INTRODUCCIN

Las bacterias FN presentan una muy amplia diversidad taxonmica, con

diferentes estilos de vida y de asociacin con los vegetales.
La fijacin biolgica de nitrgeno o reduccin de N 2 a NH4, es un proceso
que pueden llevar a cabos solos algunos procariotes gracias a que
poseen el complejo enzimtico conocido como nitrogenasa.
Las bacterias fijadoras de nitrgeno o diaztrofas, ocupan un nicho
ecolgico indispensable ya que suplen de nitrgeno fijado al ciclo global
del nitrgeno.
La informacin gentica de la bacteria para fijar nitrgeno est dada en
un cluster de genes denominado nif.
La actividad fijadora de nitrgeno atmosfrico est codificada por los
llamados genes nif (nitrogen fixation), los cuales han podido transferirse
por

manipulacin

gentica

bajo

forma

de

plsmidos

desde

microorganismos fijadores a otros que no lo son, siendo el plsmido

denominado pRD1, obtenido de Klebsiella pneumoniae, el ms utilizado
al ser estable en numerosas especies bacterianas y expresarse en las
mismas.

GENTICA Y REGULACIN DE GENES EN LA UTILIZACIN DE

NITRGENO

Un gen es una secuencia ordenada de nucletidos en la molcula

de ADN (o ARN, en el caso de algunos virus) que contiene la informacin
necesaria para la sntesis de una macromolcula con funcin celular
especfica, habitualmente protenas pero tambin ARNm, ARNr y ARNt.
Esta funcin puede estar vinculada con el desarrollo o funcionamiento de
una

funcin

fisiolgica.

El

gen

es

considerado

la

unidad

de

almacenamiento de informacin gentica y unidad de la herencia, pues

transmite esa informacin a la descendencia. Los genes se disponen,
pues, a lo largo de ambas cromtidas de los cromosomas y ocupan, en el
cromosoma, una posicin determinada llamada locus. El conjunto de
genes de una especie, y por tanto de los cromosomas que los
componen, se denomina genoma. Los genes estn localizados en los
cromosomas en el ncleo celular.
Un gen es el conjunto de una secuencia determinada de nucletidos de
uno de los lados de la "escalera" del cromosoma referenciado. La
secuencia puede llegar a formar protenas, o sern inhibidas,
4

dependiendo del programa asignado para la clula que aporte los

cromosomas.
Todos los organismos vivos estn compuestos bsicamente por carbono,
hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y muchas otras formas de elementos
qumicos. Estos elementos contribuyen para organizar finalmente
diversas biomolculas presentes en una clula. El nitrgeno al igual que
el carbono es de gran importancia en los organismos vivos.

En una clula viva, el nitrgeno es un importante constituyente de

aminocidos, protenas, enzimas, vitaminas, alcaloides y algunos de
crecimiento hormonas. Por lo tanto, el estudio del metabolismo del
nitrgeno es absolutamente esencial porque el proceso de toda la vida
depende de estas molculas que contienen nitrgeno.
El nitrgeno esta principalmente presente en la atmsfera libremente
como dinitrgeno o gas nitrgeno. (N2) es muy estable, Debido a esta
estabilidad, nitrgeno molecular, como tal, no es muy reactivo en la
atmsfera bajo condiciones normales.
En la atmsfera el volumen de nitrgeno molecular es 78,03% y tiene un
punto de ebullicin muy bajo (-195.8oC) que es incluso ms bajo que el
oxgeno. Las protenas presentes en los organismos vivos contienen
aproximadamente 16% nitrgeno.
El nitrgeno molecular (N2) es la nica reserva de nitrgeno (N)
accesible en la biosfera. Prcticamente ilimitada, esta reserva no es
directamente utilizada por los vegetales y animales. El N es un
constituyente esencial de molculas fundamentales de todos los seres
vivos: aminocidos, protenas, cidos nucleicos, vitaminas, etctera. Para
que el N2 pueda ser asimilado, es necesario que sea reducido. Los

nicos seres vivos capaces de realizar esta reaccin son las Eubacteria y
Archaea.
Las bacterias FN presentan una muy amplia diversidad taxonmica, con
diferentes estilos de vida y de asociacin con los vegetales. Sin embargo,
slo una pequea proporcin de especies son capaces de hacerlo; 87
especies en dos gneros de arquibacterias, 38 de bacterias, y 20
gneros de cianobacterias se han identificado como diaztrofos.

Fijacin del nitrgeno por microorganismos.

La fijacin biolgica de nitrgeno o reduccin de N 2 a NH4, es un proceso
que pueden llevar a cabo solo algunos procariotes gracias a que poseen
el complejo enzimtico conocido como nitrogenasa, la cual est formada
por dos protenas: una protena que contiene hierro (protena-Fe) y otra
que contiene molibdeno y hierro (protena Mo-Fe). La nitrogenasa que
contiene molibdeno Mo es la ms ampliamente distribuida.
Las bacterias fijadoras de nitrgeno o diaztrofas, ocupan un nicho
ecolgico indispensable ya que suplen de nitrgeno fijado al ciclo global
del nitrgeno. Gracias a este papel los diaztrofos estn presentes en
virtualmente todos los ecosistemas, con representantes en ambientes tan
variados como la superficie de los ocanos (Tricodesmiun), los ndulos
de las races de las plantas (Rhizobium), y en suelos aerbicos como es
el caso de Azotobacter.
En cualquier ecosistema los diaztrofos responden a condiciones
variadas del ambiente para regular el muy caro proceso de fijacin de
nitrgeno. Todos los diaztrofos regulan la nitrogenasa a nivel

transcripcional. Algunos tambin poseen sistemas rpidos de regulacin

postranscripcional.
La fijacin de nitrgeno reduccin de N 2 a NH4 requiere 8 electrones,
por lo tanto se requiere un mnimo de 16 ATP para reducir una molcula
de N2 atmosfrico. Adems la reduccin de N2 est siempre acoplada a la
reduccin de H+ a H2. Bajo condiciones fisiolgicas normales el
requerimiento de ATP es de 20 a 30 molculas de MgATP, en
consecuencia la fijacin de nitrgeno puede consumir una fraccin
significativa de la poza celular de ATP. El ATP utilizado en la fijacin de
nitrgeno lo provee la respiracin aerbica. Por lo tanto la fijacin de
nitrgeno aerbica requiere una concentracin de O2 mnima.

La nitrogenasa un complejo enzimtico sensible al oxgeno

La nitrogenasa purificada es inactivada rpida e irreversiblemente por el
O2 . La protena Fe es mucho ms sensible que la protena MoFe con
una vida media en presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos
respectivamente . El efecto de O2 sobre la nitrogenasa restringe la
7

fijacin de N2 en la mayora de las especies de eubacterias a condiciones

anaerbicas o de microaerobiosis.
La fijacin de nitrgeno en bacterias aerbicas como Azotobacter es un
proceso que demanda gran cantidad de energa, por lo que requiere una
eficiente fosforilacin oxidativa. Debido a que el O 2 es txico para el

complejo de la nitrogenasa, las bacterias aerbicas fijadoras de nitrgeno

han evolucionado una variedad de estrategias para contender con esta
paradoja aparente.
A. vinelandii fija nitrgeno en aerobiosis A. vinelandii era hasta hace poco
la nica bacteria reconocida capaz de fijar nitrgeno en condiciones de
total aerobiosis recientemente se describi otro sistema de fijacin de
nitrgeno tolerante a O2 en Streptomyces thermoaututrophicus ).
Azotobacter fija nitrgeno en aerobiosis gracias a que posee un sistema
bien integrado de proteccin de su nitrogenasa que comprende:
proteccin conformacional, proteccin respiratoria, autoproteccin y otros
cambios

morfolgicos

fisiolgicos

que

le

diazotrficamente en condiciones totalmente aerbicas.

permiten

crecer

Proteccin conformacional. En A. vinelandii un aumento pasajero del

O2 provoca un mecanismo de inactivacin (switching-off) de la
nitrogenasa, que consiste en la formacin de un complejo de nitrogenasa
inactivado pero protegido, conocido como proteccin conformacional.
Este complejo es formado por la unin no covalente de una protena que
contiene Fe-S (conocida como FeSII o Shetna) a las protenas Fe y
MoFe
Proteccin respiratoria. Cuando las clulas se adaptan al ambiente de
mayor concentracin de O2, se expresa la citocromo oxidasa cytbd,
parcialmente

desacoplada

con

baja

afinidad

por

O 2,

la

cual

probablementa acta junto con una NADH deshidrogenasa desacoplada.

El flujo de electrones a travs de esta cadena desacoplada permite tasas
de respiracin altas y un rpido consumo del O 2 intracelular sin agotar las
pozas de ATP y NADH.
La tasa respiratoria en condiciones de fijacin de nitrgeno atmosfrico
es 10 veces ms alta que la tasa normal de muchas bacterias. Adems
de reducir el O2 la citocromo oxidasa cytbd, funcionara como un
productor de ATP rpido ya que se necesitan grandes cantidades de ATP
para la autoproteccin de la nitrogenasa.
Autoproteccin.

Si

la

concentracin

de

nitrogenasa

es

lo

suficientemente alta en relacin a la concentracin de O 2 celular, la

nitrogenasa reductasa puede reducir O2 a H2O2 y posiblemente a H2O y
por lo tanto reducira el O2 en la vecindad de la nitrogenasa. Adems el
flujo constante de equivalentes reductores a travs de la nitrogenasa
puede ayudar a mantenerla en un estado reducido. Este proceso
conocido

como

autoproteccin

requiere

grandes

cantidades

de

equivalentes reductores y ATP que son los provistos por la rama cytab de
la cadena respiratoria.

Es todava motivo de controversia si la alta tasa respiratoria reduce la

concentracin intracelular de O2 (proteccin respiratoria) o solo funciona
para

proveer

equivalentes

reductores

y ATP a

la

nitrogenasa

consumidora de O2 (autoproteccin). Sin embargo se ha comprobado

que las altas tasas respiratorias son esenciales para la fijacin de
nitrgeno tolerante a O2 en Azotobacter vinelandii. Mutantes en la
oxidasa terminal cytab son incapaces de fijar nitrgeno aerbicamente.
Nitrogenasas alternativas
Adems de la extensivamente caracterizada nitogenasa que requiere
molibdeno,

Azotobacter

vinelandi

posee

otras

dos

nitrogenasas

alternativas: una que contienen vanadio y otra que contiene Fe.

El proceso a travs del cual esos microorganismos reducen el nitrgeno
hasta una forma utilizable es conocido como Fijacin Biolgica de
Nitrgeno (FBN, por sus siglas en espaol).
El proceso puede ser llevado a cabo por los microorganismos en vida
libre o en simbiosis con plantas, y permite no slo usar el nitrgeno
atmosfrico, sino tambin revertir o reducir la degradacin del suelo
(Mayz-Figueroa, 2004; Parsons, 2004)
La fijacin en general supone la incorporacin a la biosfera de una
importante cantidad de nitrgeno, que a nivel global puede alcanzar unos
250 millones de toneladas ao, de las que 150 corresponden a la fijacin
biolgica.
Es un proceso altamente consumidor de energa que ocurre con la
mediacin de la enzima nitrogenada, segn la siguiente ecuacin
(Postgate, 1998):
N2 + 16ATP + 8e- + 8H+ 2NH3 + 8H2 + 16ADP 16Pi

10

Esta reaccin est catalizada por un complejo enzimtico denominado

nitrogenasa o dinitrogenasa, que consta de dos componentes:
Componente I o nitrogenasa propiamente dicha; posee un cofactor de
hierro y molibdeno (FeMoCo) que forma parte del centro activo. Por ello,
a este componente tambin se le conoce como molibdoferroprotena.
(En realidad existen dos copias del

cofactor, cuya estequiometra es

MoFe7S8-homocitrato)
Componente II o nitrogenasa-reductasa, que posee tomos de Fe
acomplejados con S de determinadas cistenas (por lo que este
componente se denomina a veces ferroprotena).
Esta requiere de grandes cantidades de poder reductor y energa (ATP),
y la reduccin obligada de protones con un mnimo de 1 mol of H2
producido por mol de N2 reducido (Halbleib y Luden, 2000).

La actividad del complejo enzimtico puede ser mermada por el oxgeno,

de tal manera que los organismos fijadores poseen mecanismos (e.j. alta
tasa respiratoria, compartamentalizaciones o proteccin conformacional)
que les permiten mantener bajas concentraciones de ste a fin de
conservar la enzima funcionando (Ureta y Nordlund, 2002; Lee et al.,
2004). La nitrogenasa es un heterodmero formado por una subunidad
grande y otra pequea.
La subunidad grande est compuesta a su vez por cuatro subunidades
polipeptdicas iguales dos a dos, mientras que la subunidad pequea
est compuesta a su vez por dos subunidades aparentemente idnticas.
Ambas subunidades de la nitrogenasa contienen tomos de hierro y
azufre, conteniendo adems molibdeno la subunidad grande.
La informacin gentica de la bacteria para fijar nitrgeno est dada en
un cluster de genes denominado nif .
11

Los genes nif estn organizados en una unidad transcripcional altamente

conservada. Generalmente los operones de los genes nif se encuentran
en el orden nifH, nifD y nifK

Gracias a algunos experimentos genticos y a experimentos con

mutantes se ha llegado a localizar los genes del cluster nif en el
cromosoma bacteriano
lac
gal
trp

shi A
nif
his
gua
12

genes para la utilizacin

de la enzima lactosa
genes para la utilizacin
de la enzima galactosa
genes para la sntesis
de
triptfano
gen implicado en la
asimilacin de cido
shikmico
genes para la fijacin de
nitrgeno
genes para la sntesis
de
histidina
genes para la sntesis

str A

de guanina
gen que confiere
resistencia a la
estreptomicina

Mapa del cromosoma de Klebsiella (Postgate, 1998)

GENES nif
Los genes nif se encuentran agrupados en una regin de 24 kb,
denominada regulon nif que consiste en un sistema complejo de
operones.
En dicho reguln, que contiene 20 genes dispuestos en varias unidades
transcripcionales, no slo se encuentran los genes que codifican para la
reductasa (nifH) y para los tipos de subunidades de la dinitrogenasa
(nifD, para la subunidad alfa y nifK para la beta), sino que tambin
contienen los genes nifF y nif que codifican, respectivamente, la
flavodoxina y la oxidorreductada que le transfiere los electrones desde el
piruvato. Tambin se encuentran diversos genes relacionados con la
sntesis y procesamiento del CoFeMo ( nifN, V, Z, W, E, X, Y, B y Q), as
como reguladores positivos y negativos del proceso, como los genes nifa
y nifL.

13

El gen

nif es

el gen responsable

de

la

codificacin

de las

protenas relacionadas entre s y asociados con la fijacin del nitrgeno

atmosfrico en una forma de nitrgeno disponible para las plantas. Estos
genes

se

encuentran

en

bacterias

fijadoras

de

nitrgeno

y cianobacterias .
Los genes nif tienen reguladores tanto positivos como negativos. Algunos
de los genes nif son: NIF A, D, L, K, M, S, A, U, Y, W, Z
Los genes nif son los genes que codifican enzimas implicadas en la
fijacin del nitrgeno atmosfrico.
La principal enzima codificada por los genes nif es el complejo de
nitrogenasa que est a cargo de la conversin de nitrgeno atmosfricoN2 Para las formas de nitrgeno tales como amonaco, que la planta
puede utilizar para diversos fines. Adems de la enzima nitrogenasa, los
genes nif tambin codifican un nmero de protenas reguladoras que
intervienen en la fijacin de nitrgeno.
Los genes nif se encuentran tanto en bacterias de vida libre fijadoras de
nitrgeno y las bacterias simbiticas en varias plantas. La expresin de
los genes nif es inducida en respuesta a bajas concentraciones de
nitrgeno

las

concentraciones

de

oxgeno

fijo

(las

bajas

concentraciones de oxgeno se mantiene activa en el entorno de las

races).
Regulacin
En la mayora de las plantas, la activacin de los genes nif transcripcin
se realiza por la protena de nitrgeno NifA sensible. Cuando no hay
factor de nitrgeno suficiente para fijo disponible para el uso de la planta,
que es un NtrC RNApolymerase desencadena expresin NifA, y NifA
activa el resto de la transcripcin nif genes. Si hay una cantidad
14

suficiente de nitrgeno reducido o el oxgeno est presente, otra protena

se activa - NIFL, y NIFL inhibe la actividad de NifA resultante en la
inhibicin de la formacin de nitrogenasa. De informacin est regulada
por glnD y productos GlnK de genes. Los genes nif se pueden encontrar
en los cromosomas de la bacteria, pero muchas de las veces se
encuentran en plsmidos de la bacteria con otros genes relacionados con
la fijacin de nitrgeno (por ejemplo, los genes nod).

Ejemplos en la naturaleza
La expresin y regulacin de los genes nif mientras comparten
caractersticas comunes en todos o la mayora de los organismos
fijadores de nitrgeno en la naturaleza, tiene una personalidad distinta y
calidades diferentes de uno a otro diaztrofo. Ejemplos de la estructura
de los genes nif y la regulacin en diaztrofos diferentes:
Klebsiella pneumoniae - una vida libre anaerobias las bacterias fijadoras
de nitrgeno.
Contiene un total de 20 genes nif localizado en el cromosoma de la
bacteria en una regin de 24kb. nifH, nifK y nifD codifican subunidades
de la nitrogenasa, mientras nife, nifN, Nifu, NIF, nifV, nifW, nifX, NIFB y
nifQ codifican protenas involucradas la asamblea y la incorporacin de la
Fe y Mo en subunidades de la nitrogenasa.
NIFF y nifJ codifican protenas relacionadas con la transferencia de
electrones que tiene lugar en el proceso de reduccin y nifA es una
protena reguladora a cargo de la regulacin de la expresin de los genes
nif. Regulacin de la expresin genes nif se realiza a travs nifA y NIFL.
Rhodospirillum

rubrum -

una

bacteria

de

vida

libre

anaerobias

fotosintticas que adems de el control transcripcional descrito antes,

15

regula la expresin de los genes nif tambin en una forma metablicas a

travs de un reversible ADP-ribosilacin de un residuo de arginina
especfica en el complejo de nitrogenasa. El ribosilacin tiene lugar
cuando el nitrgeno est presente reducida y causa una barrera en el
flujo de transferencia de electrones y por tanto, inactiva la actividad de
nitrogenasa de. Las enzimas que catalizan la ribosilacin se llama Drag
and Draft.
Rhodobacter capsulatus - fototrofo vida libre anaerbico que contiene
una transcripcin nif sistema de los genes reguladores. R. capsulatus
regula la expresin de genes nif travs nifA en la misma forma descrita
antes, pero utiliza un activador diferente nifA llamada factor que inicia la
RcNtrC. RcNtrC activa una diferente expresin de los genes y el nifA-nif.

Rhizobium spp. - Gram negativas, bacterias simbiticas fijadoras de

nitrgeno. Por lo general, forma simbiosis con las especies Legum.
En algunos Rhizobia, los genes nif se encuentran en plsmidos llamado
los plsmidos sym (sym simbiosis =), que contienen genes relacionados
con la fijacin de nitrgeno y algunos genes de limpieza, mientras que los
cromosomas contienen la mayor parte de los genes de limpieza de las
bacterias. Reglamento de la expresin de los genes nif se realiza en el
nivel de transcripcin dentro de la planta simbitica.
REGULON
El reguln nif tiene 7 operones: nifRLA, nifJ, nifHDK, nifEN, nifUSVM,
nifWF, nifBQ.
nifRLA opern : La regulacin de la expresin fuerte de los de fijacin
de nitrgeno (NIF) est mediada por los genes de los productos del
opern nifRLA. NifA activa la transcripcin de los genes nif por la forma
16

alternativa

de ARN-polimerasa,

S54-holoenzyme.NifL es

un

gen

regulador negativo que inhibe la activacin de genes nif otros por la

protena nifA. NifR es un sitio de unin del represor, entre el promotor del
opern nifRLA y el gen NIFL. Sin protena codificada por el gen nifR se
ha encontrado.
nifHDK opern : Se compone de tres genes estructurales a saber nifK
NIF D y nifH. nifK codifica para la subunidad B de la Componente 1 de la
nitrogenasa. nifD codifica para la subunidad alfa de componente 1 de
nitrogenasa. nifH codifica para el componente 2 de la nitrogenasa.
nifEN y operones nifBQ : Comprende nife, nifN, NIFB y los genes nifQ
que son responsables de la formacin de un funcional Mo-Fe
protena. (Mo-Fe-co sitio cataltico de la nitrogenasa.) NifQ no es
absolutamente esencial.
nifJ opern : El gen nifJ codifica para la piruvato-flavodoxinaoxidorreductasa protein.This enzima est implicada en la transferencia de
electrones a nitrogenasa.
nifUSVM opern : Los NIFS, nifV y los genes nifM codificar para una
protena que se requiere para procesar el componente II. Funcin del gen
NIFU es indeterminado.
nifWF opern : La funcin de nifW es indeterminado. El gen NIFF media
de transferencia de electrones de la protena nifJ a la protena de Fe de
la nitrogenasa.

17

GENES

DE

LA

FIJACION

DE

NITRGENO
La actividad fijadora de

nitrgeno

atmosfrico est codificada por los llamados genes nif (nitrogen fixation),
los cuales han podido transferirse por manipulacin gentica bajo forma
de plsmidos desde microorganismos fijadores a otros que no lo son,
siendo

el

plsmido

denominado

pRD1,

obtenido

de

Klebsiella

pneumoniae, el ms utilizado al ser estable en numerosas especies

bacterianas y expresarse en las mismas.
Las investigaciones actuales sobre los genes nif se centran en los
siguientes aspectos:
a) caracterizacin y manipulacin del grupo nif con objeto de producir
plsmidos estables y de alta velocidad de replicacin,
b) transformacin de los microorganismos que habitualmente colonizan la
rizosfera de las plantas, y
c) transferencia del grupo nif directamente a las plantas.
La transferencia de los genes nif a las bacterias y hongos rizosfricos no
fijadores constituye un objetivo interesante, si bien cubierto de
dificultades. En el caso de microorganismos de vida libre, hay que tener
en cuenta que la fijacin biolgica de nitrgeno consume tal cantidad de
energa que hace difcil la obtencin de niveles de fijacin apreciables,
mediante la conversin de parte de la microflora rizosfrica en fijadora.
18

Una veintena de genes presentes en Klebsiella pneumoniae estn

directamente implicados en la reduccin de N2 a amonio.
Se conocen como genes nif (de nitrogen fixation) y en esta bacteria se
hallan todos agrupados lo que ha facilitado considerablemente su
estudio, junto con la particularidad de encontrarse en una especie
microbiana muy asequible. Genes homlogos a muchos de ellos y
particularmente a los estructurales, que codifican la enzima nitrogenasa,
se hallan en todos los fijadores, aunque con una distribucin distinta. La
presencia general indica un origen comn para este proceso. Los genes
nif se transcriben por grupos bajo el control de NtrA (s54 o RpoN), y su
expresin est sometida a una estricta regulacin, de tal forma que slo
puede ocurrir en condiciones de bajas concentraciones de nitrgeno
combinado y oxgeno, como corresponde a un proceso altamente
consumidor de energa y en el que est implicada una enzima, la
nitrogensa, que se inactiva por oxgeno. Esta regulacin se realiza a dos
niveles, uno, fuera del conjunto de estos genes, por NtrC, que acta
sobre el promotor del gen nifL, y, otro, a travs del activador
transcripcional NifA, cuyo gen se cotranscribe con nifL. NtrC se activa a
travs de la cascada GlnD, GlnB y NtrB cuando hay bajas
concentraciones de amonio, o lo que es lo mismo, una relacin
cetoglutarato/glutamina alta. NifL, el producto del mencionado gen nifL
inhibe estequiomtricamente la actividad de NifA en concentraciones
altas de nitrgeno combinado y oxgeno por la formacin de un complejo
NifL-NifA inactivo. Acaba de presentarse la hiptesis de que la presencia
de amonio altera la conformacin de NifL capacitndolo para ligar ATP e
hidrolizarlo, incrementando as la eficiente formacin de dicho complejo
inactivo NifL-NifA. Tambin recientemente se ha encontrado en K.
pneumoniae que Fnr, pieza clave en el metabolismo anaerobio, es de la
misma forma aqu el sensor de los niveles de oxgeno y transduce la
seal hacia el regulador negativo NifL. A bajas concentraciones de
oxgeno y amonio, NifL, adems, presenta una gran afinidad por la
19

membrana lo que determina una disminucin del nivel de activador en el

citosol capaz de unirse a NifA para inactivar su funcin. En Azotobacter
se ha demostrado la implicacin directa del producto del gen glnK (PII)
en la activacin de NifA.
El dominio C-terminal de NifL est tambin implicado en sensar los
niveles de nitrgeno combinado, por interaccin con GlnK que cuando no
est uridilado, esto es en exceso de nitrgeno, se une a NifL lo que
incrementa su capacidad para inhibir NifA y, por tanto, la expresin de los
genes nif.

En el caso de Rhizobium, aunque en la regulacin tambin interviene el

gen nifA, su activacin no ocurre como en Klebsiella.
En el esquema de la Figura que se adjunta se puede ver que cuando el
producto del gen fixL sensa bajas concentraciones de oxgeno activa
FixJ, que a su vez induce en S. meliloti la expresin de los genes fixK y
nifA, factores transcripcionales para una serie de genes implicados en el
proceso. En Bradyrhizobium japonicum la cuestin se complica y nifA es
activado por el sistema RegSR mientras que FixLJ actua a traves de
FixK2 sobre genes implicados en el metabolismo microaerobico, entre
ellos fixNOQP que codifican una oxigenasa terminal con una Km muy
baja para el oxgeno (7 nM) lo que permite el metabolismo aerobio de

20

Rhizobium en un ambiente muy pobre en este elemento en el interior de

los ndulos

(< 25 nM) frente a 250 mM del exterior.

GENTICA DE LA FIJACIN
La gentica molecular de los organismos fijadores de nitrgeno ha sido
establecida utilizando como modelo el fijador libre de Klebsiella
pneumoniae. El mapa de los genes responsables de la fijacin presenta
las siguientes caractersticas:

21

Los
para

genes
la

necesarios

sntesis

de

integrantes
sistema

enzimtico

genes

reguladores

los
del

los
estn

agrupados en una
misma

regin

del

cromosoma.
Los 20 genes constituyen una unidad reguladora (reguln) ligada al
opern his.
Los genes estn organizados en 8 unidades transcripcionales; la funcin
de la mayora de sus productos ha sido establecida.

Los genes H, D; K, codifican las subunidades de la Dinitrogenasa

reductasa y de la Dinitrogenasa, el gen F codifica la ferredoxina y el
procesamiento y la sntesis del factor FeMoCo se realizan por los
transcriptos de varios genes. Los genes L y A actan como reguladores;
el producto de nif A (NIFA) se necesita para la expresin de todos los
genes nif ( salvo nifA y nifL) y el producto de nifL (NIFL) modula la
actividad de NIFA y es afectado por altos niveles de NH3 y de O2.

22

En Rhizobium los genes nif estn localizados en un plsmido de gran

tamao que hibridiza con los genes de nif de Klebsiella pneumoniae que
hay una homologa interespecies muy marcada. Se ha establecido la
presencia de dos clases de genes:
Los genes nif, anlogos estructural y funcional a los genes nif de
Klebsiella pneumoniae ; en esta clase se han localizados los genes nif
HDK y nifB

Los genes fix, necesarios para la fijacin del nitrgeno, no tienen

homlogos en Klebsiella pneumoniae y su funcin es desconocida.
Se han identificado los genes fix ABC en R. melitoli y en B. japonicum.
Los productos de los genes nifHDK son muy similares a los de Klebsiella
y constituyen la nitrogenasa cuya expresin est regulada por nifA que se
encuentra en todas las especies de Rhizobium.
En la protena NIFA la regin N- terminal no es esencial para su actividad
y a diferencia de NIFA de Klebsiella la protena R. melitoli es sensible al
O2.
Es de notar que el gen regulador nifL slo se ha detectado en dos
especies de Klebsiella y de existir en Rhizobium no tendra similitud
estructural con los de Klebsiella.
Los genes fix ABC no tienen homologa con ninguno de los 20 genes de
Klebsiella son incapaces de complementar los mutantes nif- de esta
especie. El gen fixF est cerca de la regin con los genes responsables
de la nodulacin pero no tiene relacin con la infeccin; su ausencia no
impide la expresin de la Nasa y es activado por los productos de nifA de
K. pneumoniae y de R. melitoti.
23

REGULACIN DE LA FIJACIN
La reduccin de nitrgeno atmosfrico es un proceso altamente costoso
desde el punto de vista energtico (unas 16 molculas de ATP y 8
electrones por molcula de N2 reducida), por lo que se halla sometido a
precisos mecanismos de regulacin.

El

control

de

la

fijacin de
nitrgeno

ocurre a dos niveles: por una parte, la concentracin de enzima presente

en cada momento en la clula est controlada tanto por la represin de
su sntesis como por la degradacin de la enzima existente; por otro lado,
la actividad de la enzima est tambin regulada (Eady 1981)

24

En los ltimos aos se ha comenzado entender cmo opera la regulacin

de la transcripcin de los genes nif en Klebsiella en respuesta a ciertas
concentraciones de nitrgeno fijado de O2.
Se sabe que la regulacin opera en dos niveles:

Una regulacin especfica, mediada por los genes nifA y nifL, que
estn dentro del grupo de genes fijadores; y

Una regulacin general, en la que intervienen genes del tipo ntr

que actan controlando muchos operones en respuesta a fuentes
externas de Nitrgeno; en Klebsiella se han identificado los genes
ntrA. ntrC y glnA que se encuentran lejos del grupo de genes nif.

En conjunto el sistema regulador evidencia una capacidad de ajuste muy

fina y el esclarecimiento de los sitios y mecanismo de accin de cada una
de las protenas involucradas permitir comprender cmo opera la
regulacin global frente a las fuentes externas de Nitrgeno.
A modo de resumen se puede afirmar que la regulacin se lleva a cabo a
dos niveles: de un lado, los productos de los genes nifLA son
responsables de la sntesis ( nifA es activador) o represin ( nifL es
represor)

Regulacin de la expresin de los genes simbiticos

El sistema FixLJ, NifA y RpoN en Rhizobium meliloti (Sinorhizobium
meliloti) tiene un sistema de regulacin de expresin de genes en
relacin a la concentracinde oxgeno. Las proteinas FixL y FixJ tienen
un papel importante en esta regulacin. FixL se autofosforiliza y es capaz
de transferir el fosfato a FixJ. En caso de baja concentracinde oxgeno,
25

se aumenta la concentracin de FixJ fosforililada dentro de la clula. La

protena FixJ fosforililada acitva los genes nifA y otros genes. NifA es un
regulador positivo de los genes necesarios para la fijacin de nitrgeno.
Un factor sigma necesario para la transcripcin eficaz de muchos genes
simbiticos es el RpoN.

CONCLUSIN
26

Mediante el desarrollo del tema Regulacin y Gentica de los

Genes que Fijan Nitrgeno
sabiendo que un gen es una
secuencia ordenada de nucletidos que forman la molcula de
ADN que contiene la informacin necesaria para sntesis de una
biomolculas con funcin especfica en la clula y que esta
funcin esta relacin con el funcionamiento fisiolgico de los
seres vivo puesto que todos los seres vivos estn compuesto de
elementos bsicos como carbono, nitrgeno, oxigeno entre otros
elementos qumicos. El metabolismo del nitrgeno es de
esencial estudio porque el proceso de la vida depende de
molculas que contiene nitrgeno ya que el nitrgeno esta como
constituyente de protenas, enzimas y de hormonas de
crecimiento, el proceso mediante el cual los microorganismos
reducen el nitrgeno a una forma utilizable se le conoce como
Fijacin Biolgico de Nitrgeno que es llevado a cabo por
microorganismo de vida libre o con simbiontes de planta

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