Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLNICA

Manejo de animales e inmunizaciones
Profesores: QFB Mara de las Mercedes Zamudio Duran
QFB Francisco Javier Parada Garca
Mtra. Yolanda Flores Cabrera
Dr. Osvaldo Daniel Casteln Martnez

Integrantes del equipo:

Grupo: 1802
Villa Reyes Odra Berenisse
Equipo: 3
Valle Medina Antonio
Herrera Lpez Ema Elvira
Torres Jimnez Ramn

ndice
Introduccin........................................................................................................................................3
Biotica................................................................................................................................................4
Bioterio.................................................................................................................................................4
BIOTERIO DE PRODUCCIN............................................................................................4
BIOTERIO DE EXPERIMENTACIN..................................................................................5
Animales singenicos..........................................................................................................................5
Antgeno:.............................................................................................................................................6
Hapteno................................................................................................................................................6
Inmungeno.........................................................................................................................................6
Determinante antignico....................................................................................................................6
VAS DE INMUNIZACIN....................................................................................................................6
Volmenes de seguridad....................................................................................................................8
ANIMALES MS UTILIZADOS...........................................................................................................9
NECESIDADES DE ANESTESIA......................................................................................................10
TIPOS DE INMUNGENOS Y VIAS DE INMUNIZACIN................................................................10
Sangrado de animal..........................................................................................................................14
ADYUVANTE......................................................................................................................................16
TIPOS DE ADYUVANTES..................................................................................................................17
INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA...............................................................................................18
INMUNIDAD INNATA............................................................................................................20
LIMITE EXTERIOR DEL ORGANISMO............................................................................20
1.1.1.2. FAGOCITOS: MACRFAGOS Y NEUTRFILOS..............................................20
1.1.1.3. NATURAL KILLER (NK)......................................................................................21
1.1.1.4. PROTENAS DE FASE GUDA..........................................................................21
1.1.1.5. TOLL-LIKE RECEPTORES (TLRS): RECEPTORES SOBRE CLULAS
INFLAMATORIAS..............................................................................................................21
INFLAMACIN..................................................................................................................23
INMUNIDAD ADAPTATIVA O ESPECFICA............................................................................26
1.2.1. TIPOS DE INMUNIDAD ESPECFICA.......................................................................27
1.2.4. DETERMINANTE ANTIGNICO O EPITOPE............................................................27
1.2.6. MOLCULAS QUE PARTICIPAN EN EL RECONOCIMIENTO DEL ANTGENO....28
1.2.7. SELECCIN CLONAL................................................................................................28
1.3. CAVIDADES Y MEDIO EXTERNO...................................................................................29
1.4. FASES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA....................................................................30
2

Introduccin.
En el presente trabajo se hablara de la importancia de los animales como reactivos biolgicos en la
investigacin biomdica se consolid la ciencia del animal de experimentacin. Est persigue la
obtencin de animales biolgicamente estandarizados mediante la seleccin colectiva de
caractersticas anatmicas, fisiolgicas, ecolgicas y sanitarias. Adems de esto, se requiere de un
buen manejo del animal acoplando al pie de la letra lo que es la ley y la humanidad sobre ellos y un
manejo correcto para tener resultados confiables. En el rea de inmunologa son usados para la
prueba de nuevas vacunas y el desarrollo de enfermedades, en el caso de las vacunas es ptimo
lograr una buena inoculacin y una buena toma de la muestra para as lograr un resultado
confiable, pero esto no se puede lograr sin un manejo ptimo de los animales. La bsqueda de
nuevas sustancias con actividad adyuvante/inmunopotenciadora constituye una de las tendencias
ms importantes en la investigacin inmunolgica actual.
En la docencia e investigacin del tipo biolgica y biomdica; en el desarrollo, produccin y control
de medicamentos alimentos y otros insumos importantes para la salud humana;

requieren la

utilizacin de animales de laboratorio, los cuales se han usado desde siglos atrs cuando se
realizaron los primeros estudios anatmicos comparativos, hasta en la actualidad con su utilizacin
como reactivo biolgico. El hombre tiene necesidad de utilizar el animal en la bsqueda del
conocimiento igual que para alimentarse, vestirse y trabajar, de ah, el deber de respetar a estos
seres vivos. Por estas razones y aunado

al elevado costo econmico de su reproduccin,

mantenimiento y uso, los estudios con animales de laboratorio son un factor importante de que
contribuyan al avance del conocimiento que resultar eventualmente en

mejorar la salud del

hombre, de los animales y de las plantas.

En pases que han desarrollados la tecnologa de los animales de laboratorio han adquirido un alto
grado de sofisticacin y con ello los cientficos, pueden disponer de mltiples modelos de origen
gentico, de calidad sanitaria;

lo cual garantiza la validez y la eficiencia de las pruebas y la

produccin biolgica.

Biotica
El trmino fue acuado por Fritz Jahr en 1927, quien lo defini como la tica de las
relaciones de los seres humanos con los3animales y la naturaleza.

 Para la Comisin Nacional de Biotica se trata de una extensin de la tica reflexiona,

delibera y hace planteamientos normativos de polticas pblicas, para regular y resolver
conflictos en la vida social.
Los
investigadores
que
trabajen
y
experimenten
con
animales
estn
moralmente obligados a manifestarles tres tipos de actitudes: respeto, afecto y gratitud.
Respeto: por tratarse de seres vivos y sensibles, que estn experimentando sufrimiento y
podran terminar perdiendo la vida, tratrseles con todas las consideraciones que el caso
merece.
Afecto: considerndolos partcipes con nosotros.
Gratitud: reconocimiento por la importante ayuda al constituirse nuestros ms ntimos
colaboradores.
Seguir el principio de las tres R de la experimentacin humanizada para con los animales,
propuesta por William Russell (zologo y psiclogo) y Rex Burch (microbilogo) en 1959:
Reducir, al mximo el nmero de ellos y, por ende, el total de animales utilizados en
investigacin.
Reemplazar, siempre que sea posible el animal de experimentacin por otro modelo
experimental, cuando no resulte imprescindible el uso de animales.
Refiar, los mtodos y tcnicas utilizados de modo que produzcan al animal el menor
sufrimiento.

Bioterio
La palabra bioterio viene del griego bios que significa vida y teiron que significa conservar por
tan el bioterio se define como: El lugar destinado a la cra y control de los animales de laboratorio
empleados como reactivos biolgicos en protocolos experimentales. El diseo de unas buenas
instalaciones no solo se justifica desde el punto de vista experimental sino adems desde el punto
de vista moral ya que son seres vivos y por tanto merecen respeto. Debido a que las condiciones
de infraestructura, desarrollo y consolidacin del bioterio son variables, es necesario expresar las
normas mnimas que se deben tener en cuenta para el diseo, para brindar bienestar y seguridad
al personal y animales que all habitan.
BIOTERIO DE PRODUCCIN
Estructura fsica y organizacional especialmente diseada para la cra y mantenimiento de
animales de laboratorio.
Son
de
ubicacin
exclusiva,
fuera
del alcance de peligros sanitarios.
El objetivo principal es asegurar la procedencia de animales sanos para que no interfieran en
los trabajos cientficos de las diferentes reas de investigacin, fabricacin de vacunas,
antgenos y su control.
Los determinantes de un bioterio para un buen desempeo son:
1. Aspecto de infraestructura.
2. Animales definidos.
3. Personal capacitado
4

 BIOTERIO DE EXPERIMENTACIN
Destinado solamente para alojar animales durante el tiempo que dure un estudio o una
investigacin.
Se debe tener en cuenta que existan instalaciones con barreras sanitarias establecidas para
la proteccin de las personas as como de los animales, con el equipamiento necesario y los
procedimientos normativos operacionales correspondientes para dichos fines.

Animales singenicos
La isogenicidad, o igualdad gentica, es sin dudas la caracterstica ms importante de estas
lneas. El hecho de que todos los individuos pertenecientes a una lnea sean idnticos
genticamente, facilita el intercambio de tejidos, como ser clulas del sistema inmune o
clulas tumorales (en trminos de histocompatibilidad se habla de animales singeneicos).
En el caso del ratn, el alto porcentaje de homocigosis (mayor al 98%) es otro rasgo
particular de estos animales. Por lo tanto, los individuos que pertenecen a una lnea
consangunea no son equivalentes a una coleccin de gemelos idnticos (monocigticos), ni
tampoco a un grupo de animales clonados. La asociacin de los caracteres fijados en cada
lnea particular genera una individualidad con respecto a sus cualidades, rasgo que habr
que tener en cuenta a la hora de la eleccin de una lnea para un trabajo de investigacin.
La sensibilidad a ciertas enfermedades infecciosas, la tendencia a desarrollar enfermedades
autoinmunes (como el lupus y la diabetes) y la susceptibilidad a los carcingenos son slo
algunos ejemplos de la gran utilidad de estas lneas como animales de laboratorio de uso
particular.
Cada lnea consangunea tiene entonces su rango particular de caractersticas, incluyendo el
tipo de tumores espontneos, la habilidad para aprender, la vida media, la produccin de
leche, la agresividad y la susceptibilidad a los agentes infecciosos. Por esto mismo, la
seleccin de la lnea ms apropiada es una parte crtica del diseo y la planificacin de un
experimento.
Dado que se trata de animales genticamente idnticos, la uniformidad fenotpica de las
lneas consanguneas es otro rasgo importante que nos permite afirmar que la variabilidad
en los parmetros experimentales se debe exclusivamente a factores no genticos
(ambientales o metodolgicos). Esta uniformidad nos permite lograr precisin estadstica con
muchos menos animales que los necesarios al trabajar con grupos no consanguneos.
Finalmente, la uniformidad hace posible la comparacin de resultados experimentales entre
animales de diferentes laboratorios y adems, debido a su relativa estabilidad gentica, a lo
largo del tiempo. El nmero de lneas consanguneas censadas es actualmente 478 para el
ratn y 234 para la rata, lo que da una idea de la enorme cantidad de informacin y
bibliografa que se maneja.

Antgeno:
Sustancia INMUNGENA CON ESPECIFICIDAD ANTIGNICA: es toda molcula capaz de
generar una respuesta del SI cuando penetra en el organismo y de reaccionar especficamente con
los productos desarrollados en dicha respuesta. Son protenas o polisacridos.
5

M Hapteno
Sustancia NO INMUNGENA con ESPECIFICIDAD ANTIGNICA: molculas de bajo peso
molecular (menos 1000 daltons) capaces de reaccionar con un Ac (especificidad antignica), pero
incapaz de desencadenar por si mismas su produccin en el animal (no inmungena). Son
determinantes antignicos aislados.
Puede hacerse inmungena unindose a protenas transportadoras (CARRIER).
Inmungeno
Sustancia ajena o propia de un organismo que puede desencadenar una respuesta inmunolgica
pero a diferencia de un antgeno depende de la especie, va de inoculacin y concentracin.
Un inmungeno es cualquier sustancia que induce una repuesta inmunitaria. Todo los inmungenos
son antgenos pero no todos los antgenos son inmungenos. Aquellos antgenos que no son
capaces por si solos de causar una repuesta inmunitaria se denominan haptenos, son molculas
de bajo peso molecular y deben conjugarse con una molcula portadora o carrier que
proporcione epitopes reconocibles por las clulas de sistema inmunitario.

Determinante antignico
Es la regin del antgeno a quien van dirigidos los anticuerpos. Sitio donde se reconocen los
anticuerpos.
Vas de
inoculacin

Intraperitone
al

intravenosa

Conejos

Ratas y
cobayos

Ratn

Ratn

Con sonda
gstrica
Oral

Subcutnea

Rata

Ratn

Rata

VAS DE INMUNIZACIN
La eleccin de la va de inmunizacin va a depender de varios factores: cantidad que ha
de administrarse, solucin en la que a re suspenderse o diluirse el inmungeno y qu otros
componentes se han asociado (por ejemplo la B. pertussis no puede inocularse por va
intravenosa) y la rapidez o velocidad a la cual el inmungeno debe ser liberado a los vasos
linfticos y a la circulacin.
Las principales vas de inmunizacin son:
6

Subcutnea o hipodrmica: es muy fcil de realizar y permite inocular volmenes grandes,

pueden administrarse en sucesivas veces.

Intramuscular: el antgeno se libera lentamente, el volumen a inocular vara en funcin del tamao
del animal.

Intradrmica: es ms difcil de realizar y permite inyectar volmenes reducidos.

Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberacin rpida del antgeno
en el ratn, la inyeccin se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola)

Ndulos linfoides: empleada principalmente en el campo de la investigacin, se realiza en raras

ocasiones.

Intraperitoneal: se utiliza frecuentemente en animales pequeos (cobaya, ratn, rata, hmster,

etc.) permite inocular una grandes volmenes en ratones, no est recomendada para conejos
Tabla 2. Calibre de agujas para la obtencin de sangre en animales.

Tabla 3. Vas de administracin de fluidos y sustancias

Volmenes de seguridad
Tabla 5. Vas de administracin y volmenes recomendados (mL/Kg corporal) en diferentes
especies

ANIMALES MS UTILIZADOS
La experimentacin animal es uno de los pilares ms importante de las investigaciones
cientficas. El trabajo con animales permite obtener modelos experimentales fidedignos y
econmicos, pero ticamente obliga al investigador a evitar la produccin de dolor innecesario
en el animal. Las principales especies animales que se utilizan en la experimentacin son:

Conejos: sobre todo para producir anticuerpos policlonales.

Ratones: son animales de fcil manejo y son muy buenos para producir anticuerpos monoclonales.

Ratas: muy buenos para anticuerpos monoclonales.

Hmster: sobre todo para anticuerpos policlonales cuando tenemos poco antgeno.

Cobayas (Guinea pigs): son animales bastantes pacficos y sobre todo se utilizan para producir
anticuerpos policlonales.

Pollos: sobre todo para obtener respuesta frente a antgenos de mamferos muy conservados.

Cabras: sobre todo para obtener grandes cantidades de anticuerpos policlonales.

Humanos: ticamente discutible, peligroso.

Dado que la respuesta de los animales va a ser diferente, deben de inmunizarse varios
individuos. En caso de los conejos se debe inmunizar al menos dos, siendo mejor 3 4. En el
caso de los roedores se deben usar entre 3 a 6 animales.
NECESIDADES DE ANESTESIA
Tanto para la seguridad de los animales y de las personas que los manejan, como por
razones ticas, en todos los casos para la administracin y la toma de muestras se debe sujetar
e inmovilizar a los animales correctamente y si es necesario, se debe de administrar anestesia
9

siempre que exista resistencia al manejo o suponga dolor a la administracin de un producto o

la toma de muestras. En todos los casos debe de evitarse, en la medida de lo posible, producir
estrs o sufrimiento innecesario a los animales.
Antes de administrar un anestsico a un animal debe de tenerse en cuenta la especie, el
estado fisiolgico, la duracin de la inmovilizacin y la va de administracin. La anestesia
pretende producir un estado inconsciencia o hipnosis, acompaada de analgesia, relajacin
muscular y equilibrio de las constantes vitales, adems de deprimir el centro termorregulador e
induce estado de hipotermia que es muy peligroso en especies de pequeo tamao. Los
principales anestsicos que se utilizan son: Dixido de carbono (inhalacin 1-2 min.),
Pentobarbitona sdica (inyeccin), Fluanisona (en caso de ciruga mayor), Droperidol (se
usa en combinacin con la fluanisona en caso de ciruga mayor) y Diethyl ether (inhalacin)
TIPOS DE INMUNGENOS Y VIAS DE INMUNIZACIN
Excepto inmungenos particulares (tipo virus, hongos, bacterias, etc.) que slo deben
inyectarse va subcutnea, intramuscular o intradrmica, el resto (protena solubles, insolubles,
carbohidratos y cidos nucleicos) pueden inyectarse de forma intravenosa adems de las vas
anteriores.

Intravenosa en conejos.

Se coloca al conejo en la caja especial de

sujecin
Se localiza la vena marginal
Se rasura la oreja
Se dilata la vena, frotndola un poco.
Se limpia donde se har la puncin con etOH
al 70%

Se realiza con una aguja hipodrmica

de 26 x
Con el bisel hacia arriba
Siguiendo la trayectoria de la aguja
Se extrae la aguja suavemente
Aplicar una torunda con alcohol, con
presin suave.
10

Antes
Durante

Despu
s

11

12

13

Sangrado de animal

14

15

ADYUVANTE.
Sustancia que intensifica inespecficamente la respuesta inmunitaria frente a un Ag.

16

TIPOS DE ADYUVANTES
El antgeno libre suele dispersarse con rapidez desde los tejidos locales que drenan el sitio de la
inyeccin y una importante funcin de los adyuvantes es contrarrestar esto al proporcionar un
reservorio antignico duradero, ya sea en una localizacin extracelular o dentro de los macrfagos.
Los principales adyuvantes son:

ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND: es una emulsin estabilizada de aceite no

metabolizable en agua. Las emulsiones tienden a producir concentraciones ms altas y duraderas
de anticuerpos.

ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND: es igual que el incompleto pero contiene bacterias

atenuadas de Mycobacterium tuberculosis. Este produce granulomas y es muy irritante, por lo que
no est indicado para su uso en el ser humano.

ALUMN: compuesto de aluminio (fosfato o hidrxidos) y es el ms utilizado en el hombre. Para

incrementar la estimulacin no especfica, se asocia en ocasiones a bacterias muertas de
Bordetella pertussis. Si se emplea estas bacterias no se puede inyectar por va intravenosa, pero si
por el resto de las vas de inmunizacin.

I. PROTOCOLO DE PREPARACIN DEL ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND:

1. Resuspender el adyuvante de Freund incompleto por agitacin.
2. Preparar 200 l del BSA en solucin salina a una concentracin final de 2 mg/ml.
(Concentracin del antgeno 200 mg/ml)
3. Aadir en un tubo eppendorf 100 l del adyuvante incompleto de Freund. Mientras se agita el
adyuvante, ir aadiendo gota a gota la solucin antignica (100 l) Mezclar bien hasta que se vea
una emulsin pastosa.
4. La emulsin ahora es espesa. Guardar en nevera a 4C.
A qu concentracin tenemos la emulsin?
Inyeccin: La concentracin habitual para inyectar en una rata o ratn es de 50 a 100
g. Para un conejo la concentracin vara entre 50 y 1000 g. Antes de inyectarlo se debe diluir
el precipitado en salino con un volumen final de 250 L.
Queremos inmunizar a un ratn con 100g de BSA
II. PROTOCOLO DE PREPARACIN DEL ADYUVANTE ALUMN:
Se requiere:
17

 Preparar 10 ml de una solucin al 5% de Alluminium potassium sulphate (sulfato de potasio y

aluminio) [KAl (S04)2.12 H20] en agua destilada estril. Se conoce como ALUMN.
1. Preparar 1 ml de antgeno (BSA) diluido a una concentracin de 1 mg/ml en agua destilada en un
tubo Falcon de 15 ml.
2. Aadir 1 ml de la solucin 5 % ALUMN. Ajustar el pH a 6.5 aadiendo lentamente 4N NaOH.
Normalmente requiere varias alcuotas de 30 l, aunque esto vara de acuerdo al pH del agua.
Medir el pH con papel indicador.
3. Centrifugar la muestra 5 minutos a mxima centrifugacin en una centrfuga (13.000 r.p.m) Eliminar
el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
4. Resuspender el precipitado en 1 ml de salino estril (concentracin final de 1 mg/ml) Mantener a 4
C. Si se quisiera guardar muchos das (al menos 14), resuspender en salino/merthiolate 1: 10.000.
Inyeccin: La cantidad habitual para una rata o ratn es de 50-100 g. Para un conejo
entre 50 - 1000 g. Tomar la cantidad de antgeno necesario y aadir 10 9 unidades de B.
pertussis (el preparado comercial inactivado por calor, contiene 20 x 10 9 unidades en 0.5 ml) e
inyectar al animal en un volumen final de 250 l en salino.

INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA

El sistema inmunitario (SI) puede dividirse desde el punto de vista funcional en dos niveles:
a) Inmunidad innata: primera lnea de defensa frente a agentes infecciosos; la mayora de los
agentes patgenos pueden controlarse antes de que se produzca una infeccin declarada.
b) Inmunidad adaptativa: entra en accin cuando falla la inmunidad innata. Elabora una respuesta
especfica para cada agente infeccioso y guarda memoria de l (puede impedir la reinfeccin).
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

18

Componentes

Inmunidad innata

Inmunidad
adaptativa

Factores
solubles

Lisozima,
complemento,
protenas de fase aguda,
moco,
espermina
del
semen,
acidosis
del
estmago, grmenes de la
vagina, piel e intestino

Anticuerpos

Clulas

Fagocitos mononucleares,
neutrfilos, NK

Linfocitos T y B

Barreras
fsicoqumicas

Piel y mucosas (glndulas

sebceas), cilios de la
trquea

Sistema
inmunitario
cutneo
mucosa

Citosinas

IFN a y b , TNF, IL-1, IL-6

IFN-g, IL-2, IL3,

Resistencia no mejorada
por la reinfeccin

Resistencia
mejorada por
la reinfeccin

Caractersticas

Otra divisin de la respuesta inmune:

Inmunidad humoral: es la inmunidad que se transfiere mediante el plasma o suero de la sangre.
Inmunidad celular: es la inmunidad que se transfiere mediante clulas de la sangre, timo, bazo,
ganglios linfticos, etc.
INMUNIDAD INNATA.
Conjunto de mecanismos de defensa de vertebrados que incluye mecanismos ancianos
presentes en invertebrados
Involucra clulas (ej: fagocitos) y molculas solubles (ej: opsoninas) innatos o inducidos
tempranamente en la infeccin
Ejerce un control permanente -sistema de vigilancia que responde en forma inmediata a la
agresin provocada por patgenos
Provee un conjunto de seales indispensables para la activacin de la inmunidad adaptativa:
instruccin
LIMITE EXTERIOR DEL ORGANISMO.

19

El lmite exterior de nuestro cuerpo suele ser una barrera efectiva para detener los
microorganismos patgenos. Esta barrera est compuesta por:
a) Piel: est queratinizada y contiene microorganismos comensales que impiden el crecimiento de
patgenos. Adems, las glndulas sebceas secretan AG que tienen accin bactericida.
b) Lisozima (de la mayora de las secreciones externas): hidroliza la pared celular de las
bacterias Gram (+), rompiendo la unin entre el N-acetilmurmico y la N-acetilglucosamina del
peptidoglicano.
c) Moco de los epitelios de recubrimiento externo que bloquea el paso de los microorganismos.
d) Tapizado ciliar de la traquea que arrastra a los microorganismos.
e) pH cido del estmago, piel y vagina.
f) Espermina del semen.
g) Grmenes comensales del intestino, piel y vagina que ocupan un nicho ecolgico.
Los quemados pierden la barrera de proteccin y aumenta el riesgo de infecciones.
1.1.1.2. FAGOCITOS: MACRFAGOS Y NEUTRFILOS.
Son la primera barrera de defensa y su funcin es fagocitar y destruir partculas patgenas. Est
compuesto por:
a) Clulas del sistema mononuclear fagoctico:
Macrfagos de los alvolos, bazo, recirculantes y residentes en los ganglios linfticos.
Monocitos sanguneos.
Clulas A.
Clulas de Kupffer del hgado.
Clulas microgliales del SNC.
Fagocitos mesangiales renales.
Clulas de Kupffer.
Macrfagos esplnicos.
Histiocitos: macrfagos de los tejidos.
Osteoclastos del hueso.
b) Granulocitos (PMN): neutrfilos, eosinfilos.
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

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1.1.1.3. NATURAL KILLER (NK).

Las NK son leucocitos (linfocitos granulares grandes o LGL) que pueden reconocer los cambios de
la superficie celular que se producen en algunas clulas infectadas por virus y ciertas clulas
tumorales. Las NK se unen a estas clulas diana y las destruyen (reaccin citotxica).
1.1.1.4. PROTENAS DE FASE GUDA.
La concentracin srica de las protenas de fase aguda aumenta rpidamente durante la infeccin
y permanece elevada durante sta. Por ejemplo:
a) La protena C reactiva (PCR) que reconoce y se une por un mecanismo dependiente de calcio,
a los grupos moleculares existentes en una gran variedad de bacterias y hongos. En particular, se
une a la mitad fosforilcolina de la pared del neumococo y acta como opsonina, activando el
complemento.
b) El sistema de complemento es un grupo de 20 protenas sricas cuya funcin global es
controlar la inflamacin. Se activan por una cascada de reacciones enzimticas que conducen a:
Opsonizacin de microorganismos.
Quimiotaxis y fagocitos.
Aumento de flujo sanguneo e incremento de la permeabilidad en la zona.
Lesin de la membrana plasmtica de virus, bacterias y clulas que hayan inducido la activacin.
c) Los interferones (IFN) son un grupo de protenas importantes en la infeccin vrica.
1.1.1.5.
TOLL-LIKE
RECEPTORES
(TLRS):
RECEPTORES
SOBRE
CLULAS
INFLAMATORIAS.
Estos receptores, conservados a lo largo de la escala evolutiva, constituyen un puente entre la
inmunidad natural y adaptativa, y un sistema ancestral de reconocimiento de los microorganismos y
de seales de riesgo endgenas, como restos de clulas necrticas y protenas HSP. Se
identificados en Drosophila como molculas involucradas en el desarrollo embrionario; luego se
constat su papel en la defensa contra microorganismos
21

Hoy hablamos de una familia de protenas; se han identificado 10 TLRs en mamferos. Los diversos
TLRs reconocen distintos patrones de molculas de bacterias y virus (LPS, flagelina, lipoprotenas,
glicolpidos, secuencias de nucltidos CpG), y transmiten seales que llevan a la activacin del
NFkB y de genes de citocinas y molculas coestimuladoras. Aunque se encuentran en diversos
tipos celulares, su papel es ms significativo en las clulas presentadoras de antgenos, tales como
monocitos, macrfagos y clulas dendrticas.
Respecto a su estructura:
Su dominio extracelular une al ligando
incluye un motivo rico en Leu (18-31aa, LRRs)
diverge entre diferentes TLRs y entre TLR homlogos de diferentes especies
Su dominio citoplasmatico une protenas citoslicas
Activa vas de sealizacin dominio activador
est altamente conservado
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

La activacin de TLRs en insectos conduce a la produccin de pptidos antibacterianos

denominados cecropinas. Las Clulas inflamatorias de mamferos -neutrfilos y monocitossecretan pptidos similares denominados defensinas en respuesta a estmulos (por ejemplo IL-1).
En general se caracterizan por ser peptidos antipticos que destruyen la continuidad de la pared/
membrana bacteriana (forman poros?). No afectan clulas eucariotas.
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

22

La inflamacin inducida a travs de la activacin de TLR recluta clulas que participan en la

eliminacin del patgeno, por ejemplo neutrfilos. Las clulas activadas -a travs de los TLRsviajan al ganglio linftico preparadas para su encuentro con los linfocitos con los mecanismos de
la respuesta adaptativa activados
INFLAMACIN.
El inicio de la respuesta innata involucra la activacin celular o de sistemas enzimticos
(complemento y va de activacin por contacto). La activacin celular implica el reconocimiento de
estructuras conservadas en patgenos (patrn molecular asociado a patgenos, PAMP) por
receptores expresados en la superficie de clulas residentes en el tejido como macrfagos y
dendrticas.
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

Tras la activacin celular y de sistemas enzimticos se desencadenan mecanismos efectores

destinados a eliminar al patgeno. Las clulas fagocticas pueden ingerir y degradar patgenos
extracelulares. El complemento puede conducir a la lisis de bacterias. Tanto la activacin celular
como la activacin del complemento generan mediadores de la inflamacin.
En el inicio de una respuesta el principal sistema enzimtico involucrado es el complemento trs la
activacin de la va alterna. El mecanismo involucrado en la activacin de la va alterna se muestra
en las figuras siguientes. La activacin del complemento tambin puede ocurrir por unin de una
protena soluble MBL (lectina que une mananos) a carbohidratos presentes en patgenos, a travs
23

de un mecanismo conocido como va de las lectinas. Los niveles basales de MBL en los tejidos son
muy bajos, por lo cual es dudoso en qu medida esta va podra activarse en forma inmediata al
ingreso de un patgeno. Sin embargo como la MBL es una protena de fase aguda (sintetizada por
los hepatocitos en respuesta a IL-1 y IL-6) es posible que la va de las lectinas permita amplificar la
respuesta inflamatoria innata.
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

C3a, C4a y C5a tienen actividad anafilctica (promueve localmente dilatacin y aumento de la
permeabilidad de los vasos sanguneos), quimiotctica (dirige el trnsito de leucocitos desde la
sangre al tejido, a favor de su gradiente de concentracin) y son capaces de activar una variedad
de tipos celulares.
Es la respuesta tpica de la inmunidad natural frente a los agentes agresores. Se producen tres
acontecimientos que se manifiestan en forma de inflamacin:
a) Aumento del riego sanguneo (hiperhemia).
A nivel de los capilares se pierde la capa de msculo liso que rodea al endotelio de las arterias y
arteriolas. Esto permite la extravasacin celular a la altura de la red capilar.
Los mediadores proinflamatorios contribuyen al aumento del flujo sanguneo, a la vasodilatacin y
al aumento de la permeabilidad de los vasos. Estos dos ltimos fenmenos se asocian con la
contraccin de la clula endotelial (observar la figura superior de la izquierda): las clulas se
achican aumentando el espacio entre ellas y permitiendo el aumento del dimetro del vaso.
Los mediadores inflamatorios tambin contribuyen a la detencin de las clulas sanguneas en la
zona porque inducen la expresin de molculas de adhesin en el endotelio.
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

24

b) Aumento de la permeabilidad capilar y formacin del exudado inflamatorio por retraccin

de las clulas endoteliales que permite la salida de elementos del sistema inmunitario (SI) hacia el
lugar de la infeccin. El aumento de lquido en la zona inflamada conduce al aumento de la presin
local. Esta presin dirige el trnsito de las clulas, a travs de la linfa, desde el sitio de inflamacin
a los ganglios linfticos prximos, sitios en donde se encuentran las clulas, linfocitos B y T,
capaces de reconocer especficamente componentes extraos. As la respuesta inflamatoria resulta
fundamental para conectar los componentes de la inmunidad innata y adaptativa.
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.

c) Quimiotaxis de los leucocitos hacia el lugar de la infeccin. Los fagocitos responden a un

gradiente de concentracin de ciertas molculas como C5a y C3a. Los pasos son:
Pavimentacin del endotelio capilar.
Diapedesis o paso del endotelio capilar por seudopodos.
Movimiento ameboide por el tejido intersticial.
Aumento de la fagocitosis inespecfica mediada por opsoninas como C3b
Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Ctedra de Inmunologa, Universidad de la Repblica;
Montevideo-Uruguay.
25

Adems, Como consecuencia de la unin de varias citoquinas (IL-1, TNF-alfa), C3a y C5a a
receptores en la membrana de las clulas endoteliales, se induce un aumento de la expresin de
molculas de adhesin (selectina P) sobre la clula endotelial. Adems, estas molculas tambin
conducen al aumento de la expresin de molculas de adhesin celular sobre neutrfilos y
monocitos. En conjunto, estos cambios favorecen la detencin de las clulas sobre el endotelio
vascular en la zona inflamada y su posterior extravasacin.
Tras la inflamacin aguda puede ocurrir lo siguiente:
Resolucin con retorno a una estructura y funcin normales.
Supuracin con formacin de abcesos.
Hinchazn con regeneracin de tejido especializado o fibroso formando una cicatriz.
Persistencia del agente causante, haciendo el proceso crnico (semanas, meses, aos).
INMUNIDAD ADAPTATIVA O ESPECFICA.
El sistema inmune adaptativo se caracteriza por una fina especificidad, que se adapta al
reconocimiento del patgeno o clula tumoral que aparece como un desafo para la
homeostasis del individuo. Este reconocimiento especfico permite dirigir poderosos mecanismos
efectores contra el agente agresor. El sistema inmune adaptativo se caracteriza adems por contar
con un mecanismo de memoria por el cual, ante un segundo encuentro con el mismo desafo, la
respuesta es ms rpida y ms eficiente.
La divisin del Sistema Inmune en Innato y Adaptativo facilita el abordaje del estudio del Sistema
Inmune, pero es una divisin artificial. Ambas ramas del sistema inmune funcionan
cooperativamente potenciandose mutuamente.
El sistema inmune innato reconoce lo no-propio a travs de receptores seleccionados durante el
curso de la evolucin de la especie, los cuales reconocen estructuras comunes y altamente
conservadas en los patgenos (llamados patrones asociados a patgenos). Todas las clulas
pertenecientes a un mismo tipo celular (ej. macrfagos,
neutrfilos) presentan idnticos receptores.
26

Dicho patrn de receptores permanece invariable durante la

vida del individuo.

Por el contrario, el sistema inmune adaptativo funciona sobre la base de una distribucin
clonal de los receptores vinculados al reconocimiento especfico. Qu significa esto?: Que en el
proceso de maduracin de los linfocitos se genera en forma aleatoria un receptor de membrana
con una determinada especificidad, es decir la capacidad de reaccionar con una nica estructura
qumica. De modo que en cada clula hay una nica especificidad. Luego opera un mecanismo
de seleccin clonal por el cual los clones con especificidad por componentes propios son
eliminados, mientras que los clones con especificidad por componentes no-propios o alterados
(como los de las clulas tumorales) son estimulados por el antgeno para proliferar (aumento de
nmero) y diferenciarse (cambios fenotpicos). Como consecuencia, aparecen en el clon
seleccionado propiedades efectoras que permiten contribuir a eliminar el patgeno o las clulas
tumorales.
1.2.1. TIPOS DE INMUNIDAD ESPECFICA.
La inmunidad se puede conseguir por dos mecanismos:
a) Inmunizacin activa: introduccin de un antgeno que induce una respuesta por el sistema
inmunitario especfico.
b) Inmunizacin pasiva: transferencia de componentes de un organismo a otro que no lo est.
Este sistema se usa para bloquear un antgeno urgentemente. Es estas ocasiones se transfieren
Ac producidos en otro individuo para neutralizar el veneno.
1.2.4. DETERMINANTE ANTIGNICO O EPITOPE.
Zona del Ag en la que reside la antigenicidad: conformacin molecular de la superficie del Ag
capaz de combinarse especficamente con una zona complementara que existe en el Ac.
Los Ac son especficos para un Ag, pero un Ag puede tener varios Ac especficos. Cada Ac se
acopla a una zona del Ag llamada determinante antignico o epitopo; son formas moleculares
reconocidas por los Ac y las clulas del SI adaptativo especfico. Un Ag puede tener varios epitopos
diferentes o idnticos. Los Ac son especficos para los epitopos y no para el Ag en su conjunto.
1.2.6. MOLCULAS QUE PARTICIPAN EN EL RECONOCIMIENTO DEL ANTGENO.
En el sistema inmune adaptativo hay tres tipos de molculas que intervienen en el reconocimiento
del antgeno.
27

 Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que se presentan como receptores de membrana en

los linfocitos B, o son secretados por estos una vez que se han transformado en plasmocitos.
El receptor T (TCR) de los linfocitos T, que segn el tipo de cadena que lo forme puede ser ba o
dg. La funcin de estos ltimos es todava confusa, mientras que el papel del receptor ba est bien
establecida, y se vincula con el reconocimiento de pptidos unidos a receptores denominados
molculas del complejo mayor de compatibilidad (MHC)
Las molculas de MHC son el tercer tipo de estructura que participan en el reconocimiento del
antgeno. Pero, mientras que el reconocimiento en el caso de las Igs y los TCRs es de muy alta
especificidad, las molculas de MHC interactan con el antgeno con baja especificidad. Existen
dos tipos de receptores MHC, de clase I y clase II. Mientras que los primeros estn presentes en
todas las clulas nucleadas, los ltimos estn restringidos a un nmero limitado de clulas del
sistema inmune.

1.2.7. SELECCIN CLONAL.

Las clulas protagonistas del sistema inmune adaptativo son el linfocito B y el linfocito T y su
especificidad se basa en la especificidad de los Ac, receptor del linfocito B (BCR) y receptor de
linfocito T (TCR). La cantidad de Ags que pueden ser reconocidos es alta porque hay linfocitos
reconocedores de cualquier Ag en un porcentaje muy bajo. Cuando estas clulas reconocen el Ag,
se induce una proliferacin hasta conseguir clulas suficientes para desarrollar una respuesta
adecuada.
El Ag selecciona los clones celulares capaces de fijarlo especficamente:
a) Las clulas B estn preparadas para producir un slo tipo de Ac especfico de un Ag, que se
sita en la superficie celular como Rc del Ag. La funcin principal del linfocito B es la secrecin
de anticuerpos. Los anticuerpos o inmunoglobulinas son glicoprotenas que tienen sitios de unin
al antgeno y una regin constante vinculada a las funciones efectoras de los mismos. A travs de
su unin los anticuerpos a) bloquean o neutralizan directamente al antgeno que reconocen, b)
reclutan clulas efectoras (como macrofagos, neutrfilos, clulas NK, etc) debido a la existencia de
receptores que se unen a su regin constante, o c) disparan la va clsica del complemento.El Ag
se une al BCR y provoca la proliferacin de las clulas B para producir:
Clulas plasmticas productoras de Ac.
Clulas de memoria de larga vida que no producen Ac.

28

b) Los linfocitos T tiene una funcin central en la regulacin de la respuesta inmune y

participan adems directamente en la destruccin de los agentes agresores. Reconocen al
antgeno a travs de su receptor de membrana (TCR) que no se secreta. Hay dos tipos de
receptores ba y dg. La funcin de los linfocitos T que tienen receptores dg es poco comprendida y
nuestro conocimiento principal es sobre los linfocitos T con receptores ba. A diferencia de las
inmunoglobulinas que pueden unirse a un amplio espectro de estructuras qumicas, los linfocitos
T con
receptores
ba
solo reconocen pptidos asociados
a
receptores
de
membrana (denominadas molculas del complejo mayor de histocompatibilidad, MHC) presentes
en clulas propias del individuo. Cuando un linfocito T virgen reconoce a su antgeno (si se
cumplen una serie de condiciones) es estimulado a proliferar y diferenciarse. Esta diferenciacin
puede dar lugar a tres tipos de clulas efectoras: a) linfocitos T citotxicos (CTL) que actan por
ej. En las infecciones virales destruyendo la clula infectada, b) linfocitos T inflamatorios (TH1)
que colaboran con el macrfago aumentando su capacidad de destruir los patgenos fagocitados,
c) linfocitos T colaboradores (TH2) que colaboran con el los linfocitos B en la produccin de
anticuerpos, favoreciendo los procesos de maduracin de la afinidad, cambio de clase y generacin
de linfocitos B de memoria.

El sistema inmune produce Ac que pueden reconocer Ags antes de ponerse en contacto con l. Se
producen tantos Ac que la mayora no son reclamados nunca; pero este mecanismo se mantiene
porque los microorganismos mutan continuamente sus Ags.
1.3. CAVIDADES Y MEDIO EXTERNO.

29

Cavidade
s

Medio
interno

Proteccin
externa

Mucosas

Pile

Secreciones

Mucosida
d,
pH,
saliva,
bilis

Lisozima,
lpidos,
sudor

Inmunoglobul
inas

IgA
polimrica

IgG, IgM,
IgE,
IgA,
monomric
a

Receptor
celulas T

Cadenas
g, d

Cadenas a,
b

Dependie
ntes
de
celulas T

Independie
ntes
de
celulas T

Mastocitos

de

1.4. FASES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA.

El objetivo final de la respuesta inmune es la eliminacin del antgeno, y para ello tiene
que reconocerlo por medio de Rc especficos que hay en la superficie de os linfocitos T y B. Los
linfocitos B son los encargados de la inmunidad humoral y los linfocitos T de la celular.
Tras el reconocimiento viene la fase de activacin en la que los linfocitos experimentan una serie
de modificaciones. Las fases en las que se produce son:
Proliferacin: expansin de los clones especficos del antgeno que estimula.
Diferenciacin: hace que las clulas cuya funcin inicial era reconocer pasen a clulas efectoras
con los mecanismos necesarios para eliminar los antgenos extraos.
Estos procesos requieren numerosos mecanismos de amplificacin compuestos con otros tipos
celulares que interaccionan clula a clula y a travs de molculas solubles con accin autocrina,
paracrina o endocrina. Adems, los linfocitos migran a los lugares donde se encuentra el antgeno y
donde se produce la respuesta inmunitaria.
La siguiente fase es la efectora: los linfocitos que han sido activados son capaces de eliminar el
Ag.
En 1975 Kler y Milstein desarrollaron la tcnica de hibridacin de clulas somticas que
permiti la obtencin de anticuerpos monoclonales. Esta tcnica consiste en tres etapas:
30

I.

Inmunizacin del animal con un antgeno : Se realiza una primera inmunizacin y luego se realizan
varias inmunizaciones de recuerdo. El nmero y la frecuencia de las inmunizaciones es variable.
Por ltimo se da una inmunizacin de refuerzo (booster) tres das antes de sacrificar al animal. Las
vas de inmunizacin pueden ser subcutnea, intraperitoneal, y en ocasiones, intravenosa. Si
tenemos poco antgeno o es poco inmunognico se puede inmunizar directamente en el bazo o en
los ndulos linfticos.

II. Fusin celular: se va a realizar entre los linfocitos del bazo del animal inmunizado (aporta la
especificidad del anticuerpo) y una lnea celular tumoral (mieloma) que aporta la inmortalidad. El
mieloma no debe de producir inmunoglobulinas propias, debe de ser capaz de inducir la fusin con
alta eficacia y poseer los marcadores necesarios para seleccionar las clulas fusionadas (gen
HGPRT deficiente) en el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La fusin celular se ve
favorecida por el polietilenglicol (PEG).
III. Ensayos de especificidad frente al antgeno : la deteccin de los anticuerpos especficos, en el
medio de cultivo donde crecen los hibridomas, es uno de los puntos ms crticos en la estrategia de
produccin de anticuerpos monoclonales. Las tcnicas empleadas deben ser sensibles para
detectar g de anticuerpo por ml, deben ser rpidas para evitar el sobrecrecimiento; simples y lo
ms automatizadas posibles. Las tcnicas ms utilizadas son las enzimoinmunomtricas. Los
cultivos que den positivo deben ser clonados lo ms rpidamente posible para establecer clones
productores de anticuerpos monoclonales. Esto se realiza principalmente por el mtodo de dilucin
lmite en medio lquido o en agar.

Tcnica n2.A

Extraccin de sangre de Seno Retro-orbital

Anestesia: Obligatoria
Material: Capilares tratados con anticoagulante (EDTA, heparina)
Restricciones: Esta tcnica debe ser llevada a cabo nicamente cuando no exista
mtodo alternativo y siempre por personal cualificado debido al elevado riesgo de daar
estructuras adyacentes al globo ocular, lo que puede originar infecciones severas, ceguera
etc
Volumen de extraccin: Consultar Tabla I
31

Descripcin de la tcnica:

1. Una vez anestesiado el ratn y comprobado que se ha alcanzado el plano

quirrgico, sujetar al ratn estirando la piel del cuello hacia atrs
asegurndose de no dificultar la respiracin
2. Insertar el capilar en el ngulo externo del ojo (2 mm aprox) y girar
suavemente hasta que la sangre fluya por el mismo.
3. Recoger la muestra y retirar el capilar.
4. Oprimir ligeramente la zona de puncin con una gasa o papel para detener
la hemorragia.
5. Aplicar pomada oftlmica (Lubrifilm) al ojo.
6. Comprobar que la recuperacin de la anestesia se produce
adecuadamente aportando las medidas que se consideren necesarias
para ello (i.e , aporte de calor )
7. Observar al animal los das posteriores al sangrado para detectar la
aparicin de posibles complicaciones: protrusin de tejido adyacente al
ojo, infecciones, hemorragias

Fig. 1

32

Anexo 1

Tabla I. Volmenes de extraccin de sangre.

Tabla I.A. Volmenes de extraccin referidos a Vc (volumen circulante)

Extraccin nica

Extracciones mltiples

% Vc extrado

Perodo
de% Vc extrado
recuperacin
en 24h

Perodo de

7.5 %

1 semana

7.5 %

1 semana

10 %

2 semanas

10 %

2 semanas

15 %

4 semanas

15 %

3 semanas

recuperacin

Vc: Volumen circulante

Vc ratn: 72 ml/kg
Vc rata: 68 ml/kg

Tabla I.B. Volmenes de extraccin referidos a Vt (Volumen total)

Extraccin de sangre
7.5 %

10 %

15 %

20 %

(ml)

(ml)

(ml)

(ml)

1.8

0.1

0.2

0.3

0.4

16

1.2

1.6

2.4

3.2

V t (ml)
Ratn
(25g)
Rata
(250g)

33

Vt: Volumen total: aprox. 6% del peso (en ml)

Tabla II. Volmenes de inoculacin.

Rutas y volmenes de administracin

(ml/kg excepto *ml/sitio)
oral

Ratn

Rata

SC

IP

10 (50) 10 (40) 20 (80)

IM
0.05*
(0.1)*

10

10

0.1*

(40)

(10)

(20)

(0.2)*

IV

IV

Bolus

Perf.

(25)

(20)

() Volmenes mximos
- No ms de 2 inoculaciones IM por da
- No ms de 2 3 inoculaciones SC por da
- IV: no exceder 4% volumen circulante (bolus) o 4 ml/kg/h en perfusin

Anexo 2

Se recomienda un rango de pH de trabajo de 4,5-8 (Waynforth and Flecknell, 1992) teniendo en

cuenta que el grado de tolerancia de pH para las diferentes vas de administracin es:

Va oral > Va intravenosa > Va intraperitoneal > Va intramuscular > Va subcutnea Va

intradrmica

El pH, por s solo, no es un indicador suficiente del potencial irritante ya que la irritabilidad depende
tambin de la concentracin y del punto de ionizacin (pK) del compuesto. Estos factores, as como
la solubilidad, biocompatibilidad, viscosidad y esterilidad, debern ser valorados antes de proceder
a la inoculacin del compuesto en cuestin por cualquiera de las vas mencionadas.
34

Referencias

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removal of blood, including routes and volumes. AALAS [internet]. 2001 [citado 31 ago 2015];
35:1-41. Disponible en: http://labanimals.stanford.edu/Guidelines
2. D.B. Mortom, M. Jennings, A. Beckwell, R. Ewbank, C. Godfrey, B. Holgayte, I. Inglis, R.
James. Refining procedures for the administration of substances. AALAS [internet]. 2006
[citado 31 ago 2015]; 35:1-41 Disponible en: http://www.aalas.org

3. Crepaz, N., Passin, W.F., Herbst, J.H., y cols. Meta-Analysis of Cognitive-Behavioral

Interventions on HIV-Positive Persons Mental Health and Immune Functioning. Health
Psychology [Internet] 2008 [citado 31 ag 2015]; 27, 4-14. Disponible
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835810/

en

4. Miller, G.E., Cohen, S.). Psychological interventions and the immune system: A metaanalytic review and critique. Health Psychology [internet] 2001 [citado 31 ag 2015]; 20, 4763. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11199066
5. Trakhtenberg; E. The effects of guided imagery on the immune system: A critical
review. IJ of Neuroscience [Internet], 2008 [Citado 31 ago 2015]; 118, 839855.Disponible en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11199066
6. conbioetica-mexico.salud.gob.[Internet]. Mxico: Centro del conocimiento biotico
[actualizado Lunes 27 de enero del 2014]. Disponible en: http://www.conbioeticamexico.salud.gob.mx/interior/queeslabioetica.html

7. NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones tcnicas para

produccin, cuidado y uso de los animales de laboratorio.

35

la