La simbiosis rizobio-leguminosa

El nitrgeno es muy abundante en la atmsfera, sin embargo, las plantas no pueden

utlizarlo en su forma elemental y tienen que obtenerlo del suelo principalmente en
forma de nitratos o amonio. La fijacin biolgica de nitrgeno es un proceso clave en la
biosfera, por el cual microorganismos portadores de la enzima nitrogenasa convierten el
nitrgeno gaseoso en nitrgeno combinado. El grupo de bacterias al que se conoce
colectivamente como rizobios, inducen en las races (o en el tallo) de las leguminosas la
formacin de estructuras especializadas, los ndulos, dentro de los cuales el nitrgeno
gaseoso es reducido a amonio (Fig. 1). Se estima que este proceso contribuye entre el
60-80 % de la fijacin biolgica de nitrgeno. La simbiosis es inhibida si existe un
exceso de nitrato o amonio en el suelo. En esta simbiosis en los ndulos, la planta
husped obtiene nutrientes nitrogenados de la bacteria (rizobios) y ofrece a sta una
fuente de carbono y un ambiente favorable para fijar nitrgeno. Esta simbiosis
contribuye con una parte considerable del nitrgeno combinado en la tierra y permite a
las plantas leguminosas crecer sin fertilizantes nitrogenados y sin empobrecer los
suelos.
Las leguminosas muestran una amplia diversidad tanto morfolgica como de hbitats y
ecologa, encontramos desde formas herbceas anuales hasta rboles tropicales. Muchas
leguminosas son noduladas por los rizobios. La fijacin de nitrgeno en la simbiosis
rizobio-leguminosa es de considerable importancia en agricultura, porque causa un
aumento significativo del nitrgeno combinado en el suelo. Dado que la carencia de
nitrgeno suele darse en suelos desnudos y sin abonar, las leguminosas noduladas
ofrecen una ventaja selectiva en tales condiciones y pueden crecer bien en zonas donde
no lo haran otras plantas. Es por ello que leguminosas arbustivas y arbreas se emplean
como plantas pioneras en la reforestacin de zonas ridas y semiridas. Por el inters
que estas bacterias representan para la agricultura, emplendose como inoculantes (biofertilizantes) para los cultivos se han realizado investigaciones extensas sobre este
sistema simbitico, incluyendo estudios sobre la diversidad y la taxonoma de los
rizobios. Rhizobium fue la primera bacteria producida a gran escala y se ha aadido
como inoculante durante 105 aos a diversos cultivos agrcolas, con xito en muchos
casos.
Por otro lado, el uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ha
ocasionando graves problemas de contaminacin. No todo el fertilizante que se aplica lo
aprovecha la planta sino que en una cuanta importante acaba en lagos y lagunas. La
fijacin biolgica de nitrgeno es la opcin natural de fertilizacin qumica.
Taxonoma
Beijerinck en1888 obtuvo el primer cultivo bacteriano puro de un ndulo de raiz de
leguminosa y lo llam Bacillus radicicola. Posteriormente, Frank propuso el nombre
Rhizobium para estos aislados. Basada en la especificidad de los huspedes para 1929 ya

se haban reconocido seis especies: R. leguminosarum, R. trifolii, R. phaseoli, R.

meliloti, R. japonicum y R. lupini. En esta clasificacin, cada especie se compona de
cepas que compartan un grupo de leguminosas husped. Trabajos posteriores
desafiaron esta designacin de especies basada en la especificidad del husped. En 1944
Wilson report un gran nmero de nodulaciones que cruzaban las fronteras de las
diferentes especies.En 1964 Graham y en 1968 Moffett y Golwell sugirieron revisar la
taxonoma basndose en resultados de la taxonoma numrica. Ms tarde, en 1974,
Jordan y Allen dividieron estas especies en dos grupos de acuerdo con sus tasas de
crecimiento, flagelos y reacciones cido/alcalinas en medio YMA (Tabla 1). Adems de
estas seis especies, se incluy un grupo miscelneo designado Rhizobium spp.
La taxonoma actual de los rizobios se basa en un enfoque polifsico que incluye
morfologa, bioqumica, fisiologa, gentica y filogenia. El uso del enfoque polifsico
ha conferido a la taxonoma una base ms natural y ms confiable.
De acuerdo con la definicin aceptada de especie en bacteriologa, cada especie de
rizobios consta de un grupo de cepas que comparten caractersticas que las distinguen
como grupo de otros grupos de bacterias. El uso de tcnicas moleculares ha provisto de
una descripcin ms precisa para las especies. El anlisis de secuencias de los genes
16S rRNA se ha convertido en uno de los principales criterios para la descripcin de los
gneros y las especies de rhizobios. Se considera que las cepas cuyas secuencias del gen
16S rRNA son similares en un 97% o ms, probablemente pertenecen a la misma
especie. Las relaciones filogenticas inferidas del parecido de las secuencias de genes
de 16S rRNA tambin constituyen la base principal para la descripcin de los diferentes
gneros de rhizobios; sin embargo, no hay un porcentaje definido para marcar las
fronteras entre gneros. No obstante, cuando las secuencias de 16S rRNA son muy
parecidas, no sirven para distinguir especies cercanamente relacionadas y esto ocurre
debido a que este gen est muy conservado entre todos los organismos vivos. En la
taxonoma de Rhizobium, la hibridacin de ADN-ADN y otros mtodos han sido
incluidos para definir especies dentro de cada gnero.
Se requiere estimar el parecido entre secuencias de ADN-ADN, a partir de la
hibridacin ADN-ADN, para definir a las especies bacterianas. Esta tcnica se basa en
la caracterstica de la doble hlice del ADN que puede desnaturalizarse en altas
temperaturas y reasociarse en bajas temperaturas y es especialmente til cuando las
cepas comparten ms del 97% de sus secuencias de genes 16S rRNA. La cantidad de
ADN reasociado o la tasa de reasociacin se relaciona con la homologa de las
secuencias de ADN. Se sugiere que cuando las diferencias entre dos secuencias de ADN
sobrepasan el 30%, se cruza el borde que separa a dos especies. Cepas que comparten
un parecido de ADN-ADN entre 25 y 60% pueden representar diferentes especies
dentro del mismo gnero. Si el parecido es menor a 10% se considera que pertenencen a
diferentes gneros. La mayor parte de las especies rhizobianas definidas cumplen con
este criterio. Son excepciones a esta regla: S. fredii, R. tropici y M. plurifarium. En cada
uno de estas tres especies se incluyen cepas o grupos que comparten menos de un 70%

de parecido de ADN-ADN. En estos casos, es necesario incluir otros mtodos como

electroforesis (SDS-PAGE) de proteinas, electroforesis de multilocus enzimticos
(MLEE) y otros, para definir todas las especies descritas.
Hasta la fecha se han propuesto 6 gneros, que son: Allorhizobium, Azorhizobium,
Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium. Con base en las
secuencias de genes de 16S rRNA, todos los rizobios definidos son miembros de la
subdivisin a de las Proteobacterias. En esta misma subdivisin se encuentran bacterias
del gnero Agrobacterium que forman tumores en plantas. Los 6 gneros de los rizobios
son 6 grupos filogenticos entremezclados con otros gneros de las -Proteobacteria. En
el rbol filogentico los gneros Azorhizobium y Bradyrhizobium son dos ramas
separadas de los otros gneros de rhizobia. Los gneros Mesorhizobium y
Sinorhizobium son dos grupos distintos pero relacionados con los gneros
Allorhizobium y Rhizobium. El gnero Rhizobium est compuesto de dos subramas: (1)
las especies R. galegae y R. huautlense junto con Allorhizobium y tres especies de
Agrobacterium forman la primera subrama; (2) el resto de las especies, incluyendo la
especie tipo R. leguminosarum, y Agrobacterium rhizogenes forman la otra subrama.
Hay bacterias no-simbiticas cercanamente relacionadas con cada uno de los gneros de
rizobios. Las relaciones entre las bacterias simbiticas y las no-simbiticas y el impacto
que estas relaciones puedan tener sobre la taxonoma de rizobios, se discutir ms
adelante.
En los casos de R. tropici, R. etli, R. huautlense y M. amorphae, se utiliz el anlisis de
enzimas metablicas (MLEE) y la distancia gentica (determinada a partir de la
proporcin de loci enzimaticos con diferente mobilidad en electroforesis) de 0.5 se
consider como uno de los criterios para definir a dichas especies. Valores de distancia
gentica menor que 0.5 se encuentran entre cepas dentro de una misma especie, por
ejemplo en R. leguminosarum, y mayor que 0.5 entre diferentes especies dentro del
gnero Mesorhizobium. El anlisis MLEE provee informacin acerca de la variacin
gentica en una especie, de tal informacin se puede estimar la estructura gentica en
poblaciones naturales para valorar el papel evolutivo de la seleccin Darwiniana, deriva
aleatoria, mutacin e intercambio horizontal de genes. Selander y colaboradores en
1986 resumieron los mtodos de este anlisis. Los rhizobia parecen tener una estructura
de poblacin clonal con escasa recombinacin gentica entre poblaciones distantes; sin
embargo, hay datos que indican que existe transferencia gentica entre poblaciones
locales.
El anlisis de proteinas totales en electroforesis en una dimensin permite agrupar a los
rhizobia con base en las similaridades de los patrones. Los rhizobia se dividen en
diferentes grupos y estos grupos pueden ser definidos como especies si incluyen una
cepa de referencia para cada especie definida. Generalmente, los grupos definidos por
electroforesis de proteinas estn relacionados con aquellos que se pueden distinguir por
parecido de ADN-ADN o por patrones de enzimas metablicas.

Con la reaccin de la polimerasa en cadena (PCR) se pueden generar patrones llamados

Afingerprints@ de ADN (que literalmente quiere decir huellas digitales del ADN) que
se usan para investigar la diversidad gentica dentro de las poblaciones de rizobios.
Estos mtodos se basan en la variacin gentica en las secuencias blanco localizadas en
los genomas que sirven para anclar a los cebadores y que muestran tamaos moleculares
diferentes de los productos sintetizados por la reaccin de PCR.
El ADN puede ser amplificado con cebadores dirigidos a diferentes secuencias; por
ejemplo, cebadores sencillos para las secuencias ABOX@, cebadores al azar en los
RAPD, o pares de cebadores para distintos tipos de secuencias como son secuencias
repetidas extragnicas palindrmicas (REP), secuencias intergnicas repetidas
enterobacterianas o secuencias consensos intergnicas repetidas de enterobacterias.
Estos mtodos son tiles para detectar la diversidad gentica y para el agrupamiento de
las cepas.
La determinacin de polimorfismo en los tamaos de los fragmentos de restriccin
(RFLP) es otro mtodo para revelar la diversidad gentica entre grupos de cepas. Este
anlisis incluye la digestin del ADN total, la separacin del ADN digerido por
electroforesis y la hibridacin de los patrones de restriccin con un detector especfico
de un gen. Tambin se pueden digerir productos sintetizados por PCR y analizar los
RFLP directamente por electroforesis. As se pueden caracterizar a los genes 16S rRNA
amplificados por PCR o ADN del espacio intergentico (IGS).
En la descripcin del fenotipo de las bacterias se reporta morfologa, bioqumicas,
fisiologas, los patrones de utilizacin de fuentes de carbono y nitrgeno, los patrones
de resistencia a antibiticos, las caractersticas y otras. El cmulo de estos datos se
evalan normalmente por un anlisis de agrupamiento, la llamada taxonoma numrica.
Las caractersticas fenotpicas pueden ofrecer una visin detallada de la variacin de las
bacterias dentro de una especie o entre diferentes especies. Tambin permite reconocer
rasgos caractersticos de cada especies.
La descripcin del rango de huspedes tambin se incluye en la deficinicin taxonmica
de estas bacterias. Algunos rizobios tienen un rango ms amplio de plantas huspedes
que otras. Se ha reportado que B. japonicum es capaz de nodular un gran nmero de
leguminosas nativas de las regiones tropicales, al igual que a la soya. Mientras que S.
meliloti ha sido aislado principalmente de las plantas del gnero Medicago, Meliloti y
Trigonella.
Hasta la fecha se han descrito 30 especies en 6 gneros. Todas ellas son bastones
aerbicos Gram-negativos. Las clulas tienen formas irregulares (curvas, en forma de X
o de Y, llamadas bacteroides) dentro de los ndulos. Los bacteroides son las formas
diferenciadas que fijan nitrgeno. Normalmente los bacteroides completamente
desarrollados ya no pueden volver a reproducirse, aunque existe controversia al
respecto. Se ha reportado que los rizobios tienen tres diferentes estados de vida: uno

dentro de los ndulos de las leguminosas, otro en suelo y otro dentro de plantas no
leguminosas como endfitos. Todos los rizobios pueden vivir muy bien como saprfitos
en los suelos o en medios de cultivo. Algunos aislados pueden ser obtenidos
independientes de plantas en suelos qumicamente contaminados. Como endfitos, los
rizobios han sido aislados de diferentes plantas. Por ejemplo, R. leguminosarum bv.
trifolii se ha encontrado en races de arroz y R. etli en races de maiz. Pueden tambin
introducirse y colonizar otras plantas, tales como sucede con Azorhizobium caulinodans
en las races de la oleaginosa Brassica napus. Estas asociaciones entre rizobios y plantas
no leguminosas puede mejorar el crecimiento de las plantas aunque no se ha demostrado
que sea mediante la fijacin de nitrgeno.
Hay algunas caractersticas distintivas entre los gneros de rizobios. El gnero
Azorhizobium contiene cepas que forman ndulos de raz y de tallo y fijan nitrgeno en
condiciones de vida libre. Las cepas de Bradyrhizobium crecen lentamente (colonias de
menos de 1 mm de dimetro despus de 7 das de incubacin) y producen lcali en
medio YMA. El gnero Mesorhizobium incluye cepas con colonias de crecimiento lento
o moderado (colonias de 1-2 mm despus de 5 a 7 das de incubacin) y produce cido
en medio YMA. Los gneros restantes, Allorhizobium, Rhizobium y Sinorhizobium
crecen rpido (colonias > 2 mm despus de 5 a 7 das de incubacin) y producen cido
en medioYMA. A continuacin se presentan las descripciones de los gneros definidos.
Gnero Allorhizobium. Este gnero contiene slo una especie, A. undicola. Se trata de
bacilos Gram negativos de 0.5-0.7 x 2.0-4.0 m que forman colonias de 0.5-3.0 mm de
dimetro despus de 1-2 de incubacin en YMA. A. undicola es un rizobio de rpido
crecimiento que produce cido y polisacridos extracelulares en YMA. Fue aislado
originalmente de los ndulos de la raiz de una planta acutica, Neptunia natans, que
crece en Africa.Tambin nodula Medicago sativa, Acacia seyal, Acacia tortilis, Lotus
arabicus y Faidherbia albida. A. undicola forma una rama ms cercana a las especies
de Agrobacterium que a las especies de Rhizobium en el rbol filogentico obtenido a
partir del anlisis de las secuencias de genes de 16S rRNA.
Gnero Azorhizobium. Bacilos de 0.5-0.6 x 1.5-2.5 m. Se mueve en medio slido
gracias a flagelos peritricales y en medio lquido con un flagelo lateral. Las colonias son
circulares, translcidas, gomosas y tienen un color cremoso. Crece tan rpido como
Rhizobium (las colonias miden ms de 2 mm de dimetro despus de 2 das de
incubacin) pero produce lcali como Bradyrhizobium en YMA. Crece mejor con
cidos orgnicos como fuente de carbono que usando carbohidratos (excepto glucosa).
Fija N2 en condiciones microaerbicas y crece bien en N2 con vitaminas en un medio
libre de nitrgeno. En condiciones de microaerobiosis se requiere cido nicotnico para
la fijacin de N2. Hay una sola especie descrita en este gnero, A. caulinodans. Esta
bacteria fue aislada de ndulos de los tallos de Sesbania rostrata que crece en Senegal.
Tambin puede formar ndulos en la raz de la planta husped. S. rostrata es una de las
pocas plantas leguminosas que nodulan en los tallos y tiene un gran potencial para ser
utlizada como abono verde. La especie A. caulinodans tiene muchas caractersticas que

la diferencan de otros grupos rizobiales. En el rbol filogentico de los rizobios forma

una rama distantemente relacionada con los otros rizobios pero cercana a las especies de
Xanthobacter (similaridad del 98.2% de las secuencias de los genes 16S rRNA). Por
esta razn y considerando que sus caractersticas relacionadas con la fijacin de
nitrgeno en vida libre as como la organizacin de los genes nod y la forma de invadir
al husped, se piensa que tal vez Azorhizobium pudo haber evolucionado de una bacteria
diazotrfica a una simbitica adquiriendo genes nod por transferencia horizontal o tal
vez Azorhizobium es una forma primitiva de rizobio. Se ha planteado la posibilidad,
basada en los datos de sistemtica molecular, de combinar Azorhizobium y
Xanthobacter con Aquabacter. La habilidad de nodular los tallos de Sesbania y de fijar
nitrgeno tanto en vida libre como en condiciones simbiticas son caractersticas nicas
de esta especie. Esta bacteria invade las races de Sesbania entrando por grietas de las
races laterales, que son fisuras epidrmicas normales que se forman alrededor de races
laterales emergentes. Esta ruta de invasin es diferente a las de las otras bacterias que
entran a las races a travs de procesos de infeccin altamente especializados que
involucra la presencia de hilos de infeccin. A. caulinodans has sido usada como
bacteria promotora del crecimiento del arroz y se investigan los mecanismos que
permiten su penetracin en las races del arroz. No se conocen plsmidos simbiticos
para este gnero y se estima que los genes simbiticos estn localizados en el
cromosoma.
Gnero Bradyrhizobium. Estas bacterias son bacilos de 0.5-0.9 x 1.2-3.0 m. Se
mueven con un flagelo polar o subpolar. Este gnero consiste de cepas de lento
crecimiento, productoras de lcali. Las colonias son circulares, rara vez translcidas,
blancas y convexas con un dimetro menor a 1 mm entre 5 y 7 dias de incubacin.. Las
tres especies definidas en este gnero, B. japonicum (especie tipo), B. elkanii y B.
liaoningense pueden nodular a la soya (Glycine max). B. japonicum tiene una amplia
gama de plantas huspedes, incluyendo muchas leguminosas tropicales y algunas de
zonas templadas. Algunas especies fijan nitrgeno en vida libre bajo ciertas
circunstancias. Algunos rizobios fotosintticos formadores de ndulos de tallo aislados
de la leguminosa acutica Aeschynomene han sido identificados como miembros de B.
japonicum. B. elkanii se distingue de B. japonicum por diferencias en sus secuencias de
ADN, en patrones de enzimas metablicas de exopolisacridos, en su contenido de
cidos grasos y hemoproteinas al igual que por diferencias en sus patrones de resistencia
a antibiticos. El tiempo de generacin de estas dos especies es de 8 horas o ms. Las
dos especies de tienen una relacin filogentica cercana a Rhodopseudomonas palustris,
Afinis spp. y Blastobacter denitrificans. Se desconoce la posicin filogentica exacta de
B. liaoningense porque no se dispone de una secuencia completa del gen 16S rRNA de
esta especie. El anlisis comparativo de la secuencia parcial del gene16S rRNA indica
que B. liaoningense tiene una relacin ms cercana con B. japonicum que con B. elkanii.
Las cepas de B. liaoningense crecen mucho ms despacio (tiempo de generacin entre
16-39 hr) que las cepas de B. japonicum y B. elkanii. Algunas caractersticas
bioqumicas y diferentes patrones de utilizacin de carbohidratos permiten distinguir a
B. liaoningense de las otras dos especies. Se han obtenido tambin aislados de

Bradyrhizobium de otras leguminosas pero no se ha definido la especie a la que

corresponden. De las especies identificadas, ninguna tiene plsmido simbitico y los
genes simbiticos estn localizados en el cromosoma. Se ha reportado que existe slo
un opern del gen ribosomal en Bradyrhizobium.
Gnero Mesorhizobium (Tabla 2). Las bacterias de este gnero son bacilos que miden
0.41-0.9 x 1.2-3.0 m. Generalmente son pleomrficas en condiciones adversas de
crecimiento, tales como alta concentracin de sales. Se han reportado flagelos
peritricales o un flagelo polar o subpolar. Las colonias en YMA son circulares,
convexas, semitranslcidas y mucilaginosas; miden 2-4 mm de dimetro despus de 5
das de incubacin a 28C para algunas especies o menos de 1mm despus de 7 das
para otras. Son bacterias quimio-organotrficas que utilizan una gran variedad de
carbohidratos, cidos orgnicos y aminocidos como fuente de energa. No utilizan ni
celulosa ni almidn. Todas las cepas producen cido en YMA. Forman ndulos fijadores
de nitrgeno en las races de diferentes plantas leguminosas de regiones templadas,
subtropicales y tropicales. Se separ a este gnero de Rhizobium debido a su posicin
filogentica nica, su crecimiento lento o moderado y su produccin de cido. Hay siete
especies en este gnero: M. loti (especie tipo), M. amorphae, M. ciceri, M. huakuii, M.
mediterraneum, M. plurifarium y M. tianshanense. La especie tipo, M. loti, fue
transferida del gnero Rhizobium. Entre las siete especies definidas, M. amorphae y M.
huakuii tienen plsmido simbiticos y el resto tiene los genes simbiticos en sus
cromosomas. En la especie tipo, M. loti, se ha descubierto un fragmento de ADN
transferible entre bacterias que contiene genes simbiticos al que se ha dado el nombre
de isla simbitica. Entre estas especies es comn la existencia de dos operones
ribosomales; sin embargo, en un aislado mexicano se observa una sola copia del gen
16S rRNA. Los huspedes y los orgenes geogrficos de estas especies se muestran en
la Tabla 3. Tambin hay bacterias no simbiticas cercanamente relacionadas con
Mesorhizobium. Entre estas bacterias no simbiticas se encuentra una bacteria no
cultivable Candidatus liberobacter, y otras que pertenecen a los gneros Aminobacter,
Chelatobacter, Phyllobacterium y a grupos que an no tienen nombres.
Gnero Rhizobium (Tabla 4). Son bacilos que miden 0.5-1.0x1.2-3.0 m. Se mueven
por medio de 1-6 flagelos que pueden ser peritricales o subpolares. Las colonias
generalmente son blancas o color beige, circulares, convexas, semitranslcidas u opacas
y mucilaginosas; generalmente miden 2-4 mm de dimetro a los 3-5 das de incubacin
en YMA. El crecimiento en medio de carbohidratos generalmente est acompaado de
reaccin cida y abundante cantidad de gelatina polisacrida extracelular. Son quimioorganotrficas, utilizando una gran variedad de carbohidratos y cidos orgnicos.
Algunas cepas requieren biotina, cido nicotnico, pantotenato o tiamina como factores
de crecimiento. Las cepas de este gnero son rizobios de rpido crecimiento productores
de cido en YMA. Hay nueve especies definidas: R. leguminosarum (especie tipo), R.
etli, R. galegae, R. gallicum, R. giardinii, R. hainanense, R. huautlense, R. mongolense
y R. tropici. Nodulan diferentes especies de leguminosas en zonas templadas o
tropicales. Estas especies forman un grupo polifiltico en el rbol filogentico. R.

giardinii es una rama distantemente relacionada con las otras especies. R. galegae y R.
huautlense tienen una relacin ms cercana con las especies de Agrobacterium que con
las otras especies de Rhizobium. El resto de las especies y Agrobacterium rhizogenes
forman un grupo. Estas especies tienen tres copias de los genes ribosomales y los
plsmidos simbiticos son comunes en ellas. Sin embargo, el plsmido simbitico (o
parte de l, incluyendo genes simbiticos) puede integrarse en el cromosoma. Tambien
se han aislado cepas de R. etli que carecen de genes simbiticos R. etli es importante en
Mxico, en particular, y en Amrica Latina, en general, ya que esta especie predomina
en los ndulos del frijol comn. R. huautlense fue aislado en Mxico y se ha
demostrado que forma ndulos en suelos inundados. Se ha secuenciado completamente
la secuencia del plsmido simbitico de la cepa CFN42 y se empieza a trabajar para
determinar la secuencia de todo el genoma. Debido a que las especies de
Agrobacterium, Rhizobium, y Allorhizobium se entremezclan, adems de que no se
distinguen por caractersticas fenotpicas, se ha propuesto combinar los tres gneros en
uno solo, lo cual ha sido causa de controversia.
Gnero Sinorhizobium (Tabla 5). Son bacilos que miden 0.5-1.0x1.2-3.0 m. El nombre
genrico Sinorhizobium fue propuesto por primera vez para designar a las bacterias de
rpido crecimiento aisladas en China que nodulan a la soya. Posteriormente se separ
este gnero de Rhizobium principalmente debido a las diferencias en las secuencias de
genes 16S rRNA sin embargo no hay caractersticas fenotpicas especficas conocidas
que distingan estos dos gneros. Las ocho especies dentro de este gnero crecen
rpidamente y producen cido en medio YMA. Se han identificado tres copias del gen
ribosomal en ellas. Plsmidos grandes e incluso megaplsmidos son comunes en estas
especies y en algunos casos los genes simbiticos estn localizados en un
megaplsmido. La especie tipo, S. meliloti fue transferida del gnero Rhizobium y ha
sido estudiada extensamente. En esta especie son comunes dos megaplsmidos,
megaplsmido 1 (plsmido Sym) y megaplsmido 2 (plsmido Exo), con respectivos
pesos moleculares de 1700 y 1400 kbp. En varios laboratorios se obtuvo las secuencias
completas del cromosoma y los megaplsmidos. Adems de la especie tipo, otras
especies de este gnero son: S. arboris, S. fredii, S. kostiense, S. medicae, S. saheli, S.
terangae y S. xinjiangense. Las diferencias entre estas especies radican en el anlisis
filogentico de las secuencias de genes 16S rRNA, patrones de proteinas y enzimas,
parecido entre secuencias de ADN, caracterizacin fenotpica y especificidad de
husped. Algunas caractersticas de estas especies se listan en la Tabla 6. Algunos
grupos de rhizobia de suelo mexicano asociados a la leguminosa Leucaena
leucocephala han sido clasificados como Sinorhizobium. Se ha secuenciado el plsmido
simbitico de una cepa de Sinorhizobium con un amplio espectro de huspedes,
NGR234, y se ha descubierto que tiene una estructura de mosaico parecida a algunas
secuencias del plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o a genes de otras bacterias.
Tambin se ha reportado que el plsmido simbitico de NGR234 puede integrarse en un
megaplsmido o dentro del cromosoma en condiciones de laboratorio. Un pariente
cercano de Sinorhizobium es la bacteria Ensifer cuya secuencia del gen 16S rRNA se
parece en un 98% .

La relacin cercana entre especies de rizobios y algunas bacterias no-simbiticas indica

que los rizobios pueden tener un origen comn con otras bacterias. Se puede suponer
que nuevos linajes de rhizobios siguen emergiendo en la naturaleza debido a la
transferencia de los genes simbiticos y al hecho de que bacterias no-simbiticas,
relacionadas con rizobios, pueden convertirse en bacteria formadoras de ndulos
eficientes tanto en condiciones de laboratorio como de campo. Estos resultados
indicaran que nuevos gneros y especies de rizobios pueden surgir.
Se necesitan criterios estndar para la taxonoma en el futuro. Estos nuevos estndares
deben ofrecer una gua para la definicin de nuevos gneros y especies. Los criterios
utilizados en diferentes trabajos de investigacin no son uniformes. Por ejemplo, para
las primeras especies descritas se cuenta con informacin fenotpica acerca de su
morfologa celular, flagelos, requerimientos de factores de crecimiento, rango de pH y
temperatura, tolerancia a NaCl, resistencia a antibiticos, entre otros datos. Estos datos
normalmente no estn completos en las especies descritas recientemente.
Por otra parte, la definicin de gneros es un gran problema actualmente en taxonoma y
las soluciones generalmente son ms artificiales que naturales. Por una parte, la
definicin de gnero se basa principalmente en la filogenia del gen 16S rRNA y las
diferencias fenotpicas han sido totalmente ignoradas en muchos casos, lo que ha
llevado a decisiones conflictivas tales como en el caso de la separacin de
Sinorhizobium y Rhizobium o la sugerencia de combinar los gneros Agrobacterium y
Rhizobium. Por otro lado, no existe un estndar filogentico oficial para definir gnero.
Haukka y Young sugirieron que R. galegae (que incluye ahora a R. huautlense), A.
tumefaciens- A. rubi y A. vitis deberan pertenecer a diferentes gneros ya que el
parecido de sus secuencias de genes 16S rRNA es menor que un 90% y este umbral fue
el nivel de separacin aceptado para Sinorhizobium. Por la misma razn se ha sugerido
el gnero Allorhizobium dentro de esta rama del rbol filogentico. Sin embargo,
considerando tanto las relaciones filogenticas como los rasgos fenotpicos, Kuykendall
y colaboradores hicieron la sugerencia de combinar dentro un solo gnero todas las
especies clasificadas en los gneros Rhizobium, Agrobacterium y Allorhizobium.
El proceso de nodulacin
Se conocen bien las etapas de la infeccin y desarrollo de ndulos radicales (Animacin
1). Estas incluyen:
1. Reconocimiento de la combinacin adecuada de organismos, tanto por parte de la
planta como de la bacteria, y adherencia de la bacteria a los pelos radicales.
2. Invasin del pelo radical y formacin de un canal (o hilo) de infeccin
3. Desplazamiento de las bacterias hacia la raz principal a travs del canal de infeccin.

4. Diferenciacin de las bacterias en un nuevo tipo al que se le llama bacteroides, dentro

de las clulas de la planta, y desarrollo del estado de fijacin de nitrgeno.
5. Divisin de las clulas bacterianas y vegetales y formacin del ndulo radical
maduro.
A continuacin se describen estas etapas en ms detalle:
Las plantas leguminosas secretan compuestos especficos que atraen a los rizobios.
Entre estos compuestos se encuentran flavonoides y en respuesta a ellos los rhizobios
activan una serie de genes implicados en la nodulacin. El primer paso en la formacin
de los ndulos es la adherencia de la bacteria a la planta. En la superficie del rizobio se
localiza una protena especfica de la adherencia, la ricadesina. Es una protena que se
une al calcio y puede actuar captando complejos de calcio en la superficie de los pelos
radicales. Otras sustancias, como las lectinas, que son protenas que contienen
carbohidratos, tambin cumplen una funcin en la adherencia planta-bacteria. Las
lectinas han sido identificadas en los extremos de pelos radicales y en la superficie de
las clulas de rizobio. Despus de la unin, los pelos radicales se enroscan debido a la
accin de sustancias especfica secretadas por la bacteria, que se conocen como factores
Nod (vese mas adelante). Algunos pelos radicales se enroscan hasta 360 formando
una estructura a la que se llama "cayado de pastor". La bacteria penetra entonces en el
pelo radical e induce la formacin, por parte de la planta, de un tubo de composicin
similar a la pared celular, conocido como canal de infeccin, que avanza por el pelo
radical. A continuacin, la infeccin alcanza a las clulas de la raz adyacentes a los
pelos radicales, y los factores Nod estimulan la divisin de las clulas vegetales,
produciendo finalmente el ndulo. Las bacterias son liberadas desde el canal de
infeccin al citoplasma de las clulas vegetales por un mecanismo similar al de
endocitosis (Animacin 2). Los rizobios quedan separados del citoplasma por una
membrana derivada de la planta hospedadora y que se llama la membrana
peribacteroidal (MPB). A continuacin hay una divisin continua y sincronizada de los
rizobios rodeados de MPBs. Al cesar la divisin las bacterias se transforman en unas
formaciones ramificadas, hinchadas y deformes, llamadas bacteroides. Estos quedan
rodeados, individualmente o en pequeos grupos por la MPB. A la estructura que
contiene estos grupos de bacteroides rodeados por la MPB se les llama simbiosomas
(Animacin 2). Los bacteroides pueden llegar a ser hasta 40 veces ms grandes que los
bacilos a partir de los que se desarrollan, y hasta varios miles se encuentran en una sola
clula vegetal. La fijacin de nitrgeno no se inicia hasta que se han formado los
bacteroides. El sistema vascular de la planta se extiende dentro del ndulo y transporta
nutrientes hacia y desde el ndulo. Cuando el ndulo se deteriora las bacterias pasan al
suelo. En algunos casos las formas bacteroidales no tienen capacidad de divisin, pero
los ndulos contienen siempre algunos rizobios en estado de latencia. Estas formas
proliferan en el suelo utilizando como nutrientes algunos de los productos del ndulo
destrudo y las bacterias pueden iniciar la infeccin en otras races o mantenerse en
estado libre en el suelo.

Tipos de ndulos y especificidad de la interaccin rizobio-leguminosa

Hay que recordar que la familia de las leguminosas es enorme y diversa y comprende
alrededor de 20.000 especies. Dada esta diversidad, no es adecuado hacer
generalizaciones, hay diferentes modos de infeccin (no siempre es a travs de canales
de infeccin) y las formas y modo de desarrollo de los ndulos pueden ser muy
variadas. En general, los ndulos se pueden dividir en dos tipos: 1) ndulos
indeterminados, que contienen un meristemo persistente resultando en formas
cilindricas y a menudo ramificadas (como los ndulos de alfalfa mostrados en la Figura
2A), y 2) ndulos determinados que carecen de un meristemo persistente y tienen forma
redondeada (como el ndulo de frijol mostrado en la Figura 2B).
La formacin de una simbiosis efectiva es un proceso altamente especfico, sin
embargo, el grado de especificidad vara tremendamente entre los diferentes rizobios.
As algunas cepas tienen un rango de hospedador muy reducido como por ejemplo R.
leguminosarum biovar trifolii que slo fija nitrgeno en especies de Trifolium (trbol) o
S. meliloti, que nodula especies de los gneros Medicago, Melilotus y Trigonella. Otras
por el contrario muestran un amplio rango de hospedador, este es el caso de Rhizobium
sp. NGR234 que nodula 112 gneros incluyendo la no-leguminosa Parasponia.
Bases moleculares de la interaccion rizobio-leguminosa
El aspecto de la especifidad en la relacin rizobio-leguminosa ha promovido gran
cantidad de estudios para identificar la seales implicadas. Se conocen las seales que
se intercambian en la etapa temprana de la interaccin (Fig. 3) mientras que para las
etapas subsiguientes (infeccin, liberacin de los bacteroides, comienzo de fijacin de
nitrgeno) se conocen algunos componentes de la bacterias que son necesarios pero no
cmo actan.
La primera seal implicada en la interaccin la provee la planta. Los rizobios son
capaces de notar la presencia de la raiz de la leguminosa por medio de molculas de
bajo peso molecular (flavonoides, isoflavonoides y betanas) secretadas por la raz. Este
proceso tiene especificidad hasta cierto punto ya que las leguminosas secretan
flavonoides especficos para atraer a rizobios especficos(Figs. 3 y 4; Tabla 7). En
respuesta a la seal de la planta los rizobios responden sintetizando otras seales
especficas, los factores Nod, dirigidos hacia la planta hospedadora(Figs. 3, 5a, 5b, 5c
y5d). Los genes de la bacteria implicados en la sntesis de los factores Nod son los
genes nod (nodulacin). Estos genes, a excepcin de nodD, no se expresan si no se
encuentra la seal inductora adecuada de la planta. El gen nodD se expresa
constitutivamente y la protena NodD tiene la capacidad de reconocer los flavonoides
especficos secretados por la planta. Los operones de los genes nod estn precedidos por
un promotor que contiene una secuencia consenso. A esta secuencia consenso se le
llama caja de nodulacin (o caja nod) y que es reconocida por la protena NodD. Una

vez activada por los flavonoides, la protena NodD a su vez va a activar la transcripcin
de los genes de la nodulacin mediante su unin a las cajas nod.
La estructura del factor Nod mayoritario de S. meliloti se determin en 1990 (Fig. 5) y
desde entonces las estructuras de los factores Nod de muchos otros rizobios se han
determinado (Fig. 5 y Tablas 8 y 9). La informacin detallada de la estructura de los
factores Nod y su biosntesis se encuentra en varias revisiones. Todos los factores de
nodulacin caracterizados tienen una estructura bsica comn que consiste en un
oligmero de N-acetil-D-glucosamina unidos por enlace 1 > 4 que lleva unido un
cido graso al nitrgeno del extremo no reductor. Debido a la semejanza estructural del
oligosacrido a quitina, polmero 1 > 4 de glucosamina tpico de hongos y del
exoesqueleto de insectos, a los factores Nod tambin se les llama LCOs (del ingls:
lipo-chitin oligosaccharides).
Las estructuras de los factores Nod producidos por los diferentes rizobios varan en: 1)
la presencia de grupos adicionales mayormente en los extremos del oligosacrido de
quitina, 2) en el tipo de cido graso presente en el extremo no reductor, y 3) en la
longitud del esqueleto de oligosaccharido (Fig. 5 y Tablas 8 y 9). Estas variaciones son
los determinantes mayores de la especificidad de hospedador. Un ejemplo bien
estudiado de modificacin que determina el rango de hospedador es el grupo sulfato de
los factores de nodulacin de S. meliloti. Las cepas mutantes de S. meliloti que producen
factores Nod sin el grupo sulfato ya no son capaces de nodular en alfalfa.
Los genes de la nodulacin se definen como aquellos genes de rizobio que son
necesarios para la nodulacin o que se expresan coodinadamente con estos. Aunque los
llamamos de modo general como genes nod, comprenden a genes designados como nod,
nol y noe. Estos genes estn generalmente agrupados bien en plsmidos o en una regin
del cromosoma. Los plsmidos que llevan los genes nod se llaman simbiticos o pSym
y pueden llegar a ser tan grandes como un tercio del total del cromosoma como en S.
meliloti. En cepas de Rhizobium el tamao del pSym es menor (200-600 kb) y cuando
estas cepas se curan del plsmido simbitico ya no son capaces de nodular mientras que
la reintroduccin de un pSym homlogo o heterlogo restaura la nodulacin.
Recientemente se ha determinado la secuencia total del plsmido simbitico de
Rhizobium sp. NGR234. En M. loti los genes nod se localizan en el cromosoma, pero se
ha demostrado que la regin del cromosoma donde se localizan junto a otros genes
necesarios para la simbiosis, puede transferirse de unas cepas a otras en la rizosfera y es
por ello que a esta regin de aprox. 500 kb se le llama isla simbitica en analoga a las
islas de patogenicidad descritas para bacterias patgenas.
La biosntesis del esqueleto de los factores Nod es catalizada por los productos de los
genes nodA, nodB, y nodC (Fig. 6). La protena NodC presenta actividad Nacetilglucosamina 1 > 4 transferasa (quitina sintasa); NodB es una deacetilasa que
elimina el grupo acetilo del extremo no reductor y NodA transfiere el cido graso a esta
posicin (Fig. 6). Existen muchos otros genes involucrados en la modificacin

especfica de la estructura bsica del factor Nod en las diferentes especies de rizobio. En
la Tabla 10 se describen los genes de nodulacin para los cuales se conoce o se ha
propuesto una funcin. Por ejemplo, nodH codifica la sulfotransferasa que transfiere un
grupo sulfato al extremo reductor de los factores Nod, mientras que nodPQ sintetizan la
forma activada del sulfato que va a transferir NodH. Otro gen que determina rango de
hopedador es nodZ, cuyo producto es una fucosil transferasa que aade fucosa al
extremo reductor del factor Nod. Los productos de los genes nodF y nodE se requieren
para la biosntesis de cidos grasos poliinsaturados. La presencia de stos es necesaria
para la nodulacin de leguminosas del llamado "grupo galegoide". Por otra parte, la
capacidad de un determinado rizobio de producir factores Nod con estructuras
diferentes se ha relacionado con la amplitud en el rango de hospedador.
Los factores Nod purificados son capaces de inducir en la planta reacciones similares a
las que producen los rizobios. De modo significativo, son capaces de inducir la divisin
en clulas ya diferenciadas del cortex de la planta (Animacin 3). Es por ello que a los
factores Nod se les llama morfgenos y se ha sugerido que su estructura pueda imitar a
seales u hormonas de la propia planta, an no identificadas.
Polisacridos y componentes de superficie: Otros componentes de la bacteria
requeridos para una simbiosis efectiva
Como se ha descrito en las secciones anteriores, los factores Nod tienen un papel clave
en la induccin de las etapas iniciciales de nodulacin. Sin embargo, otros
requerimientos son necesarios para la formacin de ndulos simbiticamente efectivos.
De hecho, en estados ms tardos del proceso de infeccin tales como la formacin y
elongacin del canal de infeccin, as como la liberacin de bacterias en el citoplasma
de las clulas infectadas (Animacin 2), requieren constituyentes de superficie de los
rizobios. Los polisacridos que han sido estudiados en relacin a su funcin en
simbiosis son: exopolisacridos (EPSs), lipopolisacridos (LPSs), antgenos de tipo K
(KPSs) y glucanos cclicos En muchos casos los mutantes presentan diferentes fenotipos
simbiticos dependiendo de la pareja planta-rizobio o un mismo mutante presenta
diferentes fenotipos dependiendo de la planta (Tablas 11 y 12). Existe una gran cantidad
de estudios relacionados con las estructuras, los genes de rizobio implicados en su
biosntesis, as como los fenotipos simbiticos de los diferentes mutantes y sus posibles
funciones.
Las cepas silvestres de rizobio suelen producir grandes cantidades de exopolisacridos
(EPSs) y forman colonias muy mucosas en los medios de laboratorio. Se han elucidado
las estructuras de los EPSs producidos por ms de 20 cepas de rizobio. En la Figura 7 se
muestran las unidades repetitivas de los EPSs mejor conocidos. En S. meliloti 1021 se
han identificado dos tipos de EPS llamados como EPS I (succinoglucano) y EPS II
(galactoglucano) (Fig. 7). En ambos casos, se distingue una fraccin de alto peso
molecular y otra de bajo peso molecular. Tanto los genes para la biosntesis de EPS I

(exo y exs) como para EPS II (epx) estn localizados en el megaplsmido b, por lo que
tambin se le llama como pExo.
Mutantes de S. meliloti deficientes en la produccin de EPS I no llegan a infectar las
plantas de alfalfa. Sin embargo, la funcin de EPS I puede ser reemplazada por EPS II,
que es normalmente crptico. En otra cepa de S. meliloti, en ausencia de EPS I y de EPS
II se produce un polisrido capsular (KPS) que permite una simbiosis normal. Un
descubrimiento importante sobre la funcin del EPS ha sido que la adicin de fracciones
de bajo peso molecular puede complementar el defecto fenotpico de mutantes en EPSs.
Se sugiere que los EPSs estn implicados en suprimir la reaccin de defensa de la planta
y parecen ser requeridos para la formacin del canal de infeccin.
Como otras bacterias Gram-negativas, los rizobios producen una monocapa de
lipopolisacrido que se proyecta hacia el exterior. La estructura del LPS se divide en
tres partes: lpido A, ncleo oligosacardico y antgeno O. El lpido A consiste en un
oligosacrido al que se unen cidos grasos y es la parte hidrofbica que ancla toda la
molcula en la membrana externa. El antgeno O es una cadena polisacardica de gran
peso molecular, que es altamente variable de cepa a cepa y le confiere propiedades
antignicas. Hay muchos ejemplos de mutantes de rizobio que carecen de antgeno O y
son defectivos en el proceso de infeccin (Tablas 11 y 12). En general, los EPSs se
requieren para nodular plantas que forman ndulos indeterminados (ej. alfalfa) y los
LPSs para nodular plantas que forman ndulos indeterminados (ej. frijol). Como en el
caso de EPS y KPS, se ha propuesto que el LPS funcione como seal o bien sea
necesario para evadir la repuesta de defensa de la planta.
Los beta-glucanos cclicos son molculas cclicas de glucosa. En los generos de
Sinorhizobium y Rhizobium las glucosas estn unidas exclusivamente por enlaces -(1
>2) y en las especies de Bradyrhizobium por enlaces -(1>3) y -(1>6) (Figura
8). Los beta-glucanos estn presentes en el periplasma y tambin se secretan al medio.
Su produccin aumenta a baja osmolaridad y parece ser esencial para una
osmoadaptacin adecuada. Los mutantes de rizobio que no producen glucanos cclicos
presentan un fenotipo pleotrpico y no son capaces de llevar a cabo una simbiosis
efectiva (Tablas 11 y 12). No se conoce la funcin de los beta-glucanos en simbiosis,
como para el caso de otros polisacridos de superficie se propone que funcionan como
supresores de la respuesta de defensa de la planta. Tambin se ha propuesto que pueden
funcionar en el transporte de ciertas molculas, bien molculas seal o para retirar
sustancias txicas.
Funcionamiento del ndulo
La fijacin simbitica de nitrgeno en rizobio se lleva a cabo en los bacteriodes que se
encuentran en el citoplasma de las clulas del ndulo. La enzima nitrogenasa cataliza la
reaccin:
N2 + 8H+ + 8e- + 16 Mg-ATP > 2NH3 + H2 + 16 Mg-ADP + 16Pi

La nitrogenasa es un protena de gran tamao que consiste de dos componentes, la

protena homodimrica que contiene Fe y es codificada por nifH, y la protena
tetramrica que contiene Fe y molibdeno (Mo), codificada por los genes nifD y nifK. La
nitrogenasa de los ndulos radiculares posee caractersticas similares a la enzima de las
bacterias fijadoras de nitrgeno en vida libre, incluyendo la sensibilidad al O2 y la
capacidad de reducir acetileno y N2. La formacin de H2 es parte del mecanismo de la
nitrogenasa, pero representa una prdida significativa de energa. En algunas especies
de rizobio existe una hidrogenasa (codificada por los genes hup) que es capaz de
reciclar el H2 formado por la nitrogenasa, que resulta en un uso ms eficiente de la
energa. Es por ello, que se ha impulsado la transferencia de los genes hup a todas las
cepas de rizobio para la inoculacin en el campo.
Los bacteroides dependen totalmente de la planta para obtener la energa necesaria para
la fijacin de nitrgeno. Los principales compuestos orgnicos transportados al interior
de los bacteroides a travs de la membrana peribacteroidal son los intermediarios del
ciclo del cido ctrico, en particular los cidos de cuatro carbonos succinato, malato y
fumarato (Fig. 9). Estos cidos son utilizados como donadores de electrones para la
produccin de ATP y, tras su conversin en piruvato, como ltima fuente de electrones
para la reduccin del N2. El primer producto estable que se obtiene de la fijacin de N2
es el amonio, y varias pruebas indican que la asimilacin del amonio para formar
compuestos de nitrgeno orgnico en los ndulos radicales lo lleva principalmente la
planta. El amonio tambin se puede asimilar en los bacteroides y puede ser transferido a
la planta en forma de alanina (Fig. 9).