________________________________________________________________ __Captulo

III
Ensaios biolgicos

Introduo
Cncer: conceitos bsicos
Cncer o nome dado para um grupo de mais de uma centena de
doenas caracterizadas pela perda do mecanismo de controle que governa a
proliferao celular e a diferenciao, podendo ocorrer em diferentes clulas do
corpo. No caso de tumores slidos, a proliferao descontrolada das clulas
forma tumores locais que podem comprimir ou invadir tecidos vizinhos normais.
Uma pequena populao de clulas dentro do tumor pode ser descrita como
clulas-tronco. Elas mantm a sua habilidade de sofrer repetidos ciclos de
proliferao, como tambm migrar a distantes partes do corpo, colonizando
vrios rgos, em um processo conhecido como metstase (American Cancer
Society, 2009).
O processo pelo qual clulas normais transformam-se progressivamente
em clulas malignas requer a ocorrncia de mutaes sequenciais que surgem
como consequncia de um dano no DNA. Este pode ser resultado de um
processo endgeno, tal como erros na replicao do DNA, instabilidade qumica
intrnseca de certas bases de DNA ou ataques por radicais livres gerados
durante o metabolismo. Danos no DNA podem tambm surgir como resultado de
interaes com agentes exgenos, tal como radiao ionizante, radiao
ultravioleta, carcinognicos qumicos e biolgicos. As clulas normalmente
reparam estes danos, mas, por vrias razes, erros ocorrem e alteraes
permanentes no genoma so introduzidas. Algumas mutaes ocorrem em
genes responsveis pela manuteno da integridade do genoma, facilitando,
assim, a ocorrncia de mutaes adicionais (American Cancer Society, 2009).
Existem trs tratamentos disponveis para o cncer: cirurgia, radioterapia
e quimioterapia., embora existam tratamentos alternativos, como por exemplo,
o transplante de medula em mieloma mltiplos. Metade dos pacientes de cncer
no pode utilizar cirurgia nem radioterapia como alternativas de tratamento
devido s prprias caractersticas do tumor, como o tamanho, a localizao e a
resistncia radioterapia, restando apenas quimioterapia como opo de
tratamento. Entretanto, mesmo a quimioterapia apresenta dificuldades e a maior
delas a resistncia do cncer aos quimioterpicos utilizados atualmente
(American Cancer Society, 2009; ULLAH, 2008).

98

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Resistncia a mltiplas drogas (MDR)

A resistncia aos quimioterpicos o maior obstculo no sucesso de uma

terapia antineoplsica. Alguns tumores so intrinsecamente resistentes ao
tratamento, enquanto outros adquirem progressivamente resistncia mltipla a
uma grande variedade de frmacos estruturalmente e funcionalmente no
relacionados, tais como a antraciclinas, alcaloides da Vinca, epipodofilotoxinas,
taxanos e actinomicina D (ULLAH, 2008; TEODORI et al., 2006). Os problemas
relacionados a essa resistncia e o modo de super-los ou mesmo explor-los,
constituem uma rea de grande interesse dos oncologistas e profissionais de
reas afins (MOLNR et al., 2006).
Os oncologistas foram os primeiros a observarem que cnceres tratados
com vrias drogas antineoplsicas tendem a desenvolver uma resistncia
cruzada para agentes citotxicos, eliminando, com isso, a possibilidade de curar
esses tumores com quimioterapia. Esta observao sugere que a resistncia a
mltiplas drogas (MDR) , em muitos casos, resultante de mudanas hereditrias
nas clulas cancerosas, causando alteraes nos nveis de protenas especficas,
ou protenas mutantes, que permitem s clulas cancerosas sobreviverem na
presena de vrios agentes citotxicos diferentes.
As alteraes genticas que conferem resistncia aos agentes neoplsicos
podem afetar o ciclo celular, a susceptibilidade das clulas a apoptose, a
captao e efluxo de drogas, a armazenagem intracelular das drogas ou o reparo
de danos induzidos pelas drogas (normalmente no DNA).
O mecanismo melhor estudado de MDR envolve a superexpresso de uma
bomba de efluxo de muitas drogas dependente de energia, conhecida como
transportador

de

muitas

drogas

ou

P-glicoprotena

(P-gp),

atualmente

denominada ABCB1. Esta protena pertence super famlia de transportadores

ABC (ATP Binding Cassete) que contm uma sequencia altamente conservada,
que ligadora de ATP. A P-gp (figura 29) uma protena da membrana
plasmtica de 170 180 kDa e codificada pelo gene MDR1 (ULLAH, 2008).
Atualmente, sabe-se que outras protenas de membrana participam deste
mecanismo de resistncia, tais como a MRP (Multidrug Resistance-Associated
Protein) e a BCRP (Breaster Cancer Resistance Protein).

99

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Figura 29: Desenho esquemtico da P-gp (SORRENTINO, 2002)

Produtos naturais como fonte de medicamentos

Os produtos naturais tm desempenhado um importante papel no

tratamento de enfermidades, desde os tempos mais remotos da histria da
humanidade. No incio do sculo XX, 80 % dos medicamentos eram de origem
natural (razes, folhas e cascas) ou eram inspirados em substncias presentes
nestas partes vegetais. Atualmente, os produtos naturais continuam sendo uma
importante

fonte

de

frmacos

prottipos,

responsvel

por

60%

dos

antitumorais e 75% antimicrobianos, por exemplo, (HARVEY, 2008). A tabela 14

abaixo mostra diferentes frmacos de origem natural que esto em diferentes
estgios de desenvolvimento.
Tabela14: Origem de frmacos baseados em produtos naturais em
diferentes estgios de desenvolvimento
Estgio de
Vegetal Bacteria
Fngic Animal Semidesenvolvimen
no
o
sinttico
to
Pr-clnico
46
12
7
7
27
Fase I
14
5
0
3
8
Fase II
41
4
0
10
11
Fase III
5
4
0
4
13
Pr-registro
2
0
0
0
2
Total
108
25
7
24
61

Total
99
30
66
26
4
225

(HARVEY, 2008)

Sendo assim, pode-se concluir que os produtos naturais continuam

ocupando um relevante papel na descoberta de novos agentes teraputicos.
Produtos naturais como fonte de agentes antitumorais

100

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

As plantas tm sido uma importante fonte de agentes antitumorais para

uso clnico. Dentre estes, se podem citar a vimblastina, vincristina, camptotecina
e derivados, topotecano, irotecano, etoposideo e paclitaxel (figura 30) (CRAGG
et a.l, 2005).
N
OH

O
O

N
H
O

NH

OH

N
R O

OH

OH

OH

VIMBLASTINA (R = CH3)
VINCRISTINA (R = CHO)

TAXOL

O
N

N
O
N

O
O

OH

HO

CAMPTOTECINA

IRINOTECANO

H
O
O

HO

N
O

OH

HO

O
O

N
O

HO

OH

ETOPOSDEO
Figuras 30 Antitumorais de origem natural

TOPOTECANO

Atualmente, mais de 30 novas substncias de origem natural esto

em diferentes fases de teste clnico no tratamento de diferentes cnceres. Como

101

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

exemplo, tem-se ixabepilona, romidepsina, ECO-4601 e curcumina (figura 31)

(GORDALIZA, 2007).

O
HN
O

S HN
S

NH
HN

OH

HN

OH

IXABEPILONA

ROMIDEPSINA

HO

OH
H
N

HO

N
O

HO

ECO-4601

OH

CURCUMINA

Figura 31- Novos antitumorais de origem natural

Desta forma, a busca de novos agentes antitumorais de origem natural

mostra-se vivel e encorajadora, sendo este outro objetivo da presente
dissertao.

Flavonoides como agentes antitumorais

102

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Os flavonoides tm um largo espectro de atividades biolgicas (Tabela

15). Um nmero significativo de flavonides tem apresentado ao antitumoral
em vrios modelos animais. Atualmente, existe um considervel interesse por
estas substncias, devido aos seus efeitos benficos nos diversos mecanismos
envolvidos na patognese do cncer. As propriedades antioxidantes foram s
primeiras caractersticas estudadas nos flavonoides, em particular aquelas
relacionadas aos efeitos protetores contra doenas cardiovasculares (CAZAROLLI
et al., 2008).
Estas substncias tm mostrado uma notvel eficincia na eliminao de
radicais livres, que so agentes causadores de danos no DNA, os quais podem
acarretar a promoo de tumores. Vrios flavonoides (quercetina e apigenina,
por exemplo) revelaram possuir ao antiinflamatria, atuando na inibio da
ciclooxigenase 2 (COX-2) e induzindo a xido ntrico sintase. A inflamao
crnica desenvolve um importante papel na etiologia de diversos cnceres e
inibidores

de

COX-2

esto

sendo

estudados

como

agentes

preventivos

(CAZAROLLI et al., 2008).

Outra caracterstica que tem sido demonstrada para vrios flavonoides
a sua capacidade de inibir o crescimento de diversas linhagens de cncer
humano. Em tumores estrgenos-dependentes, este efeito inibitrio tem sido
relacionado

propriedades

antiestrognicas

de

certos

flavonoides

(isoflavonoides e quercetina, por exemplo). Em outros modelos in vitro, os

flavonoides tm tambm demonstrado afetar a sinalizao celular e o ciclo
celular de progresso. Por exemplo, certos chs contendo flavonoides inibem o
sinal de transduo mediada pelo fator de crescimento epidermal e o fator de
crescimento plaquetrio, favorecendo, assim, a inibio da angiognese
(CAZAROLLI et al., 2008). Genistena e quercetina inibem a tirosina quinase,
envolvida na proliferao celular. Finalmente, foi demonstrado que apigenina,
luteolina e quercetina causam apoptose por um mecanismo dependente de p53. Em sntese, mltiplos mecanismos antineoplsicos tm sido relacionados aos
flavonoides (CAZAROLLI et al., 2008).
Outro caso promissor o flavopiridol (figura 4), uma flavona semisinttica anloga da rohitukina, uma substncia antitumoral oriunda de uma
espcie vegetal indiana. Flavopiridol inibe quinases dependentes de ciclina
(CDKs), apresentando propriedade antitumoral indita. o primeiro inibidor de
CDKs a ser avaliado em testes clnicos em humanos pela Aventis Pharma e pelo
Instituto Nacional do Cncer (NCI) no tratamento de cncer. Testes iniciais com
infuso de flavopiridol mostraram um efeito benfico deste derivado em alguns

103

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

pacientes com linfoma non-Hodgkins, cncer de rins, de prstata, de clon e

gstrico (REN et al, 2003).
CH3
N

OH
HO

Cl

OH

Figura 32 Estrutura do flavopiridol

Tabela 15: Flavonoides com atividade antitumoral em diferentes linhagens

celulares de cncer
Cncer

Clula

Cancer oral
humano

HSC-2, HSG, SCC25

Cancer de
mama humano
Cancer de
tireide humano
Cancer de
fgado humano
Cancer de
prstata
humano
Cancer de colo
humano
Leucemia
humano

MCF-7
ARO, NPA, WRO
SK-LU1, SW900,
H441, H661, haGoK-1, A549
LNCaP, PC3,
DU145
Caco-2, HT-29, IEC6, HCT-15
HL-60, K562,
Jurkat

Flavonoide
Flavavonas, isoflavanas, EGC,
chalconas, EGCG, curcumina,
genistena, ECG, quercetina, cisplatina
Flavavonas, daidzena,
genistena, quercetina, luteolina
Genistena, apigenina, kaempferol,
crisina, luteolina, biochanina A
Flavona, quercetina
Catequina, epicatequina, quercetina,
kaempferol, luteolina, genistena,
apigenina, miricetina, silimarina
Flavona, quercetina, genistena,
antocianina
Apigenina, quercetina, miricetina,
chalconas

(REN et al. 2006)

Parte Experimental I

104

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

O presente estudo foi realizado sob a orientao da Profa. Dr a. Mrcia A.

M. Capella no laboratrio de Fisiologia Renal (Instituto de Biofsica Carlos Chagas
Filho).

Clulas e condies de cultura

Clulas utilizadas
Neste estudo foram utilizadas as seguintes linhagens celulares:

Melan-A melancito murino, cedidas pelo Prof. Robson Queiroz

Monteiro, Instituto de Bioqumica Mdica da UFRJ.

B16F10: melanoma murino, cedidas pelo Prof. Robson Queiroz Monteiro.

K-562: leucemia humana, que no expressa o fentipo MDR, e sensvel

ao quimioterpico vincristina (VCR). Cedido pela Profa. Vivian Rumjanek,
Instituto de Bioqumica Mdica UFRJ

K-562 Lucena-1: leucemia humana, que possui o fentipo MDR,

resistente vincristina, Cedido pela Prof.a Vivian Rumjanek.

Reagentes e equipamentos

Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e soro fetal bovino foram
obtidos da Invitrogen do Brasil (So Paulo, Brasil).

Kit de dosagem de desidrogenase lctica (DHL) adquirido da Doles

(Goinia, Brasil).

Solues

105

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

O meio de cultura de clulas (DMEM, baixa glicose) foi preparado em

gua ultra pura (miliQ), sendo posteriormente filtrado atravs de membranas de
0,2 m. Soro fetal bovino foi adicionado em concentrao final de 10% na hora
do uso.
A soluo salina com tampo fosfato PBS (NaCl 137 mM; Na2PO4 8,1 mM;
KH2PO4 1,5 mM; KCl 2,7 mM) foi preparada em gua MiliQ e esterilizada em
autoclave.
Cultura de Clulas
Melan-A e B16 F10
As linhagens celulares Melan-A e B16F10 foram cultivadas em DMEM
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SBF) a 37C. Melan A era
adicionado 1 l de PMA (miristato-acetato de forbol) a 10-6 M, um agente
mitgeno
As passagens foram realizadas a cada dois ou trs dias ou assim que as
clulas atingissem a confluncia. Para os procedimentos de subcultivo, retiravase o meio de cultura, sendo as clulas lavadas duas vezes com 5 ml de PBS
estril para retirada de protenas e clulas mortas. Em seguida adicionava-se 1
ml de tripsina 0,5g/l (diluda em PBS). Posteriormente, as clulas eram ento
incubadas em estufa por cerca de 10 minutos, tempo suficiente para que as
clulas se soltassem da garrafa. O processo era ento interrompido com adio
de um volume equivalente de meio de cultura com soro. Aps dissociao
mecnica de quaisquer grumos de clulas remanescentes, aproximadamente 4/5
da suspenso de clulas era transferida para um tubo do tipo Falcon, enquanto o
restante era usado na manuteno da garrafa de cultura. As clulas eram,
ento, contadas em microscpio invertido, com o uso de uma cmara de
Neubauer para que a quantidade apropriada de clulas fosse destinada cultura
em placas, de acordo com o experimento planejado. As placas eram incubadas
na estufa de cultura.

K-562 e K-562Lucena-1

106

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

As linhagens celulares K-562 e K562-Lucena-1 cresceram em suspenso

em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino em
garrafas plsticas de 50 ml na estufa a 37C por trs dias. Sendo que a linhagem
K-562-Lucena-1 era mantida na presena de VCR 60 nM.
Para os procedimentos de subcultivo, retirava-se o meio de cultura com
as clulas, colocando-os em um tubo tipo Falcon e centrifugando em seguida
para retirada de protenas e clulas mortas. Aps a centrifugao, descartava-se
o meio e ressuspendia-se as clulas em 4 ml de meio com soro. Aps esse
procedimento, 3/4 desse volume era colocado em um tubo Falcon, enquanto o
restante era usado na manuteno da garrafa de cultura.

As clulas eram,

ento, contadas em microscpio invertido, conforme procedimento mencionado

para as linhagens B16F10 e Melan A.
Medida da Viabilidade Celular Dosagem de LDH (lactato
desidrogenase)

Para a avaliao da viabilidade celular, utilizou-se um ensaio que se

baseia na reduo de um sal de tetrazlio (fenanzina metossulfato)

conseqente formao de formazana no meio em suspenso. O teste de LDH

um marcador de membrana integra. A enzima desidrogenase lctica est
presente em todo o citoplasma celular, e quando a membrana danificada h
um contato com o meio externo. Este teste detecta a presena da LDH no meio
indiretamente devido reao de reduo do sal de tetrazlio (fenanzina
metossulfato) que depende do LDH para que a reao ocorra. Esta enzima pode
ser detectada pela ao cataltica e indireta de converso do sal de tetrazlio
em outro corante solvel em gua. Sendo assim, o LDH permite analisar o
numero total de clulas viveis, isto correlacionado com a proliferao das
mesmas.
Aps 24 horas de incubao com as fraes a serem testadas, uma
alquota de 50 l de sobrenadante de cada poo foi retirada e colocada em outro
poo de outra placa de 96 poos. Em seguida, adicionava-se um volume de 100
l em cada poo de uma soluo de alumen frrico e substrato (lactato) na
proporo de 1:16, deixando, logo aps, a placa na estufa a 37 C por trs
minutos. Posteriormente, adicionava-se aos poos um volume de 100 l de uma
soluo de fenanzina metosulfato (FMS) + NAD, na proporo de 1:20 em gua,
e a seguir, colocava-se a placa na estufa de 37C por nove minutos. Ao trmino

107

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

deste tempo, procedia-se com a leitura da densidade tica de cada poo em

leitor de ELISA (Benchmark, BioRad) no comprimento de onda de 510 nm.

Anlise estatstica
Excetuando os ensaios preliminares de citotoxicidade, os demais
experimentos foram analisados atravs do teste de anlise de varincia (oneway ANOVA), usando intervalo de confiana de 95% e 99%. A magnitude das
diferenas foi verificada com os ps-testes de Dunnet.
Ensaios de CitotoxicidadeENSAIOS DE CITOTOXICIDADE
Determinao da faixa de concentrao citotxica
Objetivo
Com o objetivo de determinar a faixa de concentrao em que as quatro
linhagens celulares apresentassem maior susceptibilidade s fraes de acetato
de etila, KT1 e KT2, procedeu-se com o presente experimento, descrito abaixo.
Procedimento Experimental IA
As clulas foram cultivadas em placas de 96 poos (200l/poo) em uma
concentrao de 2x104 cls/poo e incubadas a 37C. Aps 24 horas iniciaram-se
os experimentos.
As clulas foram tratadas inicialmente com as fraes acetato de etila,
KT1 e KT2 nas concentraes de 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml. As fraes KT1 e KT2,
como visto anteriormente, so oriundas da frao acetato de etila.

Os

experimentos foram realizados com um n = 2, no sendo, por isso, realizados

testes estatsticos.

Resultados

108

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Linhagens de melanoma e melancito: B16F10 e Melan A

Neste experimento, as linhagens celulares utilizadas apresentaram
relevante sensibilidade frente s trs fraes testadas na concentrao mais
elevada (0,1 mg/ml).
A frao de acetato de etila apresentou citotoxicidade praticamente
semelhante em ambas as linhagens (em torno de 40% de morte celular). Da
mesma forma, a frao KT1 apresentou citotoxicidade semelhante nas duas
linhagens (em torno de 45% de morte celular). Por ltimo, a frao KT2
apresentou citotoxicidade ligeiramente maior na linhagem B16F10 (em torno de
40% de morte), mostrando-se mais susceptvel que a Melan-A.

Melan-A
AcOEt
KT1
KT2

Figura 33: efeito das subfraes: acetato de etila, KT1 e KT2

sobre Melan-A. Clulas tratadas com as subfraes nas
concentraes: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida
por LDH, 24 horas depois. Mdia de dois experimentos em
triplicata.
B16F10

AcOEt
KT1
KT2

109

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Figura 34: efeito das subfraes: acetato de etila, KT1 e KT2

sobre B16F10. Clulas tratadas com as subfraes nas
concentraes: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida
por LDH, 24 horas depois. Mdia de dois experimentos em
triplicata.

Linhagens leucmicas: K-562 e Lucena

A anlise dos experimentos referentes s linhagens leucmicas K-562 e
Lucena permitiu averiguar que ambas apresentaram morte celular aparente
significativa na concentrao mais elevada (0,1 mg/ml) em todas as fraes
testadas.
A frao de acetato de etila foi mais txica para Lucena (em torno de
38% de morte celular). J a frao KT1 apresentou alta toxicidade para K-562
(em torno de 60% de morte celular). Por fim, a frao KT2 foi mais txica para K562 (em torno de 40% de morte celular).

AcOEt
KT1
KT2

K-562
Figura 35: efeito das subfraes: acetato de etila, KT1 e KT2
sobre Lucena. Clulas tratadas com as subfraes
AcOEt nas
concentraes: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi
KT1
medida por LDH, 24 horas depois. Mdia de dois experimentos
em triplicata.
KT2

110

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Figura 36: efeito das subfraes: acetato de etila, KT1 e KT2

sobre K-562. Clulas tratadas com as subfraes nas
concentraes: 0,001; 0,01 e 0,1 mg/ml A viabilidade foi medida
por LDH, 24 horas depois. Mdia de dois experimentos em e
triplicata.

Concluses parciais
Assim como nas linhagens estudadas anteriormente, os resultados
apresentados para estas linhagens favorecem a continuao dos ensaios, tendo
em vista a susceptibilidade das mesmas na concentrao de 0,1 mg/ml. Uma
nova faixa de concentrao mais ampla ser estabelecida, devendo est
compreendida entre 0,01 a 0,1 mg/ml. Por meio desta ser possvel obter uma
curva de dose-resposta para cada linhagem, obtendo-se com isso, um perfil de
responsividade

para

cada

frao

testada,

assim

como

um

perfil

de

susceptibilidade.
importante ressaltar que a inexistncia de um tratamento estatstico dos
dados obtidos nestes experimentos no invalida o perfil de susceptibilidade das
linhagens frente s fraes testadas. Todavia, no serve para comparar os perfis
de susceptibilidade entre si, tendo em vista que em alguns casos os valores
ficaram prximos e podem sofrer desvios.

Curva de dose-resposta Perfil de susceptibilidade

Objetivo
Com o objetivo de determinar a curva dose-resposta das fraes KT1,
KT2 e do flavonide KTA (corniculatusina 3-O--glucopiranosdeo), realizou-se o
experimento com as linhagens celulares utilizadas nas experimentaes

111

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

anteriores, em uma faixa de concentrao compreendida entre 0,01-0,1 mg/ml.

Outro objetivo do ensaio foi determinar o perfil de susceptibilidade das linhagens
e compar-las entre si, ou seja, Lucena versus K-562 e B16F10 versus Melan A.
Procedimento Experimental IB
Baseando-se nos resultados obtidos previamente, trabalhou-se com as
seguintes concentraes: 0,01; 0,025; 0,05; 0,075 e 0,1 mg/ml.
As clulas foram cultivadas em placas de 96 poos (200 l/poo) em uma
concentrao de 2x104 clulas/poo e incubadas a 37C na estufa. Aps 24
horas iniciaram-se os experimentos.
Estes experimentos foram realizados com um n representativo de 3 para
a Melan-A, K-562, Lucena e um n de 2 para a B16F10, devido a problemas de
ordem tcnica, devendo ser complementado posteriormente.

Sendo assim,

somente nos experimentos com a linhagem B16F10 no foram realizados os

testes estatsticos.
Resultados e Discusso
Os resultados obtidos a partir das diferentes fraes testadas sero
apresentados a seguir, seguido de suas respectivas discusses.discusses.

112

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Ensaios realizados com a frao KT1

Linhagens de melanoma e melancitos: B16F10 e Melan A
Resultados em Melan-A
Neste experimento constatou-se uma relao dose-resposta para a frao
KT1 na faixa de 0,01-0,1 mg/ml. Observaram-se crescentes taxas de morte
celular em concentraes crescentes. Na concentrao mais elevada (0,1mg/ml)
obteve-se uma taxa de morte de aproximadamente 40%. Esta linhagem de
melancitos murino, neste ensaio, atua como grupo controle de clulas sadias e
normais.
Melan A KT1

Figura 37 efeito da frao, KT1 sobre Melan A. Clulas

tratadas em diferentes concentraes. A viabilidade foi
medida por LDH, 24 horas depois. Mdia de trs
experimentos em triplicata. Barras representam o erro padro
da mdia. a representa um intervalo de confiana de 99%.

Resultados em melanoma

B16F10

Com a linhagem B16F10 (melanoma murino), observou-se para a frao

KT1 uma resposta semelhante observada no experimento com a Melan A. As
crescentes concentraes foram acompanhadas de crescentes taxas de morte
clula, sendo a maior observada em 0,1 mg/ml, em torno de 40%.

113

________________________________________________________________ __Captulo
III
B16F10 KT1

Ensaios biolgicos

Figura 38: efeito da frao, KT1 sobre B16F10. Clulas

tratadas em diferentes concentraes. A viabilidade foi
medida por LDH, 24 horas depois. Mdia de dois
experimentos em triplicata. Barras representam o erro
padro da mdia.

Linhagens Leucmicas: K-562 e Lucena

Resultados em linhagem leucmica K-562
Neste experimento, a K-562 respondeu s crescentes concentraes de
KT1, alcanando na concentrao de 0,1mg/ml uma taxa de morte de
aproximadamente 45%. Por meio deste ensaio averiguou-se a susceptibilidade
desta linhagem frente frao testada.
K-562 frao KT1

Figura 39: efeito de KT1 sobre K-562. Clulas tratadas em

diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH, 24
horas depois. Mdia de trs experimentos em triplicata. Barras
representam o erro padro da mdia. a representa um
intervalo
de confiana
de 99%.
b representa um intervalo de
Resultados
em linhagem
leucmica
Lucena
confiana de 95%.

114

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

O presente resultado confirma os resultados prvios obtidos com a

Lucena utilizando esta frao. Observa-se tambm neste ensaio um crescente
aumento da susceptibilidade celular em maiores concentraes de KT1,
chegando a um percentual de morte de aproximadamente 48% em 0,1 mg/ml.
Lucena frao KT1

Figura 40: efeito da subfrao, KT1 sobre Lucena. Clulas

tratadas em diferentes concentraes. A viabilidade foi medida
por LDH, 24 horas depois. Mdia de trs experimentos em
triplicata. Barras representam o erro padro da mdia. a
representa um intervalo de confiana de 99%. b representa um
intervalo de confiana de 95%.

Os bufadienolidos so esterides cardioativos, conhecidos desde os

tempos mais remotos. Podem ser oriundos de fontes animais, tais como sapos
do gnero dos Bufonidae, como em plantas. No reino vegetal foram encontrados
em

familas:

Crassulaceae,

Hyacinthaceae,

Iridaceae,

Melianthaceae,

Ranunculaceae e Santalaceae (KRENN e KOPP, 1997).

Na famla Crassulaceae esto presentes em diferentes espcies (STEYNE
et al., 2006). At o momento, existem alguns estudos sobre as atividades
antitumorais de bufadienolidos. Na espcie Kalanchoe hybrida foram descritos
os bufadienolidos acetato de 3-bersaldegenina, acetato de 3-daigredorinenina,
assim como as kalanhibrinas A, B e C. Todos estes apresentaram atividade
citotxica para as linhagens tumorais MCF-7, NCI-H460 e SF-268 (KUO et al.,
2008). Outros relatos mostram a ao citotxica de kalanchosidos A, B e C,
oriundos de Kalanchoe gracilis para as linhagens celulares: KB (carcinoma
humano epidermide), A-549 (cncer de pulmo), 1A9 (cncer de ovrio), PC-3
(cncer de prstata) (WU et al., 2006).
Em relao aos bufadienolidos presentes em K. tubiflora, existem relatos
na literatura de citotoxicidade da briofilina A, tambm denominada briotoxina C

115

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

(YAMAGISHI et al., 1988) frente s linhagens de clulas tumorais KB, A-549

(adenocarcinoma humano de pulmo), HCT-8 (carcinoma de clon humano), P388 (leucemia linfoctica de murinos) e L-1210 (leucemia de ratos) e com
briofilina B (YAMAGISHI et al., 1989) frente linhagem KB.
Os

resultados

apresentados

no

presente

trabalho

evidenciam

citotoxicidade da frao KT1 (rica em bufadienolidos) para todas as linhagens

testadas, inclusive em clulas sadias como Melan-A. At o presente momento
no existem relatos de estudos destes bufadienolidos com estas linhagens
celulares na literatura.
Estudos de estrutura-atividade demonstram a importncia do grupo ortoacetato na atividade antitumoral contra a linhagem leucmica P-388 e prope
que os bufadienolidos exercem sua ao modulando reguladores do ciclo celular,
tais como a protena cinase C (LIAL et al., 2009).
Por fim, frente ao exposto, os resultados obtidos so de grande
importncia, para o conhecimento desta espcie e na bioprospeco de agentes
antitumorais.
As evidncias de citotoxicidade destas substncias frente estas linhagens
celulares, encorajam a continuao dos estudos, visando o isolamento dos
bufadienolidos e avaliao do seus respectivos perfis de citotoxicidade.
Ensaios realizados com a frao KT2
Linhagens de melanoma e melancito: B16F10 e Melan-A
Resultados em melanoma B16F10
Neste ensaio pode-se observar uma gradual susceptibilidade da
KT2
linhagem frente a crescentesB16F10
concentraes
da frao KT2, chegando a uma

taxa de morte de aproximadamente 42 % na concentrao de 0,1mg/ml.

116

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Figura 41: efeito da frao, KT2 sobre B16F10. Clulas tratadas

em diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH,
24 horas depois. Mdia de dois experimentos em triplicata.
Barras representam o erro padro da mdia.

Resultados em linhagem Melan-A

Os resultados obtidos neste estudo apontam para uma resposta linear de
Melan A frente a crescentes concentraes de KT2. Esta frao apresenta um
perfil de toxicidade nesta linhagem, alcanando um percentual de morte de 40%
na concentrao mais elevada (0,1 mg/ml).
Melan A KT2

Figura 42: efeito da frao, KT2 sobre Lucena. Clulas tratadas em

diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH, 24 horas
Linhagens
leucmicas:
Lucena
depois.
Mdia deK-562
trs eexperimentos
em triplicata.
Barras
representam o erro padro da mdia. a representa um intervalo de
confiana de 99%. b representa um intervalo de confiana de 95%.

Resultados em linhagem leucmica K-562

117

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Neste ensaio pode-se observar uma responsividade linear em crescentes

concentraes de KT2. Na maior concentrao (0,1mg/ml), observou-se uma
taxa de morte de aproximadamente 35%.
K-562 KT2

Figura 43: efeito da frao, KT2 sobre K-562. Clulas tratadas em

diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH, 24
horas depois. Mdia de trs experimentos em triplicata. Barras
representam o erro padro da mdia. a representa um intervalo
de confiana de 99%. b representa um intervalo de confiana de
95%.

Resultados em linhagem leucmica Lucena

Neste ensaio pode-se observar uma responsividade a KT2 aparentemente
maior que a observada para K-562. Observou-se tambm um comportamento
linear frente a crescentes concentraes de KT2, alcanando uma taxa de morte
de aproximadamente 42% na concentrao mais alta (0,1mg/ml).

Lucena KT2

118

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Figura 44: efeito da frao KT2 sobre Lucena. Clulas tratadas

em diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH,
24 horas depois. Mdia de trs experimentos em triplicata.
Barras representam o erro padro da mdia. a representa um
intervalo de confiana de 99%. b representa um intervalo de
confiana de 95%.

Em todos os resultados obtidos com as quatro linhagens, observou-se

ao citotxica da frao KT2. No captulo II, a anlise de CLAE evidenciou a
presena de pelo menos 6 flavonides nesta frao. Acredita-se que a ao
citotxica observada pode est ocorrendo ou pela ao de um nico flavonoide
presente na mistura ou pela ao conjunta de dois ou mais flavonides
(sinergismo).
Nos ensaios com as linhagens B16F10 e Melan A, a ao citotxica foi
observada para ambas as linhagens. A Melan A foi utilizada como referencial de
clulas normais e sadias.

Aparentemente, os resultados obtidos no so

promissores, visto a toxicidade observada. Entretanto, como KT2 constituda

de uma mistura de flavonoides, tornam-se necessrios estudos posteriores com
os flavonides isolados, a fim de descobrir a ao de cada um ou daqueles que
so majoritrios. Desta forma, ainda so prematuros e inconclusivos os
resultados obtidos at aqui.
Na literatura so encontradas algumas citaes de efeitos citotxicos de
flavonoides para a linhagem B16F10, como por exemplo: tangeretina, rutina
(um derivado diglicosilado do flavonol quercetina), e diosmina (CONESA et al.,
2005), luteolina, baicaleina e quercetina (YEZ et al., 2004), entre outros. Para
Melan-A existem menos relatos. Dentre os existentes, cita-se a ao dos
flavonides
miricetina e baicaleina. O cido fenlico cido glico tambm revelou
atividade citosttica (MARTINEZ et al., 2006).
Os resultados obtidos com as linhagens leucmicas so promissores,
pois para ambas as linhagens foram observadas susceptibilidade a KT2.
Constatou-se ainda, uma maior susceptibilidade da linhagem resistente a
mltiplas drogas (Lucena) quando comparada linhagem no resistente (K-562).

119

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Os resultados atuais encorajam o estudo e isolamento de flavonoides desta

frao. Uma discusso mais aprofundada dos resultados com flavonides ser
feita mais adiante, ao final dos ensaios com o flavonoide KTA.

Ensaios realizados com o flavonoide KTA (Corniculatusina 3-O-glucopiranose)

Resultados e discusses
Linhagens leucmicas K-562 e Lucena
Resultados em linhagem K-562
Neste

ensaio

observou-se

efeito

citotxico

do

flavonoide

KTA

(corniculatusina 3-O--glucopiranosdeol) sobre a linhagem K-562. Verificou-se a

responsividade desta linhagem a concentraes crescentes de KTA, mostrandose susceptvel. Uma taxa de morte 37% observada na concentrao de 200
M.

K-562 Flavonide KTA

Figura 45: efeito de KTA sobre K-562. Clulas tratadas em

diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH, 24
horas depois. Mdia de trs experimentos em triplicata. Barras
representam o erro padro da mdia. b representa um
intervalo de confiana de 95%.

Resultados em linhagem Lucena

Neste ensaio pode-se observar linearidade na taxa de morte de Lucena ao
aumento da concentrao do flavonoide KTA, evidenciando a susceptibilidade
da mesma. Significativa taxa de morte celular (42%) foi observado na

120

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

concentrao de 200 M. Pode-se constatar tambm uma maior sensibilidade de

Lucena a KTA que K-562, igualmente observado para a frao KT2.

Lucena Flavonoide KTA

Figura 46: efeito de KTA sobre Lucena. Clulas tratadas em

diferentes concentraes. A viabilidade foi medida por LDH, 24
horas depois. Mdia de trs experimentos em triplicata. Barras
representam o erro padro da mdia. b representa um
intervalo de confiana de 95%.

Resultados e discusses
Sobre o gnero Kalanchoe existem alguns estudos realizados com enfoque
em bioprospeco de agentes imunomoduladores. Os flavonoides testados
apresentam em sua maioria ao inibitria sobre linfcitos, justificando a ao
imunossupressora observada em diferentes extratos de Kalanchoe (COSTA et al.,
2008).
Com relao s linhagens tumorais em estudo, existem alguns relatos na
literatura referente ao citotxica de diferentes flavonides. Sobre as
linhagens leucmicas existem alguns relatos da ao citotxica. Os flavonides
gossipina (BABU et al., 2003),

tilirosdeo (SOUZA et al., 2002), genistena

(CONSTANTINOU E HUBERMN, 1995). vitexicarpina (WANG et al., 2005),

apigenina, quercetina, miricetina, e chalconas

(REN at al., 2003) mostraram

citotoxicidade frente linhagem K-562.

Efeitos citotxicos de flavonoides frente linhagem K-562-Lucena-1 no
foram relatados at o presente momento na literatura, segundo o levantamento

121

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

bibliogrfico realizado nas bases de dados disponveis. Desta forma, o presente

trabalho o primeiro com este enfoque.
Os resultados com KTA apresentados mostram que a linhagem resistente
a muitas drogas (Lucena) foi mais susceptvel a linhagem K-562 - no possui
fentipo de resistncia - o que ressalta a importncia desses resultados, tendo
em vista que a maioria das celulares tumorais desenvolve ou j demonstra
resistncia a muitas drogas.
Fica evidente tambm que a citotoxicidade de KT2 (mistura de
flavonides) e a de KTA esto muito prximas. Tal fato permite sugerir que outros
flavonides presentes em KT2, alm de KTA, atuam sinergicamente em sua ao
citotxica.
Conforme foi dito no captulo I, este o primeiro relato do flavonide KTA
para o gnero Kalanchoe e, at o momento, nenhuma atividade biolgica foi
relatada na literatura. Em vista disso, os resultados apresentados so inditos e
promissores, justificando estudos posteriores.
Futuramente, o flavonide KTA ser testado nas linhagens Melan-A e
B16F10, visto que estas linhagens se mostraram susceptveis frao KT2, da
qual se isolou KTA. Adicionalmente, experimentos complementares devem ser
realizados, para averiguar a toxicidade de KTA em clulas sadias, como
leuccitos, por exemplo,
Concluso final
Os resultados apresentados confirmam a ao citotxica da subfrao
KT1 para as quatro linhagens estudadas, sendo o seu efeito justificado pela
presena de bufadienolidos - conhecidamente txicos (LEE, et al. 1989) discutida no captulo I. Futuramente, esta frao ser purificada, objetivando a
obteno de bufadienolidos puros para que possam ser testados nas linhagens
tumorais utilizadas neste estudo e em outras tambm.
Os ensaios realizados com KT2 evidenciaram a sua ao citotxica nas
quatro

linhagens

estudadas.

Sabendo-se

que

diferentes

constituintes

flavonodicos esto presentes nesta subfrao, acredita-se que a ao observada

seja resultado de um sinergismo dos flavonides presentes na mistura.
Os ensaios com o flavonide KTA (corniculatusina 3-O-glucopiranosdeo)l, oriundo de KT2, revelaram considervel citotoxicidade, o que
indica a sua participao na ao citotxica observada para KT2.

122

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

Estudos posteriores devem ser realizados com linfcito humanos para

averiguar a sua toxicidade em clulas sadias. Ensaios com as linhagens Melan-A
e B16F10 sero realizados baseando-se nos resultados promissores obtidos com
KT2.
Por fim, importante ressaltar a importncia dos resultados inditos
obtidos neste trabalho, os quais contribuem para uma melhor compreenso da
espcie Kalanchoe tubiflora, assim como para a bioprospeco de agentes
antitumorais.

Bibliografia
American Cancer Society, 2009.

123

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

http://www.cancer.org/docroot/CRI/content/CRI_2_4_1x_What_Is_Cancer.asp?
sitearea. (09/02/09).

BABU, B. H.; JAYRAM, H. N.; NAIR, M. G.; AJAKUMAR, K. B.; PADIKKALA, J. Free
radical scavenging, antitumor and anticarcinogenic activity of gossypin. J.
Exp. Clin. Cancer Res. V. 22. 581-9. 2003.
CONSTANTINOU, A.; HUBERMAN. E. Genistein as na inducer of tumor cell
differentiation: possible mechanism of action. Proc. Soc. Exp. Biol Med.
V.208, p. 109-115. 1995.
CONESA, M.; ORTEGA, C.; GASCON, Y.; BAOS, A.; JORDANA, C.; GARCIABENAVENTE, O.

Treatment of metastatic melanoma B16F10 by the

flavonoids tangeretin, rutin, and diosmin. J Agric Food Chem. v.53, p.

6791-7. 2005.
CAZAROLLI, L. H.; ZANATTA, L.; ALBERTON, E. H.; FIGUEIREDO, M. S. R. B.;
FOLADOR, P.; DAMAZIO, R. G.; PIZZOLATTI, M. G.; SILVA, F. R. M. B.
Flavonoids: Prospective Drug Candidates. Mini-Reviews in Medicinal
Chemistry ,V. 8, 2008.

CRAGG, G. M.; NEWMAN. D. J. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of

Ethnopharmacology, v. 100, p. 7279, 2005.

GORDALIZA, M. Natural products as leads to anticancer drugs. Clin Transl Oncol,

v. 9, p. 767-776, 2007.

HARVEY, A. L. Natural product in drug discovery. Drug Discovery today, v.13, p.

19/20, 2008.
LEE, K. H.; CHANG, J. J.; YAN, X. Z.; HARUMA, M.; YAMAGISHI, T.Bryophyllin B, A
novel potent cytotoxic bufadienolide from Bryophyllum pinnatum. Journal
of Natural Products, v. 52. p. 1071-1079, 1989.
LIAO, S-G.; CHEN, H-D,; YEU, J-M. Plant Orthoesters. Chemical Revies. v. 109, p.
1092-1140. 2009.

124

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

MCKENZIE, R. A.; FRANKIE, F. P.; DUNSTER, P. J. The toxicy to cattle and

bufadienolide content of six

Bryophyllum species. Australian Veterinary

Journal, v .64, p. 298-301, 1987.

MOLNAR, J.; GYMNT, N.; TANAKA, M.; HOHMANN, J.; BERGMANN-LEITNER, E.;
MOLNR, P.; DELI, J.; DIDIZIAPETRIS, R.; UMBELINO FERREIRA, M. J.
Inhibition of multidrug resistance of cancer cells by natural diterpenes,
triterpenes and carotenoids. Current Pharmaceutical Design, v. 12, p. 287311, 2006.

REN, W.; QIAO, Z.; WANG, H.; ZHU, L.; ZHANG, L. Flavonoids: Promising
Anticancer Agents. Medicinal Research Reviews, v. 23, p. 519-534, 2006.

SORRENTINO, B. P. Gene therapy to protect haematopoietic cells from cytotoxic

cancer drugs. Nature Reviews Cancer, v. 2, p. 431-441, 2002.
TEODORI, E.; DEI, S.; MARTELLI, C.; SCAPECCHI, S.; GUALTIERI, F. The functions
and structure of ABC transporters: implications for the design of new
inhibitors of Pgp and MRP1 to control multidrug resistance (MDR). Curr
Drug Targets, v. 7, p. 893-909, 2006.
ULLAH, M. F. Cancer Multidrug Resistance (MDR): A Major Impediment to
Effective Chemotherapy. Asian Pacific J Cancer Prev, v. 9: p. 1-6, 2008.
KREEN,

L.;

KOPP,

B.

Bufadienolides

from

animal

and

plant

sources.

Phytochemistry.
v. 48, p. 1-29. 1998.
KUO. P-C.; KUO, T-H.; SU, C-R.; LIOU, M-J.; WU, T-S. Cytotoxic principles and pyrone ring opening derivatives of bufadienolides from Kalanchoe hybrida.
Tetrahedron. v. 64, p. 3392-3396.
STEYN, P.; VAN HEERDEN, F. R. Bufadienolides of plant and animal origin. Natural
Product Reports, 1998.

125

________________________________________________________________ __Captulo
III
Ensaios biolgicos

WU, P-L.; HSU, Y-L.; WU, T-S.; BASTON, K. F.; LEE, KH. Organic Letters, v. 8, p.
5207-5210.
YAMAGISHI, T.; YAN, X-Z.; WU, R-Y, MCPHAIL, D.R.; MCPAHIL, A.T.; LEE K.H..
Structure and stereochemistry of bryophyllin-A, a novel potent cytotoxic
bufadienolide orthoacetate from Bryophyllum pinnatum. Chemical and
Pharmaceutical Bulletin, 36, 1615-1617. 1988.

YAMAGISHI, T.; HARUMA, M.; YAN, X-Z, CHANG J-J, LEE K-H.. Antitumor Agents,
110.

1,2

Bryophyllin B, a novel potent cytotoxic bufadienolide from

Bryophyllum pinnatum. Journal of Natural Products, v. 52, p.1071-1079.

1989.

YEZ, J.; VICENTE, V.; ALCARAZ, M.; CASTILLO, J.; BENAVENTE-GARCIA, O.;
CATEREAS, M.; TERUEL, J.A. Cytotoxicity and antiproliferative activities of
several

phenolic

compounds

against

three

melanocyre

cell

lines:

relationship between structure and activity. Nutr. Cancer. v . 49, p. 191-9.

2004

126