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Orgnica
PRACTICA N 4
I.
II.
INTRODUCCION
Los estudios de microorganismos en el laboratorio se realizan con cultivos puros, es
decir con una sola especie de microorganismos el cual es inoculado en medios
slidos y lquidos estriles que aseguren la pureza del cultivo.
Las muestras desde las cuales se les quiere aislar los microorganismos son complejas
presentan una gran variedad, es de aqu donde se toma una alcuota o inculo y se
transfiere a un medio estril que generalmente es un medio lquido siempre bajo
condiciones aspticas.
Para obtener cultivos puros de microorganismos se requiere de pasajes sucesivos de
medios lquidos a slidos o viceversa hasta lograr UFC los suficientemente aisladas
que permitan su pureza.
La pureza de estos cultivos permite estudiar sus caractersticas que presentan en los
diferentes medios en los cuales se les cultiva, que pueden ser slidos o lquidos.
Siguiendo el orden de los estudios microbianos in vitro de morfologa celular y de colonias
como caracteres de especies o grupos bacterianos, el alumno observar en esta prctica
las caractersticas culturales de 4 cepas con comportamiento caracterstico diferencial en
caldo nutricio, agar en plano inclinado y agar en columna. Cada carcter vara segn las
necesidades metablicas y de multiplicacin de las especies o grupos bacterianos y en
parte ayuda a la identificacin.
OBJETIVO
- Estudiar el comportamiento de los microorganismos aislados previamente en
medios de cultivo y comprobar la pureza de los mismos.
III.
MATERIALES
IV.
PROCEDIMIENTO:
1.
1.
5.
6.
Tomar el cultivo de bacterias con la mano izquierda y destapar con el dedo meique de
la mano derecha a la altura del mechero.
Con el asa de Kohle previamente flameada al fuego extraer una alcuota del
inculo.
Tapar el tubo y colocarlo en la gradilla
Depositar el inculo en el nuevo tubo de caldo nutritivo agitando, flamear la boca
del tubo al mechero y taponar.
Esterilizar el asa al mechero
Rotular e incubar a 28 30.
2.
1.
2.
2.
3.
4.
3.
4.
V. CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS
1.
CANTIDAD DE
DESARROLLO
TURBIEDAD
Abundante
Homognea
Moderado
En grumos finos
Escaso
Nulo
En grumos gruesos
Algodonoso
- Formacin de pelcula,
De naturaleza:
Gomosa, lisa,
Corrugada, escamosa
Membranosa, Costrosa
- Sin pelcula: desarrollo
en anillo
56
OLOR
ninguno
Fecaloide,
Aromtico
Parecido a.
BRILLO
Vivo
Apagado
Opaco
FORMA
Filiforme
Difusa o Confluente
Arborescente
Rizoide
Perlada
Toruloide
TRANSPARENCIA
Opaca
Opalescente
Transparente
TEXTURA DE
SUPERFICIE
CONSISTENCIA
Lisa
Granular
Escamosa
Membranosa
Papulosa
Corrugada
Costrosa
Verrucosa
Lacerada
Cremosa
Butirosa
Viscosa o vidriosa
Gomosa o mucosa
Membranosa
Algodonosa
1.
2.
3.
4.
CUADRO III
DESARROLLO EN PUNTURA
Filiforme
Inalterado
Granular
Grisceo
Perlado
Claviforme
Rizoide
En pino invertido
Arborescente
Velloso
Negruzco
Enrojecido
Verduzco
Lechoso
Fluorescente
Opalescente
MOTILIDAD
Crecimiento difuso
Parcial o total del
Microorganismo por
Toda la columna de
Agar: BACTERIA MOVIL
Crecimiento
Circunscrito al trazo
De siembra: BACTERIA
NO MOVIL
58
VIII. CUESTIONARIO
1.
Cul es la razn de utilizar cultivos puros para el estudio morfolgico?
2.
La morfologa de los microorganismos varia con el medio de cultivo. Por qu?
3.
Cul es el fundamento de la cromognesis?
4.
Cul es el fundamento de la fluorescencia en los microorganismos?
M.O.
Caractersticas
Cantidad de
desarrollo
Forma
Textura
Consistencia
Brillo
Adherencia
Cromognesis
Aspecto del medio
Olor
Coloracin gram
M.O.
Caractersticas
Cantidad de
desarrollo
Turbidez
Desarrollo
superficie
Olor
Sedimento
Naturaleza
sedimento
Tabla I
Comportamiento Cultural de Bacterias en Medio Slido
Escherichia
Staphylococcus Pseudomonas
Salmonella
coli
aureus
sp
sp
Abundante
Abundante
Abundante
Moderado
Abundante
Difusa
Lisa
Cremosa
Mate
Moderada
Ausente
Opalescente
Fecaloide
(-)
Difusa
Lisa
Gomosa
Brillante
Moderada
Amarillo
dorado
Opalescente
Sui generis
(+)
Bacillus sp
Difusa
Lisa
Cremosa
Opaca
Moderada
Azul verdoso
Filiforme
Lisa
Cremosa
Mate
Debil
Ausente
Filiforme
Corrugada
Cremosa
Brillante
Moderada
Ausente
Fluorescente
Fruta podrida
(-)
Opalescente
Fecaloide
(-)
Opalescente
Descompuesto
(+)
Abundante
Homognea
Sin pelcula
Homognea
Sin pelcula
Homognea
Anillo verde
Homognea
Sin pelcula
Homgnea
Sin pelcula
Fecaloide
Moderado
Mucoide
Sui generis
Moderado
Mucoide
Fruta podrida
Abundante
Grumoso
Fecaloide
Escaso
Granular
Descompuesto
Ausente
Ausente
59
Bacillus sp
60
Bacillus sp
Opalescente
(+)
Penicillium sp
Moderado
Arborescente
Corrugada
Algodonosa
Opaca
Fuerte
Azul negruzca
Opalescente
Sui generis
Penicillium sp
Escaso
Escaso
Costrosa
Sui generis
Nulo
Nulo
INTRODUCCION
I.
En muchas fases de la microbiologa se hace necesario cuantificar el nmero de
microorganismos que se encuentran en un cultivo o determinar su nmero en alimentos,
aguas y otros productos.
Los mtodos que miden el nmero de clulas son importantes para contar el nmero de
organismos unicelulares como bacterias y levaduras. En la determinacin de la masa de
clulas pueden emplearse para todo tipo de microorganismo.
Existen mtodos directos e indirectos:
A) Mtodos Directos
1.- Determinacin del nmero de microorganismos
- Recuento microscpico directo
- Recuento en placas
- Nmero ms probable
- Conteo electrnico
- Electrodos de Pt, inmersos en un electrolito. Tamao de partcula 1- 3 um
1. Contador coulter
2.- Determinacin de la masa celular
- Peso seco
- Turbidimetra
- Volumen empacado
B) Estimacin indirecta de masa celular
- Cuando el cultivo contiene slidos no celulares
61
Bsicamente son valoraciones qumicas de los componentes celulares como por ejemplo
nitrgeno, CO2, protenas, ADN, lpidos, carbohidratos.
Todos los mtodos poseen ventajas y desventajas, se hace necesaria la combinacin de
varios mtodos para tener valores que muestren el nmero original de microorganismos.
OBJETIVO
Adiestrar al alumno en los mtodos usados en la determinacin del nmero de
microorganismos.
La cuantificacin permitir determinar la cintica en el caso de los Bioprocesos o el
grado de contaminacin de un producto determinado.
II.
III.
1.
2.
3.
MATERIALES
1 muestra de alimento de expendio pblico no cocinado (hamburguesa de carne y/o
pollo no cocinada, salsa de aj, cremas, etc.)
Frascos con 90 ml con agua destilada estril.
Placas Petri.
Tubos con 9 ml de solucin salina estril de 0.85%
Tubos con 9 ml de caldo lactosa
Pipetas de 1 y 10 ml
Tubos con 1 ml de agua destilada estril
Gradillas
Plumn indeleble.
Mechero
Encendedor
PROCEDIMIENTO
Tomar 1 ml 1 gr de la muestra problema segn sea lquida o slida y transferir a un
tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada estril, sta constituir la dilucin 10-1.
Realizar diluciones seriadas 10-2, 10-3, 10-4 en los tubos de agua destilada estril.
Proceder al aislamiento por los mtodos descritos abajo.
5.
6.
7.
Rotular e incubar a 28 C.
Contar el nmero de colonias que aparecen al final de la incubacin.
Realizar los clculos pertinentes.
UFC/gr o ml = (N de colonias contadas x FDD) / (volumen de siembra)
FDD: Factor decimal de dilucin = 1 / Dilucin realizada
8.
4.
5.
V. CUESTIONARIO
1.- Puede Ud. Medir el crecimiento de hongos por turbidimetra?
2.- En qu casos se emplea la Escala de Mac Farland?
2.- Cul es la desventaja que presentan los contadores electrnicos?
3.- Cul es el inconveniente que presenta el recuento directo al microscopio?
63
TABLA II
Tabla 1. ndice del NMP para varias combinaciones de resultados positivos y negativos para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con alcuotas
de 0.1; 0.01 y 0.001g.
Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5
64
PRACTICA N 5
ACCIN DE AGENTES FSICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos estn condicionadas por su
ambiente. Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se adapta a las
nuevas condiciones o en todo caso muere; en esto est implicado la magnitud y el tipo de
cambio operado. Este es el aspecto en el que los microorganismos difieren de las clulas de
plantas superiores y animales.
El conocimiento de los factores fsicos que controlan la supervivencia y multiplicacin de los
microorganismos nos sirven como instrumento de control de la actividad bacteriana para
ser esta incrementada, disminuida o destruida completamente.
El tipo de muerte bacteriana por agentes fsicos est relacionado al nmero de bacterias
sobrevivientes, lo que significa que el proceso de desinfeccin no es repentino sino gradual,
en el que el nmero de microorganismos muertos por unidad de tiempo es mayor al
principio y mucho menor cuando la accin contina.
I. EFECTO DE LA TEMPERATURA
Las bacterias son capaces de una capacidad de sobrevivencia amplia con lmites de
temperatura variable, su rango de crecer y ejercer sus actividades est entre los 0 y 90C.
CONDICIONES QUE VARIAN LA MUERTE TRMICA:
1. Contenido DE AGUA DEL MEDIO: La muerte bacteriana se genera por coagulacin de
las protenas del protoplasma. Cuanto mayor es el porcentaje de agua en el medio,
menor ser la temperatura requerida para matar la bacteria.
2. Contenido de agua de los organismos: A menor cantidad de agua, los
microorganismos se secan y se produce mayor resistencia a la temperatura.
3. Concentracin de hidrogeniones: Lo microorganismos mueren fcilmente en
condiciones cidas o alcalinas, requirindose temperaturas menores que en medios
neutros.
4. Composicin del medio: Los medios que contienen alta concentracin de protenas
incrementan la temperatura requerida para destruir bacterias, ya que las protenas
forman una pelcula alrededor de los microorganismos como medio de proteccin
indirecta ante situaciones desfavorables.
5. Edad de las clulas: Las clulas viejas son ms resistentes que las clulas jvenes a
las condiciones adversas.
65
Objetivo:
-
Materiales:
Cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Procedimiento:
1. Dos cultivos de 24 horas de edad de E. coli y S. aureus crecidos en Caldo Nutritivo se
sometern a 40 C y 65 C.
2. Cada 0, 40, 80 y 100 minutos se coger 1 ml de cada uno los tubos que contienen las
cepas microbianas en ambas temperaturas y se sembrar por el mtodo de difusin en el
medio de cultivo Agar Nutritivo. Realizar diluciones seriadas.
3. Rotular correctamente las placas Petri indicando el tratamiento y la cepa microbiana.
4. Incubar a 28 C por 48 horas en posicin invertida.
5. Realizar el recuento de microorganismos en cada uno de los tratamientos.
6. Resultados: Anotar los resultados en el siguiente cuadro:
Temperatura
40 C
65 C
Tiempo (min)
0
40
80
100
0
40
80
100
Donde:
66
67
Material
-
Procedimiento
1. En las placas con diferentes concentraciones de NaCl, sembrar la cepa de E. coli por
el mtodo del estriado.
2. Repetir el paso anterior utilizando una placa con Agar Nutritivo que contiene
concentracin normal de NaCl.
3. Rotular las placas Petri con la cepa microbiana utilizada.
4. Incubar a 28C por 48Hrs.
5. Comparar el crecimiento microbiano entre las placas que contienen las diferentes
concentraciones de NaCl y la placa con Agar Nutritivo que contiene concentracin
normal de NaCl.
6. Interpretacin y Discusin de resultados.
68
Materiales
-
Procedimiento.
1. Inocule con una azada el cultivo de E. coli en cada uno de los tubos de caldo nutritivo con
distintos valores de pH.
2. Incube a 28 C y anote sus observaciones en trminos de la cantidad de crecimiento al
segundo y cuarto da. Emplee la siguiente escala:
+
= Poco crecimiento
++
= Regular Crecimiento
+++ = Crecimiento moderado
++++ = Abundante crecimiento
3. Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:
TABLA DE RESULTADOS
pH 3.0
pH 5.0
E. coli
69
pH 7.0
pH 9.0
pH 11.0
1.
2.
3.
4.
Agentes Antispticos
Dividir la placa de Agar Nutritivo en 4 mitades.
Realizar el mismo procedimiento descrito para los agentes desinfectantes y probar las
cepas de E. coli y S. aureus.
Incube a 28 C por 48 horas y anote sus observaciones en trminos de la cantidad de
crecimiento. Emplee la siguiente escala:
+
= Poco crecimiento
++
= Regular Crecimiento
+++ = Crecimiento moderado
++++ = Abundante crecimiento
Resultados: Anote sus resultados utilizando la siguiente tabla:
70
Desinfectante
E. coli
Antisptico
S.aureus
Leja
Alcohol al 70%
Cresol
H2O2
Pinesol
Merthiolate
Jabn Protex
71
E. coli
S.aureus
4.
CUESTIONARIO
1. De los microorganismos estudiados qu estructuras bacterianas le confieren resistencia
trmica? Por qu?
2. Cul es el rango de temperatura en el cul los microorganismos crecen y se multiplican
rpidamente y en funcin de esto cul sera la temperatura recomendada para la
conservacin de los alimentos? Por qu?
3. Qu cuidados debemos practicar frente a la cantidad de agua extra o intra celular en
posibles productos frescos a temperatura ambiente?
4. Qu ejemplos de aplicacin estn basados en la fisiologa de la presin osmtica?
5. Cul es la razn de usar alcohol de 70?
6. En un proceso productivo de derivados de frutas, Cul sera el agente contaminante
principal? Cul sera su agente qumico de control? Qu funcin cumplira este agente?
Proponga un ejemplo.
7. Explique el efecto de los desinfectantes y antispticos en el desarrollo microbiano.
8. De acuerdo a la capacidad fermentativa de los carbohidratos por las bacterias estudiadas
indique los alimentos que pueden ser potencialmente deteriorados por esta actividad
metablica. Por qu?
Defina:
Desinfectante
Antisptico
Bactericida
Bacteriosttico
Plasmlisis
73
PRACTICA N 6
IDENTIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE MOHOS POST COSECHA, CARACTERSTICAS DE
LOS PRINCIPALES GRUPOS DE HONGOS
La mayora de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energa por
respiracin o fermentacin de materiales orgnicos solubles presentes en estos ambientes.
El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los microorganismos pero es el
portador de aerosoles biolgicos como polvo, gotitas de agua y otros, que pueden estar
cargados de los diversos grupos de microorganismos.
De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden principalmente del
suelo, de la vegetacin y del mar. Algunos de los gneros ms comnmente aislados del aire
son Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor y Cladosporium entre otros.
Todos los hongos se reproducen por esporulacin. Cuando la espora se encuentra en un
medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o ms tubos germinativos
que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan
HIFAS, las cuales pueden ramificarse despus. En algunas especies se forman septas a lo
largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeos compartimentos como una caa
de bamb llamndose entonces HIFA SEPTADA, otras veces no hay septacin y el
protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, describindose entonces como HIFA
NO SEPTADA CENOCITICA. En la mayora de los hongos las hifas son septadas. A medida
que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de
hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En
algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructferos grandes y de
estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el
substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se
proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen
a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misin es la de dispersar el hongo a nuevos
hbitats.
Algunos hongos tambin producen esporas sexuales formadas como resultado de la
reproduccin sexual. Las que estn encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman
ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de un basidio se denominan
BASIDIOSPORAS. Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la
clasificacin e identificacin de los hongos.
Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prcticamente hay tres grupos
importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos filamentosos que
estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales en pan viejo, queso, frutas
o cualquier tipo de alimento. Presentan una gran variedad de formas y tamaos. Las
levaduras son hongos unicelulares y la mayora son Ascomicetos. Normalmente tienen
forma oval o cilndrica y su principal forma de reproduccin es la gemacin, se desarrollan
bien en hbitats con abundante azcar tales como frutas, flores, e incluso la corteza de los
rboles. Las levaduras tienen gran importancia biotecnolgica en la industria cervecera y de
74
Cabezuela hemisfrica
Cabezuela
globosa
Cadena de conidias
Filides
Cabezuela
claviforme
Hifa septada
75
2. Penicillium
Caractersticas Macroscpicas: Las colonias del gnero Penicillium son circulares si no hay
impedimento alguno para su crecimiento. ste es generalmente blanco, pero en algunas
especies es amarillo, anaranjado, prpura o pardo claro. La superficie de la colonia madura,
o sea con sus conidios formados, puede ser: aterciopelada, ligeramente algodonosa o con
pequeos haces (fascculos) de conidiforos.
Caractersticas Microscpicas: Este gnero se caracteriza por formar conidias en una
estructura ramificada semejante a un pincel. Los filamentos o hifas alcanzan un dimetro
entre dos o tres micrmetros y tienen septos. Presenta conidiforo erecto en cuya parte
aplica se encuentras las filides distribuidas en varias ramificaciones. Los conidios son
esfricos o elipsoidales, unicelulares, hialinos que en masa se ven de color verde, verde
azulado, verde aceituna o gris. La pared de los conidios es lisa o rugosa segn las especies.
Conidiforo
76
3. Rhizopus
Caractersticas macroscpicas: Colonias algodonosas laxas, que cubre completamente la
caja de Petri y logra empujar la tapa hacia arriba. Inicia de color blanco y se torna gris con
puntos negros que corresponden a los esporangios.
Caractersticas microscpicas: Hifas gruesas y aseptadas, abundantes rizoides prominentes
de color caf, de los que salen esporangiforos largos, no ramificados, de color caf, cada
uno con un esporangio caf con esporangiosporas espiculadas. Dependiendo de la especie
puede poseer estolones o puentes de comunicacin entre los rizoides.
Esporangio
Esporangiosporas
Esporangiosporas
Esporangiforo
Estoln
Rizoides
Esporangio
Esporangiosporas
Esporangiforo
Estoln
Objetivo:
- Aislar e identificar los principales hongos ambientales causantes del deterioro de los
alimentos de acuerdo a sus caractersticas macro y microscpicas.
Materiales y sustancias
- Placas Petri conteniendo medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD).
- Asa de Kohle
- Alambre de nicrn en punta
- Lminas portaobjetos
- Papel lente
- Alcohol 70
- Agua destilada estril.
- Colorante Azul algodn de Lacto-fenol
- Cinta scotch
- Mechero Bunsen
- Encendedor
- Microscopio
- Plumn marcador
- Diversos tipos de alimentos con visible desarrollo fngico en la superficie: frutos,
cereales, granos, hortalizas, pan, etc.
Procedimiento
I. Observacin directa de las estructuras vegetativas y reproductivas asexuales de los
hongos
1. A partir de las muestras de alimentos con desarrollo fngico sobre su superficie colocar
la parte adherente de un trozo de cinta scotch y presionar con cuidado para favorecer la
adhesin de las estructuras.
2. Colocar una gota del colorante azul de algodn de lacto-fenol sobre una lmina
portaobjeto.
3. Colocar sobre la gota del colorante el trozo de cinta scotch adhiriendo con cuidado las
estructuras fngicas previamente tomadas del alimento deteriorado.
4. Examinar al microscopio con objetivo de menor aumento para buscar estructuras
reproductivas representativas y posteriormente cambiar a un objetivo de mayor
aumento para observar con mejor detalle las caractersticas de las estructuras
seleccionadas procurando que stas presenten la arquitectura completa del hongo para
facilitar su identificacin.
5. Reconocer la morfologa que conforman parte del talo vegetativo: tipo de hifa septada o
cenoctica, estoln, rizoide, etc. y, del talo reproductivo asexuales: esporangiforo,
conidiforo, filides, esporangio, esporas, vescula o cabezuela, etc.
6. Realizar la Identificacin preliminar del gnero del hongo
7. Dibujar las observaciones realizadas
78
79