X Simposium-Taller Nacional y III Internacional Produccin y Aprovechamiento del Nopal y Maguey

ASPECTOS FISIOLGICOS DE ALGUNAS PLAGAS DE Opuntia CON

PERSPECTIVAS HACIA SU CONTROL
1*

Torres-Castillo, Jorge Ariel ; Snchez-Gonzlez, Enrique Ignacio ; Torres-Acosta, Reyna Ivone ;

3
4
Blanco-Labra, Alejandro y Mondragn-Jacobo, Candelario
1

Laboratorio de Biotecnologa, Facultad de Agronoma, Universidad Autnoma de Nuevo Len. Calle Francisco Villa s/n,
Col. Ex-Hacienda el Canad. General Mariano Escobedo, CP 66050. Nuevo Len. MXICO.
2
Campo Experimental General Tern, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias.
Carretera Montemorelos-China km. 31, CP 67400. General Tern, Nuevo Len. MXICO.
3
Departamento de Biotecnologa y Bioqumica, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico
Nacional (CINVESTAV). Libramiento Norte, Carretera Irapuato-Len km. 9.6, CP 36821. Irapuato, Guanajuato. MXICO.
4
Campo Experimental Bajo, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias. Carretera Celaya-San
Miguel de Allende km. 6.5, CP 38110, Celaya, Guanajuato. MXICO.
*Correo-e: jorgearieltorres@hotmail.com

Resumen
En este trabajo se presentan los avances de la caracterizacin enzimtica del
intestino de algunas especies de insectos plaga incidentes sobre el gnero Opuntia,
y la interaccin de las mismas con algunas protenas defensivas presentes en la
planta, las cuales podran ser consideradas como mecanismos de defensa de la
planta que ya han sido sobrepasados por adaptaciones especficas de los insectos.
Palabras clave: Intestinos de insectos, inhibidores enzimticos, enzimas digestivas.
Summary
This work presents advances in the enzymatic characterization of guts from different
insect pest from Opuntia genus, including the interaction with defensive proteins from
the plant, which could be considered as part of the plant defense mechanisms that
have been passed for specific adaptations of insects.
Keywords: Insect guts, enzymatic inhibitors, digestive enzymes.

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Introduccin
Las plantas conocidas como nopales, pertenecen a los gneros Opuntia y Nopalea
de la familia Cactcea, siendo la primero la de mayor importancia con el nmero de
especies. Estas forman parte importante de la cultura y las actividades econmicas
del pas generando derrames econmicos importantes principalmente en el aspecto
de produccin de nopal verdura, frutos, derivados y forraje. El gnero se encuentra
bien representado por cerca de 181 especies, de las cuales ms del 50 % se
encuentran en nuestro pas (Badii y Flores, 2001; Labra et al., 2003). Estas plantas
constituyen parte de los elementos basales de las cadenas trficas principalmente de
las zonas ridas y semiridas, permitiendo en algunas ocasiones el desarrollo la
ganadera de subsistencia, en ambientes extremos de poca agua, donde tambin
coexiste con una serie de insectos que interaccionan con los nopales a diferentes
niveles

trficos

desde

los

herbvoros

hasta

parasitoides,

depredadores

polinizadores (Mena-Covarrubias, 2010). Los nopales estn expuestos a presiones

biticas particulares y por lo tanto esto ha orillado a la aparicin de caractersticas
especiales para protegerse, lo que a su vez permiti la aparicin de insectos fitfagos
especializados en atacar al nopal. Muchos de estos insectos pueden concluir sus
ciclos de vida asociados

al nopal, ya sea como fitfagos superficiales o

barrenadores de toda la planta (Mena y Rosas, 2004). En el caso de los insectos que
atacan a los nopales, existe poco conocimiento respecto a las respuestas fisiolgicas
por parte de la plantas y por parte del insecto, es decir, que estrategias utiliza la
planta para defenderse del ataque de los insectos y qu mecanismos han
desarrollado los insectos especialistas para poder sobrellevar la defensa bioqumica
y fsica de los nopales. En este punto cabe hacer mencin, que ambos sistemas
biolgicos han estado en continua coevolucin, por lo tanto constituyen un modelo
muy interesante que si se estudia a detalle podra conllevar al esclarecimiento de
dichas relaciones tan estrechas y probablemente al planteamiento de estrategias que
permitan un manejo integrado (Mello and Silva, 2002) de las plagas de los nopales.
Por ejemplo, se sabe que algunas plantas producen inhibidores enzimticos en
respuesta al dao por herbivora, estos inhibidores atacan las enzimas proteolticas y
amilasas de los insectos, conduciendo a la disminucin en la captura de nutrimentos

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y en casos drstico a la muerte por inanicin de los insectos (Konarev, 1986; Silva et
al., 2006). Tambin se han asociado a la herbivora, la induccin de lectinas,
glicoprotenas especializadas que permiten adherirse y cubrir la superficie del tracto
digestivo, evitando que se lleve a cabo la absorcin de nutrimentos y la secrecin de
enzimas digestivas; entre otros compuestos podemos mencionar los taninos,
polifenoles, protenas inactivadoras de ribosomas, gomas y muclagos, estos ltimos
conduciendo a la disminucin en el manejo del alimento debido a su naturaleza
pegajosa, adems de su poder como barrera fsica. No obstante, los insectos
especialistas pueden an lidiar con dichos componentes. Por lo que en el caso del
nopal, resulta de peculiar inters determinar cmo es que estos pueden colonizar las
plantas de nopal, a pesar de que ya se han detectado inhibidores de proteinasas
(Torres et al., 2009a y Torres et al., 2009b), lectinas, ceras, polifenoles y muclagos
(Stintzing y Carle, 2005). Por lo que en este trabajo se presentan avances de los
estudios en este tipo de interacciones.
Metodologa
Colecta de material biolgico
Los materiales biolgicos sern obtenidos de plantaciones de nopal del Sitio
Experimental del Norte de Guanajuato ubicado en San Luis de La Paz, Guanajuato y
del

Campo

Experimental

Bajo

ubicado

en

Celaya,

Guanajuato;

ambos

pertenecientes al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y

Pecuarias (INIFAP).
Deteccin de actividad enzimtica en extracto de intestinos de insectos plaga
Las muestras de intestino se homogeneizarn en agua pH 3 por espacio de 2 horas,
despus se sometern a una centrifugacin a 18,000 g por espacio de 30 min a 4 C.
Los sobrenadantes se emplearon como fuente de enzima para la deteccin inicial. Se
usarn buffers de diferentes pH (Todas las sales sern de la casa comercial Control
Tcnico y Representaciones, S.A. de C.V.). Los sustratos que se emplearn sern:
de la serie de sustratos cromognicos con N-Benzoil-p-Nitroanilida (SIGMAALDRICH).

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Extraccin de protenas de nopales

Las muestras de Opuntia se colectaron de muestras de traspatio de O. ficus-indica y
O. megacantha y Nopalea sp. Cada una de las muestras se sometieron a una
molienda en un mortero, luego se le agreg agua en proporcin 1:4 p:v y se agitaron
por 30 min a temperatura ambiente. Despus el extracto se someti a una
centrifugacin y el sobrenadante se recuper y concentr usando precipitacin con
acetona fra hasta lograr la precipitacin de la fraccin proteica. La fraccin proteica,
de la cual se elimin el exceso de muclago, se sec y se determin la concentracin
de protena por absorbancia a 220 nm comparando con una curva estndar de BSA.
Las muestras se usaron para la realizacin de ensayos de inhibicin.
Extraccin de proteinasas de insectos plaga de Opuntia
Las larvas y adultos de Cactophagus (Metamasius) spinolae y Laniifera cyclades
fueron colectadas en terrenos del Sitio Experimental del Norte de Guanajuato y del
Campo Experimental Bajo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales,
Agrcolas y Pecuarias. Estas se trasladaron al Laboratorio de Biotecnologa de la
Facultad de Agronoma de la Universidad Autnoma de Nuevo Len (FA-UANL),
donde se procesaron mediante diseccin de los insectos. Los intestinos fueron
retirados y almacenados a -70 C hasta su posterior uso. Las protenas fueron
extradas en agua pH 3 a 4 C mediante una extrusin rpida de 5 min y sometidos a
centrifugacin a 4 C por 10 min para clarificar el extracto. La fraccin clarificada fue
la fuente de enzima, misma a la que se le determin la concentracin de protena
mediante comparacin de absorbancia a 220 nm mediante comparacin con una
curva estndar de BSA. La muestra de precipit con acetona fra para concentrarla y
se almacen a -70 C hasta su posterior uso. Las muestras extradas se usaron en
un plazo no mayor a 5 das.
Ensayos enzimticos en solucin
Para las enzimas elastasa y quimotripsina se emple el buffer 0.02 M Tris-HCl pH
7.5, para la enzima tripsina el buffer 0.01 M Tris-HCl pH 8 y para las reacciones de
amilasa se emple el buffer 0.2 M Tris-HCl pH 6.8. En el caso de las enzimas
proteolticas se determin la actividad con protocolos basados en Erlanger, 1961 y

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con sustratos N-succinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida, Phe-Ala-Ala-p-nitroanilida y Nbenzoil-L-Arg-p-nitroanilida para elastasas, quimotripsina y tripsina respectivamente.
El blanco de reaccin se prepar con 450 L de buffer y 50 L de sustrato. La
reaccin estndar se prepar con 425 L de buffer, con 50 L de sustrato y 25 L
de enzima. Las reacciones a evaluar se prepararon como en el caso de la reaccin
estndar solo que la cantidad de enzima se ajust con respecto al buffer cuando fue
necesario. La mezcla de reaccin se dej incubando por 15 min a 37 C, al termino
de lo cual la muestra se ley a 405 nm en un espectrofotmetro. La reaccin se tom
como positiva cuando hubo absorbancia mayor a 0.05 unidades de absorbancia. En
el caso de la actividad de amilasa, el protocolo se bas en la hidrlisis (Marshall y
Lauda, 1975), el sustrato empleado fue almidn de maz con bajo contenido de
amilosa a 4 mg ml-1 en agua. El blanco de reaccin se prepar con 300 L de buffer
y 200 L de almidn. El blanco se us para calibrar el espectrofotmetro. Al blanco
posteriormente se le agreg 30 L de solucin reveladora de yodo (0.5 % de yodo
negro) y se efecto la lectura a 680 nm, esto permiti establecer el 100 % de la
cantidad de almidn al tiempo cero. Las mezclas de reaccin se prepararon con 260
L de buffer, 40 L de extracto a evaluar y 200 L de sustrato. La mezcla de reaccin
se incub por 10 min a 37 C. Luego se efecto la lectura a 680 nm y se compar
con la absorbancia del blanco para establecer el % de hidrlisis.
Ensayos mediante zimografa
Las proteinasas de insectos plaga del nopal (adultos de C. spinolae y larvas de L.
cyclades) fueron analizadas en zimogramas de actividad proteoltica. Los extractos
obtenidos de los intestinos aislados de los insectos se sometieron a electroforesis
monodimensional en geles de poliacrilamida al 10 % con 0.5 % de gelatina de piel
bovina copolimerizada. Las muestras se separaron bajo 100 V por 1.5 h en fro. Los
geles se sacaron y se colocaron en buffer adecuado (pH 4, 5, 6, 7.4, 8 y 9). Los geles
se incubaron a 37 C por 1 h 20 min. Al trmino del periodo de incubacin la muestra
se lav ligeramente con agua desionizada e inmediatamente se fijaron, se tieron y
prepararon para capturar los resultados. La actividad proteoltica se detect como
bandas claras sobre un fondo azul oscuro. Para determinar el peso molecular se
emplearon marcadores kaleidoscope de BioRad.
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Resultados
Se ha detectado la presencia de compuestos antidigestivos en cladodios de Opuntia,
como son polifenoles, lectinas, muclagos e inhibidores enzimticos; no obstante, los
insectos que atacan a dichas plantas de alguna manera han podido sobrellevar esas
defensas. En el trabajo se logr la deteccin de enzimas hidrolticas de tipo amilasa
para larvas de L. cyclades y adultos de C. spinolae. En el caso de C. spinolae
tambin se ha logrado la deteccin de enzimas de tipo protenasa a travs de
diferentes gradientes de pH. Existe una poblacin de enzimas de peso molecular
cercano a 30 kDa con actividades a pH acdicos, otra poblacin de peso molecular
cercana a los 60 kDa pero activa a pH ligeramente alcalino y otra poblacin de
enzimas de pesos moleculares entre 70 y 80 kDa activas a pH muy alcalinos. Una
diversidad de enzimas de este tipo puede capacitar a los insectos a invadir una dieta
rica en protenas escasas o antidigestivas, ya que favorece mltiples sitios de corte
de las protenas de la dieta. Como parte de los mecanismos de defensa de los
nopales, se logr la deteccin de inhibidores de tripsina, una protenasa ampliamente
distribuida entre los herbvoros. Para saber si estos inhibidores podran afectar a las
enzimas del C. spinolae, se procedi a incubarlas junto con extractos intestinales y
despus fueron analizadas por medio de zimografa. Los resultados del anlisis
confirmaron que las enzimas de alto peso molecular y activas a pH alcalino fueron
susceptibles de inhibicin con las protenas obtenidas de los escarabajos. Por otra
parte las enzimas de bajo peso molecular y activas a pH acdico no fueron afectadas
por la presencia de los inhibidores de tripsina. La presencia de proteinasas de tipo
tripsina en los intestinos de insectos plaga de nopal analizados en este trabajo fue
confirmada por ensayos in vitro. La inhibicin de enzimas de tipo tripsina tambin fue
confirmada empleando los mtodos in vitro con sustratos colorimtricos.
Discusin/Conclusin
Los resultados de esta parte de la investigacin nos permiten darnos cuenta de que
los intestinos de los insectos plaga de Opuntia presentan una arsenal complejo de
enzimas digestivas, y en el caso de C. spinolae, incluso se ha podido evidenciar que
ya presenta una serie de enzimas que probablemente estn involucradas en la

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tolerancia a los compuestos defensivos presentes en la planta, como fueron los

inhibidores de tripsina, lo cuales parecen inhibir selectivamente a las enzimas activas
a pH alcalino. No obstante, an falta esclarecer si existiesen otros factores
involucrados en la defensa de las plantas que an pueden frenar el ataque de
insectos o que ya han sido sobrepasados. El entendimiento de estas interacciones
entre plantas e insectos puede conducir al desarrollo de estrategias alternativas de
control (Mello y Silva, 2002). Los aspectos fisiolgicos que permiten la interaccin de
los insectos y los nopales, deben ser estudiados a ms detalle para poder
comprender la forma en que ambos componentes reaccionan y as poder establecer
algn modo de accin integrado. Para esto se requieren estudios multidisciplinarios
que permitan alcanzar el entendimiento de este complejo biolgico.
Agradecimientos
Se agradece al CONACYT por el apoyo financiero al proyecto CB-2009-01000000000133186, tambin al Laboratorio de Biotecnologa de la Facultad de
Agronoma de la UANL por acceso a las instalaciones. Particularmente se agradece
el apoyo tcnico y analtico a: Laboratorio de Mecanismos de Defensa de las Plantas
y al Laboratorio de Protemica y Espectrometra de Masas del CIENVESTAVIrapuato as como al personal de Sitio Experimental del norte de Guanajuato y del
Campo Experimental-Bajo del INIFAP.
Literatura citada
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two chromogenic substrates of trypsin. Arch. Biochem. Biophys. 95: 271-278.
Konarev A. 1986. Interaction of insect digestive enzymes with plant protein inhibitors
and host-parasite coevolution. Euphytica. Vol 92, No. 1-2. Pp: 89-94.
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Sgorbati. 2003. Genetic relationships in Opuntia Mill gens (Cactaceae)
detected by molecular marker. Plant Science. Vol. 165, No. 5. Pp: 1129-1136.

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J. de Melo Silva. (Eds.). Acta Horticulturae. Vol. 811. pp 293-297. ISBN: 97890-66051-09-6 y ISSN: 0567-7572.
Torres Castillo J. A., Mondragn Jacobo C. and A. Blanco-Labra. 2009b.
Characterization of a highly stable trypsin-like proteinase inhibitor from the
seeds of Opuntia streptacantha (Opuntia streptacantha Lemaire).
Phytochemistry. Vol.70, No.11-12, 1374-1381.

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