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Rio de Janeiro
2007
Rio de Janeiro
2007
________________________
Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva (NPPN / UFRJ)
________________________
Profa. Dra. Ana Lcia do Amaral Vendramini (EQ / UFRJ)
________________________
Dr. Humberto Ribeiro Bizzo (CTAA / Embrapa)
________________________
Profa. Dra. Gilda Guimares Leito (NPPN / UFRJ)
Este trabalho dedicado ao meu padrinho e av Osman Lus da Silva (1925-1998) e minha
madrinha Liberalina P. de Souza (1928-2001)
AGRADECIMENTOS
A Deus, o Pai, por se importar comigo.
Ao Prof. Dr. Antonio Jorge Ribeiro da Silva pela pacincia, orientao e confiana.
Aos membros da banca examinadora por terem aceitado o convite.
A todo o corpo docente do Programa de Ps-Graduao em Qumica de Produtos Naturais do
NPPN, principalmente, queles que contribuiram direta ou indiretamente para a minha
formao.
Ao Prof. Dr. Armando Sabaa Srur pelo fornecimento das amostras de aa do Par.
pesquisadora Daise Lopes pela contribuio inicial dada este trabalho.
Aos meus amigos de laboratrio e praticamente co-orientadores deste trabalho, os doutorandos
Josiane Roberto Domingues, Regina Pereira dos Santos e Ricardo Moreira Borges.
Aos amigos, tambm doutorandos, Juan Francisco P. Sabino da Guatemala e Ktia P. Menezes
do INCQS / FIOCruz pela companhia e pelo enriquecimento dos seminrios internos.
doutoranda Andra Gomes da Silva do Instituto de Nutrio pela colaborao intelectual.
Ao doutorando Evanoel Crizanto de Lima pela colaborao prestada no planejamento de
reaes e elucidao de mecanismos.
A todo o corpo tcnico do Programa de Ps-Graduao em Qumica de Produtos Naturais do
NPPN, especialmente, Maria Cristina Holanda, Maria do Carmo Freire e Gisele de Oliveira.
Aos amigos e colegas tambm ps-graduandos do Programa de Ps-Graduao em Qumica
de Produtos Naturais do NPPN pelo incentivo e colaborao intelectual.
amiga de graduao do curso de Farmcia Gleiser Tupinamb pelo incentivo e indicao.
Ao Prof. Dr. Mrio Vasconcelos, ex-professor de Qumica Orgnica da Faculdade de
Farmcia da UFRJ, por sua dedicao profissional e por ter sido um dos responsveis pelo
meu interesse pela rea.
Ao Dr. Mario Jorge de Arajo Gatti do Instituto Oswaldo Cruz (FIOCruz) e Luciana
Nogaroli Cavalcante pelo que contriburam para a minha formao acadmica.
Ao Prof. Dr. Adalberto Vieyra do Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho pelo incentivo e
compreenso.
Prof.a Elaine Gomes Quintana do Programa de Fisiologia do Instituto de Biofsica Carlos
Chagas Filho e ao Dr. Marcelo Einicker Lamas pela amizade e pela prontido em servir
sempre que requisitados.
coordenao de ps-graduao e direo, da gesto atual e da gesto anterior, e
administrao do NPPN por terem garantido as condies necessrias para a realizao deste
trabalho.
minha me Maria Lcia Feitosa da Silva Netto e minha av Edith Feitosa de Lima pelo
carinho e apoio durante toda a minha trajetria acadmica.
Eu sou a verdadeira videira e meu Pai o lavrador. Todo o ramo em mim que no d fruto,
ele tira, e todo o que d fruto, ele limpa, para que d mais fruto.
Jesus, segundo Joo Cap. 15:1-2.1
Traduo do Novo Mundo das Escrituras Sagradas. 1992. Watchtower Bible and Tract Society of New York,
Inc. & International Bible Students Association, Brooklyn, New York, U.S.A. Edio Brasileira, p. 1061.
RESUMO
SILVA, Osman Feitosa da. Estudo de Metodologias para a Extrao e Caracterizao de
Compostos Fenlicos da Polpa de Aa. Rio de Janeiro, 2007. Dissertao (Mestrado em
Cincias)- Ncleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, 2007.
ABSTRACT
SILVA, Osman Feitosa da. Estudo de Metodologias para a Extrao e Caracterizao de
Compostos Fenlicos da Polpa de Aa. Rio de Janeiro, 2007. Dissertao (Mestrado em
Cincias)- Ncleo de Pesquisas de Produtos Naturais, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, 2007.
SUMRIO
Pgina
1. INTRODUO...........................................................................................................14
1.1 Euterpe oleracea M.: uma espcie nativa...........................................................14
1.1.1 Ocorrncia e sinonmias............................................................................14
1.1.2 Descrio botnica da espcie e sistemtica ............................................15
1.1.3 Descrio geral e importncia econmica................................................17
1.2 Aa: um possvel alimento funcional ................................................................20
1.2.1 Polifenis do aa ......................................................................................20
1.2.2 Lipossolveis do aa.................................................................................24
1.2.3 Outros constituinetes de valor nutricional ................................................25
1.2.4 Atividade antioxidante...............................................................................25
1.3 Metodologias analticas empregadas no estudo dos polifenis........................27
1.3.1 Tcnicas de extrao e isolamento............................................................27
1.3.2 Extrao e isolamento dos polifenis do aa ...........................................30
1.3.3 Tcnicas de identificao e quantificao ................................................36
2. OBJETIVOS.................................................................................................................40
3. MATERIAL E MTODOS ......................................................................................41
3.1 Material ................................................................................................................41
3.1.1 Solventes ....................................................................................................41
3.1.2 Reagentes...................................................................................................41
3.1.3 Fases estacionrias para cromatografia em camada delgada .................43
3.1.4 Resinas para extrao em fase slida .......................................................43
............................................................................................................................62
10
11
4.4.2 Extrao em fase slida com celulose e fracionamento em coluna sob mdia
presso
..........................................................................................................................143
4.4.3 Extrao em fase slida com SAX ...........................................................148
4.4.4 Extrao em fase slida com poliamida..................................................151
5. CONCLUSES .........................................................................................................158
REFERNCIAS .............................................................................................................161
12
LISTA DE SIGLAS
AcOEt
Acetato de etila
AcOH
cido actico
AcONa
Acetato de sdio
ADBE
2-amino-difenil-borato de etila
ATFA
cido trifluoractico
BTBA
Brometo de tetrabutilamnio
BTCA
Brometo de tetracetilamnio
C18
CCD
CG
Cromatografia gasosa
CG-EM
CIT
CLAE
CLAE-DAD
CLAE-EM
DAD
EFS
EM-BAR
EM-DILAM
13
EM-IES
EM-EI
EM-IQPA
EM-TV-DILAM
Et2O
ter etlico
EtOH
Etanol
IES
MeOH
Metanol
P.A.
Para anlise
PEG
Polietilenoglicol
POL
Poliamida
RDCTF
RTIFB
SAX
XAD
14
1. INTRODUO
Plancies alagveis.
Desembocadura de um rio, ampla e funda.
15
16
17
espcies de Palmae fez com que Harborne et al. (1974) propusessem que este fosse um
marcador quimiotaxonmico para a famlia, dada a sua aparente raridade em outras espcies
at ento. Contudo, relato recente tem proposto o mesmo papel para o cido p-hidroxibenzico (Fig. 3), j detectado em extratos de mesocarpo dos frutos de duas subfamlias de
Palmae (CHAKRABORTY et al., 2006).
COOH
OH
OH
HO
OH
OH
HO
Figura 3: Estrutura do cido p-hidroxi-benzico.
Os frutos da espcie E. oleracea devem ser colhidos durante a estao seca (agosto a
dezembro na regio do delta4 amaznico) para se obter maior produo e frutos com melhores
caractersticas
organolpticas
(STRUDWICK
&
SOBEL,
1988;
ROGEZ,
2000;
Terreno triangular em que dois lados so formados por dois braos de um rio e o outro pela costa do mar.
18
19
passava de 10 % do consumo nacional naquele mesmo ano (ROCHA et al., 2007); cerca de
180 toneladas de polpa eram consumidas anualmente apenas no estado do Par (GALLORI et
al., 2004).
20
dos frutos, comum o preparo de emulses aquosas da polpa oleosa com acar e farinha de
mandioca (GALLORI et al., 2004); enquanto nos centros urbanos de outras regies, os
produtos da polpa (sorvetes, gelias, licores e bebidas energticas preparadas com ou sem
adio de outras frutas e/ou xaropes) tornaram-se populares em todos os nveis scioeconmicos (INSFRAN et al., 2004; LICHTENTHLER et al., 2005) devido seu alto valor
nutritivo (MELO et al. apud SANTOS, 2001; ROGEZ, 2000) e ao consumo crescente de
sucos de frutas naturais como bebidas energticas (BOBBIO et al., 2000).
1.2.1 Polifenis do aa
A procura por alimentos e bebidas que promovam efeitos benficos para a sade tem
motivado a comunidade cientfica a buscar cada vez mais informaes a respeito da
constituio qumica dos alimentos que fazem parte da dieta humana. Entre os constituintes
qumicos hidrossolveis detectados em alimentos de origem vegetal, os polifenis constiuem
21
a maior classe de biomolculas com atividade antioxidante (EVANS et al., 1996; WANG et
al., 1996). H evidncias suficientes para se afirmar que os radicais livres desempenham um
papel importante na maioria dos problemas de sade da sociedade moderna, principalmente
nos casos de doenas degenerativas causadas por estresse oxidativo, como os vrios tipos de
cncer, as doenas cardiovasculares e as doenas neurodegenerativas associadas com o
envelhecimento (TSAO & YANG, 2003; SAKAKIBARA et al., 2003). Os polifenis, devido
seu alto potencial redox, atuam como agentes redutores, doadores de hidrognio ou singlet
oxigen quenchers, prevenindo tais doenas degenerativas (KAHKONEN et al., 1999; TSAO
& YANG, 2003; SAKAKIBARA et al., 2003).
Devido a grande variedade de glicosdeos existentes, estima-se que haja mais de um
milho
de
compostos
fenlicos
diferentes
na
natureza
(HERRMANN,
1976;
22
Outros flavonides
cidos fenlicos
Cianidina 3-glicosdeo e
cianidina 3-rutinosdeo
Cianidina 3-arabinosdeo e
cianidina
3-arabinosilarabinosdeo
Cianidina
3-glicosdeo,
cianidina 3-rutinosdeo e
outros
derivados
de
cianidina e peonidina
Homoorientina,
orientina, isovitexina,
taxifolina desoxi-hexose
e um derivado de
homoorientina
Cianidina 3-glicosdeo e Catequina
e cido ferlico, ppelargonidina 3-glicosdeo epicatequina
hidroxi-benzico,
glico, protocatecuico,
elgico, vanlico, pcumrico,
cinco
derivados de cido
glicob e um derivado
de cido elgicob
Cianidina
3-glicosdeo, Catequina e rutina
cido protocatecuico
cianidina 3-rutinosdeo e
peonidina rutinosdeo
Cianidina
3-glicosdeo, Homoorientina,
cianidina
3-rutinosdeo, orientina, isovitexina,
desoxicianidina
3- taxifolina
sambubiosdeo, peonidina hexose, escoparina e
3-glicosdeo e peonidina outros no identificados
3-rutinosdeo
Cianidina 3-glicosdeo e Catequina
e Dois derivados de
cianidina 3-rutinosdeo
epicatequina
cido glicob, cido
ferlico,
cido
vanlico, p-cumrico,
p-hidroxi-benzico e
protocatecuico
a
Referncias
IADEROZA et al.,
1992;
ROGEZ,
2000; CONSTANT,
2003
BOBBIO et al.,
2000
GALLORI et al.,
2004
INSFRAN et al.,
2004
LICHTENTHLER
et al., 2005
SCHAUSS et al.,
2006a
PACHECO et al.,
2007
23
24
relato de Insfran et al. (2004) sugere que os cidos fenlicos encontrados na polpa dos frutos
sejam, do mais ao menos abundante: cido ferlico, p-hidroxi-benzico, glico,
protocatecuico, elgico, vanlico e p-cumrico. Cinco derivados de cido glico e um derivado
de cido elgico tambm foram detectados. O segundo relato descreve a deteco de dois
derivados de cido glico e cido ferlico como constituintes principais, enquanto cido
vanlico, p-cumrico, p-hidroxi-benzico e protocatecuico constituiriam a frao menos
expressiva. Considerando que vrios fatores ambientais, alm do estgio de maturao,
podem ter influncia sobre a composio qumica dos frutos, estes resultados parecem
bastante concordantes. Entretanto, o questionamento levantado por Schauss et al. (2006a), em
relao espcie realmente utilizada por Insfran et al. (2004), torna necessria a obteno de
novos dados que confirmem tais resultados.
1.2.2 Lipossolveis do aa
25
et al. (apud SANTOS, 2001) para o extrato hexnico dos frutos obtido em aparelho de
Soxhlet (44,47 %), mas pareceu condizente com o valor determinado por Rogez (2000),
referente aos lipdeos totais extrados da polpa (48 g / 100 g de massa seca).
26
COSON et al., 2005; LICHTENTHLER et al., 2005; MATHEUS et al., 2006; SCHAUSS
et al., 2006b; PACHECO et al., 2007). Atividade anti-radical superxido extremamente alta
foi detectada em extratos totais (acetona / gua) de frutos ntegros (SCHAUSS et al., 2006b) e
atividades moderadas a elevadas anti-radicais peroxila, peroxinitrito e hidroxila tambm
foram detectadas em extratos aquosos e/ou orgnicos de frutos ntegros e de polpa
(LICHTENTHLER et al., 2005; SCHAUSS et al., 2006b). Embora os constituintes
qumicos responsveis por estas atividades ainda no tenham sido determinados na espcie, a
procura por alimentos com atividades antioxidantes, caracterstica tpica de frutos ricos em
antocianinas, incentivou a pesquisa por suas qualidades como alimento ou ingrediente
funcional (COSON et al., 2005; LICHTENTHLER et al., 2005). Alimento funcional seria
aquele que, comprovadamente, afetaria beneficamente um ou mais alvos funcionais do corpo
humano, alm de seus devidos efeitos nutricionais, proporcionando uma melhora no estado de
sade e bem estar e/ou reduzindo o risco de desenvolvimento de uma doena (ROBERFROID
et al., 2002). dentro deste contexto funcional que o presente trabalho se prope a explorar
ainda mais a composio qumica do aa5, especificamente os constituintes polifenlicos
presentes em extratos hidrossolveis do aa liofilizado, j que seu contedo em nutrientes
vitamnicos hidrossolveis (SCHAUSS et al., 2006a; ROGEZ, 2000) no parece ser suficiente
para contribuir significativamente para a capacidade antioxidante total dos frutos.
Designado aqui como o extrato aquoso de polpa obtido por macerao dos frutos de Euterpe oleracea.
27
28
(BAILN & BUELGA, 2003). Metanol (MeOH), etanol (EtOH), acetona, gua, acetato de
etila (AcOEt) e suas combinaes so os solventes mais utilizados para a extrao de
compostos fenlicos (NACZK & SHAHIDI, 2004). Entre estes, MeOH o solvente mais
empregado e a utilizao de solues metanlicas (70-80 % em H2O) tem sido bem sucedida
na extrao de derivados hidroxicinmicos, flavonas, flavonis e catequinas (BAILN &
BUELGA, 2003). Porm, a utilizao de acetona para a extrao de antocianinas em vez de
MeOH acidificado tem proporcionado extraes mais eficientes e reprodutveis, por evitar
problemas com pectinas e permitir que a amostra seja concentrada em temperaturas mais
baixas (VIGUERA et al., 1998). Outra boa opo a extrao com AcOEt, que torna-se
quantitativa para os principais compostos fenlicos quando se associa sulfato de amnio (20
%), cido metafosfrico (2 %) e EtOH (20 %) ao solvente (BAILN & BUELGA, 2003).
Segundo Bloor (2001) a mistura MeOH / H2O / c. actico (AcOH) (70:23:7) seria
um solvente de extrao geral para a maioria dos tipos de flavonides de tecidos vegetais e 25 mL desta soluo seriam suficientes para se obter um extrato pronto para anlises
cromatogrficas subsequentes a partir de 50 mg de material vegetal. Cinquenta mililitros de
uma soluo extratora semelhante (MeOH / H2O / HCOOH; 70:28:2) foram utilizados por
Gao & Mazza (1995) para a extrao de antocianinas e outros polifenis a partir de 30 g de
sweet cherries. Entretanto, segundo Bailn & Buelga (2003), o uso de cido frmico para
acidificar solues extratoras de antocianinas no indicado por promover acilaes e gerar
artefatos. A presena de um cido orgnico teria por finalidade a manuteno do pH num
valor baixo o suficiente para se evitar a degradao das estruturas catinicas das antocianinas
por hidratao e consequente gerao de pseudobases, bases quinonoidais e chalconas
(FIGUEIREDO et al., 1996; LAPIDOT et al., 1999; FLESCHHUT et al., 2006), mas pode ser
tambm conveniente para aumentar a recuperao de cidos fenlicos em certos
procedimentos extrativos (IAKOV et al., 2003). Entretanto, Einbond et al. (2004)
29
utilizaram MeOH puro para extrair antocianinas de vrios frutos comestveis, embora a
utilizao deste solvente puro tenha sido relacionada gerao de turbidez em amostras de
sucos aps centrifugao (BAILN & BUELGA, 2003). Revilla et al. (1998) compararam
vrias tcnicas de extrao de antocianinas e concluiram que os solventes que contiham
concentraes de HCl acima de 0,12 M podiam causar hidrlise parcial de antocianinas
aciladas. Alm disso, considerando que estes extratos hidroalcolicos so sempre
subsequentemente concentrados, o uso de cidos no volteis poderia causar no apenas
hidrlise de grupos acila, mas tambm de glicosdeos, gerando agliconas instveis (KONG et
al., 2003).
Quando o objetivo do trabalho o isolamento de produtos naturais, um fator analtico
importante a presena de interferentes. Uma amostra vegetal pode conter uma grande
variedade de compostos apolares, tais como cidos graxos, esteris, terpenos, clorofilas e
carotenides, que podem prejudicar os processos de separao e as anlises subsequentes dos
componentes fenlicos da amostra (IAKOV et al., 2003; NACZK & SHAHIDI, 2004).
Vrios mtodos extrativos, como a extrao lquido-lquido, extrao em fase slida, extrao
por solvente acelerado (accelerated solvent extraction) e extrao por fluido super crtico so
recomendados para o tratamento de amostras vegetais antes das anlises cromatogrficas
(IAKOV et al., 2003). Amostras com alto teor de lipossolveis geralmente requerem
desengorduramento em aparelho de Soxhlet antes da extrao dos fenlicos (BAILN &
BUELGA, 2003). Clorofilas podem ser removidas por lavagem dos extratos hidroalcolicos
com hexano ou ter dietlico (Et2O), enquanto acares e fenlicos indesejados podem ser
removidos por extrao em fase slida (EFS) (BLOOR, 2001). ter de petrleo, AcOEt e
Et2O tambm podem ser utilizados para remover lipdeos e fenlicos indesejados (NACZK &
SHAHIDI, 2004).
30
Entre os procedimentos de EFS, o uso de resinas do tipo XAD tem sido aplicado
quando se deseja remover acares e outros constituintes polares de amostras vegetais
contendo fenlicos (BARBERN et al., 1992; WANG et al., 1997; LLORACH et al., 2003;
ADHIKARI et al., 2005). O uso de resinas trocadoras de ons tem sido reduzido, devido o
surgimento de tcnicas mais modernas e eficientes. Assim, celulose impregnada com
polietileneimina (PEI) e celulose ecteola no so mais utilizadas atualmente, enquanto DEAEcelulose e DEAE-Sephadex ainda so utilizadas, mas apenas para anlises de polissacardeos
(WATT et al., 2002; SUDHAMANI et al., 2004). Entretanto, Einbond et al. (2004) utilizaram
resina Diaion HP20-SS para remover acares e vitamina C de 12 extratos antocinicos de
frutas e Mullen et al. (2002) empregaram uma combinao desta (Diaion HP20-SS) com uma
coluna de slica funcionalizada de fase inversa (C186) para fins semelhantes.
Cartuchos contendo C18 so muito utilizados para EFS, inclusive para microextrao
em fase slida. Seu uso permite a eliminao de compostos hidrossolveis (acares e cidos
orgnicos) com H2O e a separao de cidos fenlicos, flavonides e proantocianidinas
oligomricas (eludos com AcOEt) de antocianinas e proantocianidinas polimricas (eludas
com MeOH) numa mesma etapa (NACZK & SHAHIDI, 2004). Alm disso, solues
hidroalcolicas acidificadas tambm podem ser utilizadas (WANG & SPORNS, 1999), assim
como na cromatografia em coluna (EINBOND et al., 2004).
31
al., 2000; CONSTANT, 2003). Isto porque a notvel abundncia destes pigmentos nos frutos
chamou a ateno dos pesquisadores, primariamente, para o seu possvel aproveitamento
como corantes naturais de alimentos (BOBBIO et al., 2000; CONSTANT, 2003). Entretanto,
embora j exista experincia do uso de antocianinas para esta finalidade (TIMBERLAKE &
HENRY, 1988; SAONA et al., 1999), a instabilidade destes pigmentos em valores usuais de
pH (FIGUEIREDO et al., 1996; LAPIDOT et al., 1999; FLESCHHUT et al., 2006) tornou-se
um obstculo para sua utilizao na indstria. Contudo, o uso de copigmentos tem criado
perspectivas promissoras de se conseguir aumentar a estabilidade destes polifenis em
condies diversas de pH, luz e temperatura (BAKOWSKA et al., 2003).
As antocianinas constituem uma classe distinta de glicosdeos de flavonides, cujas
agliconas (ou antocianidinas) correspondem a derivados poliidroxilados e/ou metoxilados do
ction 2-fenilbenzopirilium (ou flavilium) (Fig. 7). Considerando a vulnerabilidade destas
estruturas diante de variaes de pH, tornou-se necessrio o desenvolvimento de
metodologias especficas para a anlise destes pigmentos. Segundo Bloor (2001), para
propsitos analticos, os flavonides podem ser classificados basicamente em trs tipos:
glicosdeos de flavonides, flavonides no polares (agliconas e flavonides alquilados ou
metilados) e antocianinas. As proantocianidinas constituiriam uma quarta classe no
considerada pelo autor. Portanto, provvel que o direcionamento inicial das metodologias de
extrao, isolamento e deteco para as antocianinas tenha contribudo efetivamente para o
retardo na deteco de outros flavonides dos frutos de E. oleracea.
32
R1
3
R4
4
R4
5
2
3
5
R2
R3
R5
Figura 7: Estrutura do ction flavilium substitudo com os grupos R1-R5 presentes em antocianidinas e/ou
antocianinas (ver Quadro 2).
R1
H
OH
OCH3
OH
OCH3
OCH3
R2
H
H
H
OH
OH
OCH3
R3
OH
OH
OH
OH
OH
OH
R4
OH
OH
OH
OH
OH
OH
R5
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
H
OH
OH
OH
OH
OH
OH
Cianidina 3,5-diglicosdeo
OH
O--D-glicose
O--D-galactose
O--D-(6--Lramnosil)-glicose
O--D-glicose
OH
Cianidina 3-sambubiosdeo
OH
O--D-(2--Dxilosil)-glicose
OH
O--Dglicose
OH
Na metodologia adotada por Bobbio et al. (2000), 500 g de polpa liofilizada dos frutos
da juara foram submetidos a extrao exaustiva com soluo HCl 0,1 % em etanol. O extrato
bruto, assim obtido, foi filtrado, concentrado e armazenado a -18oC para posterior anlise por
cromatografia em papel e cromatografia lquida de alta eficiencia (CLAE). Constant (2003),
33
buscando a melhor tcnica de extrao das antocianinas dos frutos de E. oleracea para
posterior aplicao em alimentos, avaliou o tempo de extrao, o tipo de solvente e de cido
empregado e o pH das solues extratoras, alm dos efeitos da temperatura e das condies da
matria-prima. Segundo a autora, a extrao das antocianinas deve ser feita a partir do fruto
inteiro, j que o despolpamento promove a incorporao de mais lipdeos ao extrato e expe
os pigmentos ao de enzimas presentes no fruto, que aceleram a sua degradao. Os
melhores sistemas solventes foram H2O / SO2 (4000 ppm), EtOH 70 % / SO2 (1000 ppm),
EtOH 70 % / HCl (pH = 2) e H2O / SO2 (1000 ppm). Entre as preparaes aquosas sem EtOH
e sem SO2, a melhor soluo extratora foi H2O / cido ctrico (pH = 2). Constant (2003)
concluiu ainda que uma nica extrao, temperatura ambiente (31oC), j seria suficiente
para se conseguir cerca de 95 % dos pigmentos extraveis do fruto fresco e que o uso de
temperaturas mais altas (at 60C) permitiria uma maior extrao dos pigmentos, sem perdas
considerveis por degradao.
No ano seguinte, Insfran et al. (2004) partiram da polpa pasteurizada e congelada, que,
aps ser descongelada, foi centrifugada, filtrada e particionada entre ter de petrleo e
acetona. O extrato hidroflico (em acetona) foi concentrado sob presso reduzida (at 40C) e
redissolvido em gua acidificada (HCl 0,01 %) para aplicao seguinte em coluna Sep-Pak
Vac C18. A coluna foi tratada com gua acidificada (HCl 0,01 %) para a remoo de acares
residuais e cidos orgnicos, AcOEt para remover compostos polifenlicos no antocinicos,
e MeOH acidificado com HCl 0,01 % para remover a frao rica em antocianinas. As fraes
orgnicas foram concentradas e redissolvidas em tampo cido ctrico (pH = 3,5) para
posterior anlise por CLAE. Gallori et al. (2004) partiram de 2,6 g de polpa liofilizada e
triturada. Trs extraes consecutivas, sob agitao, foram realizadas com 450 mL de soluo
EtOH / H2O (7:3) com cido frmico (pH = 2). O extrato hidroalcolico obtido foi filtrado,
dividido em duas pores e concentrado sob vcuo a 25C. Uma poro foi levada secura,
34
retomada com gua acidificada (HCOOH 5 %) e submetida EFS (cartucho Extrelut). Nesta,
eluiu-se n-hexano, AcOEt e MeOH acidificado com cido frmico (pH = 2), recuperando-se,
respectivamente, compostos lipossolveis, fenlicos no antocinicos e antocianinas, as quais
foram eludas juntas com acares e cidos orgnicos. As fraes obtidas em AcOEt e MeOH
acidificado foram concentradas e analisadas por CLAE acoplada a um detector com arranjo de
diodos (DAD) para ultravioleta / visvel (UV/Vis) e por CLAE acoplada espectrometria de
massas (CLAE-EM7). A segunda poro do extrato hidroalcolico foi particionada com nhexano, concentrada at a secura e retomada com gua acidificada (HCOOH 5 %) para
anlise posterior com as mesmas tcnicas cromatogrficas.
Na metodologia adotada por Lichtenthler et al. (2005), 5 g de amostras no
comerciais de polpa liofilizada foram suspensas com gua desionizada at o volume final de
50 mL. As suspenses foram sonicadas por 10 min., centrifugadas a 2800 g tambm por 10
min. e os sobrenadantes obtidos foram analisados diretamente por CLAE-DAD8 e CLAE-EM.
Schauss et al. (2006a) utilizaram a metodologia empregada por Wu et al. (2004), na qual 1 g
de cada berry previamente congelado, liofilizado e triturado foi extrado com MeOH / H2O /
AcOH (85:15:0,5 v/v) em frasco vedado com tampa de rosca. O frasco foi agitado em vortex
por 30 s e sonicado por 5 min. Depois, o frasco foi deixado temperatura ambiente por 10
min., agitado por mais 30 s e centrifugado a 4550 g por 10 min. O sobrenadante foi removido
para um balo volumtrico de 25 mL e o resduo reextrado com 10 mL da mesma soluo
extratora. O novo sobrenadante foi adicionado ao anterior e o volume do balo (25 mL)
completado com a sol. extratora. A soluo obtida foi diluda e fitrada para as anlises
subsequentes.
Matheus et al. (2006) partiram de extratos etanlicos de frutos, flores e espigas,
obtidos com 10 L de EtOH 70 para cada 300 g de material vegetal. O perodo de extrao foi
7
Tcnica mais conhecida pela sigla LC-MS, do ingls: liquid chromatography-mass spectrometry.
Tcnica mais conhecida pela sigla HPLC-DAD, do ingls: high performance liquid chromatography- diode
array detector.
8
35
36
Tcnica mais conhecida pela sigla GC-MS, do ingls: Gas chromatography-mass spectrometry.
Tcnica mais conhecida pela sigla ESI-MS, do ingls: electrospray ionization-mass spectrometry.
11
Tcnica mais conhecida pela sigla APCI-MS, do ingls: atmospheric pressure chemical ionization-mass
spectrometry.
12
Tcnica mais conhecida pela sigla MALDI-MS, do ingls: matrix- assisted laser desorption/ionization-mass
spectrometry.
13
Tcnica mais conhecida pela sigla MALDI-TOF-MS, sendo TOF correspondente expresso: time of flight.
10
37
(GUPTA
(MCMURROUGH
&
&
HASLAM,
MCDOWELL,
1980)
do
1978),
indicados
4-(dimetilamino)-cinamaldedo
para
quantificao
de
14
15
Tcnica mais conhecida pela sigla FAB-MS, do ingls: fast atom bombardment-mass spectrometry.
Tcnica mais conhecida pela sigla EI-MS, do ingls: electron impact ionization-mass spectrometry.
38
39
mveis consistia de AcOH 6 % (v/v) em AcONa 2 mM (pH = 2,55; fase A) e CH3CN (fase
B). Outras metodologias desenvolvidas para CLAE na anlise destas e de todas as outras
classes de compostos fenlicos podem ser acessadas em detalhe numa boa reviso publicada
por Naczk & Shahidi (2004).
40
2. OBJETIVOS
41
3. MATERIAL E MTODOS
3.1 Material
3.1.1 Solventes
3.1.2 Reagentes
Acetato de sdio, cido actico glacial, cido clordrico, cido frmico, cido
fosfrico, cido o-fosfrico, cido sulfrico, cido trifluoractico, bicarbonato de sdio,
carbonato de sdio, cloreto de acetila, fosfato de sdio dibsico heptaidratado, fosfato de
sdio monobsico monoidratado, hidrxido de sdio e iodeto de metila P.A. foram utilizados
no preparo de solues extratoras, eluentes para extrao em fase slida, fases mveis para
42
16
Reagente mais conhecido pela sigla NP, do ingls: Natural products reagent.
43
p-hidroxi-benzico
foi
obtido
por
hidrlise
bsica
do
metil-ster
44
3.2 Equipamentos
3.2.1 Cromatgrafos
Para CLAE analtica, foi utilizado um cromatgrafo Shimadzu com sistema de injeo
manual (loop de 20 L), bomba Shimadzu modelo LC-10AD, detector com rede de diodos
Shimadzu modelo SPD-M10A VP, e sistema de controle Shimadzu modelo SCL-10A VP.
Para CG, foi utilizado um cromatgrafo a gs Varian Star 3400 CX.
Para CG-EM, foi utilizado um cromatgrafo a gs acoplado a um espectrmetro de
massas Shimadzu modelo GCMS-QP5000.
Nas anlises por insero direta em espetrmetro de massas com IDE, foi utilizado um
espectrmetro Agilent 1100 Ion Trap.
3.2.2 Espectrmetros
45
Coluna Symmetry ShieldTM RP18 com 5 m de poro, 4,6 x 250 mm, Waters foi
utilizada nas anlises por CLAE.
Coluna Phenomenex ZebronTM ZB-5 ms (30 m, 0,25 mm DI, com filme de 0,25 m de
espessura; fenilmetilsilicone 5%) foi utilizada nas anlises por CG-EM.
Coluna DB-5MS (122-5532) J & W Scientific / Agilent (30 m, 0,25 mm DI, com filme
de 0,25 m de espessura; temp. de -60C at 350C) foi utilizada nas anlises por CG.
Hidrognio, ar sinttico e nitrognio ultra puros foram utilizados na alimentao do
cromatgrafo a gs.
Gs hlio comprimido Air Products foi utilizado para a desgaseificao das fases
mveis utilizadas para CLAE e gs nitrognio comprimido Aga foi utilizado na concentrao
de extratos orgnicos de pequeno volume.
Amostras submetidas CLAE foram filtradas com filtro Millipore 2A (poros de 0,25
m) quando necessrio.
46
Fisatom, modelo 550 (1200 W 230 V); destilador de gua FstreemTM II, mod. A74410,
Barnstead; lmpada ultravioleta UVSL-58 Mineralight multibanda (254/366 nm; 60 Hz; 0,16
Amps) Ultra-violet Products, Inc.; liofilizador Labconco com bomba de alto vcuo de dois
estgios, modelo E2M8, Edwards; pistola de ar quente Comala 1400 W (temperaturas:
300/500C, vol. de ar: 400 L / min.) Steinel; placa de aquecimento Thermolyne 2555 Kerper
Boulevard, mod. SP18425, 50/80 Hz, Barnstead; purificador de gua Nanopure Barnstead;
vortex Ika tipo lab dancer, IP42.
3.3 Metodologia
47
frmico 4,5 % (fase mvel B). O programa foi iniciado com 100 % de fase mvel A. De 0 a 7
min., a composio da fase B foi alterada de 0 a 15 %; de 7 a 15 min., variou de 15 a 20 %; de
15 a 16 min., variou de 20 a 100 %; e, de 16 a 26 min., foi mantida a 100 %. Para as anlises
de fraes obtidas por extrao em fase slida e monitoramento das reaes de hidrlise,
utilizou-se tambm as condies descritas por Sumere et al. (1993), com vazo de 1 mL/min.
O programa foi iniciado com 85 % de sol. cido frmico 5 % (v/v) em H2O (fase mvel A) e
15 % de sol. CH3CN / MeOH (5:95; v/v) (fase mvel B); foi mantido com 15 % de B at 3
min. e alterado de 15 para 24 % de B at 8 min.; de 8 a 11 min., foi mantido a 24 % de B; de
11 a 18 min., alterado de 24 para 34 % de B; de 18 a 28 min., de 34 para 44 % de B; de 28 a
39 min., de 44 para 95 % de B; de 39 a 42 min., mantido a 95 % de B; de 42 a 47 min.,
alterado de 95 para 15 % de B; e de 47 a 50 min., mantido a 15 % de B. As condies
descritas por Wen et al. (2005) e Insfran et al. (2004) foram testadas com padres de cidos
fenlicos e flavonides, sempre com vazo de 1 mL/min. A condio descrita por Wen et al.
(2005) e uma condio modificada a partir desta foram utilizadas nas anlises realizadas com
as fraes contendo cidos fenlicos e flavonides. A condio modificada foi iniciada com
75 % de sol. cido trifluoractico (ATFA) 0,02 % em H2O (fase mvel A) e 25 % de sol.
ATFA 0,02 % em MeOH (fase mvel B) at 5 min. De 5 a 10 min., o percentual da fase B foi
variado de 25 a 30 %; de 10 a 16 min., foi variado de 30 a 45 %; de 16 a 18 min., manteve-se
a 45 %; de 18 a 40 min., foi variado de 45 a 80 %; e, de 40 a 50 min., foi reduzido de 80 para
25%, mantendo-se nesta condio por mais um minuto.
Nas anlises por CG, utilizou-se gs Hidrognio como fase mvel (1 mL/min). Nas
anlises por CG-EM utiliou-se gs Hlio (1 mL/min). A temperatura do injetor foi mantida a
270C, com interface a 230C, e a temperatura da coluna foi variada de 60 a 290C a 10C /
min ou a 20C / min.
48
Nestes ensaios, utilizou-se uma adaptao do mtodo descrito por Bonilla et al.
(2003); amostras de 200 mg de aa recm liofilizado foram submetidas extrao com
20 mL de sol. ATFA 0,5 % em H2O e centrifugadas a 3000 rpm por 10 min. Duas alquotas
de 1 mL foram transferidas para tubos de ensaio e 9 mL das solues tampo HCl / KCl 0,1
M (pH = 1) ou AcONa / AcOH 0,1 M (pH = 4,5) foram adicionados para diluir as alquotas.
Os tubos foram homogeneizados em vortex e, aps 15 min. de repouso, todas as solues
foram analisadas em espectrofotmetro a 510 nm e a 700 nm. O clculo do teor de
antocianinas totais nas amostras foi feito como descrito por Klopotek et al. (2005), utilizando
como base de clculo a massa molar (M.M.) e o coeficiente de extino molar () de cianidina
49
3.3.5 Ensaio preliminar das tcnicas de extrao e isolamento para a anlise de antocianinas
50
reao com orcinol desse negativa. Em seguida, 125 mL de soluo ATFA 0,5 % em CH3CN
/ H2O (1:1) foram aplicados para remover todos os pigmentos do XAD-16 e volumes
semelhantes de MeOH e gua foram utilizados para limpar a coluna.
Todas as fraes removidas com soluo ATFA 0,5 % em CH3CN / H2O (1:1) foram
concentradas em rota-evaporador (at 40C) para remover a CH3CN e reunidas. O extrato
aquoso reunido foi congelado, liofilizado e pesado. Uma pequena alquota dos pigmentos
semi-purificados obtidos foi diluda em MeOH / H2O e analisada por CLAE e EM-IES.
10 mg de frao
rica em
pigmentos
100 mg de aa
liofilizado
Extrao com ATFA 0,5 %
em CH3CN / H2O (1:1)
Filtrao
Liofilizao
Concentrao
Frao aquosa em
CH3CN / H2O / ATFA
CLAE e EM-IES
Filtrado
Partio com
Hexano
EFS em XAD-16
Dissoluo em
ATFA 0,5 %
Fase
orgnica
Liofilizao
Fase aquosa
Fase aquosa
Partio com
AcOEt
Frao
aquosa seca
17
Os quatro dgitos que designam as marchas referem-se sua data (dia e ms) de partida e so utilizados aqui
como cdigo de identificao.
51
centrifugado a 3500 rpm por 30 min. e o sobrenadante foi reunido com o obtido
anteriormente. Os 30 mL de extrato aquoso (pool sobrenadante) foram particionados duas
vezes com 30 mL de hexano e, em seguida, duas vezes com o mesmo volume de AcOEt. A
frao aquosa resultante foi concentrada em rota-evaporador (at 40C), congelada, liofilizada
e retomada em MeOH para anlise seguinte por CCD em placa de gel de slica. A frao em
AcOEt foi tambm concentrada em rota-evaporador (at 40C) e retomada em MeOH.
Soluo AcOEt / AcOH glacial / HCOOH / H2O (100:11:11:26) (WAGNER & BLADT,
1996) foi utilizada como fase mvel e as fraes obtidas foram cromatografadas em placas
separadas, em duplicata. A placa desenvolvida com o extrato rico em pigmentos foi analisada
sem tratamento e aps tratamento com orcinol sulfrico. A placa com a frao advinda da fase
AcOEt foi revelada com soluo ADBE e visualizada com luz ultravioleta (a 254 nm e
366 nm).
52
53
40 mL). Ento, a coluna foi lavada com volume suficiente de H2O e os pigmentos foram
eludos com 110 mL de soluo ATFA 0,5 % em CH3CN / H2O (1:1). Esta soluo foi
concentrada em evaporador rotatrio (a 40-45C), congelada e liofilizada. A frao liofilizada
teve sua massa determinada em balana analtica. Um resumo de todo o procedimento
apresentado nos esquemas 2 e 3.
Pool sobrenadante
2 g de aa liofilizado
Partio com
n-hexano
Fase hexano
+
Fase aquosa
Pellet + Sobrenadante
Partio com
AcOEt (3x)
Fase AcOEt
+
Fase aquosa
Pellet + Sobrenadante
2a Reextrao ATFA 0,5 %
Centrifugao por 20 min. a
3000 rpm
Pellet + Sobrenadante
Fase aquosa
Concentrao a 40-45C
Fase aquosa
Coluna de XAD-16 de 40 mL
Lavagem com H2O
Eluio com CH3CN / H2O / ATFA
143 mg de frao
rica em pigmentos
Congelamento
e Liofilizao
Frao aquosa sem
acares livres
54
3.3.9 Ensaio preliminar para a preparao de amostras para EFS em coluna de celulose
As duas primeiras fases AcOEt obtidas por partio do extrato aquoso da marcha
anterior (partida de 2 g) foram lavadas duas vezes com 100 mL de H2O, reunidas e
concentradas em evaporador rotatrio (at 40C). Como a frao concentrada normalmente
apresentava resduos de clorofilas e antocianinas, adicionou-se 50 mL de H2O e fez-se novas
parties com volumes iguais de hexano e AcOEt (duas vezes cada). A frao obtida em
AcOEt foi novamente concentrada em evaporador rotatrio e redissolvida em 2 mL de AcOH
1 % com o auxlio do ultrassom (5 min.). Em seguida, a nova soluo em AcOH 1 % foi
aplicada na coluna de celulose e submetida EFS, conforme descrito por Bloor (2001).
Assim, aps eluio do volume de injeo, a coluna foi desenvolvida com AcOH 2 % e
depois com MeOH. Cada frao foi analisada posteriormente por CLAE-DAD e a frao
eluda com AcOH 2 % foi submetida derivatizao com diazometano para anlise
subsequente por CG-EM. Um resumo deste procedimento apresentado no esquema 4.
Fase AcOEt
Concentrao
a 38-40 C
Resduo cido
Adio de H2O
Partio com
hexano
Fase hexano
+
Fase aquosa
Partio com
AcOEt
4 Fraes
Eluio com AcOH 2% e
com MeOH
Aplicao na Coluna de
Celulose
Adio de AcOH 1%
Resduo cido
Concentrao
a 38-40 C
Fase aquosa + Fase AcOEt
55
5 g de aa liofilizado
Pool sobrenadante
Extrao em Soxhlet
com hexano por 8 h
Partio com
AcOEt (2x)
Material desengordurado
(2,52 g)
Extrao com ATFA 0,5 %
Ultrassom por 12 min.
Centrifugao por 20 min. a
3000 rpm
Pellet + Sobrenadante
Reextrao ATFA 0,5 %
Centrifugao por 20 min.
a 3000 rpm
Fase aquosa
+
Fase AcOEt
Concentrao
a 38-40C
Resduo cido
Pellet + Sobrenadante
56
analisados por CG e/ou por CG-EM. As reaes com diazometano foram realizadas com e
sem adio de 10 mg de BTBA e 0,5 mL de tampo Na2HPO4 / HCl 1 M (pH = 7).
Num ensaio preliminar com o cartucho SAX, partiu-se de 5 g de aa comercial
liofilizado. Aps concentrao da frao solvel em AcOEt em evaporador rotatrio, o
resduo cido foi submetido concentrao por corrente de gs N2 at a secura. Ento,
adicionou-se 1 mL de AcONa 50 mM (pH = 7) e submeteu-se a soluo ao ultrassom por 2
min. Como a maior parte do resduo ainda no havia solubilizado, adicionou-se 0,2 mL de
MeOH e mais 0,8 mL da soluo anterior. Aps agitao, formou-se uma suspenso que pde
ser aplicada integralmente na SAX. A resina, anteriormente tratada com 3 mL de MeOH e 4
mL de H2O, foi desenvolvida com a suspenso e, em seguida, lavada com 3-4 mL de H2O.
Depois, foi desenvolvida com 4 mL de soluo H2SO4 500 mM, com a qual obteve-se uma
frao fortemente colorida. Todas as fraes recolhidas foram analisadas por CLAE-DAD e,
posteriormente, a frao rica em cidos fenlicos foi submetida derivatizao com metanol
anidro acidificado; em seguida, os produtos de reao foram analisados por CG e CG-EM.
57
58
Pool sobrenadante
5 g de aa liofilizado
Concentrao a
40C e clean-up
em coluna C18
Frao metanlica
Concentrao
at a secura
Dissoluo em
c. frmico 3 %
em H2O
Coluna C18 sob
mdia presso
Pellet + Sobrenadante
Esquema 6: Marcha 1106.
3.3.12 Testes comparativos para EFS por SAX e obteno da frao ligada parede celular
59
500 mM, com a qual obteve-se a frao rica em cidos fenlicos. Todas as fraes recolhidas
foram analisadas por CLAE-DAD.
O pellet obtido aps a segunda extrao com a sol. ATFA 0,5 % foi submetido
hidrlise bsica com 50 mL de sol. NaOH 2 M ou uma reextrao com 80 mL de EtOH
70 % em H2O seguida por lavagem com 80 mL de H2O e hidrlise bsica nas mesmas
condies. Imediatamente aps o incio da reao de hidrlise ou duas horas aps, a
suspenso foi novamente centrifugada a 3000 rpm por 20 min. e o sobrenadante foi separado
e acidificado com 6-7 mL de HCl P.A. Este foi particionado duas vezes com 50 mL de AcOEt
e as fases orgnicas foram reunidas e concentradas em evaporador rotatrio (at 40C). O
concentrado foi dissolvido em 4 mL de soluo AcONa 200 mM e eludo num cartucho SAX
como descrito anteriormente, utilizando sol. AcONa 50 mM para as lavagens. Todas as
fraes recolhidas e o extrato etanlico bruto foram tambm analisados por CLAE-DAD. Um
resumo do melhor procedimento apresentado no esquema 7.
Resduo fibroso
4 Fraes
Resduo fibroso
limpo
Soluo amostra
Hidrlise com
NaOH 2 M
Hidrolisado
Centrifugao
Acidifio do
sobrenadante
com HCl P.A.
Frao seca
Suspenso
fenlica
Partio
com AcOEt
Concentrao
em rota-vapor
Fase orgnica
60
61
2,6 g de aa
liofilizado e
desengordurado
Pool Sobrenadante
Clean up em coluna C18
Extrato antocinico
Extrao com
MeOH / ATFA 1%
em H2O (90:10)
concentrao a
38-40C
Extrato concentrado
Centrifugao a
3000 rpm
Diluio em H2O
Partio com AcOEt
Pellet + Sobrenadante
Fase orgnica
concentrao a
38-40C
Reextrao com
MeOH / ATFA 1%
em H2O (90:10)
Centrifugao a
3000 rpm
Resduo aquoso
Pellet + Sobrenadante
POLIAMIDA
62
As fraes neutras a serem derivatizadas por estes reagentes foram acidificadas com
HCl P.A. (at pH = 2) e particionadas duas vezes com volumes iguais de AcOEt. Exceto no
procedimento descrito no item 3.3.10, as fraes cidas foram diretamente particionadas com
o solvente. As fases orgnicas foram reunidas e concentradas em evaporador rotatrio (a
40C) at a secura e retomadas com a soluo reagente (diazometano em EtOH / Et2O ou
cloreto de acetila / MeOH anidro).
63
Esta reao foi testada de acordo com o mtodo proposto por Fiamegos et al. (2004) e
com modificaes para se adequar aos substratos testados. Primeiramente, utilizou-se 2 mg de
cido glico mais 2 mg de cido cafico como substratos para a reao. Estes foram
solubilizados com 0,5 mL de tampo H2PO4- / HPO42- 1 M (pH = 8) mais H2O at 10 mL. A
soluo foi transferida para um frasco Erlenmeyer com tampa de rosca vedado com teflon, ao
qual adicionou-se tambm 1 mL de sol. BTBA 0,1 M em CH2Cl2, 0,1 mL de CH3I e 1 mL de
CH2Cl2. A mistura foi, ento, aquecida a 70C por 30 min. sob agitao constante (com barra
magntica) e a fase orgnica foi recuperada com CH2Cl2 para anlise subsequente por CGEM. Posteriormente, testou-se uma quantidade maior de substrato (20 mg de cido glico)
com um tempo de reao tambm maior (1 hora). Em um segundo teste, a reao foi realizada
com 20 mg de cido cinmico, 0,1 mL de CH3I e 20 mg de BTBA recm dissolvidos em 2 mL
64
de CH2Cl2, sem aquecimento. O frasco vedado contendo todos os reagentes foi submetido a
um banho com ultrassom por 60 min. com intervalos de agitao manual vigorosa a cada
12 min. Aps todas as reaes, os produtos foram extrados por partio com CH2Cl2, usando
NaCl para aumentar a fora inica da fase aquosa. Em seguida, as fases orgnicas foram
concentradas por corrente de gs N2 e os produtos foram diludos em volumes apropriados de
clorofrmio / metanol para serem analisados por CG-EM.
Outro teste com padres, utilizando 20 mg de uma mistura de substratos (cido glico,
cinmico, p-cumrico e sirngico; 5 mg de cada), foi realizado com apenas 10 mg de BTBA
nas mesmas condies citadas anteriormente. O mesmo teste foi repetido outras vezes com
20 mg de BTBA ou BTCA e apenas 2 mg de cada substrato ou resduo da frao obtida em
AcOEt (segundo o procedimento inicial descrito no item 3.3.10).
Estes ensaios seguiram metodologia baseada na tcnica utilizada por Gao & Mazza
(1994). Alquotas de 0,5 mL de fraes da coluna C18 aberta ou da SAX foram transferidas
para um frasco Erlenmeyer com tampa de rosca vedado com teflon e submetidas hidrlise
cida por adio de 1 mL de HCl 2 M e 0,5 mL de MeOH, seguindo-se com aquecimento
100C por 1 h. Os produtos de reao foram analisados diretamente por CLAE-DAD.
65
4. RESULTADOS E DISCUSSO
De acordo com o item 3.3.10, aps extrao dos lipossolveis com hexano e
evaporao dos resduos do solvente, o material desengordurado obtido foi pesado e o teor de
lipossolveis extrado com hexano foi calculado por diferena. Trs determinaes feitas com
amostras de aa Top revelaram uma mdia de 49 % (p/p) de lipdeos totais. Para a
determinao deste teor nas amostras de aa comercial, pesou-se a frao recuperada em
hexano aps concentrao em rota-evaporador (a 40-45C). A mdia de duas determinaes
semelhantes revelaram um teor de 44 % (p/p) de lipdeos totais. Passando a fazer a
determinao do teor de lipdeos totais nas amostras de aa Top tambm por pesagem da
frao obtida em hexano, revelaram-se valores maiores que os anteriores (obtidos por marchas
66
distintas): 52 % (p/p), como mdia de trs determinaes semelhantes. Embora, em cada caso,
o nmero de determinaes tenha sido pequeno, os valores considerados nos clculos de cada
mdia foram todos muito semelhantes. Contudo, dois fatores importantes devem ser
considerados na avaliao destes resultados: a possvel evaporao incompleta dos resduos
de hexano do material desengordurado18, o que causaria uma subestimao do teor de lipdeos
totais calculado por diferena, e a provvel perda de substncias volteis durante a
concentrao da frao recuperada em hexano, o que tambm causaria uma subestimao do
teor calculado diretamente. Portanto, embora os resultados citados aqui estejam concordantes
com o valor relatado por Rogez (2000), possvel que estes teores sejam ainda maiores.
O ensaio para determinao de fenlicos totais est descrito no tem 3.3.3. Com o
auxlio de uma curva padro (Fig. 8) foi possvel expressar o teor de fenlicos totais nas
amostras de aa analisadas em equivalentes de cido glico por unidade de massa seca. A
mdia de duas determinaes semelhantes, feitas em triplicata, para trs amostras
homogeneizadas de aa comercial foi 33,2 0,92 mg equivalentes de cido glico / g de aa
liofilizado. Uma determinao isolada com outra amostra de aa comercial revelou um teor
mais elevado de fenlicos totais, 41,8 mg equivalentes de cido glico / g de aa liofilizado,
assim como outra determinao isolada, tambm feita em triplicata, com uma amostra de aa
Top, a qual revelou um teor de 36,3 mg equivalentes de cido glico / g de aa liofilizado.
Diferenas significativas entre estes valores, quando existentes, podem ser atribudas a
diversos fatores, como condies climticas de cultivo, tipo de solo, poca da colheita e
estgio de maturao dos frutos.
18
O material desengordurado no foi aquecido, para evitar degradao de pigmentos e de outros polifenis.
67
ABS
Curva Padro
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
y = 0,0229x + 0,0968
R2 = 0,9993
20
40
60
80
100
120
Figura 8: Curva padro obtida aps os ensaios com alquotas de 3 mL das solues de cido glico a 10, 25, 50 e
100 ppm.
Conforme descrito no item 3.3.4, o teor de antocianinas totais nas amostras de aa foi
calculado em equivalentes de cianidina 3-rutinosdeo (M.M. = 595,1 g / mol), j que esta a
antocianina mais abundante em E. oleracea. Embora sus absortividade molar a 510 nm (510)
seja quase quatro vezes menor que o valor correspondente para cianidina 3-glicosdeo
(FIGUEIREDO et al., 1996; KIM et al., 2005), segunda antocianina mais abundante nos
frutos, a relao entre concentrao do rutinosdeo e concentrao do glicosdeo supera a
relao observada entre suas absortividades. Considerando as razes entre os respectivos
valores de absortividade molar a 510 nm (510) e entre os valores recuperados de absorbncia
para ambos os pigmentos nos cromatogramas visualizados no mesmo comprimento de onda
(dado no mostrado), a concentrao do rutinosdeo, calculada em funo da concentrao do
glicosdeo, atinge 26 vezes a concentrao deste na amostra de aa comercial e 7 vezes na
amostra de aa Top analisada. Os respectivos teores de antocianinas totais foram calculados
68
4.2 Antocianinas
No primeiro ensaio descrito neste trabalho para a anlise de antocianinas (item 3.3.5),
utilizou-se ATFA 0,5 % em CH3CN / H2O (1:1) como soluo extratora. O uso desta soluo
gerou problemas durante a etapa de extrao da frao dos compostos fenlicos no
antocinicos com AcOEt, j que a acetonitrila migrou para a fase AcOEt, carreando
pigmentos da frao aquosa. Embora a maior parte da CH3CN tenha sido perdida durante esta
etapa, a frao aquosa foi ainda liofilizada e redissolvida em sol. ATFA 0,5 % aq. antes de ser
aplicada na coluna de XAD-16, pela qual seriam removidos acares livres e cidos
orgnicos. Aps passagem por esta resina, apenas 10 mg de frao semi-purificada de
pigmentos puderam ser recuperados, o que equivale a 10 % do material de partida (em massa
seca). Embora se tenha detectado vrias substncias no identificadas na anlise por CLAE a
280 nm (dado no mostrado), o cromatograma obtido a 520 nm (Fig. 9) mostra a deteco de,
pelo menos, seis picos bem definidos com absoro neste comprimento de onda. De acordo
com os respectivos valores de tempo de reteno de cada pico e comparando-os com os
valores obtidos para alguns padres de glicosdeos (antocianinas), pode-se sugerir que alguns
69
dos picos assinalados correspondam a cianidina 3,5-diglicosdeo (pico 1), cianidina 3galactosdeo (pico 2), cianidina 3-glicosdeo (pico 3) e cianidina 3-rutinosdeo (pico 4).
3
1
2
5
6
Figura 9: Cromatograma obtido por CLAE da frao de pigmentos semi-purificada a 520 nm. Condies
cromatogrficas: item 3.3.2.
70
Figura 10: Espectro de massas obtido por insero direta da frao de pigmentos semi-purificada.
O pico de m/z = 449 obtido por insero direta (Fig. 10) corresponderia aos picos 2 e 3
do cromatograma obtido por CLAE (Fig. 9), ou seja, aos ismeros cianidina 3-glicosdeo e
cianidina 3-galactosdeo. A anlise por fragmentao daquele pico (m/z = 449) selecionado
(Fig. 12) mostra o fragmento correspondente aglicona, cianidina (m/z = 287).
OH
OH
O
OH
CH 3
OH
O+
HO
OH
O
O HO
O
OH
OH
OH
Figura 11: Espectro de massas obtido por anlise de fragmentao do pico de m/z = 595 selecionado e estrutura
do diglicosdeo correspondente, cianidina 3-rutinosdeo19.
Como nenhum pico de massa correspondente ao diglicosdeo cianidina 3,5diglicosdeo (P.M. = 611 u.m.a.) foi detectado na primeira anlise por insero direta (Fig.
10), fez-se uma nova anlise com a amostra mais concentrada (Fig. 13). O novo espectro
19
Detalhes da nomenclatura, referentes s configuraes dos carboidratos, podem ser conferidos no Quadro 2
(item 1.3.2).
71
obtido revelou no somente o pico de m/z = 611, mas tambm o de m/z = 581. A anlise da
fragmentao deste ltimo (Fig. 14) mostra o aparecimento do pico de m/z = 443, que sugere
uma perda de 138 unidades de massa (581 - 443), seguida por outra perda de 156 unidades
(443 - 287) para gerar a aglicona, tambm cianidina.
OH
OH
O+
HO
OH
O HO
OH
OH
OH
Figura 12: Espectro de massas obtido por anlise de fragmentao do pico de m/z = 449 selecionado e estrutura
do glicosdeo predominante responsvel pelo respectivo sinal, cianidina 3-glicosdeo.
72
CL-EM, o que d possibilidade do pico 449 do espectro do sambubiosdeo ter sido gerado
devido presena deste ltimo (cianidina 3-glicosdeo).
Figura 13: Espectro de massas obtido por insero direta da frao de pigmentos concentrada.
73
Figura 14: Espectro de massas obtido por anlise de fragmentao do pico de m/z = 581 selecionado.
OH
OH
O+
HO
OH
OH
O
OH
OH
OH
HO HO
Detalhes da nomenclatura, referentes s configuraes dos carboidratos, podem ser conferidos no Quadro 2
(item 1.3.2).
74
mostrado) podem ser, respectivamente, atribudas a peonidina 3-glicosdeo e peonidina 3rutinosdeo, tambm detectadas por Schauss et al. (2006a).
Especulativamente, o sinal de m/z = 535 (Fig. 13) poderia ser atribudo malvidina 3glicosdeo-acetato, de acordo com o relato de Wang & Sporns (1999). A falta de padres de
antocianinas e o fato de no se ter feito anlises por CL-EM ou por EM de alta resoluo com
esta frao no permitiu a identificao inequvoca deste e de outros sinais.
75
extrato de uma das amostras (figuras 16 e 17) mostram que poucas substncias, alm das duas
antocianinas principais, puderam ser detectadas por esta metodologia.
Am1a
Figura 16: Cromatograma da frao aquosa do extrato Am1a obtido por CLAE com deteco a 520 nm.
Condies cromatogrficas: segundo Sumere et al. (1993). Sinais: cianidina 3-glicosdeo (1) e cianidina 3rutinosdeo (2).
Am1a
Figura 17: Cromatogramas da frao aquosa do extrato Am1a obtido por CLAE com deteco a 350 e 270 nm.
Condies cromatogrficas: segundo Sumere et al. (1993). Os principais sinais esto indicados com seus
respectivos valores de tempo de reteno (min.).
A anlise por CCD em placas de gel de slica, descrita no item 3.3.6, revelou duas
manchas de antocianinas com valores de Rf bem distintos (0 e 0,42), evidenciando a presena
76
As duas tcnicas descritas no item 3.3.8 para a obteno da frao aquosa a ser tratada
na
coluna
de
XAD-16
(40 mL)
diferem,
principalmente,
quanto
forma
de
77
A anlise por CCD em placas de gel de slica, descrita no item 3.3.6, permitiu a
deteco de duas manchas fluorescentes azuis reveladas com ADPBE a 366 nm (Rf = 0,79 e
0,88). A deteco de manchas azuis neste comprimento de onda indicou a presena de cidos
fenlicos na frao obtida em AcOEt (WAGNER & BLADT, 1996) e sugeriu que uma
partida de 100 mg de aa liofilizado seria suficiente para fornecer quantidades detectveis
destes polifenis em outras etapas analticas.
78
As fraes extradas com AcOEt, obtidas de marchas como a descrita nos itens 3.3.8 e
3.3.9, foram submetidas a EFS numa pequena coluna de celulose microcristalina para a
obteno de fraes enriquecidas com cidos fenlicos e flavonides. A anlise por CLAE da
primeira frao (F1-celulose-071221), eluda com sol. AcOH 2 %, mostra a deteco de vrias
substncias com absoro na faixa caracterstica de cidos fenlicos (Fig. 18).
Figura 18: Cromatogramas de F1-celulose-0712 obtidos a 270 e 330 nm. Condies cromatogrficas: segundo
Sumere et al. (1993). Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de reteno.
Embora, nesta etapa preliminar, no se tenha feito anlises com padres de cidos
fenlicos, a presena de vrios picos com absoro em 270 nm e 330 nm foi indicativa de que
a frao eluda com sol. AcOH 2 % estava enriquecida com tais fenlicos, o que estaria em
concordncia com a tcnica descrita por Bloor (2001). Segundo o autor, os flavonides de
uma amostra tambm contendo cidos fenlicos ficariam presos na celulose aps eluio com
AcOH 2 % e poderiam ser removidos posteriormente com um lcool. Ento, aps tratamento
21
Os quatro dgitos que acompanham as designaes das fraes se referem data (dia e ms) de partida da
marcha correspondente e so utilizados aqui como cdigo de identificao.
79
da frao cida (~ 4,5 mg) com diazometano, fez-se a anlise dos produtos de reao por CGEM (Fig. 19).
Figura 19: Cromatograma reconstrudo da F1-celulose-0712 por CG-EM (CIT22). Condies cromatogrficas:
item 3.3.2. Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de reteno (min.).
22
Contagem de ons totais; tambm conhecido pela sigla TIC, do ingls: Total Ion Count.
cido 3,4-diidroxi-benzico.
24
cido 3-metoxi-4-hidroxi-benzico.
25
cido 3,4-dimetoxi-benzico.
23
80
OCH 3
benzoato de metila
Figura 20: Espectro de massas do pico eludo em 8,4 min. (Fig. 19) obtido por CG-EM e estrutura proposta para
o derivado correspondente.
26
cido 3,4,5-triidroxi-benzico.
cido 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-benzico.
28
Nome mais comum para o 3-(3,4-dimetoxi)-fenil-2(E)-propenoato de metila.
29
cido 3,4-diidroxi-cinmico.
30
cido 3-metoxi-4-hidroxi-cinmico.
31
cido 3-(3-metoxi-4-hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico.
27
81
OCH 3
H3 CO
p-metoxi-benzoato de metila
Figura 21: Espectro de massas do pico eludo em 12,9 min. (Fig. 19) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O
H3 CO
OCH 3
H3 CO
3,4-dimetoxi-benzoato de metila
Figura 22: Espectro de massas do pico eludo em 15,7 min. (Fig. 19) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
82
O
H3CO
OCH 3
H3CO
OCH3
3,4,5-trimetoxi-benzoato de metila
Figura 23: Espectro de massas do pico eludo em 17,2 min. (Fig. 19) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O
H3CO
OCH 3
H3CO
3,4-dimetoxi-cinamato de metila
Figura 24: Espectro de massas do pequeno pico eludo em 19,0 min. (Fig. 19) obtido por CG-EM e estrutura
proposta para o derivado correspondente.
83
O
H3 CO
OCH 3
H3 CO
5(3,4-dimetoxi)-fenil-pentanoato de metila
Figura 25: Espectro de massas do pico eludo em 19,1 min. (Fig. 19) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
84
Analisando o espectro de massas da figura 25, possvel notar as perdas de 32 (252220) e 28 (220-192) unidades de massa, tpicas de steres metlicos (PRETSCH et al., 1980),
gerando um pico relativamente abundante de m/z = 192. Embora o fragmento gerado por
rearranjo de McLarferty (de m/z = 74) no tenha sido detectado, a deteco do fragmento
mais estvel (m/z = 151; pico base), por quebra da ligao C4-C5, e a deteco do pico de m/z
= 152, com abundncia relativa superior a 10 %, sustentam a proposta de um derivado de
cadeia saturada e di-substitudo no anel aromtico (figuras 26 e 27).
OCH 3
m/z = 252
H3 CO
H3CO
m/z = 151
OCH3
H3 CO
- 101
m/z = 151
H3 CO
H3 CO
OCH3
OCH3
Figura 26: Rota de fragmentao do on molecular proposto (m/z = 252) para gerar o fragmento de m/z = 151.
85
H3 CO
OCH 3
m/z = 252
OCH3
- CH2CHCH2COOCH3
H3CO
m/z = 152
OCH3
Figura 27: Rota de fragmentao do on molecular proposto (m/z = 252) para gerar o fragmento de m/z = 152.
86
cido glico
cido protocatecuico
cido p-hidroxi-benzico
cido clorognico
cido sirngico
cido vanlico
Epicatequina
Catequina
cido cafico
cido vertrico
cido ferlico
cido p-cumrico
cido elgico
cido cinmicob
6,3-6,7
12,4-12,7
19,1
20,3-20,7
20,9
20,9-21,0
21,5
21,7
22,4-23,0
25,1-25,5
27,0
27,6-27,8
30,1
30,4
87
3
1
6
5
4
Figura 28: Cromatograma da F1-celulose-1001 obtido por CLAE-DAD a 280 nm. Condies cromatogrficas:
segundo Wen et al. (2005). Sinais identificados: cido glico (1), cido vanlico (4) e cido vertrico (5). Os
principais sinais no identificados esto indicados com seus respectivos espectros obtidos no UV.
88
OH
HO
O
OCH3
HO
cido vanlico
OH
OH
H3CO
HO
OCH3
OH
cido glico
cido vertrico
89
Figura 30: Cromatograma reconstrudo da F1-celulose-1001 por CG-EM (CIT). Condies cromatogrficas:
item 3.3.2. Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de reteno (min.).
As diferenas observadas entre os resultados obtidos com F1-celulose-0712 e F1celulose-1001 podem ser atribudas falta de padronizao dos procedimentos realizados
durante a marcha 1001, no descrita na seo 3 (Material e Mtodos) pelo mesmo motivo, ou
ainda a algum problema com a coluna de celulose, a qual j havia sido reutilizada em trs
anlises consecutivas. Por outro lado, embora o estado de conservao da coluna durante a
marcha 0712 fosse melhor, a deteco de substncias contaminantes em F1-celulose-0712 foi
maior. Substncias de carcter lipossolvel considervel, entre elas um carotenide (16,4
min.) e at mesmo uma cera (23,4 min), puderam ser detectadas nesta frao cida (Fig. 19).
Alm disso, a carga de material lipossolvel eludo nas fraes da celulose era, muitas vezes,
visivelmente expressiva, indicando que a etapa de desengorduramento por partio do extrato
aquoso com hexano no havia sido eficiente. Portanto, aps algumas tentativas frustradas de
90
se repetir os resultados obtidos pela marcha 071232 com partidas de 5 g de material liofilizado,
utilizando a mesma coluna de celulose, todos os ensaios passaram a ser iniciados com
extrao dos lipossolveis em aparelho de Soxhlet, ainda com hexano. Entretanto, no primeiro
ensaio realizado com aparelho de Soxhlet, ainda se utilizou a mesma coluna de celulose e no
obteve-se resultados satisfatrios.
A tcnica utilizada para a obteno da frao submetida EFS com a RTIFB foi
descrita no item 3.3.10. Antes de seu uso, a resina foi tratada com 7,5 mmols de NaOH,
suficientes para preencher todos os stios positivos da resina com hidroxilas (esq. 9; R1). Em
seguida, foi necessrio um volume bastante elevado (70 mL) de sol. MeOH / H2O (1:1) para
neutralizar a resina, ou seja, remover a base forte (OH-) e recolocar uma base fraca
(provavelmente Cl-, j que a gua purificada utilizada tem pH = 5 e este deve ser o contra-on
presente) (esq. 9; R2).
Esquema 9: Reaes com a resina trocadora de ons fortemente bsica. R-N+(CH3)3: stio de ligao da RTIFB;
HO2CR / -O2CR: cido fenlico e base conjugada; HOAc / -OAc: cido actico e base conjugada.
Como a frao cida foi diluda em sol. AcONa 500 mM (pH = 8), todos os seus
constituintes cidos foram ionizados, inclusive os cidos fenlicos, cujo pKa33 da funo
32
33
Trs marchas semelhantes, com resultados equivalentes, foram representadas aqui com a designao 0712.
Logartmo do inverso da constante de ionizao cida.
91
cida varia em torno de 4,5 (FIAMEGOS et al., 2004; DOVBII et al., 2006). Nestas
condies, durante a eluio desta frao amostra, os cidos fenlicos ionizados (bases
conjugadas relativamente fortes) substituiram os ons Cl- (bases fracas) nos stios positivos da
resina (esq. 9; R3). Esta interao seria forte o suficiente para resistir a lavagem com a sol.
MeOH / H2O (1:1), a qual carrearia todos os interferentes no ionizveis (como os
flavonides) e as bases conjugadas fracas (de cidos fortes, como o ATFA) solveis em tal
soluo. A anlise por CLAE-DAD da frao eluda com a sol. HCl P.A. (1:20; v/v) em
MeOH / H2O (1:1) (F2-RTIFB-1104) revelou a deteco de quatro substncias em altssimas
propores (Fig. 31). Como os valores de tempo de reteno obtidos nas condies descritas
por Wen et al. (2004) apresentaram-se significativamente deslocados para a esquerda (em 0,52 min.) (Fig. 31 e tab. 1), a identificao inequvoca dos cidos sirngico, p-cumrico e
cinmico requereu nova anlise da F2-RTIFB-1104 por CLAE-DAD, utilizando as condies
descritas por Sumere et al. (1993) (Fig. 31, insert a).
Detector A-290 nm
F2-RTIFB-110407
F2-RTIFB-1104_Wen
1200
Detector A-280 nm
F2-1104-Res Troc de ons Fort Bsica-1o teste
F2-1104-RTFB
1750
(a)
1500
1200
(b)
1750
1500
1250
1250
1000
1000
750
750
500
500
250
250
mAU
1000
mAU
1000
800
800
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
600
400
400
200
200
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 31: Cromatograma de F2-RTIFB-1104 obtido por CLAE-DAD com deteco a 280 nm. Condies
cromatogrficas: segundo Wen et al. (2004). Sinais: cido sirngico (1), cido 3-(4-hidroxi)-fenil-2(Z)propenico (2), cido p-cumrico (3) e cido cinmico (4). Insert a: cromatograma de F2-RTIFB-1104 obtido
nas condies descritas por Sumere et al. (1993). Insert b: espectro do pico 2 obtido no UV.
mAU
mAU
600
92
27.71 min
Lambda max : 309 197 226 209
Lambda min : 205 191 216 247
200
250
300
350
nm
Figura 32: espectro do cido p-cumrico obtido no UV.
93
HO
HO
94
OCH3
H3CO
p-metoxi-benzoato de metila
Figura 34: Espectro de massas do ster metlico do cido p-metoxi-benzico obtido por CG-EM dos produtos de
reao da F2-RTIFB-1104 com diazometano e BTBA.
OCH 3
HO
p-hidroxi-benzoato de metila
Figura 35: Espectro de massas do ster metlico do cido p-hidroxi-benzico obtido por CG-EM dos produtos de
reao da F2-RTIFB-1104 com diazometano e BTBA.
95
H3 CO
p-metoxi-benzoato de butila
Figura 36: Espectro de massas do ster butlico do cido p-metoxi-benzico obtido por CG-EM dos produtos de
reao da F2-RTIFB-1104 com diazometano e BTBA.
HO
p-hidroxi-benzoato de butila
Figura 37: Espectro de massas do ster butlico do cido p-hidroxi-benzico obtido por CG-EM dos produtos de
reao da F2-RTIFB-1104 com diazometano e BTBA.
96
Embora parea evidente que a grande massa de material recuperado da RTIFB se deva
a contaminantes polares advindos da prpria resina, devido provavelmente ao tratamento com
NaOH ou MeOH, uma pequena alquota de 2 mg da F2-RTIFB-1104 liofilizada foi submetida
ainda esterificao com metanol anidro acidificado. Os produtos da reao foram analisados
por CG, detectando-se vrios picos de muito baixa intensidade (Fig. 38), entre eles dois picos
com o mesmo tempo de reteno que os steres metlicos obtidos por reao com padres de
cido cinmico e cido sirngico, tambm detectados pela primeira vez em E. oleracea. A no
deteco de derivados do cido p-cumrico sugere que este (assim como o seu ismero Z)
tenha sido degradado prontamente a cido p-hidroxi-benzico durante as etapas de
concentrao da frao cida, embora o ster metlico deste tlimo quase no tenha sido
detectado (Fig. 38; seta em 10,8 min.). Este resultado confirma a baixa proporo de
substratos para a reao de esterificao nos 2 mg da F2-RTIFB-1104 liofilizada.
Figura 38: Cromatograma de F2-RTIFB-1104 obtido por CG. Condies cromatogrficas: item 3.3.2. Sinais
identificados: cinamato de metila (9,8 min.), p-hidroxi-benzoato de metila (seta) e 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato de metila (14,6 min.).
97
Um ensaio preliminar com o cartucho SAX foi descrito no item 3.3.10. Nele, a frao
obtida em AcOEt, aps ser concentrada at a secura, foi suspensa em um total de 1,8 mL de
sol. AcONa 50 mM mais 0,2 mL de MeOH. A adio de MeOH tinha como objetivo a
dissoluo total dos constituntes da frao, embora o solvente pudesse causar uma perda da
capacidade de troca da resina, segundo o manual do fabricante. Ainda segundo o mesmo
manual, o condicionamento da resina e as etapas de lavagem poderiam ser feitos com gua
desionizada ou com um tampo de baixa fora inica. Ento, aps o condicionamento da
resina com H2O, a suspenso amostra34 foi aplicada e a frao coletada durante a eluio desta
foi denominada F0-SAX-1707, a qual conteria as substncias sem qualquer afinidade pela
resina. A frao coletada durante a etapa de lavagem com H2O foi denominada F1-SAX1707; a parte final desta frao, prxima interface com a soluo seguinte, foi recolhida em
frasco separado e denominada F2-SAX-1707; e a frao recolhida com a sol. H2SO4 500 mM
foi denominada F3-SAX-1707. Os cromatogramas obtidos das anlises destas fraes por
CLAE-DAD (Fig. 39) revelaram que a maior parte das substncias detectadas foi recuperada
em F1, eluda com H2O, e em F3, onde se esperava recuperar todos os cidos fenlicos.
34
Mesmo aps a adio dos 0,2 mL de metanol, a frao obtida em AcOEt no foi solubilizada completamente.
98
1: 280 nm, 8 nm
F0-SAX-170707 (passagem direta)
F0-SAX-1707
1: 280 nm, 8 nm
F1-SAX-170707 (passagem direta)
F1-SAX-1707
1: 280 nm, 8 nm
F2-SAX-170707 (passagem direta)
F2-SAX-1707
800
1: 280 nm, 8 nm
F3-SAX-170707 (H2SO4 500 mM)
F3-SAX-1707
600
600
400
400
200
200
F3
F2
F1
F0
mAU
mAU
800
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 39: Cromatogramas sobrepostos das fraes F0 a F3-SAX-1707 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993).
99
Detector A-283 nm
F1-SAX-170707 (passagem direta)
F1-SAX-1707
250
10
250
Retention Time
200
200
3
1
mAU
150
mAU
150
7
4
100
100
50
50
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 40: Cromatograma da F1-SAX-1707 a 280 nm. Condies cromatogrficas: conforme descrito por
Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cido protocatecuico (1), cido p-hidroxi-benzico (2), cido vanlico
(3) e cido sirngico (4).
Quatro cidos fenlicos puderam ser identificados antes e aps a reao de hidrlise e
vrios picos, incluindo o de maior intensidade (mx. = 290 nm), no puderam ser
identificados, entre os quais tambm o nico produto evidente gerado pela reao (Fig. 41;
pico 11). Este corresponderia a uma aglicona gerada, provavelmente, a partir de um dos dois
provveis substratos (ou de ambos) consumidos pela reao, os picos eludos em 28,3 e 29,9
min. (Fig. 40; setas).
100
Detector A-283 nm
F1-SAX-170707 hidrlise cida
F1-SAX-1707-hidrlise cida
200
200
10
Retention Time
150
150
100
mAU
mAU
3
100
7
8
11
50
50
6
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 41: Cromatograma da F1-SAX-1707 a 280 nm aps hidrlise cida. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cido protocatecuico (1), cido p-hidroxibenzico (2), cido vanlico (3) e cido sirngico (4).
Diante deste resultado, tornou-se evidente que a primeira hiptese poderia ser
descartada, j que a maior parte das substncias presentes em F1-SAX-1707 no correspondia
a cidos fenlicos glicosilados. Alm disso, como a maioria das substncias com tempo de
reteno maior que 15 min. eluiram nesta frao, a no deteco de cido glico aps
hidrlise sugeriu a inexistncia de derivados hidrolisveis deste cido em toda a frao obtida
em AcOEt, contrariando os resultados obtidos por outros autores (INSFRAN et al., 2004;
PACHECO et al., 2007). Por outro lado, a maior parte das substncias eludas em F3-SAX1707 (Fig. 39) tiveram tempo de reteno inferior a 15 min., mostrando que as bases
conjugadas dos cidos mais polares foram retidas preferencialmente na resina durante o
tratamento com H2O nas condies descritas para este ensaio. Isto poderia sugerir que apenas
os cidos mais fortes (de pKa mais baixo) no estariam sendo removidos pelo tratamento com
gua purificada, cujo pH varia entre 5 e 6. Entre os picos detectados no cromatograma obtido
por CLAE-DAD da F3-SAX-1707, apenas dois cidos fenlicos puderam ser identificados
por comparao de seus respectivos valores de tempo de reteno e espectros obtidos no UV
101
1000
Detector A-280 nm
F3-SAX-170707 (H2SO4 500 mM)
F3-SAX-1707
800
mAU
600
400
200
7 8
6
10
15
20
25
Minutes
30
35
40
45
50
Figura 42: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-1707 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cido glico (1) e cido protocatecuico (4).
102
11,0
14,2
10,4
11,5
12,0
13,7
13,5 14,6
16,6
Figura 43: Cromatograma da F3-SAX-1707 obtido por CG. Condies cromatogrficas: item 3.3.2. Os principais
sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de reteno (min.).
35
103
14.3
12.5
17.4
Figura 44: Cromatograma reconstrudo da F3-SAX-1707 por CG-EM (CIT). Condies cromatogrficas:
conforme descrito no item 3.3.2. Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de
reteno.
36
Informao passada diretamente pelo Prof. Dr. Armando U. O. Sabaa Srur do Instituto de Nutrio da UFRJ,
um dos scios da empresa Top Aa Ltda.
104
O
O
O
O
1-propen-1,2,3-tricarboxilato de metila
Figura 45: Espectro de massas do pico eludo em 13,2 min. (Fig. 44) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O
HO
O
O
O
2-propanol-1,2,3-tricarboxilato de metila
Figura 46: Espectro de massas do pico eludo em 13,7 min. (Fig. 44) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
105
5-oxo-tetraidrofurano-2,3-dicarboxilato de metila
Figura 47: Espectro de massas do pico eludo em 14,3 min. (Fig. 44) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
A deteco de trs derivados de cidos fenlicos, eludos em 14,6 min., 17,0 min. e
17,4 min. (Fig. 44), permitiu uma avaliao da reao de esterificao. A elucidao das
estruturas correspondentes (figuras 48-50) revelou que a esterificao com metanol anidro
acidificado tambm pode gerar produtos fenol-metilados, como a reao com diazometano, j
que F3-SAX-1707 no continha cido vanlico nem cido sirngico, mas sim os respectivos
precursores: cido protocatecuico e cido glico (Fig. 42). Embora as anlises realizadas por
CG com os produtos de esterificao dos padres destes cidos fenlicos no tenham
evidenciado a existncia deste tipo de derivatizao, a anlise por CG com os produtos de
reao da F3-SAX-1707 (Fig. 43) confirma a deteco de derivados dos cidos vanlico e
sirngico (eludos em 11,5 e 14,6 min., respectivamente). A ocorrncia deste tipo de reao
talvez seja o motivo pelo qual quase no se detectou o ster metlico do cido p-hidroxibenzico nos produtos de esterificao da F2-RTIFB-1104 (Fig. 38).
106
O
O
O
HO
3-metoxi-4-hidroxi-benzoato de metila
Figura 48: Espectro de massas do pico eludo em 14,7 min. (Fig. 44) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O+
O
HO
m/z = 151
Figura 49: Espectro de massas do pico eludo em 17,0 min. (Fig. 44) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o on de m/z = 151 (pico base).
107
O
O
O
HO
O
3,5-dimetoxi-4-hidroxi-benzoato de metila
Figura 50: Espectro de massas do pico eludo em 17,4 min. (Fig. 44) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
37
108
109
1: 280 nm, 8 nm
F0-SAX-090807 (passagem direta)
F0-SAX-0908
1: 280 nm, 8 nm
F1-SAX-090807 (lavagem com H2O/pH=8)
F1-SAX-0908
1: 280 nm, 8 nm
F2-SAX-090807 (removido com H2SO4)
F2-SAX-0908
700
1: 280 nm, 8 nm
F3-SAX-090807 (removi com H2SO4)
F3-SAX-0908
600
600
500
500
400
400
300
300
200
200
100
mAU
mAU
700
100
F3
F2
F1
F0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 51: Cromatogramas sobrepostos das fraes F0 a F3-SAX-0908 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993).
A anlise dos dados espectrais e dos respectivos valores de tempo de reteno dos
picos eludos em F3-SAX-0908 mostra que as condies cromatogrficas descritas por
Sumere et al. (1993) no eram adequadas para resolver os picos referentes aos cidos pcumrico e ferlico, co-eludos em 27,6 min. (Fig. 52). O espectro obtido no UV para a
mistura (insert b) est indicado para o pico correspondente. Alm disso, os picos 1, 2 e 6 do
cromatograma apresentam, respectivamente, as mesmas caractersticas espectrais que os picos
3, 5 e 7 do cromatograma obtido com a F3-SAX-1707 (Fig. 42) e, portanto, poderiam ser
relacionados com o cido ctrico e seus anlogos. A anlise do mesmo cromatograma a
260 nm (Fig. 52; insert a) mostra a alta proporo dos cidos p-hidroxi-benzico, vanlico e
sirngico na F3-SAX-0908.
110
Detector A-279 nm
F3-SAX-090807 (removi com H2SO4)
F3-SAX-0908
Retention Time
500
500
(b)
350
Detector A-260 nm
F3-SAX-090807 (removi com H2SO4)
F3-SAX-0908
350
(a)
300
300
250
250
400
400
150
150
100
100
50
50
10
15
20
25
30
35
40
45
300
mAU
mAU
300
200
mAU
mAU
200
50
Minutes
200
200
4
6
2
100
9
8
100
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 52: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-0908 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cido p-hidroxi-benzico (3), cido vanlico
(4), cido sirngico (5) e cidos ferlico e p-cumrico (7). Insert a: mesmo cromatograma monitorado a 260 nm.
Insert b: espectro do pico 7 obtido no UV.
Com o objetivo de se confirmar a identidade dos cidos co-eludos anteriormente, fezse nova anlise por CLAE-DAD com a mesma frao nas condies descritas por Wen et al.
(2005). O cromatograma obtido mostra a boa separao dos picos referentes aos cidos pcumrico e ferlico (Fig. 53), embora os cidos p-hidroxi-benzico, vanlico e sirngico
passem a co-eluir nestas condies (pico 1).
111
Detector A-280 nm
F3-SAX-090807-(H2SO4 500 mM)
F3-SAX-0908_Wen
800
800
600
600
400
200
mAU
mAU
2
400
200
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 53: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-0908 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Wen et al. (2005). Sinais identificados: cidos p-hidroxi-benzico, vanlico e sirngico (1),
cido ferlico (2) e cido p-cumrico (3).
112
80
80
60
60
40
40
20
20
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 54: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-2307 (frao obtida por marcha no descrita) a
280 nm. Condies cromatogrficas: conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinal indicado por seu
respectivo espectro no UV: cido glico.
38
cido 2,4,6-triidroxi-benzico.
mAU
mAU
Detector A-280 nm
F3-SAX-230707 (H2SO4 500 mM)
F3-SAX-2307
113
R1
R1
OH
O+
HO
HO
R2
OH
OH
A
CHO
B
O
R2
OH
OH
OH
OH
Antocianidina
Pelargonidina
Cianidina
Peonidina
Delfinidina
Petunidina
Malvidina
cido fenlico
correspondente
p-hidroxi-benzico
protocatecuico
vanlico
glico
3-metoxi-4,5diidroxi-benzico
sirngico
R1
R2
H
OH
OCH3
OH
OCH3
H
H
H
OH
OH
OCH3
OCH3
39
114
500
1: 280 nm, 8 nm
F0-SAX-200807 (passagem direta / somente amostra)
F0-SAX-2008_Wen
1: 280 nm, 8 nm
F1-SAX-200807 (lavaagem com sol. AcONa 50 mM)
F1-SAX-2008_Wen
1: 280 nm, 8 nm
F2-SAX-200807 (removido com sol. H2SO4 500 mM)
F2-SAX-2008_Wen
500
1: 280 nm, 8 nm
F3-SAX-200807 (removido com sol. H2SO4 500 mM)
F3-SAX-2008_Wen
300
300
200
200
100
100
mAU
400
mAU
400
F3
F2
F1
F0
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 56: Cromatogramas sobrepostos das fraes F0 a F3-SAX-2008 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Wen et al. (2005).
A anlise dos dados espectrais obtidos no UV revelou que dois picos, eludos entre 25
e 26 min., estavam presentes em todos os cromatogramas das fraes SAX-2008 (Fig. 56).
Estes picos, com bandas fortes entre 345 e 350 nm (Fig. 57), corresponderiam a dois Cglicosdeos de flavonas, provavelmente homoorientina40 e orientina41, segundo dados da
literatura (GALLORI et al., 2004; SCHAUSS et al., 2006a), indicando que as condies
descritas para este ensaio ainda no eram satisfatrias para se obter uma frao rica em cidos
fenlicos e livre de flavonides. Alm disso, a deteco de glicosdeos de flavonides nesta
marcha, mas no na anterior, sugere que estas molculas tenham sido degradadas durante o
tratamento da frao cida da marcha 0908 com a sol. NaOH 3 % (p/v). Por outro lado, a
deteco destes flavonides na F3-SAX-2008 evidenciou a ocorrncia de ionizao parcial
destas molculas na soluo de pH corrigido, obtida aps dissoluo da frao amostra em
sol. AcONa 200 mM. Entretanto, embora o valor de pKa de hidroxilas fenlicas varie
normalmente em torno de 10, o valor correspondente destes grupos em flavonides bastante
40
41
Luteolina 6-C-glicosdeo.
Luteolina 8-C-glicosdeo.
115
varivel (entre 7,3 e 12,5) ou ainda desconhecido para a maioria deles (FIAMEGOS et al.,
2004). Portanto, como a faixa de pKa1 (referente carboxila) dos cidos fenlicos (~ 4,5)
exige que se trabalhe com a SAX em valores de pH acima de 7 para mant-los todos
ionizados, tornou-se evidente que esta resina no era adequada para o isolamento de cidos
fenlicos em presena de certos flavonides, com valores de pKa muito baixos. O
comportamento varivel de flavonides de mesma classe extrados de E. oleracea pde ser
verificado aqui aps a deteco de outros dois glicosdeos de flavonas apenas em F0, F1 (Fig.
58) e F2. Estes, provavelmente, corresponderiam a isovitexina (27,2 min.) e seu ismero (26,2
min.) ainda no identificado, conforme proposta feita por Schauss et al. (2006a).
Detector A-350 nm
F3-SAX-200807 (removido com sol. H2SO4 500 mM)
F3-SAX-2008_Wen
300
300
250
250
200
200
150
150
100
100
50
50
mAU
350
mAU
350
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 57: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-2008 a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Wen et al. (2005). Sinais indicados: homoorientina (24,8 min.) e orientina (25,2 min.).
116
Detector A-350 nm
F1-SAX-200807 (lavaagem com sol. AcONa 50 mM)
F1-SAX-2008_Wen
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
10
15
20
25
30
35
mAU
mAU
60
40
Minutes
Figura 58: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F1-SAX-2008 a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Wen et al. (2005). Sinais indicados: isovitexina (27,2 min.) e seu ismero (26,2 min.).
Embora a etapa de extrao da frao aquosa da marcha 2008 tambm no tenha sido
assistida por ultrassom (item 3.3.12), o cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX2008 a 280 nm (Fig. 59) mostra claramente a deteco de cido protocatecuico (pico 4).
Portanto, assim como nas amostras de aa comercial, a deteco deste cido em amostras de
aa Top poderia estar relacionada com uma contaminao da frao orgnica (AcOEt) com
quantidades significativas de pigmentos da frao aquosa (como citado no item 3.3.9), fato
ocorrido durante a marcha 2008, mas no durante a marcha anterior (0908). Alm de cido
protocatecuico, uma pequena quantidade de cido glico tambm foi detectada, mas sua
concentrao foi, de longe, muito inferior observada em F3-SAX-1707 (Fig. 42).
117
Detector A-281 nm
F3-SAX-200807 (removido com sol. H2SO4 500 mM)
F3-SAX-2008_Wen
300
300
18
16
200
mAU
12
4
150
11
200
15 17
150
14
20 21
22
3
100
250
19
mAU
13
250
100
7
10
1
50
50
5
2
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 59: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-2008 a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Wen et al. (2005). Sinais identificados: cido glico (2), cido protocatecuico (4), cido
clorognico (7), cidos p-hidroxi-benzico, vanlico e sirngico (8), cido cafico (10), homoorientina (15),
orientina (16), cido ferlico (17) e cido p-cumrico (18).
42
118
algum destes picos como o ismero 3 do cido clorognico (cido neoclorognico) no seria
compatvel com os valores de tempo de reteno citados para tal molcula na literatura (GAO
& MAZZA, 1995; BENGOECHEA et al., 1997), mas o ismero 4 deste cido poderia estar
presente. Contudo, existiria ainda a possibilidade destes compostos serem derivados de cidos
cinmicos com cido glico. Isto explicaria a baixa concentrao de cido glico livre nesta
frao, mas no na frao equivalente da marcha anterior (F3-SAX-0908), na qual no se
detectou cido glico nem tais derivados (figuras 52 e 53). Alm disso, vale mencionar
tambm que os derivados de cido glico citados na literatura para E. oleracea (INSFRAN et
al., 2004; PACHECO et al., 2007) tem caractersticas espectrais semelhantes do cido
glico (mx. = 270 nm), indicando que estes seriam derivados esterificados na funo
carboxila (tipo galatos).
HOOC
OH
O
OH
O
HO
OH
OH
119
1: 280 nm, 8 nm
F0-SAX-pellet-hid-basica-090807
F0-SAX-pellet-hid-basica-0908_W en
700
1: 280 nm, 8 nm
F3-SAX-pellet-hid-basica-090807
F3-SAX-pellet-hid-basica-0908_W en
600
600
500
500
400
400
300
300
200
200
100
100
F3
F0
mAU
mAU
700
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 61: Cromatogramas sobrepostos das fraes F0 e F3-SAX-pellet-0908 a 280 nm. Condies
cromatogrficas: conforme descrito por Wen et al. (2005).
A deteco dos cidos protocatecuico, p-hidroxi-benzico, vanlico, ferlico e pcumrico em altas propores na F3-SAX-pellet-0908 (Fig. 62) sugeriu que todos estes
120
cidos, entre outros, fossem os constituintes principais da frao ligada parede celular. O
pico 5, tambm detectado na F2-RTIFB-1104 (Fig. 31), corresponderia ao cido 3-(4hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico (o ismero cis do cido p-cumrico), enquanto o pico 6, com
espectro no UV tambm semelhante ao do cido p-cumrico, seria o pico mais intenso ainda
no identificado. Entre outros picos no identificados, os picos 1 e 2 seriam dois dos anlogos
do cido ctrico j detectados anteriormente (Fig. 42) e o pico 9 seria mais um derivado
cinmico, com absoro mxima em 285-290 sh e 323 nm.
700
700
Detector A-281 nm
F3-SAX-pellet-hid-basica-090807
F3-SAX-pellet-hid-basica-0908_Wen
600
600
500
500
8
3
400
300
300
200
200
100
mAU
mAU
400
100
2
0
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 62: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-pellet-0908 a 280 nm. Condies
cromatogrficas: conforme descrito por Wen et al. (2005). Sinais identificados: cido protocatecuico (3), cidos
p-hidroxi-benzico e vanlico (4), cido 3-(4-hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico (5), cido ferlico (7) e cido pcumrico (8).
121
Figura 63: Cromatograma reconstrudo da F3-SAX-pellet-0908 por CG-EM (CIT). Condies cromatogrficas:
conforme descrito no item 3.3.2. Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de
reteno.
O
HO
O
O
O
2-propanol-1,2,3-tricarboxilato de metila
Figura 64: Espectro de massas do pico eludo em 14,5 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
122
OCH3
H3CO
p-metoxi-benzoato de metila
Figura 65: Espectro de massas do pico eludo em 13,4 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
123
OCH 3
HO
p-hidroxi-benzoato de metila
Figura 66: Espectro de massas do pico eludo em 14,4 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
Os dois steres metlicos detectados em 15,3 min. (Fig. 67) e 16,1 min. (Fig. 68)
confirmaram a deteco dos cidos protocatecuico e vanlico por CLAE-DAD (Fig. 62); um
seria o ster metlico 3-metoxi 4-hidroxilado e o outro seria o 3-hidroxi 4-metoxilado. Alm
destes dois, um ster metlico dimetoxilado (Fig. 69) e um derivado de estrutura desconhecida
(Fig. 70) tambm foram detectados.
124
O
H3CO
OCH3
HO
vanilato de metila
Figura 67: Espectro de massas do pico eludo em 15,3 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O
HO
OCH 3
H3 CO
3-hidroxi-4-metoxi-benzoato de metila
Figura 68: Espectro de massas do pico eludo em 16,1 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
125
O
H3CO
OCH 3
H3CO
3,4-dimetoxi-benzoato de metila
Figura 69: Espectro de massas do pico eludo em 16,2 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O+
O
HO
m/z = 151
Figura 70: Espectro de massas do pico eludo em 16.8 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o on de m/z = 151 (pico base).
126
Como o cido glico no foi detectado no cromatograma obtido por CLAE-DAD (Fig.
62), o derivado trimetoxilado (Fig. 71), detectado em 17,6 min., foi relacionado com o cido
sirngico, que embora tambm no tenha sido aparentemente detectado no mesmo
cromatograma, co-eluiria com os cidos p-hidroxi-benzico e vanlico nas condies
utilizadas e poderia ter seu espectro no UV encoberto pelos espectros de ambos.
O
H3CO
OCH 3
H3CO
OCH3
3,4,5-trimetoxi-benzoato de metila
Figura 71: Espectro de massas do pico eludo em 17,6 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
127
um derivado do cido ferlico (Fig. 62; pico 7) e o segundo seria um derivado de seu ismero
cis, provavelmente eludo em 24,6 min. (Fig. 62; pico 6).
Embora o cromatograma obtido por CLAE-DAD (Fig. 62) tenha revelado a presena
do cido p-cumrico e de seu ismero cis, apenas dois derivados deste cido foram
detectados por CG-EM, um p-metoxilado (Fig. 75) e o outro p-hidroxilado (Fig. 76), o que
sugere a presena de apenas um dos dois precursores.
O
H3CO
OCH 3
HO
ferulato de metila
Figura 72: Espectro de massas do pico eludo em 19,2 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
128
H3CO
H3CO
H 3CO
3,4-dimetoxi-(Z)-cinamato de metila
Figura 73: Espectro de massas do pico eludo em 18,4 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
O
H3CO
OCH 3
H3CO
3,4-dimetoxi-(E)-cinamato de metila
Figura 74: Espectro de massas do pico eludo em 19,7 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
129
OCH 3
H3CO
p-metoxi-cinamato de metila
Figura 75: Espectro de massas do pico eludo em 17,4 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
OCH 3
HO
p-hidroxi-cinamato de metila
Figura 76: Espectro de massas do pico eludo em 18,2 min. (Fig. 63) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
130
Quando o pellet recuperado aps a obteno do extrato aquoso foi previamente tratado
com EtOH 70 % e gua purificada (pellet 2008), a concentrao de cido protocatecuico entre
os produtos de hidrlise bsica caiu consideravelmente (Fig. 77), sugerindo que este seja
apenas um contaminante gerado por degradao de antocianinas residuais. Por outro lado,
embora o cromatograma da F3-SAX-pellet-2008 mostre apenas cinco picos principais (todos
mais intensos que os picos correspondentes da marcha anterior), outros picos menores
tambm poderiam corresponder a substncias exclusivas desta frao. Os picos eludos em
24,5 min., 25,2 min. e 29,9 min., com espectros no UV tpicos de derivados cinmicos (Fig.
77; insert b), no foram detectados na frao rica em cidos fenlicos livres da marcha 2008
(Fig. 58) e, portanto, seriam constituintes exclusivos da frao ligada. A alta proporo de
cido p-hidroxi-benzico pode ser verificada no cromatograma obtido a 260 nm (Fig. 77;
insert a), o que sustenta a proposta feita por Chakraborty et al. (2006), a qual sugere que este
cido seja um marcador quimiotaxonmico para a famlia Palmae.
Detector A-281 nm
F3-SAX-pellet-200807-hidrlise bsica
F3-SAX-pellet-2008_Wen
1750
Detector A-260 nm
F3-SAX-pellet-200807-hidrlise bsica
F3-SAX-pellet-2008_W en
2500
(a)
2000
2000
1500
1500
mAU
1250
1750
2500
1500
(b)
1250
mAU
1500
1000
1000
5
6
500
1000
500
3 4
1000
0
10
15
20
25
30
35
mAU
mAU
40
Minutes
750
750
2
500
500
3 4
250
250
1
0
10
15
20
25
30
35
40
Minutes
Figura 77: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-pellet-2008 a 280 nm. Condies
cromatogrficas: conforme descrito por Wen et al. (2005). Sinais identificados: cido protocatecuico (1), cidos
p-hidroxi-benzico e vanlico (2), cido 3-(4-hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico (3), cido 3-(3-metoxi-4-hidroxi)fenil-2(Z)-propenico (4), cido ferlico (5) e cido p-cumrico (6). Insert a: mesmo cromatograma recuperado a
260 nm. Insert b: espectro obtido no UV para o pico eludo em 24,5 min.
131
Figura 78: Cromatograma reconstrudo da F3-SAX-pellet-2008 por CG-EM (CIT). Condies cromatogrficas:
conforme descrito no item 3.3.2. Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de
reteno.
132
Interessantemente, desta vez, nenhum derivado de cido ctrico foi detectado, assim
como nenhum derivado de cido glico ou sirngico, evidenciando que estes cidos no so
constituintes da frao ligada. A deteco de apenas dois derivados de cido protocatecuico
ou vanlico (16,1 e 16,2 min.) refletiu a baixa concentrao de cido protocatecuico nesta
frao (Fig. 77; pico 1), o qual tambm no deve ser um constituinte real da frao ligada.
Ao contrrio do que havia sido sugerido pelos resultados da marcha anterior, a
presena do ismero cis do cido p-cumrico foi confirmada aqui aps a deteco de quatro
derivados deste cido, dois steres p-metoxilados e dois p-hidroxilados (figuras 79-82). A
deteco do mesmo nmero de derivados do cido ferlico, eludos em 17,7 min., 18,4 min.,
19,2 min. e 19,7 min. (Fig. 78), confirmou a presena dos dois ismeros (E e Z) propostos
anteriormente. Este o primeiro relato que mostra a deteco destes ismeros Z em frutos de
E. oleracea na literatura.
H3 CO
H 3CO
p-metoxi-(z)-cinamato de metila
Figura 79: Espectro de massas do pico eludo em 16,3 min. (Fig. 78) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
133
HO
H 3CO
p-hidroxi-(z)-cinamato de metila
Figura 80: Espectro de massas do pico eludo em 17,0 min. (Fig. 78) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
OCH 3
H3 CO
p-metoxi-(E)-cinamato de metila
Figura 81: Espectro de massas do pico eludo em 17,4 min. (Fig. 78) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
134
OCH 3
HO
p-hidroxi-(E)-cinamato de metila
Figura 82: Espectro de massas do pico eludo em 18,2 min. (Fig. 78) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
135
Portanto, com o intuito de se propor uma metodologia mais prtica e reprodutvel, decidiu-se
testar o uso da soluo Na2HPO4 100 mM para dissolver a frao amostra e o uso de um
tampo Na2HPO4 / HCl 50 mM (pH = 7) para as etapas de condicionamento e lavagem (item
3.3.14). O uso da soluo Na2HPO4 100 mM para neutralizar a frao cida teria a vantagem
de tender a gerar um tampo na faixa de pH desejado, j que o pKa do cido conjugado
correspondente (H2PO4-) igual a 7,2. Entretanto, nesta concentrao, a soluo de Na2HPO4
prestou-se muito bem apenas para amostras no muito cidas, como a frao ligada, obtida a
partir do pellet previamente tratado com EtOH 70 % e H2O (Fig. 83).
1: 280 nm, 8 nm
F0-SAX-hidrlise bsica do pellet-250907a
F0-SAX-pellet-2509a_W en-modif
1: 280 nm, 8 nm
F1/F2-SAX-hidrlise bsica do pellet-250907a
F1-SAX-pellet-2509a_W en-modif
700
1: 280 nm, 8 nm
F3-SAX-hidrlise bsica do pellet-250907a
F3-SAX-pellet-2509a_W en-modif
600
600
500
500
400
400
300
300
200
200
100
100
F3
F1
F0
mAU
mAU
700
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 83: Cromatogramas sobrepostos das fraes F0, F1 e F3-SAX-pellet-2509a (fraes obtidas por marcha
no descrita) a 280 nm. Condies cromatogrficas: conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as
modificaes propostas no item 3.3.2.
Embora o pellet 2509a tenha sido submetido a um tratamento prvio com EtOH 70 %
e H2O (item 3.3.14), um pico intenso de cido protocatecuico pde ser detectado na F3-SAXpellet-2509a (Fig. 84), contrariando a proposta de haver degradao de antocianinas residuais.
Entretanto, como o extrato aquoso desta marcha foi obtido com sol. ATFA 0,1 % (marcha no
descrita), possvel que a alta proporo de cido protocatecuico em F3-SAX-pellet-2509a se
deva extrao ineficiente das antocianinas pela sol. ATFA 0,1 % (fato visivelmente
136
600
1: 280 n m , 8 n m
F 3-S AX-h i d r l i se b si ca d o p el l et-250907a
F 3-S AX-p el l et-2509a_W en -m o d i f
500
500
400
400
mAU
300
mAU
300
3
6
200
200
100
100
4
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minut es
Figura 84: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-pellet-2509a a 280 nm. Condies
cromatogrficas: conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as modificaes propostas no item 3.3.2.
Sinais identificados: cido glico (1), cido protocatecuico (2), cidos p-hidroxi-benzico e vanlico (3), cido
cafico (4), cido 3-(4-hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico (5), cido 3-(3-metoxi-4-hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico
(6), cido ferlico (7) e cido p-cumrico (8).
Com o objetivo de se obter apenas steres metlicos dos cidos fenlicos, testou-se as
tcnicas de alquilao descritas no item 3.3.13, baseadas no mtodo originalmente proposto
por Fiamegos et al. (2004). Esta tcnica, quando executada no pH adequado, deveria gerar
apenas um derivado para cada cido fenlico analisado e, consequentemente, cada derivado
seria correlacionado com apenas um cido fenlico precursor, o que evitaria dvidas quanto a
identificao deste ltimo. Alm disso, os cidos presentes na frao obtida em AcOEt
poderiam ser derivatizados e extrados em uma s etapa, estando prontos para anlise por CGEM, sem a necessidade de um tratamento prvio por EFS.
137
Figura 85: Cromatograma reconstrudo da RDCTF-3 por CG-EM (CIT). Condies cromatogrficas: item 3.3.2.
Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de reteno (min.).
138
OCH 3
cinamato de metila
Figura 86: Espectro de massas do pico eludo em 12,8 min. (Fig. 85) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
139
cinamato de butila
Figura 87: Espectro de massas do pico eludo em 16,4 min. (Fig. 85) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
140
Figura 88: Cromatograma reconstrudo da RDCTF-5 por CG-EM (CIT). Condies cromatogrficas: item 3.3.2.
Os principais sinais esto indicados com seus respectivos valores de tempo de reteno (min.).
OH
cido cinmico
Figura 89: Espectro de massas do pico eludo em 14,1 min. (Fig. 88) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
141
Alm do cido cinmico, apenas o cido sirngico gerou derivados detectveis por esta
reao, o ster metlico em 17,5 min. (Fig. 90) e o ster butlico em 20,2 min. (Fig. 91), quase
no detectado. A ausncia de derivados de cido glico e de cido p-cumrico sugeriu que
apenas os derivados mais volteis estivessem sendo detectados nas condies de anlise
destes ensaios.
Admitindo a possibilidade de ainda haver erros relacionados com a metodologia,
testou-se a reao com quantidades menores de cidos fenlicos e quantidades maiores de
catalisador, inclusive com brometo de tetracetilamnio (BTCA), mas nenhuma das reaes
geraram derivados detectveis. Um teste feito com uma frao obtida em AcOEt revelou que
apenas cidos graxos podiam ser derivatizados por esta tcnica (dado no mostrado).
O
H3 CO
OCH 3
HO
OCH3
3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato de metila
Figura 90: Espectro de massas do pico eludo em 17,5 min. (Fig. 88) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
142
O
H3 CO
O
HO
OCH3
3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoato de butila
Figura 91: Espectro de massas do pico eludo em 20,2 min. (Fig. 88) obtido por CG-EM e estrutura proposta
para o derivado correspondente.
4.4 Flavonides
Nenhuma mancha tpica de flavonides foi detectada aps a anlise por CCD em
placas de gel de slica nas condies descritas no item 3.3.6. Como a deteco de flavonides
j havia sido relatada por outros autores (GALLORI et al., 2004; INSFRAN et al., 2004;
LICHTENTHLER et al., 2005; SCHAUSS et al., 2006a; PACHECO et al., 2007), este
resultado poderia sugerir que a sol. ATFA 0,5 % seria ineficiente em extrair flavonides, ou
ainda, que a partida de 100 mg de aa liofilizado seria insuficiente para fornecer quantidades
detectveis destes polifenis. Da, decidiu-se primeiro testar partidas com quantidades
maiores de material liofilizado, utilizando-se a mesma soluo extratora.
143
4.4.2 Extrao em fase slida com celulose e fracionamento em coluna sob mdia presso
Figura 92: Cromatograma obtido por CLAE da F4-celulose-0712 a 340 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Alguns sinais esto indicados com seus respectivos valores de
tempo de reteno.
43
Quercetina 3-O-rutinosdeo.
144
145
3,7 min.; picos 1 e 2), o que sugeriu a presena de mais de um diglicosdeo 3,5, ambos ainda
no citados na literatura. Por outro lado, de acordo com os relatos de Gallori et al. (2004) e
Schauss et al. (2006a), dois dos picos 6, 7 e 8 corresponderiam a peonidina 3-glicosdeo e
peonidina 3-rutinosdeo, os quais tambm foram detectados por EM-IES (item 4.2.1). A
deteco de antocianinas no detectadas anteriormente em extratos aquosos totais, obtidos
pelo uso de ATFA 0,5 % em H2O e por marchas com partidas de 5 g de aa liofilizado (dado
no mostrado), sugere que o uso de solues aquosas com ATFA no adequado para a
extrao completa das antocianinas presentes nos frutos de E. oleracea. Outros dois
glicosdeos de flavonides, provavelmente homoorientina e orientina, tambm puderam ser
detectados quando o cromatograma foi visualizado a 350 nm (Fig. 94). A banda a 521 nm,
presente no espectro obtido para orientina, devida a um rastro de antocianinas presente em
quase todo o cromatograma.
3000
3000
3: 520 nm, 8 nm
F1-RP18-MP-1106-Extrato total
F1-RP18-MP-1106
5
4
2500
2500
1500
1500
mAU
2000
mAU
2000
1000
1000
1
500
500
78
9
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 93: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F1-RP18-1106 a 520 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cianidina 3,5-diglicosdeo (2), cianidina 3sambubiosdeo (3), cianidina 3-glicosdeo (4) e cianidina 3-rutinosdeo (5).
146
2: 350 nm, 8 nm
F1-RP18-MP-1106-Extrato total
F1-RP18-MP-1106
700
700
2
600
600
500
500
400
400
mAU
mAU
3
300
300
200
200
6
100
100
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 94: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F1-RP18-1106 a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cianidina 3-glicosdeo (3), cianidina 3rutinosdeo (4), homoorientina (6) e orientina (7).
147
2: 350 nm, 8 nm
F2-RP18-MP-1106-Extrato total
F2-RP18-MP-1106
120
120
100
100
80
mAU
140
80
2
8
60
60
mAU
140
1
40
40
56
20
20
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 95: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F2-RP18-1106 a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cianidina 3-sambubiosdeo (1), cianidina 3glicosdeo (2), cianidina 3-rutinosdeo (3), homoorientina (7) e orientina (8).
3: 520 nm, 8 nm
F3-RP18-MP-1106-Extrato total
F3-RP18-MP-1106
300
300
250
250
(b)
mAU
150
200
150
mAU
(a)
200
3
100
100
1
50
50
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 96: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-RP18-1106 a 520 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinais identificados: cianidina 3-glicosdeo (2), cianidina 3rutinosdeo (4). Insert a: espectro obtido no UV para o pico 1. Insert b: espectro obtido no UV para o pico 3.
148
O primeiro resultado relevante para flavonides com o uso da SAX foi obtido quando
as condies da EFS ainda no estavam ajustadas para o isolamento da frao rica em cidos
fenlicos. O uso de tampo HCO3- / HCl 50 mM (pH = 7) para suspender a frao amostra
(obtida em AcOEt) e de H2O para as etapas de condicionamento e lavagem (marcha 2307, no
descrita) proporcionou um fracionamento inadequado dos cidos fenlicos da frao de
partida, mas concentrou os dois principais flavonides (homoorientina e orientina) nas fraes
iniciais (F0 e F1-SAX-2307; figuras 97 e 98). Isto porque, alm do tampo no ter sido
adequado para neutralizar a frao amostra, as etapas de condicionamento e lavagem com
gua purificada (pH = 5-6) proporcionaram a reduo ou a manuteno do pH em valores
suficientemente baixos para remover, com eficincia, as espcies ionizveis de pKa mais alto,
como os dois flavonides detectados, e tambm boa parte dos cidos fenlicos. A baixa
recuperao de cidos fenlicos na F3-SAX-2307 pode ser verificada na figura 54
(cromatograma a 280 nm), na qual no foi possvel visualizar o pico eludo em 14,5 min. (mx.
= 340 nm), outro possvel glicosdeo de flavonide (Fig. 99).
149
150
150
2: 350 nm, 8 nm
F0-SAX-230707 (passagem direta)
F0-SAX-2307
125
125
OH
OH
100
100
OH
HO
O
HO
75
75
mAU
mAU
HO
OH
OH
50
50
25
25
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 97: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F0-SAX-2307 a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinal indicado por sua estrutura molecular: homoorientina.
2: 350 nm, 8 nm
F1-SAX-230707 (H2Od)
F1-SAX-2307
120
120
OH
HO
100
100
OH
OH
O
80
80
OH
60
40
40
OH
20
20
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 98: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F1-SAX-2307 a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993). Sinal indicado por sua estrutura molecular: orientina.
mAU
mAU
HO
HO
60
150
Detector A-340 nm
F3-SAX-230707 (H2SO4 500 mM)
F3-SAX-2307
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
10
15
20
25
30
35
40
45
mAU
mAU
120
50
Minutes
Figura 99: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-SAX-2307 a 340 nm. Condies cromatogrficas:
conforme descrito por Sumere et al. (1993).
151
OH
HO
OH
O
OH
HO
HO
OH
OH
OH
HO
O
HO
HO
OH
OH
152
sol. MeOH / ATFA 1 % em H2O (90:10; v/v) para a obteno do extrato total (item 3.3.13), o
qual seria submetido, em seguida, a um segundo desengorduramento em coluna de fase
inversa, como citado anteriormente. Este procedimento permitiu o isolamento de uma frao
amarela, removida da coluna C18 com a prpria soluo extratora, e de uma frao verde,
removida com MeOH / CHCl3 (1:1) (item 3.3.13).
A anlise da frao amarela em espectrofotmetro revelou a presena de carotenides,
com bandas tpicas em 421, 443 e 471 nm, mas revelou tambm que a frao no estava pura,
mostrando bandas fracas em outros comprimentos de onda. Alm disso, aps concentrao
desta frao em evaporador rotatrio (at 40C), a anlise por CG-EM revelou apenas a
presena de fragmentos de carotenides, alm de cidos graxos e esterides j relatados na
literatura (dado no mostrado). Por outro lado, como era de se esperar, a anlise da frao
verde em placa de gel de slica exposta luz ultravioleta (a 366 nm) revelou a presena de
clorofilas, aps visualizao de manchas vermelhas caractersticas.
A frao de interesse (vermelha), contendo os polifenis, seria particionada com
AcOEt para se obter uma frao orgnica livre de antocianinas, a qual seria, em seguida,
fracionada numa coluna de poliamida para a obteno de uma frao rica em flavonides e
livre de cidos fenlicos (item 3.3.13).
Aps alguns testes com a poliamida em coluna para EFS, fez-se a proposta de que a
resina, quando tratada com AcOEt, apresentaria mais afinidade para flavonides do que para
cidos fenlicos. Isto porque, geralmente, os primeiros possuem mais hidroxilas fenlicas que
estes ltimos, sendo estas hidroxilas um dos grupos funcionais que, de fato, interagem com a
poliamida (por ligaes de hidrognio com as carbonilas de seus grupos amida). Entretanto,
tambm podem ocorrer interaes com carboxilas de cidos, fenlicos ou no, o que no
ocorreria com flavonides.
153
154
1: 280 nm, 8 nm
F1a-Poliamida-250907b
F1a-POL-2509b_Wen-modif
200
200
150
150
100
mAU
mAU
7
100
8
10
50
50
1
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 102: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F1-POL-2509b a 280 nm. Condies cromatogrficas:
conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as modificaes propostas no item 3.3.2. Sinais
identificados: cido protocatecuico (2) e cido vanlico (4).
2: 350 nm, 8 nm
F2-Poliamida-250907b
F2-POL-2509b_Wen-modif
50
50
30
30
mAU
40
mAU
40
2
5
20
20
6 7
3
10
10
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 103: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F2-POL-2509b a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as modificaes propostas no item 3.3.2. Sinais
identificados: homoorientina (1), orientina (2), isovitexina (3), vitexina (4) e rutina (5).
155
Detector A-350 nm
F3-Poliamida-250907b
F3-POL-2509b_Wen-modif
60
2
1
60
50
50
(b)
40
40
30
20
mAU
mAU
(a)
30
20
10
10
-10
-10
0
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 104: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F3-POL-2509b a 350 nm. Condies cromatogrficas:
conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as modificaes propostas no item 3.3.2. Insert a: espectro
obtido no UV para o pico 1. Insert b: espectro obtido no UV para o pico 2.
156
glicosdeo de flavonide (pico 3), eludo em 11,7 min., o qual deveria ser o mais hidroxilado
e/ou glicosilado dentre todos os flavonides detectados at aqui.
Detector A-340 nm
F4-Poliamida-250907b
F4-POL-2509b_W en-modif
40
40
30
30
20
20
mAU
mAU
2
7
10
10
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 105: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F4-POL-2509b a 340 nm. Condies cromatogrficas:
conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as modificaes propostas no item 3.3.2.
157
120
120
Detector A-370 nm
F5-Poliamida-250907b
F5-POL-2509b_Wen-modif
100
100
80
80
60
mAU
5
3
mAU
(a)
60
40
40
20
20
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Minutes
Figura 106: Cromatograma obtido por CLAE-DAD da F5-POL-2509b a 370 nm. Condies cromatogrficas:
conforme mtodo descrito por Wen et al. (2005) com as modificaes propostas no item 3.3.2. Insert a: espectro
obtido no UV para o pico 4.
A ausncia de picos no cromatograma obtido aps a anlise por CLAE-DAD da F6POL-2509b (dado no mostrado) sugeriu que j no houvesse mais substncias em
quantidades detectveis na poliamida aps o tratamento com CH3CN / MeOH (1:1).
Entretanto, como no se testou acetonitrila pura, a possibilidade de haver ainda substncias
em quantidades detectveis na resina no pde ser descartada, j que este solvente mostrou-se
ter a melhor capacidade de desoro de substncias adsorvidas na poliamida entre os
solventes orgnicos testados neste trabalho.
158
4. CONCLUSES
159
160
Entre os no fenlicos, foram tambm detectados os cidos benzico e cinmico. O ltimo foi
detectado apenas com o uso da RTIFB; cido benzico e cido vertrico apenas com a coluna
de celulose; e cido 3-(3-metoxi-4-hidroxi)-fenil-2(Z)-propenico apenas na frao ligada
parede celular, com a SAX. Entre as propostas de identificao de cidos fenlicos, foram
sugeridos os cidos 5-(3-metoxi, 4-hidroxi)-fenil-pentanico, clorognico, cafico e
floroglucinico. Os principais componentes da frao ligada foram os cidos p-hidroxibenzico (possvel marcador quimiotaxonmico para a famlia Palmae), vanlico, 3-(4hidroxi)-fenil-2 (Z)-propenico, 3-(3-metoxi-4-hidroxi)-fenil-2 (Z)-propenico, ferlico e pcumrico.
Os resultados obtidos neste trabalho sugerem ainda que os cidos glico e
protocatecuico, assim como o cido floroglucinico, sejam produtos de degradao gerados
durante os procedimentos preparativos e analticos, no sendo constituintes naturais do fruto
no processado.
Os glicosdeos de flavonides identificados foram cianidina 3,5-diglicosdeo, cianidina
3-glicosdeo, cianidina 3-rutinosdeo, homoorientina e orientina. Cianidina 3-sambubiosdeo e
cianidina 3-galactosdeo foram relacionadas a um nico sinal obtido por CLAE e no
puderam ter sua identificao confirmada inequivocamente por EM-IES. Entre as propostas
de identificao de flavonides, foram sugeridos vitexina, isovitexina, rutina e quercetina.
Este o primeiro relato a citar a deteco dos cidos benzico, sirngico, vertrico, 3(4-hidroxi)-fenil-2 (Z)-propenico, 3-(3-metoxi-4-hidroxi)-fenil-2 (Z)-propenico e cinmico
em amostras de aa. tambm o primeiro relato a sugerir a deteco dos cidos 5-(3-metoxi,
4-hidroxi)-fenil-pentanico, clorognico, cafico e floroglucinico neste alimento. Entre os
flavonides, cianidina 3,5-diglicosdeo, cianidina 3-galactosdeo, vitexina e quercetina foram
tambm propostos pela primeira vez em aa.
161
REFERNCIAS
AA: GUIA RURAL - ABRIL ANURIO., 1988 apud SANTOS, G. Aa (Euterpe
oleracea): Aspectos qumicos e farmacolgicos. 2001. f. 14. Dissertao (Mestrado em
Cincias Farmacuticas) - Centro de Cincias da Sade, Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Rio de Janeiro, 2001.
ADHIKARI, D.; Francis, J.; Schutzki, R; Chandra, A.; Nair, M. Quantification and
characterization of cyclo-oxigenase and lipid peroxidation inhibitory anthocyanins in
fruits of Amelanchier. Phytochemical Analysis 2005, 16, 175-180.
BAILN, M. & BUELGA, C. Polyphenol extraction from foods. In Buelga, C. &
Williamson, G. (Eds.) Methods in polyphenol analysis. Cambridge, UK: Royal Society of
Chemistry, 2003, p. 1-16.
BAKOWSKA, A.; Kucharska, A.; Oszmianski, J. The effects of heating, UV irradiation,
and storage on stabilaty of the Anthocyanin-polyphenol copigment complex. Food
Chemistry 2003, 81, 349-355.
BARBERN, F.; Blzquezt, M.; Viguera, C.; Ferreres, F.; Lorente, F. A comparative study
of different Amberlite XAD resins in flavonoid analysis. Phytochemical Analysis 1992, 3,
178-181.
BENGOECHEA, M.; Sancho, A.; Bartolom, B.; Estrella, I.; Cordovs, C.; Hernndez, T.
Phenolic composition of industrially manufactured pures and concentrates from peach
and apple fruits. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 4071-4075.
BLOOR, S. Overview of methods for analysis and identification of flavonoids. In: Packer,
L. (Ed.) Methods in Enzymology, Vol. 335: Flavonoids and other polyphenols. University of
California, Berkeley, Academic Press, 2001, p. 3-14.
BOBBIO, F.; Druzian, J. Abrao, P.; Bobbio, P.; Fadelli, S. Identification and quantification
of anthocyanins from the aa fruit (Euterpe oleracea) Mart. Cienc. Tecnol. Aliment.
2000, 20, 388-390.
BONILLA, E.; Akoh, C.; Sellappan, S.; Krewer, G. Phenolic content and antioxidant
capacity of Muscadine grapes. J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 5497-5503.
BONOLI, M.; Verardo, V.; Marconi, E.; Caboni, M. Antioxidant phenols in Barley
(Hordeum vulgare L.) Flour: Comparative Spectrophotometric study among extraction
162
methods of free and bound phenolic compounds. J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 51955200.
BRESSANI, R.; Mora, D.; Flores, R.; Brenes, R. Evaluation of two methods to determine
the polyphenol content in raw and cooked beans and its effect on protein digestibility.
Arch. Latinoam. Nutr. 1991, 41, 569-583.
CAO, G.; Muccitelli, H.; Snchez-Moreno, C.; Prior, R. Anthocyanins are absorbed in
glycated forms in elderly women: a pharmacokinetic study. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73,
920-926.
CHAKRABORTY, M.; Das, K.; Dey, G.; Mitra, A. Unusually high quantity of 4hydroxybenzoic acid accumulation in cell wall of palm mesocarps. Biochemical
Systematics and Ecology 2006, 34, 509-513.
COHEN, K. Sistema de produo do aa: composio qumica do aa. Embrapa
Amaznia Oriental 2005, 04, verso eletrnica. Disponvel em: http//www.cpatu.embrapa.br.
Acesso em: 12/08/2007.
COSSON, J.; Travaglia, F.; Piana, G.; Capasso, M.; Arlorio, M. Euterpe oleracea juice as a
functional pigment for yogurt. Food Research International 2005, 38, 893-897.
CONSTANT, P. Antocianinas de aa (Euterpe oleracea M): extrao, caracterizao,
desenvolvimento de formulao e aplicao em alimentos. 2003. Tese (Doutorado em
Cincia e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viosa, Viosa, 2003.
DOVBII, O.; Kazakova, O.; Lipkovskaya, N. The effect of the structure of cinamic acid
derivatives on their interaction with highly dispersed silica in aqueous medium. Colloid
Journal 2006, 68, 777-783.
EINBOND, L.; Reynertson, K.; Luo, X; Basile, M.; Kennely, E. Anthocyanin antioxidants
from edible fruits. Food Chemistry 2004, 84, 23-28.
EVANS, C.; Miller, N.; and Paganga, G. Structure-antioxidant activity relationships of
flavonoids and phenolic acids. Free Radicals Biol. Med 1996, 20, 933-956.
FIAMEGOS, Y.; Nanos, C.; Vervoort, J.; Stalikas, C. Analytical procedure for the in-vial
derivatization-extraction of phenolic acids and flavonoids in methanolic na aquous plant
extracts followed by gas chromatography with mass-selective detection. Journal of
Chromatography A 2004, 1041, 11-18.
163
164
165
166
PASCOAL NETO, C.; Belino, E.; Evtuguin, D.; Silvestre, A. Total fractionation and
analysis of organic components of industrial Eucalyptus globulus kraft black liquor.
Appita Journal 1999, 52, 213-217.
PRETSCH, E.; Clerc, T.; Seibl, J.; Simon, W. Tablas para la elucidacion estructural de
compuestos organicos por metodos espectroscopicos. Edicin espaola, Madrid. Editorial
Alhambra S. A., 1980, 307 p.
REVILLA, E.; Ryan, J.; Ortega, G.; Comparison of several procedures used for extraction
of anthocyanins from red grapes. J. Agric. Food Chem. 1998, 46, 4592-4597.
ROBERFROID, M. Functional food concept and its application to prebiotics. Digest Liver
Dis 2002, 34 (2), S105-110.
ROCHA, A.; Carvalho, L.; Sousa, M.; Madeira, S.; Sousa, P.; Tano, T.; Kerth, V.; Resende,
A.; Moura, R. Endothelium-dependent vasodilator effect of Euterpe oleracea Mart. (aa)
extracts in mesenteric vascular bed of the rat. Vascular Pharmacology 2007, 46, 97-104.
RODRIGUES, R.; Lichtenthler, R.; Zimmermann, B.; Papagiannopoulos, M.; Fabricius, H.;
Marx, F.; Almeida, O.; Maia, J. Total oxidant scavenging capacities of Euterpe oleracea
Mart. (Aa seeds) and their polyphenolic compounds. In 29a Reunio Anual da Sociedade
Brasileira de Qumica; guas de Lindia, 2006, PN-041.
ROGEZ, H. Aa: Preparo, composio e melhoramento da conservao. Belm, Brasil:
EDUFPA, 2000, 360 p.
SAKAKIBARA, H.; Honda, Y.; Nakagawa, S.; Ashida, H.; Kanazawa, K. Simultaneous
determination of all polyphenols in vegetables, fruits and teas. J. Agric. Food Chem. 2003,
51, 571-581.
SANTOS, G. Aa (Euterpe oleracea): Aspectos qumicos e farmacolgicos. 2001. 151 f.
Dissertao (Mestrado em Cincias Farmacuticas) - Centro de Cincias da Sade,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2001.
SAONA, L.; Giusti, M.; Wrolstad, R. Color and pigment stability of red radish
Anthocyanins and red-fleshed potato Anthocyanins in juice model system. J. Food Sci.
1999, 61, 688-694.
SCHAUSS, A.; Wu, X.; Prior, R.; Ou, B.; Patel, D.; Huang, D.; Kababick, J. Phytochemical
and nutrient composition of the freeze-dried amazonian palm berry, Euterpe oleracea
Mart. (Acai). J. Agric. Food Chem. 2006a, 54, 8569-8603.
167
SCHAUSS, A.; Wu, X.; Prior, R.; Ou, B.; Huang, D.; Owens, J.; Agarwal, A.; Jensen, G.;
Hart, A.; Shanbrom, E. Atioxidant capacity and other bioactivities of the freeze-dried
amazonian palm berry, Euterpe oleracea Mart. (Acai). J. Agric. Food Chem. 2006b, 54,
8604-8610.
SEERAM, N.; Bourquin, L.; and Nair, M. Degradation products of cyanidin glycosides
from tart cheries and their bioactivities. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 4924-4929.
SINGLETON, V. & ROSSI, J. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. 1965, 16, 144-158.
SMITH, E. Astringent tannins of Acer species. Phytochemistry 1977, 16, 1421-1426.
SOUZA, M.; Yuyama, L.; Aguiar, J.; Pantoja, L. Suco de aa (Euterpe oleracea Mart.):
avaliao microbiolgica, tratamento trmico e vida de prateleira. Acta Amaznica 2006,
36, 483-496.
STONER, G.; Sardo, C.; Apseloff, G.; Mullet, D.; Wargo, W.; Pound, V.; Singh, A.; Sanders,
J.; Aziz, R.; Casto, B.; Sun, X. Pharmacokinetics of anthocyanins and ellagic acid in
healthy volunteers fed freeze-dried black raspberries daily for 7 days. J. Clin. Pharmacol.
2005, 45, 1153-1164.
STRUDWICK, J. & SOBEL, G. Uses of Euterpe oleracea Mart. in the amazon estuary,
Brazil. Adv. Econ. Bot. 1988, 6, 225-253.
SUDHAMANI, S; Tharanathan, R.; Prasad, M. Isolation and characterization of
extracellular polysaccharide from Pseudomonas caryophylli CFR 1705. Carbohydrate
Polymers 2004, 56, 423-427.
SUMERE, C.; Fach, P.; Casteele, K.; Cooman, L.; Everaert, E.; Loose, R.; Hutsebaut, W.
Improved extraction and reversed phase-high performance liquid chromatographic
separation of flavonoids and the identification of rosa cultivars. Phytochemical Analysis
1993, 4, 279-292.
TIMBERLAKE, C. & HENRY, B. Anthocyanins as natural food colorants. Prog. Clin.
Biol. Res. 1988, 280, 107-121.
168
TSAO, R. & YANG, R. Optimization of a new mobile phase to know the complex and
real polyphenolic composition: towards a total phenolic index using high performance
liquid chromatography. Journal of Chromatography A 2003, 1018, 29-40.
VIGUERA, C.; Zafrilla, P.; Barbern, F. The use of acetone as extraction solvent for
anthocyanins from strawberry fruit. Phytochemical Analysis 1998, 9, 274-277.
VOGEL, A. Qumica Orgnica: Anlise Orgnica Qualitativa, vol. 3. Traduo da 3
edio. Ao Livro Tcnico S.A. e Editora da Universidade de So Paulo, 1971, p. 1017-1023.
WAGNER, H. & BLADT, S. Plant drug analysis: A thin layer chromatography atlas.
Second edition. Ed. Springer, 1996, 384 p.
WANG, H.; Cao, G.; Prior, R. Total antioxydant capacity of fruits. J. Agric. Food Chem.
1996, 44, 701-705.
WANG, H.; Cao, G.; and Prior, R. Oxygen radical absorbing capacity of Anthocyanins. J.
Agric. Food Chem. 1997, 45, 304-309.
WANG, J. & SPORNS, P. Analysis of anthocyanins in red wine and fruit juice using
MALDI-MS. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 2009-2015.
WATT, D.; ONeill, S.; Percy, A.; Brasch, D. Isolation and characterization of a partially
methylated galacto-glucurono-xylo-glycan, a unique polysaccharide from the red
seaweed Apophloea lyallii. Carbohydrate Polymers 2002, 50, 283-294.
WEN, D.; Li, C.; Di, H.; Liao, Y.; Liu, H. A universal HPLC method for the
determination of phenolic acids in compound herbal medicines. J. Agric. Food Chem.
2005, 53, 6624-6629.
WOLLENWEBER, E. & DIETZ, V. Occurrence and distribuition of free flavonoid
aglycones in plants. Phytochemistry 1981, 20, 869-932.
WU, X.; Cao, G.; Prior, R. Absorption and metabolism of anthocyanins in elderly women
after consumption of elderberry or blueberry. The Journal of Nutrition 2002, 132, 18651871.
169