METODOLOGA DE INVESTIGACIN

Condiciones ambientales
Para la determinacin de los ndices de Fases (IF),
ndice Mittico (IM) y duracin del ciclo celular se
registraran condiciones del ambiente de trabajo
(tales como temperatura, humedad relativa y
presin atmosfrica) durante el experimento
Material biolgico
Races de estaquillas enraizadas de Vitis amaznica,
Vitis labrusca, Vitis rupestris y Vitis rotundifolia de
una longitud aproximada de 1.0 1.5 cm
Germinacin de las muestras
Las muestras sern germinadas en cmaras
hmedas confeccionadas en placas Petri de 15 x
100 mm y desinfectadas con alcohol al 75 %,
cubrindose luego con papel filtro humedecido en
agua.
Fijacin
Los meristemos radiculares se colocarn a
diferentes horas del da 1 a 24, cada hora - en
solucin fresca del fijador de Carnoy (Etanol
absoluto + cido actico glacial en una proporcin
de 3:1, respectivamente) donde permanecern por
espacio de 4:00 o ms horas a 4 C.
Coloracin
Se usar orcena actica clorhdrica de acuerdo al
mtodo de Tjio & Levan (1954) modificado por
Talledo & Escobar (1993).
Las races se transfieren a una solucin A del
colorante (orcena actica al 4.4 % + HCl 1N, 9:1
vol.), calentndose por pocos segundos hasta
obtener el desprendimiento de vapores evitndose la

ebullicin y el calentamiento excesivo. Luego se

deja enfriar y se repite el paso anterior tres veces.
Despus de ello se deja enfriar por completo.
Preparacin de la muestra para el squash
Las porciones radiculares teidas se colocaran sobre
un portaobjetos, cortndose 1 mm del meristemo
con una hoja de bistur; el resto se descarta,
eliminndose el excedente de solucin A.
Finalmente se agregar 1 o 2 gotas de solucin B
(orcena actica al 4.4 % + HCl al 45 %, 1:1 vol.),
dejando las muestras en la misma durante 10
minutos, para luego realizar el squash con un cubre
objetos.
Prensado o squash
Se procede a colocar el cubreobjetos y se golpea
firme y fuertemente la muestra con una varilla de
goma. A continuacin se realizara el aplastamiento
presionando fuertemente la lmina con el dedo
pulgar, evitando cualquier movimiento del
cubreobjetos. Finalmente, se envolver la lmina en
papel filtro realizando presin con la parte inferior
de la palma de la mano.
Observacin al microscopio: contaje de Fases
Determinacin de los ndices de fases e ndices
Mitticos Parciales
Las muestras procesadas de cada hora sern
observadas al microscopio con el propsito de
determinar el ndice de fases (If) mediante el contaje
de las diferentes fases del ciclo celular (interfase,
profase, metafase, anafase y telofase) en
aproximadamente 1000 clulas, registradas y
expresadas en porcentajes. Finalmente la sumatoria

de clulas en divisin (profase, metafase, anafase y

telofase) respecto al total de clulas expresadas en
porcentajes constituye el ndice Mittico (Im).
Formulas parciales (observacin por cada hora).

IF ( )=

N de clulas de cada fase

x 100
N total de clulas

( )=IFp+ IFm + IFa+ IFt

Donde: IF = ndice de fases; IM = Indice mittico;
p = Profase; m = Metafase, a = Anafase y t =
Telofase.
Para facilitar el anlisis de los resultados se propone
usar el software de procesamiento de imgenes
ImageTool 3.0
Determinacin de los IF e IM Totales y de La
Duracin de Ciclo Celular
Los If(%) totales se obtienen de la divisin de las
sumatoria de los porcentajes de cada fase de la
mitosis, obtenidos para cada hora, entre el nmero
total de horas.
Con estos porcentajes se determina el IM total
mediante la sumatoria de los ndices de fases en
divisin (profase, metafase, anafase y telofase).

IF ( )=

IF parciales de cada fase

N de horas

 ( )=IFp+ IFm+ IFa+ IFt

La proporcin de clulas en las fases de la mitosis
respecto al total de clulas de la muestra (el ndice
mittico-IM) va a reflejar directamente la duracin
relativa de dichas fases, as como la propia mitosis.
En un sistema asincrnico, esta informacin es
insuficiente para establecer en trminos absolutos la
duracin de cada fase individualmente. Para ello es

preciso, adems, conocer cul es la duracin del

ciclo celular.
Para determinar la duracin del ciclo mittico es
necesario evaluar la duracin en horas para cada
fase en un periodo de tiempo suficiente, durante el
cual se observe claramente el inicio y el final de la
mitosis en porcentajes significativos de las clulas
de la muestra, calculando la duracin total del ciclo
mediante la sumatoria de los periodos ocupados por
la profase, metafase, anafase y telofase.

Para ello se precisa determinar los IF totales.

CC=Valores en horas de las fases en divisin y en interfase

Donde CC = Ciclo Celular
Un valor elevado para IM no nos indica que la
divisin se produce rpidamente, sino ms bien que
la mitosis, ocupa una gran parte del tiempo total del
ciclo celular. Este mtodo permite determinar los
valores promedio.