Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgico.

Laboratorio de Diagnstico Clnico. 2 curso.

Pruebas de identificacin bacteriana

U.T. 16 - 1 Bloque temtico III

Pruebas de identificacin bacteriana

Identificacin bacteriana
La identificacin es un proceso por el cual debemos determinar a qu especie pertenece una
determinada cepa bacteriana, mediante la comparacin de una serie de caractersticas que pueden
ser puestas en evidencia en el laboratorio y que han sido estudiadas para la gran mayora de las
especies importantes desde el punto de vista de la patologa infecciosa humana.
Cuanto ms semejanza haya entre las caractersticas obtenidas en el laboratorio y las que
habitualmente presenta una determinada especie, mayor ser la probabilidad de que esa cepa
problema pertenezca a dicha especie.
Las caractersticas utilizadas en la identificacin de cada grupo de microorganismos
dependen de las posibilidades de cada laboratorio, fundamentalmente econmicas y de
cualificacin del personal, as como de la epidemiologa especfica de la zona.
Las caractersticas que se tienen en cuenta para lograr una correcta identificacin son las
siguientes:

Caractersticas no bacterianas:
Paciente:

Edad
Sexo
Patologa
Muestra:

Obtencin
Conservacin
Transporte

Caractersticas bacterianas:
de cultivo:

Medios en los que crece

Temperatura
Atmsfera de crecimiento
Crecimiento en aero o anaerobiosis
Morfologa de las colonias
individuales:

Caractersticas estructurales:
- Tincin de Gram
- Morfologa
- Tamao
- Agrupamiento
- Presencia de estructuras:
Cpsula, Flagelos, Esporas
- Movilidad

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Pruebas de identificacin bacteriana

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Caractersticas metablicas :
Accin bacteria/sustrato:
Enzimticas
No enzimticas
Accin agente qumico/bacteria :
Pruebas de susceptibilidad
Determinacin de metabolitos libres
Caractersticas inmunolgicas
Anlisis de DNA
En el proceso de identificacin tradicional se establecen tres niveles de procesamiento:
a) el primero hace referencia a la morfologa y a su comportamiento ante la tincin de Gram
u otras tinciones que se utilicen especficamente para cada grupo.
b) el segundo nivel de identificacin debe especificar el gnero a que pertenece el
microorganismo.
c) por ltimo, la conclusin debe hacerse con la identificacin a nivel de especie.

Pruebas de identificacin
Tradicionalmente la identificacin de una cepa bacteriana comienza con la visualizacin de un frotis
de la colonia aislada al que se le ha realizado una tincin de Gram:
Bsicamente los cuatro grandes grupos que nos encontraremos en este primer paso son los
siguientes:
Cocos Gram positivos
Cocos Gram negativos
Bacilos Gram negativos y
Bacilos Gram positivos
La identificacin puede realizarse tambin sobre grupos de microorganismos con
caractersticas especiales, como son:
Micobacterias
Anaerobios
Rickettsias y Chlamydias
Micoplasmas
Espiroquetas
Actinomices y Nocardias
Cindonos a los cuatro grupos descritos ms arriba, los laboratorios deben utilizar una
rutina especfica que vaya realizando de forma secuencial o simultnea una serie de pruebas que nos
permitir ir diferenciando las especies ms importantes desde el punto de vista infeccioso.
Quizs las ms utilizadas cuantitativamente sean las pruebas bioqumicas que nos permiten
determinar caractersticas metablicas de los microorganismos objeto de identificacin, aunque las
reacciones de aglutinacin o precipitacin utilizadas son ms rpidas y ms especficas.
Las pruebas podramos clasificarlas fundamentalmente en aquellas que nos permiten la
identificacin de Gram positivos y pruebas para identificacin de Gram negativos, aunque hay una
serie de pruebas comunes a ambos grupos que vamos a enumerar.

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Pruebas de identificacin bacteriana

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Pruebas de identificacin iniciales

Morfologa bacteriana
Tincin de Gram
Agrupamiento celular
Movilidad
Atmsfera de crecimiento
Gram positivos
- Lisostafina
- Coagulasa
- DNAsa
- Fosfatasa
- CAMP
- Hidrlisis de esculina
- Hidrlisis del hipurato
-Sensibilidad a novobiocina
- Sensibilidad a optoquina
- Sensibilidad a bacitracina
- Sensibilidad a SXT
Crecimiento en ClNa
- Crecimiento en bilis
- Produccin de hemlisis
-Pruebas inmunolgicas

Catalasa
Citocromo - oxidasa
Oxidacin -fermentacin
Fermentacin de azcares
Gram negativos
- galactosidasa (ONPG)
- Arginina dehidrolasa
- Lisina decarboxilasa y Ornitina decarboxilasa
- Utilizacin de citrato
- Produccin de SH2
- Produccin de indol
- Ureasa
- Triptfano desaminasa (TDA)
- Reduccin de nitratos
- Rojo de metilo
- Voges Proskauer
- Kligler
- Hidrlisis de la gelatina
- Pruebas inmunolgicas

Una bacteria es un complejo ser vivo con un sistema de estructuras y molculas

intracelulares en parte similar al nuestro. La presencia de ciertos enzimas hace que las bacterias
puedan actuar sobre algunos sustratos y transformarlos; la ausencia de un enzima determinado
impedir esa transformacin o al menos la retardar, si el proceso puede desarrollarse siguiendo
otra va. La presencia de determinadas molculas, ya provengan de la propia estructura bacteriana,
ya sean subproductos de su metabolismo intermediario, puede ponerse de manifiesto mediante una
serie de reacciones qumicas adecuadas.
Casi todos los miembros de una misma especie bacteriana deben poseer un sistema
metablico similar, por lo que las enzimas y metabolitos presentes en la bacteria, no diferirn
mucho entre s.
La dificultad en la identificacin de una especie bacteriana estriba en que los enzimas o
molculas responsables de determinados procesos metablicos no siempre se expresan
fenotpicamente.
Si todos los miembros de una misma especie reaccionaran idnticamente ante determinados
sustratos y poseyeran siempre las mismas rutas metablicas, el problema de la identificacin sera
mnimo.
El problema reside en que no siempre pueden ponerse de manifiesto las mismas
transformaciones enzimticas o la presencia de determinados metabolitos. Esto hace que tengamos
que utilizar simultneamente una gran diversidad de pruebas (pruebas bioqumicas) y comparar los
resultados obtenidos con aquellas especies que presentan una mayor coincidencia.

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Pruebas de identificacin bacteriana

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Las pruebas bioqumicas, unidas a otras caractersticas de identificacin, hacen fiables casi
en un 100% los procedimientos rutinarios de identificacin bacteriana.
Determinadas pruebas son especficas de gnero o de especie en un 99,99%, pero an queda
un 0,01% que podra llevar al traste con nuestro proceso de identificacin si lo hicisemos de forma
dicotmica.
La eleccin de una prueba o de una batera de pruebas debe hacerse en funcin de:
- Muestra estudiada
- Especies bacterianas que se pretenden identificar
- Factores econmicos
- Experiencia en esas pruebas
En ningn caso, el procedimiento de identificacin puede darnos una certeza absoluta sobre
las conclusiones obtenidas. Unicamente nos indicar cul es la especie a la que el microorganismo
identificado tiene mayor probabilidad de pertenecer.
Para que la cepa aislada del paciente no experimente un gran nmero de transformaciones o
mutaciones, que podran equivocarnos al mostrar falsas reacciones, es imprescindible tener en
cuenta lo siguiente:
- Conservar la muestra en las condiciones establecidas si no va a ser inmediatamente
procesada
- No diluir la muestra en medio lquido
- Realizar el menor nmero posible de resiembras
- Procurar realizar la identificacin a partir de un cultivo puro
- Evitar medios demasiado selectivos

Clasificacin de las pruebas de identificacin

Las pruebas para realizar una identificacin bacteriana deben partir de un cultivo puro donde
las colonias estn perfectamente aisladas.
En funcin del tiempo utilizado en la realizacin de la prueba podemos diferenciarlas en

Pruebas rpidas o inmediatas (desde segundos a algunos minutos)

Dentro de este grupo tenemos la catalasa y la oxidasa. Tambin pueden incluirse todas las pruebas
inmunolgicas de deteccin de antgenos bacterianos por reacciones de aglutinacin.

Pruebas intermedias (menos de 6 horas)

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Lisostafina y coagulasa, por ejemplo.

Hoy da, con la utilizacin de sustratos cromognicos de conversin rpida, la mayora de las
pruebas bioqumicas pueden leerse en cuatro horas aproximadamente.

Pruebas lentas (de 18 a 48 horas)

A este grupo pertenecen la mayora de las pruebas que detectan componentes metablicos o
aquellas que determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada.
En funcin del tipo de prueba o de su fundamento, las pruebas de identificacin pueden
dividirse en:
Pruebas bioqumicas
Pruebas inmunolgicas
Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Pruebas de tolerancia a condiciones especiales
Hoy da se han desarrollado multitud de galeras multipruebas que permiten su lectura en un
intervalo de tiempo muy corto, entre dos y cuatro horas, de manera que la identificacin puede
realizarse en la misma jornada laboral.
Las pruebas de identificacin bioqumica pueden clasificarse en funcin de la parte del
metabolismo que estn poniendo de manifiesto. Los aspectos metablicos que pueden estudiarse
son:

Metabolismo respiratorio:
Catalasa
Citocromo-oxidasa

Mecanismo de produccin de energa:

Oxidacin-Fermentacin
Reduccin de nitratos a nitritos
Rojo de metilo
Voges Proskauer

Metabolismo hidrocarbonado
Fermentacin de hidratos de carbono
Utilizacin del citrato
Beta galactosidasa (ONPG)

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Metabolismo proteico:
Hidrlisis de la gelatina
Hidrlisis de la urea por ureasa
Produccin de indol
Produccin de cido sulfhdrico
Fenilalanina desaminasa (TDA)
Prueba de las decarboxilasas:
LDC
ODC
ADH

Deteccin de exoenzimas:
Cogulasa
Fosfatasa
Desoxirribonucleasa

Las pruebas inmunolgicas utilizan las reacciones de aglutinacin para poner en evidencia
antgenos bacterianos. Las ms utilizadas son pruebas de aglutinacin para deteccin de:
Staphylococcus aureus
Estreptococos beta hemolticos
Streptococcus pneumoniae
Serotipos de Salmonella
Serotipos de E. coli
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis

Por ltimo, las pruebas de sensibilidad utilizan una caracterstica de los microorganismos
frente a una sustancia qumica o antimicrobiano que consiste en la sensibilidad o resistencia

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constante frente a dicha sustancia, lo cual nos puede permitir confirmar o descartar la presencia del
microorganismo. Las pruebas de susceptibilidad ms utilizadas son:
- Sensibilidad a Novobiocina para detectar S. epidermidis
- Sensibilidad a Optoquina para detectar S. pneumoniae
- Sensibilidad a Bacitracina para detectar S. pyogenes
- Sensibilidad a Metronidazol y Sulfatiazol para detectar G. vaginalis
Dentro de este grupo podramos incluir las pruebas de crecimiento bacteriano en condiciones
especiales (inhibidoras para algunos microorganismos). Entre las ms importantes tenemos:
- Crecimiento en ClNa al 6,5%
- Crecimiento (solubilidad) en bilis
- Crecimiento a temperatura de 10 C

Sistemas de identificacin multipruebas (galeras)

Las caractersticas metablicas de un microorganismo solo buscan poner de manifiesto la
existencia de enzimas bacterianas que son capaces de metabolizar un sustrato especfico. Tanto la
disminucin del sustrato consumido como la formacin del producto resultante de la reaccin,
pueden ser objetivados mediante la utilizacin de un sistema visualizador que nos permita
reconocer fcilmente si la reaccin ha tenido lugar o no.
Como ejemplo podemos poner la utilizacin de un medio diferencial que contenga lactosa y
un indicador de pH. Los microorganismos que fermenten la lactosa darn como resultado final unos
productos cidos que harn que el pH del medio disminuya y, por lo tanto, que el indicador vire
hacia el color correspondiente al pH cido; en caso contrario, el pH del medio no cambiar y el
indicador tampoco variar o, en el peor de los casos, virar hacia el color correspondiente al lado
bsico.
Sin embargo, una determinada caracterstica no es exhibida siempre por todos los miembros
de una especie bacteriana. La frecuencia con que una especie bacteriana muestra una determinada
caracterstica metablica, puede variar desde el 0% hasta el 100%; esto hace difcil la eleccin de
pruebas para poder distinguir especies, que deben escogerse entre aquellas que tengan mayor poder
diferenciador.
Pongamos otro ejemplo: la prueba de la oxidasa es una prueba que Escherichia coli y
Proteus mirabilis darn negativa en el 100% de los casos. Evidentemente sta no es un prueba que
nos permita diferenciar entre ambas especies. Sin embargo, la prueba de la TDA es positiva en P.
mirabilis en un 100% de casos y negativa en E. coli siempre: sta s es una prueba que nos servira
para diferenciar entre las dos especies.

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Una prueba cualquiera, X, que dos especies diferentes dieran positiva en un 50% de los
casos, tampoco servira para diferenciar las cepas, pues la probabilidad de que se tratase de una u
otra especie estara repartida al 50%.
Hasta hace relativamente pocos aos, la identificacin de bacterias en el laboratorio de
microbiologa se haca basndose en unos esquemas arborescentes, dicotmicos, que atendiendo a
los resultados de una prueba seguan bifurcndose con otras pruebas, limitando cada vez ms las
posibilidades, hasta que al final de una de las ramas se consegua una identificacin presuntiva.
Estas pruebas eran elegidas de manera que tuvieran un poder discriminador muy alto, en
general mayor del 95%, aunque tanto mejores seran cuanto ms se acercasen al 100%. Una prueba
que discriminase solo el 80% de las bacterias estara cometiendo un error de identificacin en una
de cada 5 identificaciones. El inconveniente de este procedimiento era que no se poda realizar la
siguiente prueba hasta conocer el resultado de la anterior. Si tenemos en cuenta que, en general,
cada prueba tarda en realizarse 18-24 horas, a veces era necesario esperar varios das hasta concluir
el proceso de identificacin.
Estos esquemas de identificacin estaban rgidamente estructurados y tenan poca
flexibilidad ante cualquier prueba con menor poder de discriminacin. Una prueba incorrecta, o una
alteracin o excepcin en el metabolismo de una especie bacteriana, conduca por un camino
equivocado y terminaba en una identificacin incorrecta.
El siguiente paso fue la realizacin simultnea de varias pruebas, para as, aumentar la
velocidad de procesamiento. Es clebre, por su importancia histrica, la batera de pruebas
denominada IMVyC, que realizaba a la vez las pruebas de Indol, rojo de Metilo, Voges Proskauer y
Citrato.
Finalmente aparecieron las galeras multipruebas, un sistema de celdillas aisladas con
sustrato liofilizado que se inoculaban individualmente y que permitan realizar simultneamente
entre 10 y 25 pruebas bioqumicas. El procedimiento dicotmico que histricamente haba servido
para avanzar por el camino correcto de la identificacin, quedaba para ser utilizado en contados
casos.
Con la implantacin generalizada de la tecnologa informtica y la posibilidad de manejar
muchos datos a velocidades impensables para el ser humano, fue posible codificar el enorme
nmero de pruebas que se hacan mediante la asignacin de un cdigo numrico a cada
microorganismo en funcin de los resultados obtenidos, ante la realizacin de determinadas
pruebas. API fue una de las primeras denominaciones comerciales de este sistema que haba
logrado disminuir los costes y el tiempo para llegar a una identificacin aceptable.
As, cada microorganismo era sometido a una batera de pruebas cuyos resultados se
expresaban de forma numrica. Cada especie estara definida por un cdigo numrico, resultado de
la codificacin de las reacciones a que hubiera sido sometido. Ante un microorganismo problema,
no tendramos ms que buscar el cdigo numrico y comprobar a qu bacteria pertenecera.
El procedimiento de codificacin ms sencillo hubiese sido asignar un 1 a las pruebas
positivas y un 0 a las negativas. El resultado hubiese sido que los cdigos numricos deberan tener

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entre 10 y 25 dgitos, dependiendo del nmero de pruebas, con el consiguiente engorro en el manejo
de un nmero con tantos dgitos. Para evitar este excesivo nmero de dgitos se utiliz un
procedimiento ingenioso: agrupar los resultados de las pruebas de tres en tres, de manera que el
resultado de cada tro de pruebas quedase reducido a un dgito.
Supongamos tres pruebas cualesquiera: las combinaciones posibles de positividad y
negatividad de todas ellas entre s quedan reducidas a 8 casos. Vemoslo:
Prueba 2

Prueba 3

Prueba 1

A cada combinacin de resultados podramos asignarle un dgito de 0 a 7; as el 0 podra

indicar las tres pruebas negativas, el 1 solo la primera prueba positiva, etc.
Para codificar el dgito de un tro de pruebas se establece el siguiente sistema:
- Si una prueba cualquier es negativa se le asigna un valor de 0 (cero) a la prueba.
- Si la primera prueba es positiva se asigna un valor de 1.
- Si la segunda prueba es positiva se asigna un valor de 2.
- Si la tercera prueba es positiva se asigna un valor de 4.
El cdigo numrico se obtiene sumando los valores de las tres pruebas. Los lmites inferior y
superior del cdigo son 0 y 7 respectivamente. La codificacin quedara de la siguiente manera:
Prueba 1

Prueba 2

Prueba 3

positivo = 1

positivo = 2

positivo = 4

negativo = 0

negativo = 0

negativo = 0

Cdigo numrico

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Para cada tro de resultados se adjudicara un dgito. En caso de que el nmero de pruebas no
fuese mltiplo de tres, se efectuara el agrupamiento de las sobrantes.
Por ejemplo, un batera de 10 pruebas con unos resultados establecidos aleatoriamente por
nosotros, podra tener el siguiente cdigo numrico:
Resultado

Valor

Prueba 1

Prueba 2

Prueba 3

Prueba 4

Prueba 5

Prueba 6

Prueba 7

Prueba 8

Prueba 9

Prueba 10

Dgito

El cdigo numrico de esta combinacin de resultados sera 5631 y ese sera el cdigo que
deberamos buscar en nuestro libro de cdigos para conocer la identificacin del microorganismo.
Si la batera fuese de 20 pruebas, el cdigo numrico tendra 7 dgitos, y el ltimo de ellos
correspondera a la suma de valores de dos pruebas. La ventaja de este sistema de identificacin es
que permite calcular la probabilidad de que una bacteria muestre un perfil de pruebas bioqumicas
concreto, expresndolo en forma de porcentaje sobre el total de bacterias investigadas.