PRACTICA N 1

Mtodo de conteo directo: Mtodo de Breed

I. INTRODUCCIN
Los recuentos microscpicos directos permiten determinar el nmero de
clulas microbianas, por observacin directa en el microscopio. Presentan
una gran ventaja ya que la muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida
como leche o cultivos puros en medio lquido), o puede prepararse una
dilucin tal como se realiza para otros mtodos de recuento.
Se basa en contar microrganismos en una cantidad conocida de muestra
utilizando frotis coloreados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las
especialmente diseadas para contar hongos en alimentos como la cmara
de Howard. Se determina el nmero TOTAL de clulas presentes (VIABLES Y
NO VIABLES). Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen
diferentes estados metablicos de las clulas. Por ejemplo en un recuento en
cmara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir
las clulas VIABLES (no absorben el colorante, se vern transparentes) de las
NO VIABLES (absorben el colorante y se vern azules).
El mtodo de Breed es un mtodo de recuento directo bastante simple,
fcil y eficaz a pesar de ser un mtodo antiguo (1911). Este mtodo de
Conteo Directo al Microscopio (CMD) es usado mayoritariamente para el
diagnstico microbiolgico de la leche y se lo considera un mtodo rpido
para estimar el grado de contaminacin bacteriano de la leche pero que no
est diseado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el conteo en
placa es ms preciso, ms prctico y ms barato que un conteo directo
ejecutado adecuadamente. Si el mtodo se contemplara como un mtodo
para estimar la calidad de la leche con propsito de pago, su uso sera
limitado para pequeo nmero de muestras con alto contenido bacteriano
(2.3 x 106 ufc/mL) debido a la insensibilidad del mtodo.
El mtodo de Breed tambin es usado para diagnstico de mastitis bovina
(diagnstico subclnico). En sta, el coloreado con azul de metileno nos
permite ver adems leucocitos y clulas somticas, tambin se pueden usar
coloraciones por los mtodos de LevowitzWeber o BroadhurstPaley que
permiten observar especficamente clulas somticas en leche.
II. OBJETIVOS

III.

Hacer un recuento toral de microorganismos que hay en una muestra.

MATERIALES Y MTODOS
A. Materiales

Microscopio calibrado

Lminas portaobjeto

Lmina patrn de Breed

Pipeta calibrada

Colorante de Gram o Azul de metileno

Muestra

Aceite de cedro

B. Mtodos
1. Estandarizacin del Equipo:
a. Se coloca la lmina patrn que tiene una tabla macromtrica
marcada, que tiene divisiones de 0.1 a 0.01 m; con el objetivo de
inmersin, proceder as:
Medir el campo en mm. hasta el tercer decimal.
Determinar el rea del campo en mm 2; aplicando la frmula de
superficie del crculo:
Ao = r2
b. Clculo del factor microscpico:
Se mide con exactitud el rea del microscopio en mm 2.
Luego se divide 100 entre el rea encontrada (X = 100 x A campo).
Luego, para hallar el factor microscpico se multiplica este valor
hallado por 100 (FM = X x 100)
Se indica que los microscopios tiene un factor de microscopio de
300,000 a 600,000.
2. Preparacin de la Pelcula:
a. Se lava la lmina, desengrasndola. Una vez hecho se coloca sobre
la lmina patrn, en este caso al carecer de ella se coloca una
lmina de cartn que tenga una cuadrado de 1 cm 2.
b. Enseguida colocar la muestra previamente homogenizada (20
veces).

c. Con la pipeta calibrada se coloca 0.01 ml. de la muestra en la

lmina. Esta se extiende por toda el rea del cuadrado de la lmina
patrn.
d. Luego debe hacerse el secado lento para evitar el
resquebrajamiento de la pelcula; en especial cuando la muestra se
trata de leche.
e. Teir la pelcula por el Mtodo de Gram
3. Examen Microscpico:
a. Contar en el microscopio los microorganismos por campo utilizando
lente de inmersin. Se cuenta a lo largo de toda la pelcula.
b. Se cuenta como mnimo 20 campos y un mximo 100 campos.
c. Cuando se cuentan los microorganismos se deben de contar como
uno solo: aquellas bacterias que estn solas, los agregados, los
grupos, los cocos o bacilos en cadenas.
4. Cmputo y clculo del microorganismo:
a. Se contar un mnimo de 10 campos.
b. Luego se sacar un promedio del nmero de microorganismos por
campo y se multiplica por el factor microscpico.
c. Luego, como la muestra usada fue de 0.01 mL, multiplicaremos el
resultado anterior obtenido por 100 para pasarlo a la misma unidad
(mL).
IV.

RESULTADOS

Clculo del promedio de microorganismo por campo:

# de Campo
# de Mos.
1
100
2
98
3
132
4
85
5
101
6
115
7
96
8
118
9
110
10
115

Promedio de microrganismos por campo (n):

Clculo del rea del microscopio:

Radio hallado: 50 m

A O = . r 2
A O =3,141592. ( 50 m )
A O =7853,98 m

Clculo del factor microscpico:

rea del cuadrado= 1 cm2 = 108
m2

FM =

FM =

A cuadrado
AO

1 08 m 2
2
7853,98 m

Clculo del nmero de clulas por mL:

Volumen de la muestra (V)= 0,01
mL

N =

N =

FM .n
V

12732,398 . 107 clulas

0,01 mL

Figura N 1: Observacin microscpica de la

muestra sometida a tincin GRAM
V. COMENTARIOS
El mtodo de Breed es un mtodo rpido, econmico y prctico. A pesar de
esto, se presenta mucho error, debido a la subjetividad que presenta;
tambin se usa mayormente para muestras lquidas ms no para slida,
porque puede causar confusin.
Se debe tener mucho cuidado en cuanto a la limpieza y esterilidad de los
materiales a usar para obtener lo ms ptimos resultados.
VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

DAVILA F., Nuria y J. E., HERNANDEZ G. (2006) Mtodos de ensayos

rpidos de deteccin de microorganismos en la leche. Revista Electrnica
de Veterinaria REDVET, Vol. VII, N 07, obtenido el 24 de enero de 2016
en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf

OLIVAS E., ALARCN L. (2004) Manual de Prcticas de Microbiologa

Bsica y Microbiologa de Alimentos: Programa de Nutricin. Universidad
Autnoma de Ciudad Jurez. Mxico.