Conclusin: E-test parece ser un mtodo alternativo

Abstracto
Objetivo: dermatomicosis es una infeccin con

para MIC determinacin de los frmacos antimicticos

para las especies de dermatofitos, ya que es una
metodologa menos laborioso y los resultados se
podra obtener con mayor rapidez.

hongos relacionados con la piel: piel lampia, cabello

y / o uas. El tratamiento oral de infecciones fngicas
en dermatologa se ha convertido en una modalidad
preferida para la gestin de estas enfermadades muy
comunes. Aunque hay un nmero creciente de
antifngicos disponibles para el tratamiento de
dermatofitos, algunos casos y recadas no han
respondido al tratamiento. La determinacin de hongos
in vitro se ha informado de susceptibilidad antifngica
que es importante para la capacidad de erradicar
dermatofitos. E-test (AB Biodisk, Suecia) es rpido,
fcil de realizar in vitro la prueba de susceptibilidad
antifngica. El objetivo de este estudio fue investigar
la susceptibilidad de las diferentes especies de
dermatofitos cepas aisladas de muestras clnicas a
cinco agentes antifngicos utilizando el mtodo de Etest.

Materiales y Mtodos: Un total de 66 muestras se

obtuvieron de la uas, pies, regin inguinal, el tronco y
las manos. Estas cepas probadas puntos finales MIC de
E-test para la anfotericina B, fluconazol, itraconazol,
caspofungina, y ketoconazol se leyeron despus de 72
y 96 horas de incubacin para cada cepa en RPMI
1640 agar.

Resultados: Los dermatofitos ensayados incluyeron

Trichophyton rubrum 43 (65,1%), Trichophyton
mentagrophytes 7 (10,7%), Microsporum canis 5
(7,6%),
Trichophyton
tonsurans
5
(7,6%),
Epidermophyton floccosum 4 (6,0%) y Trichophyton
violaceum 2 (3,0%). El agente ms activo contra todas
las especies de dermatofitos fue caspofungina con una
concentracin inhibitoria mnima (CIM) oscilar (ug/
ml-1) (0,02-3, 0.032-4, 0,125-0,50, 0,032-2, 0,250,50, 0,125-0,50) y raconazole con un rango de MIC
(ug/ml-1 (0,038-1,5, 0,094-1,5, 1-32, 0,016-0,50,
0,25-0,50, 0,125-0,50). El agente menos activo fue el
fluconazol con un rango de MIC (ug/ml -1) (0,19-48, 2256, 2-8, 256, 256, 8-24).

Introduccin

Los dermatofitos son un grupo especializado de

hongos, cuyo efecto tejido queratinoso de los seres
humanos y otros vertebrados, causando infecciones
superficiales. Los organismos pertenecen a tres
gneros,
Trichophyton,
Epidermophyton,
y
Microsporum Las infecciones causadas por estos
hongos se encuentran entre las infecciones cutneas
ms prevalentes a nivel mundial y el reciente aumento
en el nmero de pacientes con estados
inmunocomprometidos, como el SIDA, la diabetes
mellitus, el cncer y el trasplante de rganos ha dado a
estas infecciones ms protagonismo [1-6].
El tratamiento de dermatofitosis se basa en el uso de
agentes antifngicos tpicos y sistmicos. En los
ltimos aos, un nmero de agentes antifngicos
segura y altamente eficaz se han introducido en la
prctica clnica. Aunque un nmero creciente de
antimicticos han convertido en disponibles para el
tratamiento de dermatofitosis, hay informes que
sugieren recalcitrante a la terapia o, posiblemente, la
resistencia de los dermatofitos a los agentes
antimicrobianos. Con el fin de predecir la capacidad de
un agente antimictico dado para erradicar
dermatofitos y ayudar a la gestin de pacientes, la
determinacin de la susceptibilidad antifngica in vitro
de los dermatofitos sera til en la comprensin de un
tratamiento fallido o exitoso. Sin embargo, no todas las
especies tienen el mismo patrn de sensibilidad y
puede ser necesario realizar en las pruebas de
sensibilidad in vitro para la seleccin y el seguimiento
de la terapia antifngica. Aunque un mtodo de
referencia todava no est disponible, diversas tcnicas
se han utilizado para probar los dermatofitos, incluidos
los mtodos de macro y micro de dilucin en caldo,
dilucin de agar y difusin en disco. Sin embargo,
estos mtodos toman mucho tiempo y mano de obra
intensiva, y no son prcticos para el laboratorio
clnico. Por lo tanto, se necesitan enfoques alternativos
simples [1, 3, 4, 6-8]. El E-test es un mtodo simple
agar base cuantitativa concentracin inhibitoria
mnima (CIM).
El reactivo consiste en una tira delgada, calibrado de
plstico con un gradiente predefinido, exponencial y
continuo de agente antifngico en 15 diluciones
dobles. El E-test ha sido utilizado satisfactoriamente
para probar bacterias, levaduras y mohos. Sin
embargo, hay pocos datos disponibles sobre el
rendimiento de la E-test para la susceptibilidad
antifngica de dermatofitos [4, 9-11]. El objetivo de

este estudio fue investigar la susceptibilidad de las

diferentes especies de dermatofitos cepas aisladas de
muestras clnicas a cinco agentes antifngicos
(anfotericina B, fluconazol, itraconazol, caspofungina,
y ketoconazol) utilizando el mtodo de E-test.

Materiales y METODOS
Cepas y muestras: Sesenta y seis cepas fueron aisladas
de piel infectada y las uas en la Microbiologa Clnica
y del Departamento de la Escuela de Medicina de la
Universidad de Ataturk Microbiologa. Los aislados
fueron recogidos durante un perodo de un ao en
Laboratorio de Micologa. Incluyeron T. rubrum, T.
mentagrophytes, M. canis, T. tonsurans, E. floccosum
y T. violaceum. Todas las cepas fueron identificados
por mtodos estndar, que incluyen la identificacin
basada en las caractersticas macroscpicas y
microscpicas de las cepas de cultivo. Las pruebas
adicionales incluyen aquellos para la capacidad de
producir un pigmento de color rojo cuando las cepas se
cultivaron en agar de dextrosa de papa (PDA) y para la
capacidad de producir ureasa, as como el ensayo de
perforacin de pelo Las cepas se almacenaron -70 0C
hasta que el tiempo de uso, y antes de la prueba fueron
sub cultivadas en PDA a 28 0C de 15 das para
asegurar caractersticas ptimas de crecimiento [1, 3,
6]. Todos los procedimientos en el protocolo
experimental fue aprobado por el Comit de tica de la
Facultad de Medicina.

Metodo E-Test
Medio: El ensayo se realiz en medio RPMI 1640
con L-glutamina, aunque sin bicarbonato (Gibco,
Nueva York, EE.UU.), pH 7,0 suplementado con 2%
de
glucosa,
tamponado
0,165
M
morfolinopropanosulfnico cidos (MOPS) (Fisher
Biotech, Nueva Jersey, EE.UU.) y 1,8% de agar
(Difco, Sparks, EE.UU.). Las placas de Petri de 15 cm
de dimetro contenan RPMI 1640 a una profundidad
de 4,0 mm.

Agentes antifngicos:

tiras de E-test se
obtuvieron de AB Biodisk (Solna, Suecia) y
almacenados a -20 C hasta que se realizaron las
pruebas. Las concentraciones ensayadas variaron
desde 0,002 hasta 32,000 ug / ml-1 para la anfotericina
B, itraconazol, caspofungina, y ketoconazol y 0,016 a
256,000 ug / mL-1 para fluconazol.

Procedimiento:

Todos los aislamientos fueron

probados contra cinco agentes antifngicos utilizando
el E-test de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Las suspensiones de inculo se prepararon
y se ajustaron a un 65-70% de transmitancia a una
longitud de onda de 530 nm que corresponde a una
concentracin de 105 a 106 ufc / mL-1 verificada por
recuentos de placas cuantitativos. La superficie del
agar RPMI se inocul por inmersin de un hisopo
estril en la suspensin de inculo y las rayas de
manera uniforme en tres direcciones. Despus el
exceso de humedad fue absorbido por el agar y la
superficie estaba completamente seco, una tira de Etest se aplic a cada placa. Las placas se incubaron a
28 C y los resultados se leyeron a 72-96 horas.

Determinacin de los puntos finales

MIC: En general, MIC se defini como la
concentracin de frmaco ms baja a la que el borde
de la zona de inhibicin elptica interceptado la escala
de MIC en la tira de E-test. Cuando se observ un
doble halo de crecimiento, el MIC se ley en el punto
donde el crecimiento se inhibi completamente.
Cuando se observaron diferentes intersecciones a cada
lado de la tira, el ms alto valor MIC se ley.

Resultados
Los dermatofitos aislados se obtuvieron de las
uas de los pies 16 (24,2%), 33 pies (50,0%), regin
inguinal 7 (10,7%), el tronco 5 (7,6%) y las manos 5
(7,6%). La distribucin de las especies aisladas 66
dermatofitos fueron T. rubrum 43 (65,1%), T.
mentagrophytes 7 (10,7%), M. canis 5 (7,6%), T.
tonsurans 5 (7,6%), E. floccosum 4 (6,0 %) y T.
violaceum 2 (3,0%) (Tabla 1).
Todas las cepas probadas crecieron bien en
RPMI glucosa, suplemento de agar plateado. Ellos
fueron ledas en el mtodo E-test despus de 96 horas
de incubacin, excepto en el caso de T.
mentagrophytes, que requieren slo 72 horas de
incubacin.
La Tabla 2 resume las susceptibilidades in vitro
de 66 aislados clnicos de dermatofitos a cinco agentes
antifngicos como se determina por E-test. El agente
ms activo contra todas las especies de dermatofitos
fue caspofungina con un rango de MIC (ug / ml -1)
(0,02-3, 0,032-4, 0,032-4, 0,125-0,50, desde 0,25
hasta 0,50, 0,125-0,50) e itraconazol con un gama
MIC (ug / ml-1) (0,038 a 1,5,
0,094 a 1,5, 1-32,
0,016-0,50, 0,25-0,50, 0,125-0,50). El agente menos
activo fue el fluconazol con un rango de MIC (ug/ml -1)

(0,19-48,
2-256,
2-8, 256, 256, 8-24). Los
resultados del ensayo de la susceptibilidad a la
anfotericina B y ketoconazol fueron los siguientes;
respectivamente, 0,012-8, 0,19-8, 0,50-3, 0,125-6,
32, 0,75 y 0,032-8, 0,064-8, 32, 32, 32, 32.
En general, las especies de dermatofitos
mostraron patrones similares de la susceptibilidad a
cada agente antifngico a prueba. Se encontraron altos
valores de MIC para algunas cepas, dos cepas de
dermatofitos (1 T. rubrum y 1 T. mentagrophytes)
tenan CIM de caspofungina de 32 ug / ml, 16 cepas
(11 T. rubrum, 4 E. floccosum y 1 T. mentagrophytes )
tenan MIC de anfotericina B de 32 ug / ml, 53 cepas
(36 T. rubrum, T. tonsurans 5, 4 E. floccosum, 2 M.
canis y T. mentagrophytes 6) tuvieron MIC de
fluconazol de 256 ug / ml , 2 cepas (2 M. canis) tenan
CIM de itraconazol de 32 ug / ml, y 33 cepas (18 T.
rubrum, 1 T. tonsurans, 4 E. floccosum, 5 M. canis, 2
T. violaceum y 3 T. mentagrophytes) tena MICs de
ketoconazol de 32 ug / mL. Tabla 2 resume los rangos
de MIC, las concentraciones inhibidoras del 50%
(MIC 50) y 90% (MIC 90) de los aislamientos de los
cinco frmacos antimicticos contra 66 cepas de
dermatofitos.

Discusin
Las infecciones causadas por dermatofitos se
producen en todo el mundo y puede ser muy grave y
difcil de tratar en pacientes cuya respuesta
inmunolgica se deteriora. Estas infecciones
representan un importante problema de salud pblica
an sin resolver.
Los dermatofitos son responsables de la
mayora de las infecciones fngicas que afectan la piel,
cabello y uas. Ellos comprenden un grupo
filogenticamente estrechamente relacionado de
gneros con numerosas especies. Ellos atacan a los
tejidos queratinizadas y causan un amplio espectro de
manifestaciones clnicas que varan de leves a graves.
La distribucin de los dermatofitos y sus
agentes etiolgicos tiene frecuencias desiguales, con
variaciones de su prevalencia segn los pases e
incluso las regiones de un mismo pas. En este estudio,
T. rubrum fue el microorganismo ms frecuentemente
aislado 43 (65,1%), seguido por T. mentagrophytes 7
(10,7%), M. canis 5 (7,6%), T. tonsurans 5 (7,6%), E.
floccosum 4 (6,0%) y T. violaceum 2 (3,0%). Estos
resultados estn de acuerdo con muchos otros y
estudios internacionales locales.

La mayora de las infecciones superficiales

causadas por dermatofitos pueden ser erradicadas
rpidamente con antifngicos tpicos y sistmicos.
Tratamiento antimictico oral con nuevos agentes,
tales como la terbinafina, itraconazol y fluconazol, es
el tratamiento de eleccin para la dermatofitosis que
no responde a las terapias tpicas. El espectro de
actividad de estos medicamentos es variable, lo que
lleva al fracaso del tratamiento en 25 a 40% de los
pacientes tratados, posiblemente debido a la falta de
cumplimiento del paciente, la falta de penetracin del
frmaco en las uas, la biodisponibilidad del
medicamento o las interacciones entre medicamentos y
resistencia.
El anlisis in vitro de la actividad antifngica
de agentes antifngicos permite la comparacin entre
diferentes antimicticos, que a su vez podr aclarar las
razones de la falta de respuesta clnica y ayudar a los
mdicos en la eleccin de una terapia eficaz para sus
pacientes. Sin embargo, es importante que las
metodologas utilizadas para las pruebas in vitro
estandarizarse para facilitar el establecimiento de los
parmetros de control de calidad y los puntos de
quiebre interpretativos.

Actualmente, ningn mtodo de referencia se

ha establecido para probar la susceptibilidad de la
droga de los dermatofitos. Se requiere el desarrollo de
tcnicas simples y reproducibles para los ensayos
clnicos de estos patgenos importantes. El E-test es un
mtodo nuevo y prometedor, con amplias aplicaciones
en la prctica de laboratorio clnico, y se apoya en los
resultados de extensas pruebas de bacterias y
levaduras. Sin embargo, slo hay unos pocos informes
que describen el uso de este mtodo para dermatofitos.
En este estudio, se determin valores de CIM
de cinco agentes antifngicos (anfotericina B,
fluconazol, itraconazol, caspofungina, y ketoconazol) a
las diferentes especies de dermatofitos cepas aisladas
de muestras clnicas utilizando el mtodo de E-test.

En nuestro estudio, el agente ms activo contra

todas las especies de dermatofitos se caspofungina con
un rango de MIC (ug / ml-1) (0,02-3,0,032-4, desde
0,125 hasta 0,50, 0,032 a 2, desde 0,25 hasta 0,50,
0,125-0,50) e itraconazol con un rango de MIC (ug /
ml-1) (0,038 a 1,5, 0,094 a 1,5, 1-32, 0,016 a 0,50,
0,25-0,50,,125-0,50). El agente menos activo fue el
fluconazol con un rango de MIC (ug / ml-1) (0,19-48,
2-256, 2-8, 256, 256, 08.24). Los resultados del ensayo
de la susceptibilidad a la anfotericina B y ketoconazol
fueron los siguientes; respectivamente,0,012 a 8, 0,198, 0,50-3,,125-6, 32, 0,75 y 0,032-8, 0,064-8, 32, 32,
32, 32.