la degradacin anaerbica

gen bbs: -oxidaDon de benzylsuccinato para la

degradacin anaerbica de tolueno
Lu et al., 2011 Microbial gene funcDons enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 10

34

Cambios en la composicin de las

comunidades microbianas
16S rRNA
phylochip

Phospholipids fawy acids (PLFA)

35

Hazen et al., 2010 Science 330. 204-208

Cambios en la composicin de las

comunidades microbianas

Redmond and ValenDna., 2011 Proc Natl Acad Sci USA, 10.1073/pnas.1108756108

Cambios en la composicin de las

comunidades microbianas

Redmond and ValenDna., 2011 Proc Natl Acad Sci USA, 10.1073/pnas.1108756108

Composicin de comunidades en la pluma

de contaminacin

Bacterias psicroflicas degradadoras de hidrocarburos y otros organismos no

cultivados de ambientes fros contaminados con hidrocarburos

Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979

38

FuncDonal Gene
Arrays (FGA)

39

FuncDonal Gene Arrays

(Geochip)

24253 - 50mer
> 57000 genes
>150 grupos funcionales

40

FuncDonal Gene Arrays

(Geochip 3.0)

28000 - 50mer
57000 genes
292 grupos funcionales
gyrB para anlisis logenDco
41

Clasicacin funcional de genes

4,000-5,000 genes funcionales detectados por muestra

1652 genes involucrados en la degradacin de hidrocarburos
Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979

42

Clasicacin funcional de genes

El petrleo es el factor dominante en

la estructuracin de la comunidad
funcional microbiana

Lu et al., 2011 Microbial gene funcDons enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 10

43

Mtodos
Deepwater Horizon
Golfo de Mxico 2010

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Diversidad microbiana

6h
39h

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Diversidad microbiana
6h

39h

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Diversidad funcional

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Genes de degradacin de hidrocarburos

en el metagenoma
metagenome
prsDno
distal
proximal

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Genes de degradacin de hidrocarburos

en el metaproteoma

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Mul0ple Displace Amplica0on (MDA)

primer
3

Rolling circle amplicaDon de DNA circulares con primers random y 29 DNA

polimerasa

Dean et al. (2001) Genome Res. 11:1095-1099

Mul0ple Displace Amplica0on (MDA)

Hutchison, C.A. III & Venter, J.C. (2006) Nature Biotechnology 24, 657-658

Reconstruccin metablica de
Oceanospirillales
COG annotaDons of assembled sequence data
Blast comparison of unassembled single-cell reads

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

Anlisis de la pluma por FT-IR

Mason et al., The ISME Journal (2012) 6, 17151727

2010: Derrame en el golfo de Mxico

55

Nature, Vol 466, 12 Aug 2010, p. 802

Derrame de petrleo

56

Podemos aprender algo?

Cada caso depende de un conjunto de caractersDcas que
va a determinar el riesgo y el impacto:
El volumen de petrleo derramado
La naturaleza qumica del petrleo
El ecosistema
Las condiciones ambientales especcas
Hay un factor comn?
El caracter cosmopolita de los microorganismos
degradadores de petrleo
El anlisis cienQco de las condiciones del derrame
es necesario para determinar la mejor estrategia
para minimizar el riesgo e impacto sobre el
ambiente

57

Qu hay que considerar para que los resultados

de laboratorio tengan uso prcDco?

58

db
e otella
cepas edn egradadoras
de
El cDiseo
uello de
la biodegradacin
clorotolueno
no est necesariamente
en la enzimologa
Cl

CH3

Cl

CH2OH

TOD dioxigenasa (de Pseudomonas puBda F1)

todC1C2BA

Cl

CH2OH

Cl

CHO

xylB

va orto cromosomal
en el husped

Cl

COOH

TOL (pWW0 de P. puBda mt-2)

xylC

Cl

COOH

Cl

OH

OH

JB2

PA142

OH

TCA
OH

VIntegracin
elocidad de estable
ujos metablicos
PFuncional
roduccin en
de vlaas
conversin
secundarias
deimproducDvas
2-Cl tolueno en 2 Cl benzoato
CNo
ontrol
crecen
siolgico
utilizando
de vas
2-Cl
degradaDvas
tolueno
59
Haro & de Lorenzo 2001 Journal of Biotechnology 85, 103-113

Uso de microarrays para evaluar los patrones

de expresin en Pseudomonas puBda

60

Ecologa de la degradacin

61

Limitaciones a la funcionalidad de
un inoculante
Baja concentracin del contaminante
Incluye problemas de baja solubilidad o baja biodisponibilidad
Presencia de compuestos inhibitorios
Depredacin

Reduccin de poblaciones acDvas

Preferencia por otras fuentes de carbono

Incapacidad de dispersin

El microoganismo no llega al contaminante

62

Limitaciones siolgicas y
regulatorias a la bioaumentacin
Falta de induccin del opern catablico
Falta de reconocimiento del efector regulatorio

Falta de reconocimiento del sustrato

Enzimas catablicas en la bacteria

Stress celular

Por el mismo contaminante o el ambiente

Caos metablico por mlDples contaminantes

Generacin de intermediarios txicos o vas muertas

Balance termodinmico del proceso de degradacin

Potencial redox y disponibilidad de aceptor de electrones
63

Desazos en la construccin de
GMB para uso en bioremediacin
Problema

Solucin

E coli no es suficientemente robusta

Usar bacterias ambientales

Resistencia a antibiticos como

marcador de seleccin

Marcadores no antibiticos y resistencia

extrable

Funciones codificadas en plsmidos

Integracin estable en cromosoma

Expresin dependiente de inductores

qumicos

Expresin dependiente en input

ambiental

Fuerte seleccin contra los genes/

circuitos implantados

Ortogonalizacin de la funcin

64

Literatura adicional
McGenity et al. 2012. Marine crude-oil biodegradaDon: a central
role for interspecies interacDons. AquaBc Biosystems 8: 10-29

Ramos et al. 2011. Laboratory research aimed at closing the
gaps in microbial bioremediaDon. Trends in Biotechnology 29:
641647

De Lorenzo, V. 2008. Systems biology approaches to
bioremediaDon. Current Opinion in Biotechnology 19: 579589

65