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Summary
A comparative study in rats was completed to investigate the local responses and the
hematological changes after the injection of an intramuscular dose of sapindussaponin (19,59
mg,) and of vaccine of P. falciparum - sapindussaponin (19,59 mg - 0,25 mL suspension.)
The effects were compared with them caused by physiological serum and by the bovine of P.
falciparum (0,25 mL suspension.) groups of five male rats were injected in the gastrocnemio
muscle with 0,25 mL of the test solution: At 0 days in the left one. At the 48 and 192 hours
blood samples took one peripheral (glue) of two fellows of each group selected at random.
They prepared one frotices and he was realized the white corpuscle counting with light
microscope with immersion lens. The percentage results were subject to the ANOVA variance
analysis of a factor with the tests post hoc DMS and t of Dunnett. It finishes that there
changes in the formula leucocitaria are as answer to the injection from Sapindussaponin and
P. falciparum - sapindussaponin.
According to the results it finishes:
1. Registering local responses in the test solution administration zone was not possible.
2. The variations in leukocyte percentage: Neutrophil and monocitos indicate the cellular
answer to the saponin and the association saponin antigenic fractions P. falciparum.
Words key: Sapindussaponin, intramuscular injection, local reactions in rats.
I. INTRODUCCIN
El hombre siempre ha estado interesado por conocer la naturaleza y aprovecharla para la
solucin de diferentes problemas tales como la necesidad de a) alimentacin para una
poblacin humana cada da mayor, b) nuevos medicamentos para las enfermedades que en la
actualidad son incurables, y c) nuevas materias primas industriales; motivo por el cual, se ha
empeado en investigar cientficamente las sustancias presentes en los seres vivos que le
rodean, tanto plantas (Fitoqumica) como animales (Zooqumica)1.
Los vegetales que contienen saponinas, hetersidos llamados saponinas (del latn sapo,
jabn), se han utilizado profusamente en muchas partes del mundo por sus propiedades
detergentes2.
Saponina es una sustancia capaz de formar espuma al ser agitada con agua o disuelta en
alcohol. Las contienen plantas muy diversas, entre ellas la acacia, la saponaria o jabonera, el
castao de indias y muchas otras. Las saponinas se han utilizado mucho, y an se utilizan en
ocasiones, como agentes limpiadores de la contaminacin producida por vertidos txicos.
Poseen virtudes hemostticas (capacidad de detener las hemorragias) 3.
Existen unas 6 familias de plantas que presentan grandes cantidades de saponinas, una de
stas es Sapindaceas con la especie Sapindus saponaria. Las saponinas son glicsidos
resultante de la unin de la sapogenina (aglicn) con uno o ms azcares. La Saponina aislada
de Sapindus saponaria es la L-Hederina (sapindussaponina), la Sapogenina es la LHederagenina y los azcares: rhamnosa y arabinosa4.
En nuestro pas, tenemos la especie Sapindus saponaria L. (choloque o boliche), de la
que desde pocas precolombinas se ha utilizado el pericarpio del fruto maduro por su alto
contenido de saponinas5. Motivo por el cual los dos ltimos aos se ha trabajado en nuestros
laboratorios con la cscara del fruto maduro, para desarrollar una tecnologa de obtencin de
un extracto concentrado de saponinas. Ahora es necesario encontrar aplicaciones cientfico-
anteriores, las saponinas interactan con el ergosterol presente en las membranas, induciendo
prdida de su integridad o alteracin en la porcin hidrocarbonada cargada negativamente9.
En la Pontificia Universidad Catlica de Chile, en 2002 se anunci la creacin de una
industria para la extraccin y comercializacin de saponinas, que en la actualidad muestra
interesantes perspectivas de desarrollo por su aplicacin en el proceso de refinacin del
cobre10.
La oferta de productos para la firma del Tratado de Libre Comercio (TLC) Per-USA; entre
tantos otros los productos naturales, incluye saponinas11. As tambin, en la Lista Arancelaria
de Colombia12 para el TPD Colombia-USA, estn las saponinas.
Adyuvante es una sustancia distinta de un antgeno que potencia la activacin de los linfocitos
T al favorecer la acumulacin y activacin de otros leucocitos, denominados clulas
accesorias, en el lugar de exposicin al antgeno. En las clulas accesorias, los adyuvantes
aumentan la expresin de coestimulantes y citocinas que activan a los linfocitos T y pueden
prolongar tambin la expresin de complejos pptido-CPH en la superficie de las CPA13.
Material de estudio
Extracto concentrado de saponinas de pericarpio de fruto maduro de Sapindus saponaria L.
(choloque)
Rattus rattus var albinus 20 individuos con peso entre 300 400 g; divididos al azar en
cuatro grupos (un testigo y tres grupos ensayo) de 5 especimenes cada uno.
Materiales de prueba: Saponinas de Sapindus saponaria L. purificadas en el laboratorio de
Anlisis Instrumental, suspensin de fracciones antignicas aisladas de P. falciparum
preparada en el laboratorio de Toxicologa, suero fisiolgico, reactivos para microscopia
ptica.
Material de vidrio de uso corriente en el Laboratorio.
Equipos: Columna de fraccionamiento de espuma, espectrofotmetro UV/Vis HP 8452A,
Microscopio ptico binocular, balanza analtica.
Mtodos y tcnicas
Diseo experimental:
A los grupos de Rattus rattus var albinus testigo y experimentales, se les administr va
intramuscular 0,75 mL suero fisiolgico (grupo T), suspensin de fracciones antignicas
(grupo A), saponinas (grupo B) y saponinas - suspensin de fracciones antignicas
respectivamente (grupo C). Se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de dos
especmenes de cada grupo, seleccionados al azar, a las 48 y 192 horas. Se realizaron los
anlisis hematolgicos y estadsticos correspondientes.
Mtodos y tcnicas:
Extraccin de saponinas por maceracin.
Cada vez se seleccionar una muestra 25 frutos secos de Sapindus saponaria L. Se cort la
cscara por el dimetro peciolar, se registr el peso de cscaras en balanza sensible al 0,01 g.
5
Se macerar las cscaras en 250 mL de agua por 24 horas. Se filtrar el extracto a travs de
torunda de algodn. El filtrado acuoso se depositar en el baln del Equipo de
fraccionamiento de espuma con 70 cm de columna, a velocidad mnima. Se realiz el
fraccionamiento de espuma hasta completar 100 mL de escurrido, el que fue sometido a
ebullicin por 5 minutos. En fiola de 25 mL se separaron alcuotas de 0,25; 0,5 y 1,0 mL para
medir la absorbancia del escurrido de de espuma y se determin la concentracin de las
saponinas mediante la ecuacin de la curva de calibracin respectiva.
Ensayo inflamatorio14
Un estudio comparativo en ratas se llev a cabo para investigar las reacciones locales y los
cambios hematolgicos despus de la inyeccin de una dosis intramuscular de
sapindussaponina (19,59 mg), y de vacuna de P. falciparum sapindussaponina (19,59 mg
0,25 mL suspensin). Los efectos fueron comparados con los causados por suero fisiolgico y
por la vacuna de P. falciparum (0,25 mL suspensin). Grupos de cinco ratas machos fueron
inyectados en el msculo gastrocnemio con 0.25 mL de la solucin de prueba: a 0 das en el
izquierdo. A las 48 y 192 horas se tomaron muestras de sangre perifrica (cola) de dos
individuos de cada grupo seleccionados al azar. Se prepararon frotices y se realiz el conteo
de glbulos blancos con microscopio ptico con lente de inmersin.
Anlisis estadstico
Los resultados porcentuales fueron sometidos al anlisis de varianza ANOVA15 de un factor
con las pruebas post hoc DMS y t de Dunnett para determinar si existe o no diferencia
significativa entre las respuestas de los grupos experimentales y testigo, mediante el
software16 SPSS v 10.
III. RESULTADOS
Los resultados se presentan en los siguientes cuadros y grficos.
CUADRO 1. FORMULA LEUCOCITARIA EN Rattus rattus var albinus
PORCENTAJE DE CLULAS
Grupo
Horas
Testigo
A
48
B
C
A
B
192
Neutrfilos
16
18
17
17
45
44
23
42
17
17
37
37
32
32
Eosinfilos
5
5
8
8
8
8
4
1
8
8
3
3
0
0
Basfilos
40
23
25
25
10
10
28
30
25
25
18
18
21
21
neu
eos
bas
lin
mon
mac
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de cuadrados
gl
Media cuadrtica
Sig.
1504,714
183,000
1687,714
124,429
4,500
128,929
627,857
146,500
774,357
1114,429
793,000
1907,429
274,429
25,000
299,429
265,714
100,000
365,714
6
7
13
6
7
13
6
7
13
6
7
13
6
7
13
6
7
13
250,786
26,143
9,593
,004
20,738
,643
32,259
,000
104,643
20,929
5,000
,027
185,738
113,286
1,640
,266
45,738
3,571
12,807
,002
44,286
14,286
3,100
,082
Variable
dependiente
(I)
Muestra
(J)
Muestra
neu
Testigo
eos
Testigo
bas
Testigo
lin
Testigo
mon
Testigo
mac
Testigo
A48h
B48h
C48h
A192h
B192h
C192h
A48h
B48h
C48h
A192h
B192h
C192h
A48h
B48h
C48h
A192h
B192h
C192h
A48h
B48h
C48h
A192h
B192h
C192h
A48h
B48h
C48h
A192h
B192h
C192h
A48h
B48h
C48h
A192h
B192h
C192h
Diferencia de
medias (I-J)
,000
-27,500(*)
-15,500(*)
,000
-20,000(*)
-15,000(*)
-3,000(*)
-3,000(*)
2,500(*)
-3,000(*)
2,000(*)
5,000(*)
6,500
21,500(*)
2,500
6,500
13,500(*)
10,500
-6,000
21,500
5,500
-6,000
9,000
7,000
-4,500(*)
-7,500(*)
-2,000
-4,500(*)
-8,500(*)
-14,500(*)
7,000
-5,000
7,000
7,000
4,000
7,000
Error
tpico
5,113
5,113
5,113
5,113
5,113
5,113
,802
,802
,802
,802
,802
,802
4,575
4,575
4,575
4,575
4,575
4,575
10,644
10,644
10,644
10,644
10,644
10,644
1,890
1,890
1,890
1,890
1,890
1,890
3,780
3,780
3,780
3,780
3,780
3,780
Sig.
1,000
,001
,019
1,000
,006
,022
,007
,007
,017
,007
,041
,000
,198
,002
,602
,198
,021
,055
,591
,083
,621
,591
,426
,532
,049
,005
,325
,049
,003
,000
,106
,227
,106
,106
,325
,106
Intervalo de confianza
al 95%
Lmite
Lmite
inferior
superior
-12,09
12,09
-39,59
-15,41
-27,59
-3,41
-12,09
12,09
-32,09
-7,91
-27,09
-2,91
-4,90
-1,10
-4,90
-1,10
,60
4,40
-4,90
-1,10
,10
3,90
3,10
6,90
-4,32
17,32
10,68
32,32
-8,32
13,32
-4,32
17,32
2,68
24,32
-,32
21,32
-31,17
19,17
-3,67
46,67
-19,67
30,67
-31,17
19,17
-16,17
34,17
-18,17
32,17
-8,97
-,03
-11,97
-3,03
-6,47
2,47
-8,97
-,03
-12,97
-4,03
-18,97
-10,03
-1,94
15,94
-13,94
3,94
-1,94
15,94
-1,94
15,94
-4,94
12,94
-1,94
15,94
Variable
dependiente
neu
(I)
Muestra
(J)
Muestra
Diferencia de
medias (I-J)
Error
tpico
Sig.
Intervalo de confianza
al 95%
Lmite
Lmite
inferior
superior
-17,03
17,03
10,47
44,53
-1,53
32,53
-17,03
17,03
2,97
37,03
-2,03
32,03
,33
5,67
,33
5,67
-5,17
,17
,33
5,67
-4,67
,67
-7,67
-2,33
-21,74
8,74
-36,74
-6,26
-17,74
12,74
-21,74
8,74
-28,74
1,74
-25,74
4,74
-29,45
41,45
-56,95
13,95
-40,95
29,95
-29,45
41,45
-44,45
26,45
-42,45
28,45
-1,79
10,79
1,21
13,79
-4,29
8,29
-1,79
10,79
2,21
14,79
8,21
20,79
-19,59
5,59
-7,59
17,59
-19,59
5,59
-19,59
5,59
-16,59
8,59
-19,59
5,59
A48h
Testigo
,000
5,113 1,000
B48h
Testigo
27,500(*)
5,113
,004
C48h
Testigo
15,500
5,113
,074
A192h
Testigo
,000
5,113 1,000
B192h
Testigo
20,000(*)
5,113
,024
C192h
Testigo
15,000
5,113
,084
eos
A48h
Testigo
3,000(*)
,802
,030
B48h
Testigo
3,000(*)
,802
,030
C48h
Testigo
-2,500
,802
,066
A192h
Testigo
3,000(*)
,802
,030
B192h
Testigo
-2,000
,802
,151
C192h
Testigo
-5,000(*)
,802
,002
bas
A48h
Testigo
-6,500
4,575
,566
B48h
Testigo
-21,500(*)
4,575
,009
C48h
Testigo
-2,500
4,575
,981
A192h
Testigo
-6,500
4,575
,566
B192h
Testigo
-13,500
4,575
,082
C192h
Testigo
-10,500
4,575
,197
lin
A48h
Testigo
6,000
10,644
,979
B48h
Testigo
-21,500
10,644
,281
C48h
Testigo
-5,500
10,644
,986
A192h
Testigo
6,000
10,644
,979
B192h
Testigo
-9,000
10,644
,892
C192h
Testigo
-7,000
10,644
,958
mon
A48h
Testigo
4,500
1,890
,176
B48h
Testigo
7,500(*)
1,890
,022
C48h
Testigo
2,000
1,890
,782
A192h
Testigo
4,500
1,890
,176
B192h
Testigo
8,500(*)
1,890
,012
C192h
Testigo
14,500(*)
1,890
,001
mac
A48h
Testigo
-7,000
3,780
,347
B48h
Testigo
5,000
3,780
,624
C48h
Testigo
-7,000
3,780
,347
A192h
Testigo
-7,000
3,780
,347
B192h
Testigo
-4,000
3,780
,782
C192h
Testigo
-7,000
3,780
,347
* La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05.
a Las pruebas t de Dunnett tratan un grupo como control y lo comparan con todos los dems grupos.
Linfocitos
36
42
42
14,5
27
30,5
29
Monocitos
3,5
8
8
11
12
5,5
18
Macrfagos
7
0
0
12
3
0
0
10
IV. DISCUSIN
11
Para basfilos se registra una disminucin en todos los casos; pero la variacin es
significativa slo en el caso del grupo que recibi saponinas.
Los basfilos conforman solamente un pequeo porcentaje del nmero total de clulas
blancas, pero son una parte importante de la respuesta inmunitaria del cuerpo, pues liberan
histamina y otras sustancias qumicas que actan sobre los vasos sanguneos cuando la
respuesta inmunitaria es activada19.
El porcentaje de linfocitos se incrementa ligeramente en el grupo que recibi slo antgeno y
se mantiene a las 192 horas. Hay disminucin en los otros casos; pero las variaciones no son
significativas.
El porcentaje de monocitos sufre un incremento en todos los casos, slo a las 48 horas la
variacin no es significativa para el grupo que recibi la combinacin saponinas antgenos
de P. falciparum; pero a las 192 horas el porcentaje celular se incrementa al 500%.
Los monocitos colaboran con otros glbulos blancos en la eliminacin de tejidos muertos o
daados, en la destruccin de clulas cancerosas y en la regulacin de la inmunidad contra las
sustancias extraas. Al igual que otros glbulos blancos, los monocitos se originan en la
mdula sea y luego entran en el flujo sanguneo. En unas horas, emigran a los tejidos donde
se convierten en macrfagos, y constituyen las clulas defensivas (fagocitos) del sistema
inmunitario.
Los macrfagos se esparcen en el organismo pero se acumulan en altas concentraciones en
pulmones, hgado, bazo, mdula sea y membranas que cubren las cavidades ms
importantes, donde sobreviven durante muchos meses.
Ciertos tipos de infecciones (la tuberculosis, entre otras), el cncer y los trastornos del sistema
inmune aumentan la cantidad de monocitos. En enfermedades hereditarias como la de
Gaucher y de Niemann-Pick, los desechos celulares se acumulan en los macrfagos, causando
una alteracin de su funcin.
12
Para macrfagos solo el grupo que recibi saponinas tuvo un incremento a las 48 horas que
disminuy a las 192 horas; en los otros casos no fueron encontrados en el conteo.
13
V. CONCLUSIONES
14
1.
2.
3.
4.
5.
Almenara, O. Fsico-Qumca. Ed. Empresa Editorial Humbolt, S.A. Lima: 1984. 192194.
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7.
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11.
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16