ESTUDIO DE ANTAGONISMO SOBRE PENICILLIUM SP.

Ariadna Caro Garca1

Mnica Varela Gallego2
RESUMEN
Muchos microrganismo generan toxinas que inhiben o detienen la respuestas
biolgicas de un receptor, en la prctica de laboratorio se determin el
antagonismo que produce el Bacillus sp hacia el moho Penicillium sp
disminuyendo o deteniendo totalmente su crecimiento; esto se realiz
sembrando la bacteria y el moho en dos agares diferentes los cuales fuero el
Nutritivo y Ogy este ltimo es selectivo para mohos y levaduras, en el primer
agar se sembr el bacilo mediante la tcnica de rejilla por todo el medio y
posterior mente se inocularon en tres partes del medio el Penicillium sp para
luego ser incubados a 37 por 24 horas, en el segundo se sembr en el centro
por agotamiento el bacilo y en la parte externa de la caja el Penicilum sp este
se dej a temperatura ambiente. En el agar nutritivo se encontr que el moho
no creci mientras que en el agar OGY el moho se expandi hasta la mitad sin
ocupar totalmente el espacio donde se encontraba el bacilo.
Palabras claves: Antagonismo, Bacillus sp, Penicillium sp.

ABSTRACT
Many microorganism produce toxins that inhibit or stop the biological responses
of the recipients of the UN, in the Lab antagonism They produce the Bacillus sp
Towards the mold Penicillium sp totally do slowing or stopping growth was
determined; This was done planting the bacteria and mold in two different agars
which the Nutritive and OGY agar this is selective molds and yeasts in the
primer bacillus seeded agar grid technique Through All for the middle and
posterior mind is I inoculated in three contradictory environmental Penicillium sp
then To be incubated at 37 for 24 hours in , the second was planted in the
center of exhaustion bacillus and the outside of the box the Penicilum sp esta
itself left a room temperature . In the nutrient agar it was found that the mold
without grew as the OGY agar mold to spread the sin Half fill the space where
the bacillus totally was.
Keywords : Antagonism , Bacillus sp , Penicillium sp.

1 Estudiante Ingeniera ambiental. Ncleo temtico biotecnologa ambiental.

Universidad de Cundinamarca, Extensin Facatativ. Cdigo: 463212107
2 Estudiante Ingeniera ambiental. Ncleo temtico biotecnologa ambiental.
Universidad de Cundinamarca, Extensin Facatativ. Cdigo: 463212139

INTRODUCCIN
En la actualidad el control de plagas
en cultivos ha sido una estrategia
para
disminuir
las
prdidas
econmicas por cosechas en mal
estado; a pesar de la eficacia de las
medidas preventivas de limpieza y
desinfeccin
de
equipos
e
instalaciones en la reduccin de la
poblacin patgena, es la propia
fruta la que generalmente llega
contaminada del campo3, por lo que
se
hace
necesario
realizar
tratamientos dirigidos a controlar de
forma activa las podredumbres
mediante productos qumicos, los
cuales
producen
efectos
secundarios al medio ambiente
como perdida de la fertilidad del
suelo ente otras4, es por esto se
hace necesario encontrar nuevas
alternativas biotecnologcas que
permitan su control de las plagas de
tal manera que el impacto sea
mnimo.
Un mtodo para esto es el biolgico
mediante el uso de organismos
antagonistas utilizados para control
de enfermedades los cuales son
generalmente saprfitos, debido a
su facilidad de adaptacin al medio
y a su alta capacidad de
competencia por nutrientes frente a

otros organismos, a su versatilidad y

fcil manipulacin5.
Uno de los productos ms afectados
por plagas son la manzana y la
naranja por el crecimiento del
Penicillium expansum que es capaz
de desarrollarse por debajo de 0 C,
produciendo prdidas de hasta un
80% en poscosecha, por la
podredumbre azul que produce
debido a la micotoxina Patulina que
puede tener una alta toxicidad y
crnica que puede producir cncer o
mutaciones6. Una de las alternativas
para su control es mediante el uso
de Bacillus sp por su produccin de
antibiticos (iturina, surfactina y
fengycin)7.
El objetivo del presente trabajo fue
identificar esta accin antagonica
entre el Bacillus sp hacia el
Penicillium sp (debido a que por
falta de recursos no se puedo
identificar el gnero del moho) y as
poder
determinar
diferentes
mtodos biotecnolgicos para el
control de plagas, presentes en los
cultivos.
5 Hoyos Carvajal V. Antagonismo in
vitro de Trichoderma spp. sobre
aislamientos de Sclerotinia spp. y
Rhizoctonia spp.

3 Escartin E., Castillo Tovar J.,

Martinez Paniche F., Sanches Ventura
S. Antagonism of native yeasts
against blue mould (penicillium
expansum link) in apple fruits.

6 Avalos Rivera S., Alvar R., Modos de

4 El sol de Puebla,Impacto
Negativo provoca el uso de
agroqumicos en el suelo, 30 de
julio del 2013.

7 Zikovic S., Gavrilovick V., Control of

accin de cuatro cepas de levaduras

antagnicas contra Penicillium
expansum Link en manzana.

penicillium expansum by combining

bacillus subtilis and sodium
bicarbonate.

METODOLOGA

Obtencin de Penicillium sp.

La cepa del hongo Penicillium sp.
se selecciona por su virulencia
sobre manzanas y la posibilidad de
su obtencin.
Se colectan en plazas de mercado
manzana sanas, y con sntomas
leves de presencia del Penicillium
sp. que estn localizadas dentro de
los manchones caractersticos de la
enfermedad.
Aislamiento microbiolgico
Obtencin de la cepa
Penicillium sp.

identificacin

Aislamiento de C. Laurentii (como

levadura antagonista presente en
la manzana)
5 muestras de manzana.
Procesamiento de las Muestras

de

Si se observa crecimiento
del Penicillium sp. se toma la
muestra de la parte afectada
en la fruta.
Se siembra la muestra en
cajas de agar OGY.
Se incuba por 7 das a 25C.
Se realiza una observacin
macroscpica
y
microscpica
para
la
seleccin del morfotipo.
La cepa se mantiene en agar
OGY.

Seleccin e
antagonistas

realizan pruebas con Bacillus

sp. en medio de cultivo agar
nutritivo.

de

Se aslan las cepas de

levaduras
de
inters
antagnico,
mediante
cultivos sobre PDA para
seleccionar los antagonistas
con habilidad de inhibir in
vitro el crecimiento micelial
de Penicillium sp.

Adems de las levaduras

presentes en la manzana, se

Las muestras de manzana se

cortan usando instrumentos
estriles y colocndolas en
placas de Petri igualmente
estriles.
Posteriormente sembrar los
trozos de manzana en medio
de cultivo PDA, que permite
la visualizacin de las
colonias
de
levaduras
sospechosas
de
Cryptococcus Laurentii por el
pigmento marrn que ellas
toman.
Las placas sembradas se
dejan
a
temperatura
ambiente.
Las colonias levaduriformes
que tomen el pigmento
marrn son repicadas a un
nuevo medio PDA.
Se procede a realizar la
identificacin
de
las
levaduras
con
pruebas
bioqumicas ya que C.
Laurentii no es fermentadora
de azucares y es ureasa
positivo.

Evaluacin de los antagonistas

Se coloca en dos extremos

de una caja Petri con PDA al
antagonista
a
evaluar,
haciendo un rayado con un
asa bacteriolgica y el hongo
fitopatgeno Penicillium sp.
con crecimiento activo de
micelio, en el centro.
Se incuban los ensayos a
temperatura ambiente.
Lectura
del
crecimiento
fngico al segundo y sexto
da.8
Lectura de resultados

menor de 10% y crecimiento

normal de la colonia fngica,
de forma similar al testigo.
Baja: ausencia de zona de
inhibicin o con un porcentaje
entre
1039%
y
con
disminucin en el crecimiento
de la colonia fngica.
Media: ausencia de zona de
inhibicin o un porcentaje
entre de 4069% y con
disminucin en el crecimiento
de la colonia fngica
Positivo: presencia de zona
de inhibicin definida o en un
porcentaje entre 70100%
respecto al testigo.9

La tasa de crecimiento micelial del

patgeno se da en cm/da, se
determina teniendo en cuenta el
radio de crecimiento micelial de la
colonia fngica calculando su
magnitud mediante la expresin
sugerida por Mead en 1993.
T.C= (Cf - Ci) / (Tf Ti)
Dnde:
Cf: es el crecimiento final expresado
en cm.
Ci: es el crecimiento inicial
expresado en cm.
Tf: es el tiempo final (das).
Ti: es el tiempo inicial (das).
El comportamiento de inhibicin se
puede agrupar de la siguiente
manera:

Negativo: ausencia de zona

de inhibicin o un porcentaje

8 Snchez S. ANTAGONISM OF NATIVE

YEASTS AGAINST BLUE MOULD
(Penicillium expansum Link) IN APPLE
FRUITS. Revista Fitotecnia Mexicana.
2008.

9 Hernndez A. Uso de
Microorganismos Antagonistas en el
Control de Enfermedades Postcosecha
en Frutos. Universidad de la Habana.
2007.

RESULTADOS

Se esperaba obtener el Penicillium sp. directamente de la manzana, sin

embargo se obtuvo una cepa pura en el laboratorio de la universidad, lo
que facilit el estudio.

Imagen 1. Frutas para obtener Penicillium sp.

Cepa pura de Penicillium sp. obtenida en el laboratorio. Crecimiento

normal 2,5 cm.

Imagen 2. Crecimiento normal de Penicillium sp. (Testigo para el

estudio de antagonismo)

En el aislamiento de C. Laurentii de la manzana no se obtuvieron

levaduras de ningn tipo, se present crecimiento de un moho verde, a
este se le realiz tincin con azul de lactofenol y se observ en el
microscopio objetivo 40X, donde no mostr ninguna estructura
especializada que permitiera asociarlo a un gnero.

Imagen 3. Resultados del aislamiento de levaduras de la manzana.

Se realiz la siembra de Bacillus sp. y Penicillium sp. de 3 maneras

diferentes:

Observaci
Siembra
Imagen
N
n

Agar nutritivo,
Siembra en rejilla
del Bacillus sp.
en la mitad de la
caja de Petri,
siembra de
fracciones de
Penicillium sp. en
la otra mitad.

Condiciones:
Incubacin 24
horas a 37C,
posteriormente se
dej a temperatura
ambiente.

Da 2:
Crecimiento
de Bacillus
sp. Sin
crecimiento
de
Penicillium
sp.

Da 6:
Crecimiento
de Bacillus
sp. Sin
crecimiento
de
Penicillium
sp.

Agar OGY,
Siembra del
Bacillus sp. en
una sola lnea en
el centro de la
caja de Petri,
siembra de
Penicillium sp. a
los extremos.

Condiciones: Se
dej a temperatura
ambiente.

Agar nutritivo,
Siembra en rejilla
de Bacillus sp. en
toda la caja de
Petri, siembra de
fracciones de

Da 2: Sin
crecimiento
de Bacillus
sp. sin
crecimiento
de
Penicillium
sp.

Da 6:
Crecimiento
de Bacillus
sp. con
crecimiento
normal de
Penicillium
sp.

Da 2:
Crecimiento
de Bacillus
sp. sin
crecimiento
de
Penicillium
sp.

Penicillium sp. en
los extremos de la
caja.

Condiciones:
Incubacin 24
horas a 37C,
posteriormente se
dej en la nevera.

Da 6:
Crecimiento
de Bacillus
sp. sin
crecimiento
de
Penicillium
sp.

Tabla 1. Resultados obtenidos en el laboratorio.

Medicin
(cm)
I
n
i
c
i
a
l
0
,
2
c
m
0
,
3

F
i
n
a
l

0
,
2
c
m

0
,
3
c
m

c
m

Tasa de crecimiento
micelial (cm/da)

TC=

2
c
m

c
m

0
,
3

(0,20,2)
=0
(62)

TC=

Positivo

Negativo

Positivo

TC=

(20,3)
=0,425
(62)

Comportamiento
de inhibicin (con
referencia al
testigo de
antagonismo)

(0,30,3)
=0
(62)

Tabla 2. Resultados de inhibicin segn T.C.

En las manzanas abundan

grmenes
diversos,
principalmente
hongos
unicelulares
y
bacterias,
entre los hongos pueden
distinguirse las levaduras y
los
mohos.
El
comportamiento de cada una
de ellos es muy variable en
funcin
de
diferentes
circunstancias:
Cantidad
de
oxgeno
disponible.
Temperatura.
Presin.
Iluminacin.
Las concentraciones entre
0,2 y 1,5% de azcar son
ideales para las bacterias
lcticas, sin embargo a las
levaduras
les
resulta
indiferente.
En
concentraciones de 15 y 20%
las
levaduras
presentan
tolerancia, siendo letal si se
llega a concentraciones del
35%. Las sustancias de
deshecho de metabolismo de
los
microorganismos,
es
decir,
el
alcohol,
son
perjudiciales
para
los
microorganismo,
hay
levaduras
oxidativas
y
levaduras salvajes como las
que estn presentes en la
piel de la manzana que
disminuyen
su
actividad
cuando la concentracin
alcohlica alcanza el 4%,
situacin que viene agravada

ANLISIS

con la
oxgeno.

insuficiencia

de

Sobre las frutas tambin

pueden
crecer
mohos,
levaduras y bacterias. Sin
embargo el pH de las frutas
es demasiado bajo, en
general, para que pueda
haber crecimiento bacteriano
y
elimina
estos
microorganismos
del
deterioro incipiente de frutas,
que es llevado a cabo por
hongos y levaduras10. Debido
a que en la prctica de
laboratorio no creci ninguna
levadura sobre la manzana
se piensa que el crecimiento
del moho en la superficie de
los trozos de la fruta que se
pusieron el medio de cultivo
(PDA)
no
permiti
el
crecimiento de otro tipo de
microorganismos debido a
que
ocuparon
toda
la
superficie de la misma, por lo
que el antagonismo solo se
pudo evaluar entre el Bacillus
sp. y Penicillium sp.

Se han descrito varios

mecanismos de accin de los
antagonistas para controlar el
desarrollo de patgenos.
Algunos
de
estos
son
antibiosis, competencia por

10 Garmendia J. Microorganismos
de a manzana. 2000.

espacio o por nutrientes,

interacciones directas con el
patgeno (micoparasitismo y
lisis enzimtica) e induccin
de resistencia.

En general, los antagonistas

no tienen un nico modo de
accin y la multiplicidad de
stos es una caracterstica
importante para su seleccin
como agentes de control
biolgico. Si el antagonista
posee varios modos de
accin reduce los riesgos de
desarrollo de resistencia en
el patgeno. Este tambin se
reduce mediante el uso de
combinaciones
de
antagonistas con diferente
modo de accin. 11
Entre los agentes de control
biolgico ms estudiados se
encuentran
los
microorganismos
pertenecientes a los gneros
Streptomyces,
Pseudomonas,
Agrobacterium, Trichoderma
y Bacillus. Estos ltimos
estn considerados como
excelentes candidatos para el
desarrollo de bioproductos
aplicables en el campo para

11 Layton C. Bacillus spp.;

perspectiva de su efecto
biocontrolador mediante antibiosis
en cultivos afectados por
fitopatgenos. Universidad Colegio
Mayor de Cundinamarca. 2011

el control de enfermedades
de origen fngico. 12

La accin biocontroladora de
Bacillus sp. est mediada
generalmente
por
la
produccin de metabolitos
antibiticos
capaces
de
actuar
sobre
microorganismos de origen
diverso. Los pptidos que
produce y que tienen esta
accin son variados y
representan un grupo de
metabolitos
activos
que
afectan
directamente
a
algunos fitopatgenos. Se ha
reportado que Bacillus sp.
produce gramicidina.13

Bacillus
sp.
para
las
muestras 1 y 3 present un
desempeo positivo en el
antagonismo
contra
Penicillium
sp.
probablemente
por
la
capacidad
de
secretar
lipopptidos antibiticos del
grupo Iturin cuyo mecanismo
de accin va dirigida sobre la
permeabilidad
de
la
membrana y la composicin

12 Rojas M. Aislamiento y
caracterizacin de cepas de Bacillus
asociadas al cultivo del arroz (Oryza
sativa L.). Universidad de la Habana.
2011

13 Layton C. Bacillus spp.;

perspectiva de su efecto
biocontrolador mediante antibiosis
en cultivos afectados por
fitopatgenos. Universidad Colegio
Mayor de Cundinamarca. 2011.

lipdica de la clula fngica,

de tal forma que inhibe el
crecimiento micelial y la
esporulacin del hongo, la
produccin
de
los
lipopptidos antibiticos y la
actividad de control biolgico
estn
directamente
relacionados
con
la
capacidad de Bacillus sp. de
formar biofilms. Sin embargo,
este microorganismo posee
otro tipo de caractersticas
que
probablemente
determinan
su
eficacia
relacionada con el amplio
espectro de accin y la
resistencia a la hidrlisis, de
igual
forma
presenta
resistencia
a
altas
temperaturas y a una amplia
gama de pH. 14

El Penicillium sp. no creci

cuando se incub a 37C, al
realizar esto las esporas del
patgeno
con
la
cepa
Bacillus sp., su germinacin
se detuvo un 100% por lo
que se obtuvo un alto
comportamiento inhibitorio, a
pesar de que pasadas las 24
horas de incubacin se
dejaran las cajas de Petri a
temperatura ambiente o en la
nevera, se piensa que esto
se
pudo
dar
por
la
temperatura
ptima
de

14 Corrales L. Evaluacin del

efecto biocontrolador de Bacillus
spp., frente a Fusarium spp., bajo
condiciones de invernadero en
Rosmarinus officinalis L.
Universidad Colegio Mayor de
Cundinamarca. 2011.

crecimiento del Penicillium

sp. que es de 22-30C. 15 ya
que en la muestra nmero 2
donde se le dieron estas
condiciones ambientales y
nutricionales (agar OGY) al
fitopatgeno el antagonismo
resulto ser negativo, con un
crecimiento micelial igual al
del testigo.En el caso donde
estuvieron
en
contacto
clula-clula con el patgeno
(muestra nmero 3), la
germinacin del Penicillium
sp. se inhibi en 100% con
relacin al testigo, ya que
esta muestra fue incubada a
37C, tambin se debe tener
en cuenta que se dej en la
nevera
y
las
bajas
temperaturas actan como
un agente bacteriosttico, y
se pudo inhibir el crecimiento
inmediato
de
los
dos
microorganismos, se puede
decir que; el mtodo de
accin del Bacillus sp y del
Penicillum
sp
es
de
competencia por nutrientes,
este tipo de competencia es
la ms comn dada por los
componentes
esenciales
para el desarrollo de las
funciones
microbianas
vitales;
reproduccin,
nutricin, respiracin y/o
metabolismo, de esta manera
se delimita la colonizacin de
otras especies.16 De este
15 Huerta F. Penicillium.
Universidad Veracruzana. 2009.
16 Layton C. Bacillus spp.;
perspectiva de su efecto
biocontrolador mediante antibiosis
en cultivos afectados por
fitopatgenos. Universidad Colegio
Mayor de Cundinamarca. 2011.

modo se explica porque al

darle primero las condiciones
ptimas en agar nutritivo al
Bacillus
sp.
cuya
temperatura de crecimiento
se ubica entre los 10 - 48C,
siendo su temperatura ptima
entre 28 - 37C, se presenta
una inhibicin total del
Penicillium sp. de este modo
el antagonista acapara los
nutrientes del medio de
cultivo y no permite que se
presente el crecimiento del
moho,
adems de
las
sustancias antibiticas que
produce
naturalmente
el
Bacillus y que terminan de
inhibir por completo su
crecimiento, del mismo modo
al dar las condiciones
favorables para el desarrollo
de los dos microorganismos
(temperatura ambiente) en el
agar OGY el Penicillium sp.
se hallar en su rango de
temperatura
ptimacon
requerimientos nutricionales
especficos para hongos
mientras que el Bacillus sp.
crecer pero no en las
condiciones ptimas lo que le
dar un rendimiento mucho
menor.

CONCLUSIONES
El conocimiento del modo de
accin
de
los
microorganismos
antagonistas
sobre
los
patgenos es fundamental

para la optimizacin de los

mtodos y el momento de su
aplicacin.
Es necesario tener en cuenta
las
condiciones
de
crecimiento
de
cada
microorganismo al evaluar un
caso de antagonismo, ya que
segn estas se pueden dar
variaciones en los resultados
obtenidos.
Bacillus sp. resulta ser un
antagonista muy efectivo
para el Penicillium sp. con
una inhibicin del 100% del
crecimiento
micelial,
nicamente cuando se le
brindan
las
condiciones
ptimas para su desarrollo,
pues acapara los nutrientes y
no permite el crecimiento del
moho.
Cuando
se
dan
las
condiciones ptimas para el
crecimiento del Penicillium
sp. por encima de las
condiciones del Bacillus sp.
este crece de igual manera
que el testigo puro, por lo que
se da un antagonismo
negativo.
El uso de Bacillus sp. como
antagonista del Penicillium
sp.
(causante
de
enfermedades pos-cultivo de
frutas) es solamente viable
en condiciones in vitro donde
se puedan controlar los
requerimientos del mismo.

BIBLIOGRAFA

Escartin E., Castillo Tovar J., Martinez Paniche F., Sanches Ventura S.
Antagonism of native yeasts against blue mould (penicillium expansum
link) in apple fruits.
El sol de Puebla,Impacto Negativo provoca el uso de agroqumicos en el
suelo, 30 de julio del 2013.
Hoyos Carvajal V. Antagonismo in vitro de Trichoderma spp. sobre
aislamientos de Sclerotinia spp. y Rhizoctonia spp.
Avalos Rivera S., Alvar R., Modos de accin de cuatro cepas de
levaduras antagnicas contra Penicillium expansum Link en manzana.
Zikovic S., Gavrilovick V., Control of penicillium expansum by combining
bacillus subtilis and sodium bicarbonate.
Snchez S. ANTAGONISM OF NATIVE YEASTS AGAINST BLUE
MOULD (Penicillium expansum Link) IN APPLE FRUITS. Revista
Fitotecnia Mexicana. 2008.
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Enfermedades Postcosecha en Frutos. Universidad de la Habana. 2007.
Garmendia J. Microorganismos de a manzana. 2000.
Layton C. Bacillus spp.; perspectiva de su efecto biocontrolador
mediante antibiosis en cultivos afectados por fitopatgenos. Universidad
Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011
Rojas M. Aislamiento y caracterizacin de cepas de Bacillus asociadas
al cultivo del arroz (Oryza sativa L.). Universidad de la Habana. 2011
Corrales L. Evaluacin del efecto biocontrolador de Bacillus spp., frente
a Fusarium spp., bajo condiciones de invernadero en Rosmarinus
officinalis L. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2011.
Huerta F. Penicillium. Universidad Veracruzana. 2009.