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A
PRESERVAÇÃO
DA
INFORMAÇÃO
GENÉTICA
O
papel
biológico
desempenhado
pelas
moléculas
de
DNA
exige
que
elas
possuam
duas
propriedades
fundamentais:
auto‐replicação
e
preservação
da
informação
genética.
Para
que
o
conteúdo
informacional
do
DNA
seja
preservado,
e
corretamente
transmitido,
de
geração
em
geração,
é
indispensável
que
haja
fidelidade
na
replicação
semiconservativa
e
que
existam
mecanismos
capazes
de
reparar
modificações
estruturais
produzidas
no
material
genético
por
agentes
físicos
ou
químicos
do
meio
ambiente.
Erros
na
replicação
semiconservativa
podem
ocorrer
espontaneamente,
mas,
ao
final
da
replicação,
são
bastante
raros
dada
a
existência
de
mecanismos
capazes
de
impedí‐los
ou
corrigí‐los.
Durante
a
formação
das
novas
cadeias
polinucleotídicas,
além
das
diferenças
de
afinidade
das
bases
nitrogenadas
[formação
preferencial
de
pares
entre
adenina
e
timina
(A:T)
ou
entre
citosina
e
guanina
(C:G)],
a
atuação
seletiva
da
DNA
polimerase
(Pol)
e
sua
capacidade
exonucleolítica
(“editorial”)
que,
agindo
no
sentido
3’→5’,
elimina
nucleotídeos
incorretamente
inseridos,
evita
grande
parte
dos
erros
de
emparelhamento.
Em
E.
coli,
a
DNA
polimerase
III
(Pol
III),
responsável
pela
replicação
semiconservativa
é
uma
enzima
constituída
de
10
proteínas
(subunidades)
diferentes
e
cada
célula
contém
de
10
a
20
moléculas,
que
polimerizam
de
500
a
1.000
nucleotídeos
por
segundo.
A
atividade
de
“revisão
editorial”
(exonuclease
3'→5'),
encontra‐se
na
subunidade
epsilon
(ε),
codificada
pelo
gene
dnaQ
(mutD).
Em
células
humanas
a
polimerização
é
mais
lenta
(em
torno
de
50
nucleotídeos
por
segundo)
e
o
complexo
de
replicação
é
composto
pelas
DNA
polimerases
alfa
(Polα
=
POLA),
delta
(Polδ
=
POLD1)
e
epsilon
Polε
=POLE,
sendo
que
a
atividade
de
“revisão
editorial”
encontra‐se
nas
duas
últimas.
Correção
de
erros
de
emparelhamento
em
grandes
fragmentos
(Mismatch
Repair
–
MMR)
Outros
mecanismos
podem
se
expressar
após
a
replicação,
por
meio
de
enzimas
capazes
de
remover
bases
nitrogenadas
incorretamente
incorporadas
à
cadeia
ou
de
degradar
segmentos
nos
quais
tenham
ocorrido
erros,
ou
ainda,
eliminar
bases
alteradas
ou
lesadas;
para
tal,
é
indispensável
a
distinção
entre
as
hélices
neossintetizadas
e
as
preexistentes,
o
que
depende
dos
diferentes
graus
de
metilação
existentes
entre
elas.
Em
E.
coli,
na
hélice
neossintetizada
a
adenina
das
seqüências
5’GATC3’
não
está
metilada.
Na
hélice
parental
a
adenina
está
metilada
na
posição
N6
(N6MeA)
pela
DNA‐adenina
metilase
(32
kDa),
produto
do
gene
dam.
Quando
persistem
erros
de
emparelhamento,
após
a
replicação,
algumas
enzimas
entram
em
ação;
as
proteínas
MutS
e
MutL
reconhecem
os
erros
de
emparelhamento
e
a
proteína
MutH
corta
o
DNA
uma
das
seqüências
5’GATC3’
não
metiladas
adjacentes.
Posteriormente
a
DNA
helicase
II,
produto
do
gene
uvrD
(mutU,
recL,
uvrE),
em
conjunto
com
proteínas
que
se
ligam
à
hélice
simples
(Ssb)
abrem
o
fragmento
e
as
exonucleases
digerem
o
DNA.
A
PolIII
sintetiza
de
novo,
conforme
mostrado
na
figura
VII.1.
Embora
a
eficiência
do
reparo
de
alguns
erros
dependa
da
seqüência,
em
E.
coli
o
único
erro
para
o
qual
ainda
não
foi
detectada
a
correção
é
o
par
C:C,
e
o
par
mais
facilmente
corrigido
é
o
G:T.
Além
dos
erros
de
emparelhamento
o
sistema
também
repara
deleções
ou
inserções
de
até
três
nucleotídeos,
originadas
pelo
deslizamento
da
DNA
polimerase,
normalmente
em
seqüências
repetitivas.
A
reparação
é
iniciada
pela
ligação
do
homodímero
de
MutS
(97
kDa)
ao
erro,
seguida
da
ligação
de
MutL
(68
kDa),
também
na
forma
de
homodímero,
dependente
da
hidrólise
de
ATP.
A
ligação
deste
complexo
leva
à
ativação
de
uma
endonuclease
GATC
latente,
associada
à
proteína
MutH
(25
kDa),
a
qual
incisa
a
ligação
5’
da
guanina
na
seqüência
GATC
não
metilada.
O
sítio
GATC
pode
dirigir
a
correção
de
um
erro
distante
de
até
1
kb,
mas
o
sinal
é
muito
reduzido
quando
a
distância
ultrapassa
2
kb.
A
combinação
MutSLH
parece
“sentir”
a
presença
do
erro
e
da
não‐metilação,
acreditando‐se
que
para
isto
se
forme
uma
estrutura
alfa
(α),
que
talvez
seja
a
ativadora
de
MutH.
VII
2
A
reação
é
estritamente
exonucleolítica,
iniciando‐se
no
corte
e
prosseguindo
através
do
erro
até
cerca
de
100
bases
após.
A
função
exonucleolítica
é
bidirecional;
no
sentido
5’→3’
é
feita
pela
exonuclease
RecJ
ou
pela
exonuclease
VII
(produto
do
gene
xseA)
e
no
sentido
3’→5’
é
feita
pela
exonuclease
I
(produto
do
gene
sbcB).
FIGURA
VII.1
–
Como
as
exonucleases
I,
VII
e
RecJ
só
agem
em
hélice
simples
é
provável
que
a
helicase
II
(produto
do
gene
uvrD),
seja
necessária
para
desenrolar
o
DNA
e
permitir
a
entrada
das
exonucleases.
Como
o
duplo
mutante
recJ
xseA
não
é
hipermutável
e
diversos
mutantes
em
exonuclease
I
fazem
a
hidrólise
bidirecional
é
possível
que
exista
uma
outra
atividade
exonucleásica
3’→5’
além
da
exonuclease
I,
provavelmente
a
exonuclease
X.
A
última
etapa
é
o
preenchimento
da
lacuna,
especificamente
pela
PolIII,
uma
vez
que
outras
polimerases
não
são
capazes
de
substituí‐la,
sugerindo
uma
ligação
entre
o
sistema
de
reparação
e
o
de
replicação
do
DNA.
A
DNA
ligase
termina
o
reparo,
unindo
o
DNA
neossintetizado
ao
preexistente.
Cepas
bacterianas
contendo
mutações
no
gene
dam
que
produzam
a
enzima
em
quantidades
maiores
que
o
normal
ou
não
a
produzam
são
hipermutáveis,
uma
vez
que,
neste
caso,
a
diferenciação
entre
as
hélices
pela
proteína
MutH
é
dificultada.
Os
mutantes
deficientes
em
Dam
também
são
hipersensíveis
à
morte
pelo
agente
alquilante
N‐metil‐N’‐
nitro‐N‐nitrosoguanidina
(MNNG).
Entretanto,
os
mutantes
duplos
dam
mutL
e
dam
mutS
não
são
mais
sensíveis
que
a
cepa
selvagem,
o
que
implica
MutS
e
MutL
no
aumento
de
morte
associada
à
deficiência
de
metilação.
Por
outro
lado,
a
mutagênese
é
semelhante
nas
cepas
selvagens
e
nos
mutantes
dam
e
dam
mutL,
mostrando
uma
separação
entre
efeitos
letais
e
mutagênicos.
Estas
observações
conduziram
à
sugestão
de
que
as
lesões
O6MeG
produzidas
por
MNNG
podem
provocar
a
resposta
do
reparo
por
erros
de
emparelhamento,
devido
à
formação
dos
pares
O6MeG:T
e
O6MeG:C.
VII
3
Como
o
sistema
só
repara
erros
na
hélice
filha,
ele
não
repara
a
base
metilada
na
hélice
mãe
(lesão),
já
que,
neste
caso,
seria
um
reparo
abortivo
que
poderia
resultar
em
letalidade,
devido
à
síntese
inútil
do
DNA.
Em
células
humanas,
diversos
genes
codificam
para
proteínas
semelhantes
a
MutS
e
MutL
e
a
sua
não
funcionalidade
está
relacionada
ao
aparecimento
de
alguns
cânceres
esporádicos
e
a
praticamente
100%
dos
cânceres
de
cólon
hereditários
HPPCC
(Hereditary
Non
PolyposisColorectal
Cancer).
Aparentemente,
em
células
humanas
a
correção
de
erros
de
emparelhamento
funciona
de
maneira
semelhante
ao
descrito
para
E.
coli.
Em
extratos
de
células
humanas
já
foi
verificado
que
a
correção
é
realizada
de
maneira
similar
e
também
ocorre
a
excisão
bidirecional.
Os
principais
alvos
do
MMR
humano
são
erros
de
emparelhamento,
tais
como:
G:T,
G:G,
A:C
e
C:C,
entretanto,
as
proteínas
do
MMR
também
se
ligam
a
lesões,
tais
como:
O6MeG,
ligada
a
C
ou
T,
ligações
cruzadas
GpG
de
cisplatina,
fotoprodutos
da
radiação
UVC,
etc.
Em
células
humanas
foram
identificados
genes
que
participam
na
correção
dos
erros
de
emparelhamento:
MSH2
(MSH
=
MutS
Homolog),
MSH3
e
MSH6
que
codificam
proteínas
homólogas
à
MutS
bacteriana
e
MLH1(MLH
=
MutL
Homolog),
MLH3,
e
PMS2
(PMS=Post‐Meiotic
Segregation),
que
especificam
diferentes
homólogos
da
MutL
bacteriana
As
proteínas
MSH2
e
MSH6
[GTBP
(G:T
Binding
Protein)
ou
p160]
formam
um
heterodímero
que
é
ativo
na
correção
de
erros
de
emparelhamento
e
foi
designado
MutSα.
MSH2
também
forma
complexo
com
MSH3
gerando
MutSβ.
Dependendo
do
par,
os
heterodímeros
reconhecem
diferentes
substratos.
MutSα
reconhece
erros
de
emparelhamento
de
bases
e
deleções/inserções
enquanto
MutSβ
somente
reconhece
deleções/inserções
e,
para
uma
ligação
eficiente
de
MutSα
ao
erro
há
necessidade
de
fosforilação.
As
proteínas
PMS2
e
MLH1
também
formam
um
heterodímero
denominado
MutLα
que
também
é
ativo
no
reparo
dos
erros
de
emparelhamento.
Admite‐se
ainda
a
existência
de
outro
complexo
(MLH1
com
MLH3)
que
atuaria
em
conjunto
com
o
complexo
MutSβ,
de
maneira
ainda
desconhecida
(Figura
VII.2).
FIGURA
VII.2
–
MMR
em
humanos
VII
4
Em
células
humanas
o
reconhecimento
dos
erros
depende
de
MutSα
e
MutLα
e
a
especificidade
da
correção
é
similar
à
de
bactérias.
O
sistema
corrige
tanto
troca
de
bases
como
pequenas
deleções
e
inserções
de
até
quatro
nucleotídeos.
A
reação
é
dependente
de
ATP
e
é
acompanhada
por
síntese
de
reparo
partindo
da
incisão
e
atravessando
o
erro.
Uma
simples
incisão
em
até
1
kb
de
distância
do
erro
pode
dirigir
o
reparo,
entretanto,
a
eficiência
vai
diminuindo
com
a
distância
entre
100
e
1000
bases
e
independe
do
corte
em
3’ou
em
5’.
Assim
como
em
E.
coli,
a
excisão
é
bidirecional
e
as
lacunas
geradas
começam
na
incisão
e
vão
até
90
a
170
nucleotídeos
após
o
erro.
Como
a
excisão
é
igual
para
erros
de
emparelhamento
ou
inserção
de
2
nucleotídeos
acredita‐se
que
o
mecanismo
seja
o
mesmo.
A
polimerase
δ
é
a
responsável
pela
ressíntese.
A
sinalização
para
distinguir
a
hélice
filha
não
está
clara
em
mamíferos.
Verificou‐se
que
não
é
metilação
em
seqüências
específicas
como
em
E.
coli.
O
sinal
parece
ser
a
permanência
de
proteínas
associadas
à
hélice
mãe
durante
a
replicação
ou
a
presença
de
quebras
simples
na
hélice
filha
que
ocorrem
durante
a
replicação.
A
exonuclease
I
humana
é,
possivelmente,
a
responsável
pela
digestão
(5’→
3’)
da
fita
contendo
o
erro.
Não
se
conhece
a
exonuclease
responsável
pela
digestão
da
fita
na
direção
3’→
5’,
embora
haja
sugestões
de
que
as
funções
editoriais
das
Polδ
e
Polε
seriam
as
responsáveis
por
esta
digestão.
Além
disto,
nenhuma
helicase
foi
ainda
detectada
para
este
sistema
em
células
humanas.
O
tratamento
de
células
com
agentes
alquilantes
tais
como
MNNG
conduz
à
translocação
de
MSH2
e
MSH6
para
o
núcleo,
conduzindo
ao
aumento
da
atividade
de
ligação
de
MutSα
aos
erros
de
emparelhamento,
entretanto,
ainda
não
se
mostrou
inequivocamente
a
indução
do
MMR,
tanto
em
bactérias
como
em
eucariotos.
A
primeira
evidência
da
existência
deste
mecanismo
em
células
humanas
veio
de
estudos
com
uma
cultura
celular
hipermutável,
que
era
deficiente
na
correção
dos
erros.
Esta
cultura
foi
isolada
in
vitro
pela
sua
capacidade
de
sobreviver
em
presença
de
lesões
no
DNA,
pela
exposição
a
agentes
alquilantes,
que
normalmente
matariam
as
células.
A
partir
destes
experimentos
a
seleção,
in
vitro,
para
resistência
a
MNNG
ou
Metil
Nitroso
Uréia
(MNU)
conduziu
à
identificação
de
diversas
linhagens
celulares
de
mamíferos
tolerantes
a
metilação.
Tanto
em
bactérias
como
em
células
humanas
a
resistência
adquirida
contra
o
efeito
letal
de
agentes
metilantes,
a
qual
não
pode
ser
atribuída
a
um
aumento
do
reparo
das
lesões,
é
definida
como
tolerância
a
metilação.
A
linhagem
melhor
caracterizada
é
a
MT1
(MT
=
Methylation
Tolerance),
derivada
de
células
humanas
linfoblastóides
TK6,
após
uma
única
etapa
de
seleção
para
resistência
a
MNNG.
Esta
linhagem,
embora
seja
centenas
de
vezes
mais
resistente
a
MNNG
que
a
parental,
em
alguns
casos
é
mais
sensível
à
mutagênese
do
MNNG.
Portanto
MT1
tolera
adutos
citotóxicos.
Células
MT1
também
exibem
um
defeito
de
pontos
de
checagem
(checkpoints)
do
ciclo
celular
após
tratamento
com
MNNG
e
são
hipermutáveis
em
ausência
de
MNNG.
A
mutagênese
espontânea
é
elevada
60
vezes
nas
células
MT1,
sendo
em
sua
maior
parte
do
tipo
transversões,
transições
A
G
e
inserções
ou
deleções
de
um
nucleotídeo.
Baseado
nos
fenótipos
de
MT1
e
de
bactérias
deficientes
no
reparo
de
erros
de
emparelhamento
foi
sugerido
que
os
defeitos
de
reparo
podem
conferir
tolerância
a
agentes
alquilantes
em
células
de
mamíferos,
assim
como
ocorre
em
bactérias.
Células
MT1
são
deficientes
em
atividade
MutSα
e
têm
mutações
em
ambos
os
alelos
do
gene
que
codifica
a
subunidade
MSH6.
MT1
exibe
um
defeito
de
checagem
no
estágio
G2
do
ciclo
celular.
Observações
similares
foram
feitas
em
células
de
camundongos
com
o
gene
MSH2
nocauteado.
VII
5
Correção
de
erros
de
emparelhamento
em
pequenos
fragmentos
(VSP
=
Very
Short
Patch)
Outras
seqüências
metiladas
existem
no
DNA,
tais
como
a
(CC(A/T)GG),
metilada
pela
DNA‐citosina
metilase
(Dcm),
na
segunda
citosina,
na
posição
C5.
Esta
metilação
em
E.
coli
protege
o
DNA
contra
enzimas
de
restrição
enquanto
em
células
de
mamíferos
ela
suprime
a
transcrição,
acarretando
o
bloqueio
de
alguns
genes.
Em
condições
de
baixa
de
5‐metil
citosina
(C5MeC)
há
um
aumento
da
formação
de
tumores,
sugerindo
a
localização
destas
seqüências
possivelmente
em
promotores
de
oncogenes.
A
desaminação
da
C5MeC
acarreta
a
formação
do
par
T:G.
O
sistema
VSP
corrige
eficientemente
T
nos
erros
G:T
que
ocorrem
naquelas
seqüências.
Os
sítios
de
reconhecimento
de
Dcm
são
pontos
hipermutáveis
devido
à
desaminação
espontânea
da
C5MeC
do
par
G:
C5MeC,
um
evento
que
conduz
ao
par
G:T.
O
sistema
VSP
utiliza
dois
genes
de
reparação
de
erros
de
emparelhamento,
mutS
e
mutL
mas
não
os
genes
mutH
e
uvrD.
Adicionalmente,
são
necessários
os
produtos
dos
genes
vsr
e
polA.
O
gene
vsr
está
localizado
antes
do
dcm
e
fazendo
parte
da
mesma
unidade
transcricional.
Em
heteroduplexes
nas
quais
as
seqüências
GATC
estão
metiladas,
representando
DNA
replicado,
o
sistema
VSP
entra
em
ação
(Figura
VII.3);
quando
o
DNA
está
em
replicação
e
a
hélice
filha
não
está
metilada,
age
o
sistema
MutSLH.
FIGURA
VII.3
–
Esquema
proposto
para
o
mecanismo
de
reparo
de
erros
de
emparelhamento
em
pequenos
fragmentos
(Very
Short
Patch
Repair)
em
E.
coli.
O
produto
do
gene
vsr
é
uma
proteína
de
18
kDa
constituindo
uma
endonuclease
de
correção
de
erros
hélice‐específica.
Ela
reconhece
o
par
G:T
no
contexto
CT(A/T)GG
e
NT(A/T)GG
e
faz
incisões
do
lado
5’da
timina
produzindo
terminais
5’PO4
e
3’OH.
Aparentemente
a
PolI
(que
é
requerida
para
o
VSP)
remove
a
timina
com
sua
atividade
exonucleolítica
5’→3’
e
faz
a
síntese
de
reparo
de
pequenos
fragmentos
(entre
10
e
20
nucleotídeos)
como
é
sua
característica.
VII
6
MutS
e
MutL
provavelmente
agem
estimulando
ou
regulando
a
endonuclease
Vsr,
já
que
em
células
contendo
plasmídeos
multicópia
com
o
gene
vsr,
MutS
e
MutL
são
dispensáveis
no
reparo
VSP.
Uma
vez
terminado
o
reparo,
a
proteína
Dcm
metila
novamente
a
citosina.
Em
células
humanas,
a
reparação
de
G:T
para
G:C
foi
demonstrada
em
extratos
nucleares
de
células
HeLa.
A
análise
dos
intermediários
da
reação
indica
que
o
reparo
envolve
a
troca
de
um
simples
nucleotídeo
e,
a
Polβ,
é
a
responsável
pelo
fechamento
da
lacuna.
Atividades
enzimáticas
capazes
de
incisar
as
ligações
fosfodiéster
imediatamente
a
5’e
3’da
timina
errada
foram
identificadas
em
extratos
de
células
humanas.
Uma
vez
que
a
timina
é
liberada
como
uma
base
livre,
foi
sugerido
que
uma
timina‐DNA
glicosilase
gere
um
sítio
intermediário
abásico,
que
serve
de
substrato
para
as
incisões.
A
enzima
(55
kDa)
foi
isolada
de
células
HeLa
e
é
uma
timina‐DNA
glicosilase
específica
para
erros,
que
é
capaz
de
remover
T
do
par
G:T,
sem
atividade
AP
liase
ou
AP
endonuclease
associada.
O
par
G:T
é
originado
da
desaminação
de
C5MeC
nas
seqüências
CpG.
Esta
enzima
também
pode
remover
U
dos
pares
G:U
que
podem
surgir
de
desaminações
de
citosina
em
regiões
ricas
em
G:C.
Correção
de
erros
por
MutY
(metil
independente)
O
erro
G:A
ocorre
muito
freqüentemente
durante
a
polimerização,
entretanto,
na
ausência
de
MutSLH
o
número
de
mutantes
com
este
erro
não
é
muito
elevado,
devido
à
existência
de
outros
sistemas;
assim,
a
proteína
MutY
retira
A
do
par
G:A
e
também
participa
da
reparação
da
lesão
oxidativa
8‐oxoguanina
(8‐oxoG
=
GO),
em
conjunto
com
as
proteínas
MutT
e
MutM
como
será
visto
adiante.
Este
sistema
libera
pequenos
fragmentos
e
é
independente
de
MutSLH,
hidrólise
de
ATP
ou
metilação.
Os
erros
G:A
são
corrigidos
para
G:C.
O
reparo
requer
a
função
do
gene
mutY
(micA)
e
da
PolI,
a
qual
libera
e,
em
seguida,
incorpora
entre
10
e
20
nucleotídeos.
A
proteína
MutY
funciona
como
uma
DNA
glicosilase
com
uma
atividade
3’AP
liase
associada,
removendo
especificamente
A
dos
pares
errados
G:A
e
C:A
com
uma
eficiência
20
vezes
maior
para
o
par
G:A.
Em
células
humanas,
recentemente
foi
purificada
uma
enzima,
que
cliva
especificamente
erros
A:G.
Ela
faz
simultaneamente
incisões
na
primeira
ligação
fosfodiéster
3’
e
5’
do
erro
no
lado
com
A
e
não
no
lado
com
G,
uma
ação
muito
similar
à
da
proteína
MutY
de
E.
coli.
Erros
de
emparelhamento
e
recombinação
genética
Normalmente,
a
freqüência
de
recombinação
genética
entre
E.
coli
vs
S.
typhimurium
(recombinação
homeóloga)
é
da
ordem
de
10‐6
para
um
dado
caráter
(ex.,
xyl
ou
met),
comparada
com
a
recombinação
entre
E.
coli
vs
E.
coli
(recombinação
homóloga),
que
é
de
10‐1.
Em
mutantes
mutSLH
a
freqüência
aumenta
cerca
de
1.000
vezes
quando
a
divergência
de
nucleotídeos
é
de
cerca
de
20%
(E.
coli
vs
S.
typhimurium),
sendo
os
mutantes
mutS
e
mutL
os
mais
eficazes
em
deixar
a
recombinação
ocorrer.
A
indução
do
sistema
SOS
estimula
a
recombinação
homeóloga
através
da
superprodução
da
proteína
RecA.
Já
que
a
proteína
RecA
é
capaz
de
deixar
mais
de
30%
de
erros
de
emparelhamento
na
recombinação,
o
efeito
cumulativo
de
deficiência
de
correção
de
erros
de
emparelhamento
e
indução
do
sistema
SOS
leva
a
taxa
de
recombinação
homeóloga
a
aproximar‐se
da
homóloga.
Trocas
entre
seqüências
divergentes
em
somente
3%
são
dramaticamente
inibidas
por
MutS,
um
efeito
que
pode
ser
significativamente
aumentado
por
MutL.
Como
estas
proteínas
não
interferem
na
recombinação
homóloga
o
maior
efeito
é
bloquear
a
migração
dos
cruzamentos
das
hélices
de
DNA
durante
as
trocas
homeólogas,
não
deixando
a
recombinação
ocorrer,
formando
uma
verdadeira
barreira
entre
as
espécies.
VII
7
Barreiras
genéticas
entre
bactérias
Embora
a
transferência
de
material
durante
a
conjugação
seja
altamente
eficiente,
a
freqüência
de
recombinação
entre
E.
coli
vs
S.
typhimurium
é
muito
baixa,
aproximadamente
105
vezes
menor
que
entre
as
mesmas
espécies.
Durante
a
conjugação
Hfr
x
F‐,
o
DNA
entra
na
célula
receptora
como
uma
hélice
simples
com
a
fita
líder
5’.
Na
célula
F‐
a
fita
complementar
é
sintetizada,
gerando
a
dupla
hélice.
As
pontas
da
dupla
hélice
são
substrato
para
a
enzima
RecBCD,
que
com
sua
ação
helicase
e
exonuclease
digere
a
dupla
hélice
até
encontrar
uma
seqüência
chi
(χ)
(5’GCTGGTGG3’).
A
seqüência
χ
altera
a
enzima
baixando
a
afinidade
de
RecD
com
o
heterodímero
RecBC.
Com
a
perda
de
RecD
o
complexo
RecBC
fica
deficiente
em
exonuclease
mas
proficiente
em
helicase,
produzindo
hélices
simples
de
DNA.
A
proteína
RecA
forma
um
polímero
na
hélice
simples
e
catalisa
a
procura
por
seqüências
idênticas
no
DNA
em
hélice
dupla.
A
troca
de
hélices
mediada
por
RecA
requer
um
mínimo
de
identidade
para
processamento.
Durante
a
conjugação
interespécies
o
número
de
segmentos
com
o
mínimo
de
identidade
é
limitado
pelo
grau
de
divergência
entre
os
DNAs
dos
conjugantes,
diminuindo
a
velocidade
da
recombinação
mediada
por
RecA.
Conseqüentemente,
o
complexo
entre
RecA
e
DNA
em
hélice
simples
permanece
mais
tempo
no
cruzamento
interespécies
que
no
cruzamento
intraespécies,
resultando
na
ativação
da
função
coproteásica
de
RecA
e
desrepressão
do
regulon
SOS.
Como
resultado
aumenta
a
quantidade
das
proteínas
RecA
e
RuvAB
o
que
estimula
a
recombinação
entre
as
espécies.
Assim,
o
SOS
age
como
um
regulador
positivo
indutível
da
recombinação
interespécies.
Entretanto,
a
indução
do
sistema
SOS
não
afeta
a
atividade
de
correção
de
erros
de
emparelhamento
em
grandes
fragmentos,
que
é
um
poderoso
inibidor
da
recombinação
entre
seqüências
divergentes
e,
a
ligação
das
proteínas
MutS
e
MutL
bloqueia
a
troca
de
hélices
promovida
por
RecA,
reduzindo
a
freqüência
de
recombinação
interespécies
(Figura
VII.4)
Reparação
de
deleções
e
inserções
As
repetições
de
dinucleotídeos
e
trinucleotídeos
que
ocorrem
freqüentemente
no
DNA
de
eucariotos
e
mais
raramente
em
procariotos,
representam
um
problema
potencial
durante
a
replicação,
provocando
deslizamento
entre
as
hélices
e
conduzindo
a
deleções
e
inserções.
A
freqüência
de
deleções
e
inserções
num
fragmento
de
dinucleotídeos
repetitivos
(AC)20
é
aumentada
cerca
de
13
vezes
em
cepas
de
E.
coli
mutL
e
mutS,
o
que
não
ocorre
em
mutantes
recA.
Este
fato
correlaciona‐se
com
a
detecção
de
instabilidade
em
repetições
de
dinucleotídeos
em
células
humanas
deficientes
no
reparo
de
erros
de
emparelhamento.
Por
outro
lado,
repetições
de
trinucleotídeos
(CTG)180
são
mais
estáveis
nos
mutantes
mutH,
mutL
ou
mutS,
sugerindo
a
participação
do
sistema
MMR
na
promoção
das
deleções
e
inserções.
Entretanto,
a
estabilidade
das
repetições
de
trinucleotideos
(CGG)80
não
é
afetada
pela
reparação
de
erros
de
emparelhamento
em
E.
coli.
Em
células
humanas
ainda
não
foi
reportada
instabilidade
de
repetições
de
trinucleotídeos
em
células
mutantes,
deficientes
na
reparação
de
erros
de
emparelhamento.
A
atuação
conjugada
dos
processos
acima
descritos
faz
com
que
a
probabilidade
de
ocorrência
e
(ou)
persistência
de
um
erro
de
emparelhamento
seja
bastante
reduzida,
da
ordem
de
grandeza
de
l0‐10,
ou
seja,
de
um
nucleotídeo
indevidamente
inserido
para
cada
1010
nucleotídeos.
Na
polimerização
normal
os
erros
são
da
ordem
de
10‐4;
após
a
“revisão
editorial”
passam
para
10‐7
e
após
a
ação
das
proteínas
Mut
são
da
ordem
de
10‐10.
Uma
base
nitrogenada
incorporada
erroneamente
acarreta
alteração
do
conteúdo
informacional,
transmissível
às
gerações
subseqüentes,
constituindo
a
mutagênese
direta.
VII
8
FIGURA
VII.4
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
a
manutenção
da
barreira
genética
entre
bactérias,
enfocando
o
papel
das
proteínas
MutSL.
REPARAÇÃO
DE
LESÕES
(ASPECTOS
GERAIS)
Agentes
químicos
também
podem
provocar
erros
de
emparelhamento,
causando
modificações
estruturais
nas
bases
nitrogenadas
e
alterando
sua
capacidade
de
formação
correta
de
pares.
Isto
ocorre,
por
exemplo,
após
tratamento
com
certos
agentes
alquilantes,
como
MNNG,
capaz
de
inserir,
por
exemplo,
grupamentos
metil
no
O6
da
guanina,
de
forma
que
esta
passa
a
se
emparelhar
com
a
timina,
e
não
mais
com
a
citosina.
Diversos
agentes
físicos
ou
químicos
do
meio
ambiente
promovem
modificações
estruturais
na
molécula
de
DNA,
englobadas
sob
a
designação
genérica
de
lesões,
cuja
persistência
representa
um
obstáculo
à
manutenção
dos
processos
bioquímicos
intracelulares.
Assim,
é
fácil
entender
a
importância
dos
mecanismos
enzimáticos
que
atuam
restaurando
a
integridade
do
genoma
ou
criando
vias
que
permitam
à
célula
“tolerar”
as
lesões,
isto
é,
manter
suas
funções
mesmo
sem
a
eliminação
dos
danos
provocados
no
DNA.
A
não
funcionalidade
dos
mecanismos
de
reparação
conduz
à
inativação
celular
após
o
tratamento
com
o
agente
físico
ou
químico
ou,
eventualmente,
à
modificação
do
patrimônio
genético,
isto
é,
ao
surgimento
de
mutações.
Mas
nem
sempre
os
mecanismos
de
reparação
atuam
corretamente,
em
alguns
casos
eles
podem
VII
9
promover
o
desaparecimento
da
lesão,
com
alteração
do
conteúdo
informacional,
o
que
caracteriza
a
mutagênese
indireta.
Estas
diferentes
possibilidades
encontram‐se
esquematicamente
representadas
na
figura
VII.5.
FIGURA
VII.5
–
Atuação
dos
mecanismos
de
reparação
na
eliminação
das
lesões,
na
preservação
do
conteúdo
informacional
e
na
mutagênese.
Os
mecanismos
de
reparação
do
DNA
são,
em
geral,
dependentes
dos
produtos
de
diversos
genes
e
se
caracterizam
por
possuírem
várias
etapas,
possibilitando
vias
alternativas,
muitas
vezes
coexistentes
e
competitivas.
REVERSÃO
DIRETA
DAS
LESÕES
Alguns
tipos
de
lesões
podem
ser
revertidos
diretamente,
mediante
a
ação
de
uma
única
enzima,
que
desfaz
a
lesão
produzida,
restaurando
a
integridade
da
molécula
de
DNA.
Como
exemplos
de
mecanismos
deste
tipo
de
reparação
podem
ser
citados
a
fotorreativação
e
a
remoção
de
grupamentos
alquil.
Além
destes
mecanismos
enzimáticos,
algumas
lesões,
como
os
dímeros
de
pirimidinas
podem
ser
revertidos
diretamente
pela
radiação
ultravioleta,
como
é
o
caso
da
fotorreversão.
Fotorreativação
Entre
os
fotoprodutos
formados
pelas
radiações
UV
germicidas
(UV‐C),
os
dímeros
de
pirimidinas
(CPD
=
Ciclobutane
Pyrimidine
Dimer)
são
os
mais
freqüentes,
sendo
os
maiores
responsáveis
pela
inativação
celular.
A
fotorreativação
consiste
na
eliminação
de
CPDs
formados
no
DNA
pelo
UV‐C,
mediante
exposição
das
células
às
radiações
UV
de
comprimentos
de
onda
superiores
a
300
nm
ou
à
luz
visível.
O
processo,
esquematicamente
representado
na
figura
VII.6,
é
mediado
pela
enzima
de
fotorreativação
ou
fotoliase,
que
tem
a
propriedade
de
combinar‐se,
mesmo
em
ausência
de
luz,
com
DNA
contendo
dímeros
de
pirimidinas.
Quando
o
complexo
enzima‐substrato
é
iluminado,
ele
se
dissocia,
sendo
liberados
o
DNA
reparado
e
a
enzima,
esta
podendo
atuar
em
outros
sítios
nos
quais
ainda
existam
dímeros.
Existem
entre
10
e
20
moléculas
por
célula
bacteriana
e
a
fotoliase
(49
kDa)
age
rompendo
a
ligação
ciclobutano
entre
a
duas
pirimidinas,
numa
velocidade
de
5
dímeros
/molécula/min
e,
em
E.
coli
é
codificada
pelo
gene
phr.
Para
estas
células
os
comprimentos
de
onda
mais
eficientes
para
promover
a
fotorreativação
situam‐se
entre
340
e
390
nm.
VII
10
FIGURA
VII.6
‐
Esquema
do
modelo
proposto
para
a
fotorrestauração
enzimática
em
E.
coli.
A)
visão
geral;
B)
etapas
fotoquímicas.
Recentemente
foi
detectado
que
a
fotoliase
de
plantas
também
é
capaz
de
desfazer
a
ligação
do
fotoproduto
6‐4
(6‐4PP
=
6‐4
Pyrimidine
Pyrimidone).
A
fotoliase
contém
dois
cromóforos
FADH2
ou
FADH‐
(1,5‐dihidroflavina
adenina
dinucleotídeo)
e
folato
MTHF
[5,10‐metenoetiltetrahidrofolil
(poliglutamato)]
ou
deazaflavina
(8‐HDH).
O
folato
absorve
a
maioria
dos
fótons
e
é
chamado
de
“antena”
da
fotoliase.
O
folato,
ao
receber
um
fóton,
passa
ao
estado
tripleto
e
desativa‐se
transferindo
a
energia
para
o
FADH‐.
O
FADH‐
excitado
(singleto)
transfere
um
elétron
para
o
dímero.
Através
de
um
rearranjo
eletrônico
há
quebra
do
anel
ciclobutano,
gerando
pirimidina
e
pirimidina
ânion
o
qual
transfere
o
elétron
para
o
FADHo,
regenerando
o
FADH2
(Figura
VII.6B).
A
fotorreativação
permite
não
somente
o
aumento
da
viabilidade
celular
após
exposição
ao
UV‐C,
germicida,
mas
também
a
redução
da
mutagênese
fotoinduzida.
O
processo
parece
ser
altamente
específico
para
dímeros
de
pirimidinas,
mas,
a
fotoliase
talvez
desempenhe
outros
papéis
na
célula,
entre
os
quais
o
favorecimento
de
outros
mecanismos
de
reparação.
A
ligação
da
fotoliase
aos
dímeros
torna
estas
lesões
mais
acessíveis
ao
complexo
UvrABC,
aumentando
a
eficiência
da
reparação
por
excisão
de
nucleotídeos
(ver
adiante).
Foi
mostrado
que
a
FADH2
purificada
da
fotoliase
de
E.
coli
catalisa
a
monomerização
de
dímeros
de
uracil
em
poli‐U
in
vitro,
mas
com
uma
eficiência
1.000
vezes
menor
que
a
de
dímeros
de
uracil
do
DNA.
A
fotorreativação
já
foi
descrita
nos
mais
diversos
sistemas
biológicos:
micoplasmas,
bactérias,
leveduras,
moscas,
sapos,
diversas
plantas
e
mamíferos
não
placentários,
mas
não
em
mamíferos
superiores.
Alguns
estudos
sugeriram
a
existência
de
proteínas
filogeneticamente
correlacionadas
à
fotoliase
em
células
de
mamíferos
e
outros
mostraram
perda
de
dímeros,
dependentemente
de
luz,
em
células
em
cultura
e
em
pele
humana
intacta,
entretanto,
estes
estudos
não
foram
confirmados.
VII
11
Muitos
estudos
falharam
na
tentativa
de
mostrar
fotorreativação
em
organismos
mais
avançados
que
os
não‐placentários
(marsupiais);
portanto,
acredita‐se
que
ela
não
exista
em
seres
humanos.
Em
células
humans
foram
detectadas
proteínas
similares
às
fotoliases,
porém
não
relacionadas
ao
reparo
de
lesões
mas
sim
à
regulação
do
ritmo
circadiano.
Já
foram
clonados
os
genes
CRY1
e
CRY2
em
humanos
e
em
camundongos.
CRY1
e
CRY2
são
expressos
em
diversos
tecidos
tais
como:
fígado,
testículos,
cérebro
e
retina
e
seus
produtos
agem
como
fotorreceptores
circadianos.
Aparentemente
os
genes
CRY1
e
CRY2
têm
papéis
antagônicos,
uma
vez
que
o
período
circadiano
é
diminuído
em
camundongos
cry1‐/‐
e
aumentado
em
camundongos
cry2‐/‐.
Este
gene
revela
uma
modificação
evolucionária
muito
interessante,
uma
vez
que
uma
enzima
de
reparação
de
DNA
parece
ter
se
transformado
em
uma
proteína
com
funções
completamente
diferentes.
Fotorreversão
A
reversão
de
dímeros
de
pirimidinas
pode
também
ser
obtida
por
outros
processos,
independentes
da
fotoliase.
Ela
ocorre,
por
exemplo,
mediante
exposição
das
células,
previamente
irradiadas
com
UV
germicida,
a
comprimentos
de
onda
situados
entre
200
e
300
nm
(235nm
favorece
a
fotomonomerização
e
280
nm
favorece
a
dimerização),
uma
vez
que
a
união
de
duas
pirimidinas
é
uma
reação
reversível
e
que
cada
comprimento
de
onda,
ainda
que
com
diferentes
eficiências,
pode
promover
tanto
a
dimerização
como
a
monomerização;
a
desdimerização
devida
unicamente
à
exposição
ao
UV‐C
constitui
a
fotorreversão
direta.
Proteínas
ricas
em
triptofano,
como
a
codificada
pelo
gene
32
do
fago
T4,
e
mesmo
oligopeptídeos
ricos
neste
aminoácido,
podem,
quando
expostos
a
comprimentos
de
onda
de
334
nm,
adquirir
a
capacidade
de
promover
a
monomerização
de
timinas
dimerizadas,
o
que
parece
ser
conseqüência
da
transferência
de
elétrons
do
anel
do
triptofano
para
os
dímeros;
este
fenômeno
constitui
a
fotorreversão
sensibilizada.
Transferência
de
grupamentos
alquil
Quando
células
são
tratadas
com
agentes
alquilantes
tais
como
MNU
ou
MNNG,
seu
DNA
é
alquilado
nas
mais
diversas
posições.
Em
alguns
casos,
estas
lesões
podem
ser
reparadas
diretamente,
pela
remoção
dos
grupamentos
alquil.
As
metilações
que
ocorrem
no
oxigênio
exocíclico
das
bases
são
diretamente
removidas,
sendo
O6MeG
a
mais
abundante
(6
a
8%
das
metilações
totais)
e
O4MeT
a
de
menor
importância
(<
0,4%).
A
metilação
da
ligação
fosfotriéster
é
da
ordem
de
17%.
(Na
figura
VII.7
estão
representados
os
diferentes
sítios
de
metilação
com
as
respectivas
ocorrências)
FIGURA
VII.7
–
Principais
sítios
de
alquilação
VII
12
Em
E.
coli
existem
duas
enzimas
que
reparam
o
DNA
por
transferência
direta
do
grupamento
alquil;
as
proteínas
Ada
e
Ogt
(O6‐Metilguanina
‐
DNA
Metiltransferases)
codificadas
pelos
genes
ada
e
ogt
respectivamente.
A
proteína
Ada
(37
kDa)
remove
grupamentos
metil
das
posições
O6
da
guanina,
O4
da
timina
e
da
ligação
fosfotriéster
enquanto
a
Ogt
só
consegue
removê‐los
das
posições
O6
da
guanina
e
O4
da
timina.
A
remoção
dos
grupamentos
alquil
das
bases
acarreta
a
inativação
das
proteínas
(enzima
“suicida”),
entretanto,
no
caso
da
remoção
do
metil
da
ligação
fosfotriéster,
a
proteína
Ada
sofre
uma
mudança
conformacional,
tornando‐se
um
ativador
de
seu
próprio
gene,
conduzindo
à
síntese
de
milhares
de
moléculas
de
Ada.
A
proteína
Ogt
(19
kDa)
é
constitutiva,
não
tendo
sido
detectado
nenhuma
ativação
por
qualquer
tratamento.
Foi
mostrado
que
os
mutantes
ada
e
ogt
são
propensos
a
acumular
mutações
espontaneamente,
mostrando
a
existência
de
alquilações
espontâneas
provenientes
provavelmente
do
cloreto
de
metila,
que
é
abundante
na
atmosfera,
com
uma
estimativa
anual
de
emissão
de
5
x106
toneladas,
a
maior
parte
de
fontes
naturais
e
de
fontes
endógenas
como
a
S‐adenosil
metionina
e
outros
doadores
intracelulares.
Apesar
da
semelhança
quanto
à
sua
atuação,
recentemente
foi
verificado
que
aparentemente
Ada
prefere
O6MeG
e
Ogt
prefere
O4MeT.
Em
células
humanas,
a
O6‐Metilguanina‐DNA
Metiltransferase
(O6MGT),
ainda
conhecida
como
Atase,
AGT
e
AGAT,
também
é
uma
enzima
suicida
que
repara
o
DNA
transferindo
o
grupamento
metil
da
O6MeG
no
DNA
para
um
resíduo
cisteína
da
enzima
em
uma
reação
irreversível.
A
transferência
do
grupamento
alquil,
inativa
e
transforma
a
enzima
em
alvo
para
ubiquitinação
e
degradação
por
proteases.
Ela
repara
também
O6
etilguanina
e
O6
butilguanina
assim
como
O4
metiltimina
com
uma
eficiência
mais
baixa.
Estas
lesões
são
produzidas
por
agentes
alquilantes
(MNNG,
MNU,
etc.,
contidos
em
alimentos,
cigarros,
etc.).
Em
condições
fisiológicas
o
DNA
é
metilado
por
metilantes
naturais
como
a
S‐
adenosilmetionina.
A
O6MGT
foi
detectada
em
todas
as
espécies.
A
enzima
humana
é
uma
proteína
monomérica
de
24
kDa.
Ela
é
semelhante
à
Ogt
bacteriana
e
também
só
tem
função
de
metil
transferase
para
O6MeG
e
O4MeT,
com
uma
preferência
10.000
vezes
maior
para
O6MeG.
Ela
não
tem
a
função
de
retirar
grupos
alquil
das
ligações
fosfotriéster
e
também
não
tem
a
função
regulatória
parecida
com
a
proteína
Ada
de
bactérias,
embora
seja
induzida
por
estresse
genotóxico.
O
gene
da
O6MGT
humana
está
localizado
no
cromossomo
10
e
tem
6
exons
e
mais
de
170
kb
e
a
proteína
tem
regiões
de
extensa
homologia
com
as
bacterianas,
entretanto,
não
há
muita
homologia
de
seqüência
e
o
cDNA
humano
não
hibridiza
com
o
DNA
genômico
de
E.
coli.
A
proteína
humana
é
uma
enzima
simples,
sem
cofator,
com
uma
cisteína
ativa
na
seqüência
contexto
PCHRV
(Pro‐Cys‐His‐Arg‐Val),
que
é
conservada
em
todas
as
O6MGTs.
O
sítio
ativo
é
escondido
(latente
=
críptico)
só
se
tornando
acessível
após
modificação
conformacional
induzida
pelo
contato
com
o
DNA.
Os
efeitos
citotóxicos,
mutagênicos
e
tumorigênicos
da
O6MeG
são
diminuídos
pela
ação
da
enzima
O6MGT.
Não
são
conhecidos
mutantes
humanos
para
o
gene
da
O6MGT,
entretanto
cerca
de
20%
dos
tumores
humanos
são
sensíveis
a
MNNG
e
não
possuem
atividade
O6MGT
detectável
sendo
denominados
fenotipicamente
Mer‐
(Methylation
repair
minus).
Similarmente,
a
transformação
de
células
humanas
com
vírus
tumorais
causa
um
fenótipo
deficiente
em
O6MGT,
denominado
Mex‐
(Methylation
excision
minus).
Embora
não
sejam
mutadas
no
gene
O6MGT,
a
introdução
do
gene
bacteriano
ou
humano
em
células
Mer‐
ou
Mex‐
restaura
a
resistência
a
MNNG,
o
que
indica
uma
relação
de
causa
e
efeito
entre
a
falta
de
atividade
de
O6MTG
e
a
sensibilidade
a
agentes
alquilantes.
A
O6MGT,
logicamente,
tem
um
papel
importante
na
prevenção
do
câncer.
Em
um
grande
número
de
cânceres,
a
mutação
oncogênica
resultou
de
uma
transição
G:C
para
A:T,
a
qual
pode
ter
resultado
de
uma
alquilação
de
G.
Em
verdade,
a
superexpressão
de
O6MGT
protege
camundongos
transgênicos
de
cânceres
induzidos
por
agentes
alquilantes.
Em
um
caso,
a
expressão
de
O6MGT
humana
em
camundongos
transgênicos
protegeu‐os
contra
o
linfoma
de
timo,
induzido
por
MNU.
Em
outro
caso,
a
expressão
do
gene
ada
de
E.
coli
VII
13
em
camundongos
transgênicos
protegeu
os
animais
contra
câncer
de
fígado
induzido
por
dimetil
ou
dietilnitrosamina.
A
ocorrência
de
tumores
cerebrais
em
ratos
jovens
tratados
com
etil
nitrosuréia
é
correlacionada
com
a
persistência
da
O6
alquil
guanina
no
cérebro.
Similarmente,
o
tratamento
crônico
com
MNU
especificamente
resulta
em
tumores
neurais
em
animais
experimentais
e
é
acompanhado
por
progressiva
acumulação
de
O6MeG
no
cérebro
sem
a
concomitante
acumulação
em
outros
tecidos.
Ainda
não
foi
detectada
doença
humana
associada
com
a
mutação
no
gene
da
O6MGT.
O
fenótipo
Mer‐
parece
ser
o
efeito
e
não
a
causa
da
transformação
maligna.
Transferência
de
grupamentos
alquil
por
AlkB
As
metilações
podem
ocorrer
em
14
sítios
diferentes
no
DNA
(Ver
figura
VII.7),
12
dos
quais
são
reparados
por
Ada,
AlkA
e
AlkB.
As
metilações
mais
abundantes
são
N7MeG
(70%)
e
N3MeA
(10%).
Alguns
agentes
alquilantes,
tais
como:
CH3Cl,
CH3I
e
CH3Br,
geram
metilações
em
RNA
e
DNA
em
hélice
simples
(N1MeA
e
N3MeC),
uma
vez
que
estes
sítios
estão
protegidos
na
dupla
hélice.
AlkB
é
uma
dioxigenase
α‐cetoglutarato‐Fe(II)
dependente,
que
utiliza
um
intermediário
ferro‐oxo
para
hidroxilar
N1MeA
e
N3MeC
no
DNA.
Estes
intermediários
hidroxilados
são
instáveis
e
se
decompõem,
gerando
formaldeído
e
regenerando
a
base
íntegra.
No
caso
de
N1etilAdenina
é
liberado
acetaldeído.
(Figura
VII.8)
FIGURA
VII.8
–
Reparo
de
alquilações
por
AlkB
In
vitro,
AlkB
repara
DNA
em
hélice
simples
assim
como
DNA
em
hélice
dupla
(preparado
por
anelamento
após
a
metilação).
Além
disto,
AlkB
também
é
capaz
de
retirar
o
N1metil
de
dATP,
impedindo
a
incorporação
do
precursor
metilado
durante
a
síntese
de
DNA.
O
primeiro
gene
humano
descrito
como
homólogo
ao
alkB
de
E.
coli,
foi
o
ABH1.
Entretanto,
os
resultados
obtidos
não
foram
confirmados,
embora
este
gene
possua
18,5%
de
identidade
com
alkB
e
possivelmente
tenha
uma
função
relacionada.
Posteriormente
ABH2
e
ABH3
(também
conhecido
como
DEPC‐1),
foram
descritos
e
mostraram
complementar
a
mutação
alkB
de
E.
coli.
ABH2
está
localizado
no
cromossomo
12
e
é
composto
de
4
exons
e
AHB3
está
no
cromossomo
11,
sendo
composto
de
10
exons.
As
proteínas
AHB2
e
AHB3
são
do
grupo
da
superfamília
das
dioxigenases
cetoglutarato
Fe(II)‐
dependentes,
contendo
a
seqüência
contexto
de
ligação
do
Fe(II).
VII
14
As
duas
proteínas
retiram
metil
de
N1MeA
e
N2MeC
e
ABH2
é
mais
ativa
em
N1MeA
e
ABH3
em
N3MeC
no
DNA.
Em
contraste
com
AlkB
as
proteínas
humanas
têm
muito
pouca
afinidade
por
N‐etilA.
As
proteínas
AlkB
e
ABH3
preferem
DNA
em
hélice
simples
e
RNA,
enquanto
ABH2
prefere
DNA
em
hélice
simples
e
dupla,
por
isto
AlkB
e
ABH3
reparam
eficientemente
RNA,
entretanto,
a
preferência
das
duas
proteínas
humanas
por
DNA
é
o
dobro
daquela
observada
para
RNA.
Como
as
metilações
N1MeA
e
N3MeA
são
geradas
em
DNA
em
hélice
simples,
foi
sugerido
que
AlkB
e
os
homólogos
devam
funcionar
nas
forquilhas
de
replicação
e
nos
sítios
de
transcrição.
Em
verdade,
os
mutantes
alkB
de
E.
coli
são
muito
mais
sensíveis
a
agentes
alquilantes
em
fase
exponencial
do
que
na
estacionária
de
crescimento
e
ABH2,
mas
não
ABH3,
co‐localiza
com
PCNA
(Proliferating
Cell
Nuclear
Antigen)
nos
“foci”
de
replicação.
Além
disto
alkB
também
está
associado
com
a
replicação
em
organismos
como
C.
crescentus,
aumentado
sua
expressão
durante
a
fase
S,
junto
com
outros
genes
requeridos
para
a
síntese
de
DNA.
Ainda
não
se
demonstrou
a
indução
dos
genes
humanos
pelos
tratamentos
com
agentes
metilantes
de
hélices
simples
DNA.
Reparo
de
quebras
simples
pela
ligação
direta
Na
maior
parte
das
vezes
a
reparação
das
quebras
produzidas
no
DNA
pelas
radiações
X
,
γ
e
outros
agentes
requer
o
sistema
recombinacional.
Além
disto,
os
grupamentos
deixados
normalmente
requerem
processamento
para
limpeza
das
pontas
antes
da
polimerização.
Em
E.
coli,
e
possivelmente
em
outros
organismos,
algumas
das
quebras
simples
produzidas
podem
ser
reparadas
diretamente
pela
ação
da
DNA
ligase.
A
enzima
de
E.
coli
requer
NAD
e
Mg2+
como
co‐fatores
e,
como
todas
as
DNA
ligases,
requer
pontas
livres
no
sítio
da
quebra
e
a
presença
de
3’OH
e
5’PO4.
Assim,
uma
quebra
simples
com
estas
características,
produzida
por
agentes
lesivos,
está
sujeita
ao
reparo
pela
ligação
direta
(Figura
VII.9).
FIGURA
VII.9
–
REPARO
DE
QUEBRAS
SIMPLES
‐
Esquema
do
modelo
proposto
para
ligação
direta
de
quebras
simples
no
DNA
de
E.
coli.
REPARAÇÃO
POR
EXCISÃO
Aspectos
gerais
O
isolamento
de
mutantes
de
E.
coli
B
denominados
Bs‐1
e
Bs‐2,
bastante
sensíveis
às
radiações
UV‐C,
levou,
há
mais
de
quatro
décadas,
à
proposição
da
existência
de
um
mecanismo
de
reparação
independente
VII
15
da
iluminação
e
que,
nestes
mutantes,
seria
deficiente.
Por
esta
razão,
este
mecanismo
foi
inicialmente
denominado
de
reparação
no
escuro
(“dark
repair”),
sendo
hoje
conhecido
como
reparação
por
excisão
ou
reparação
por
excisão‐ressíntese.
Este
tipo
de
reparação,
provavelmente
o
mais
importante
mecanismo
de
eliminação
de
lesões
foto,
radio
ou
quimioinduzidas,
admite
várias
vias
alternativas,
que
podem
ser
agrupados
em:
a) remoção
da
base
nitrogenada
lesada,
seguida
da
inserção
de
uma
base
idêntica,
não
lesada;
b) remoção
da
base
nitrogenada
lesada,
gerando
um
sítio
apurínico
ou
apirimidínico,
capaz
de
ser
reconhecido
por
uma
endonuclease,
que
produz
uma
quebra
na
cadeia
polinucleotídica,
seguindo‐se
a
eliminação
do
fragmento,
ressíntese
e
ligação;
c) excisão
de
um
fragmento
relativamente
curto
da
cadeia
contendo
a
lesão,
seguida
de
ressíntese
e
ligação.
d) excisão
de
um
longo
fragmento
de
cadeia,
formado
por
mais
de
1.500
nucleotídeos,
seguida
de
ressíntese
e
ligação.
REPARAÇÃO
POR
EXCISÃO
DE
BASES
(BER)
O
material
genético
é
constantemente
exposto
a
agentes
físicos
e
químicos
que
induzem
grande
variedade
de
modificações
no
DNA.
Para
evitar
que
esses
agentes
causem
mutações
ou
morte
celular
os
organismos
desenvolveram
diversos
mecanismos
para
prevenir
e
reparar
as
lesões.
Uma
grande
variedade
de
lesões
é
reparada
por
um
sistema
em
múltiplas
etapas,
denominado
reparação
por
excisão
de
bases,
composto
das
seguintes
etapas:
a) liberação
da
base
lesada
ou
mal
emparelhada
por
uma
DNA
glicosilase
específica,
b) incisão
da
cadeia
açúcar
fosfato
no
sitio
abásico
resultante,
por
uma
liase
ou
por
uma
endonuclease,
c) remoção
do
terminal
criado,
d) síntese
de
reparo
e
e) ligação
do
DNA
neossintetizado
ao
pré‐existente.
DNA
glicosilases
Bases
nitrogenadas
lesadas
pelo
tratamento
com
agentes
físicos
ou
químicos
podem
ser
removidas
pela
atuação
de
N‐glicosilases,
capazes
de
romper
a
ligação
entre
a
base
e
a
desoxirribose.
Muitas
DNA
glicosilases
reconhecem
somente
uma
forma
particular
da
lesão
da
base
e
a
maioria
das
DNA
glicosilases
é
altamente
específica
para
bases
com
uma
lesão
específica.
Elas
são
proteínas
pequenas,
com
menos
de
30
kDa
e
o
aparecimento
de
bases
livres
após
tratamento
do
DNA
com
agentes
genotóxicos
é
a
maior
demonstração
da
atividade
das
DNA
glicosilases.
Isto
normalmente
é
feito
por
análise
cromatográfica
seja
da
mistura
inteira
da
incubação
do
DNA
marcado
radioativamente
seja
da
fração
contendo
oligo
ou
mononucleotídeos
solúveis
em
ácido
ou
álcool.
O
sistema
de
excisão
de
bases
é
o
principal
sistema
para
a
reparação
de
bases
modificadas,
sítios
com
perda
de
bases,
quebras
simples
e
pequenas
lacunas
no
DNA.
Uracil
DNA‐glicosilase
(ura‐DNA‐glicosilase)
É
uma
enzima
codificada
em
E.
coli
pelo
gene
ung,
constituindo‐se
de
um
polipetídeo
de
25,6
kDa
que
remove
moléculas
de
uracil
incorporadas
ao
DNA
pela
DNA
polimerase,
que
incorpora
erradamente
uma
molécula
de
uracil
para
cada
1.000
a
10.000
timinas.
VII
16
O
uracil
também
pode
ser
formado
no
DNA
em
conseqüência
da
desaminação
da
citosina,
fenômeno
este
que
ocorre
com
elevada
freqüência
pela
ação
de
agentes
físicos
ou
químicos.
Portanto,
a
ura‐DNA‐glicosilase
tem
um
papel
relevante
em
evitar
a
mutagênese
espontânea
C:G
T:A.
Algumas
formas
de
vida
usam
o
uracil
no
DNA
(bacteriófagos
PBS1
e
PBS2
de
Bacillus
subtilis).
Estas
cepas,
entretanto,
possuem
ura‐DNA‐glicosilase.
Em
verdade,
logo
após
a
infecção
o
gene
ugi
do
fago
(inibidor
da
ura‐DNA‐glicosilase)
é
expresso,
permitindo
a
replicação
do
vírus.
A
ura‐DNA‐glicosilase
utiliza
DNA
em
hélice
dupla
ou
simples
contendo
deoxiuridina.
A
enzima
retira
o
uracil
e
“engloba‐o”
no
seu
sítio
ativo,
o
que
limita
as
lesões
reparáveis.
Entretanto,
além
do
uracil,
foi
mostrado
que
ela
também
é
capaz
de
reconhecer
5‐fluoruracil,
5,6‐dihidroxiuracil
e
5‐hidroxi‐2’‐deoxiuridina.
O
gene
UNG
humano
foi
clonado
e
codifica
uma
proteína
de
34
kDa
que
é
processada
pela
clivagem
do
N‐
terminal,
gerando
um
polipeptídeo
de
26
kDa,
que
é
funcional
tanto
no
núcleo
como
nas
mitocôndrias
e
tem
preferência
por
DNA
em
hélice
simples.
Interessantemente,
alguns
vírus,
incluindo
HSV1,
HSV2
e
varicela
zoster,
codificam
sua
própria
uracil‐DNA
glicosilase,
indicando
a
importância
desta
enzima
para
sua
manutenção.
Não
existe
doença
humana
conhecida
associada
com
defeito
em
UNG.
Hidroximetiluracil‐DNA
glicosilase
(somente
em
eucariotos)
O
hidroximetiluracil
(HmUra)
é
formado
pela
oxidação
do
grupamento
metil
da
timina
ou
pela
desaminação
da
5‐hidroximetilcitosina.
Ele
é
detectado
em
urina
de
ratos
e
de
humanos
e
é
usado
como
uma
medida
da
formação
de
lesões
oxidativas
no
DNA
nestes
organismos.
Esta
lesão
é
removida
por
uma
glicosilase
específica
presente
em
todos
os
vertebrados,
mas
não
em
procariotos,
provavelmente
porque
os
procariotos
não
têm
muitos
resíduos
5‐metilcitosina.
A
enzima
age
igualmente
em
DNA
em
hélice
simples
como
em
dupla,
em
contraste
com
a
uracil‐DNA
glicosilase,
que
prefere
DNA
em
hélice
simples
e
outras
glicosilases
que
preferem
DNA
em
hélice
dupla.
3
metil
adenina
DNA
glicosilases
(bactérias)
/
N‐metilpurina‐DNA
glicosilase
(humanos)
Quando
do
tratamento
das
células
com
agentes
alquilantes,
diversas
posições
nas
bases
são
alquiladas
e
não
são
reconhecidas
pelas
proteínas
Ada
e
Ogt.
Entre
as
bases
alquiladas,
a
3‐metil‐adenina
é
a
lesão
mais
crítica
uma
vez
que
interfere
com
a
replicação,
conduzindo
à
letalidade.
Em
E.
coli,
duas
proteínas
são
responsáveis
pela
eliminação
destas
bases,
as
enzimas
Tag
e
AlkA
(3‐metil‐
adenina
DNA
glicosilases),
codificadas
pelos
genes
tag
e
alkA,
respectivamente.
A
proteína
Tag
(21
kDa)
é
capaz
de
reparar
diversas
bases
além
da
N3MeA.
Ela
também
catalisa
a
excisão
de
3‐metilguanina,
3‐
etiladenina
e
3‐etiltioetiladenina.
A
proteína
AlkA,
além
de
remover
N3MeA
é
capaz
de
catalisar
a
eliminação
de
pelo
menos
mais
20
produtos
de
metilação,
tais
como:
3‐metilguanina,
7‐metilpurinas,
7
e
3‐etilpurinas,
O2‐metilpirimidinas,
5‐
hidroximetiluracil,
N1‐carboxietiladenina,
N7‐carboxietilguanina,
etc.
Recentemente
foi
mostrado
que
a
proteína
AlkA
também
é
capaz
de
remover
hipoxantina
(Hx,
resultante
da
desaminação
da
adenina)
e
que
a
atividade
Hx‐DNA‐glicosilase
detectada
anteriormente
em
E.
coli
e
em
células
HeLa,
em
verdade
correspondia
a
uma
das
atividades
da
proteína
AlkA
Em
células
humanas
só
foi
detectada
uma
N‐metil
purina‐DNA
glicosilase
(MPG),
que
é
uma
proteína
de
33
kDa.
A
enzima
de
mamíferos
é
funcionalmente
homóloga
à
AlkA
de
E.
coli
com
relação
à
especificidade
de
substrato,
entretanto
ela
não
tem
homologia
de
seqüência
com
Tag
nem
com
AlkA,
portanto,
o
nome
N‐metil
purina‐DNA
glicosilase
é
preferido
para
a
enzima
humana.
Entretanto,
o
nome
não
define
completamente
o
espectro
de
substratos.
A
enzima
remove
também
GO,
hipoxantina
e
1,
N6‐eteno
Adenina
da
mesma
maneira
que
N3MeA.
Os
mutantes
de
E.
coli
são
extremamente
sensíveis
aos
efeitos
mutagênicos
e
letais
dos
agentes
alquilantes,
entretanto,
em
humanos
não
foi
detectada
nenhuma
doença
associada
com
a
deficiência
de
MPG.
VII
17
DNA
glicosilases
com
atividade
AP
liase
associada
Em
reações
in
vitro
foi
detectada
uma
associação
de
eliminação
das
bases
com
concomitante
quebra
das
ligações
fosfodiéster.
Foi
mostrado
que
as
incisões
ocorrem
por
β‐eliminação
no
lado
3’
do
sítio
AP
e
foi
mostrado
também
que
esta
β‐eliminação
em
sítios
AP
pode
ser
facilitada
por
algumas
proteínas
básicas,
não
se
sabendo,
entretanto,
se
elas
são
verdadeiras
enzimas,
uma
vez
que,
a
quebra
por
endonucleases
envolve
uma
molécula
de
água,
ou
seja,
são
endonucleases
hidrolíticas.
Isto
gerou
controvérsias
acerca
das
“verdadeiras”
AP
endonucleases
e
sua
distinção
entre
proteínas
que
provocam
quebras
espúrias
no
DNA.
Química
e
estrutura
dos
sítios
AP
Os
sítios
AP
existem
no
DNA
como
uma
mistura
de
equilíbrio
contendo
cadeia
aberta
α,
β‐aldeído
insaturado,
α
e
β‐hemiacetal
e
cadeia
aberta
α,
β‐hidrato
insaturado.
Os
aldeídos
abertos
constituem
somente
1%
dos
sítios
AP,
mas
são
os
mais
reativos.
Os
sítios
AP
podem
reagir
quimicamente
levando
à
quebra
da
cadeia
na
ausência
de
proteínas.
β‐eliminação
–
Ocorre
de
duas
maneiras:
um
próton
é
transferido
do
grupo
CH2
da
desoxirribose
α‐
para
o
grupo
carbonil
do
carbono
1
ou
uma
base
de
Schiff
é
formada
entre
uma
amina
e
o
grupo
C1
carbonil
da
cadeia
aberta
do
aldeído.
Ambas
as
reações
são
seguidas
de
β‐eliminação
que
deixa
3’
α,
β‐aldeído
insaturado,
4‐hidroxi‐2‐pentenal
e
5’PO4,
sendo
este
o
mais
relevante
mecanismo
de
clivagem
nos
sítios
AP.
δ‐eliminação
–
Em
certas
condições
o
aldeído
insaturado
3’
pode
sofrer
uma
reação
adicional
de
delta
eliminação,
resultado
da
liberação
de
4‐hidroxi‐pent‐2,4‐dienal
deixando
uma
lacuna
de
um
nucleotídeo
e
terminais
3’PO4
e
5’PO4.
Rearranjo
–
Em
condições
alcalinas
o
aldeído
3’
α,
β‐
insaturado
pode
rearranjar‐se
formando
um
3’–2‐
oxociclopent‐1‐enil
terminal.
Todas
as
DNA
glicosilases
que
podem
hidrolisar
as
ligações
fosfodiéster
no
sítio
da
perda
da
base
o
fazem
por
β‐eliminação.
Portanto,
foi
sugerido
que
estas
e
outras
proteínas
que
facilitam
a
β‐eliminação
nos
sítios
AP
devem
ser
designadas
como
AP
liases
e
não
AP
endonucleases.
Na
figura
VII.10
estão
representadas
as
reações
descritas
acima.
MutY‐DNA‐glicosilase
(no
contexto
da
lesão
GO)
–
Sistema
GO
A
MutY‐DNA
glicosilase
é
uma
glicosilase
de
36
kDa
que
catalisa
a
remoção
de
adenina,
independentemente
do
estado
de
metilação
do
DNA.
É
codificada
pelo
gene
mutY
(micA).
Células
deficientes
em
MutY
são
hipermutáveis,
gerando
transversões
G:C
T:A.
O
gene
foi
clonado
e
gera
um
polipeptídeo
de
39,1
kDa
cuja
seqüência
apresenta
homologia
com
a
endonuclease
III,
produto
do
gene
nth
de
E.
coli
.
A
proteína
MutY
purificada
é
capaz
de
remover
adenina
do
DNA
contendo
A:G
ou
A:C
e
tem
associada
uma
atividade
3’AP
liase.
A
proteína
evita
a
mutagênese
potencial
das
lesões
GO
(G:C
T:A)
que
escapam
do
reparo
da
FaPy,
já
que
esta
não
reconhece
eficientemente
GO
em
frente
a
A.
Deve
ser
notado,
entretanto,
que
os
mutantes
mutY
somente
conduzem
ao
aumento
de
mutações
espontâneas
G:C
T:A
presumivelmente
porque
as
MutSLH
eliminam
C:A
e
possivelmente
G:A,
tornando
o
papel
de
MutY
redundante.
A
MutY
é
a
única
glicosilase
que
funciona
na
correção
de
erros
de
emparelhamento
de
bases
normais.
VII
18
FIGURA
VII.10
–
Três
formas
de
incisão
de
sítios
abásicos
no
DNA.
Sistema
GO
A
lesão
GO
pode
parear
tanto
com
C
como
com
A,
de
modo
que
o
sistema
GO
está
envolvido
com
a
atenuação
dos
efeitos
mutagênicos
desses
erros
de
emparalhamento.
A
observação
de
que
tanto
mutantes
fpg/mutM
como
mutY
têm
aumento
da
freqüência
de
transversões
G:C
T:A
levou
à
conclusão
que
eles
devem
participar
de
um
reparo
comum.
Em
verdade,
havia
sido
mostrado
que
a
proteína
MutY
é
capaz
de
catalisar
a
remoção
de
A
do
par
A:GO,
um
substrato
que
pode
aparecer
na
replicação
se
existirem
lesões
GO
no
DNA.
Além
disto,
a
proteína
MutY
permanece
ligada
ao
DNA
após
a
retirada
da
A
do
par
A:GO,
possivelmente
protegendo
o
sítio
GO
contra
o
ataque
da
FaPy,
evitando
quebras
duplas.
A
superexpressão
do
gene
fpg/mutM
corrige
completamente
o
fenótipo
mutante
mutY.
E
o
duplo
mutante
mutY
mutM
tem
uma
taxa
de
mutagênese
espontânea
que
é
20
vezes
maior
que
a
soma
das
taxas
dos
dois
mutantes
isoladamente.
Coletivamente
estas
observações
levaram
ao
modelo
de
reparação
das
lesões
GO
(Figura
VII.11).
VII
19
FIGURA
VII.11
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
eliminação
de
8‐oxoG
do
DNA
de
E.
coli:
A)
estrutura
química
da
base
8‐oxoG;
B)
atividade
DNA
glicosilase
de
reparo
das
enzimas
MutY
e
MutM
(Fpg)
removendo,
respectivamente,
Adeninas
incorretamente
emparelhadas
frente
a
8‐oxoG
e
8‐oxoG;
C)
atividadefosfatase
de
MutT
removendo
8‐oxoG
do
pool
citoplasmático
de
nucleotídeos
trifosfato
e
MutM
e
MutY
corrigindo,
respectivamente,
8‐oxoG:C
e
8‐oxoG:A
durante
a
replicação
do
DNA.
Se
as
lesões
GO
forem
removidas
pela
FaPy
antes
da
replicação,
o
reparo
é
efetuado
pelo
sistema
de
excisão
de
bases
normal.
Se
a
lesão
GO
não
é
eliminada
antes
da
replicação,
e
a
replicação
for
acurada,
entrará
citosina
e
a
FaPy
terá
outra
oportunidade
de
eliminar
a
lesão.
Entretanto
a
replicação
pode
levar
à
formação
do
par
A:GO.
A
excisão
de
A
pela
MutY
pode
iniciar
o
processo
de
excisão
da
hélice
não
lesada,
o
que
pode
conduzir
à
formação
do
par
C:GO,
que
é,
outra
vez,
sujeito
à
ação
da
FaPy
.
Após
a
remoção
da
A
pela
MutY,
o
ataque
a
GO
pela
FaPy
é
bloqueado
pela
ligação
de
MutY
ao
DNA.
Resta
saber
como
o
sistema
de
excisão
de
bases
consegue
contornar
este
obstáculo
e
colocar
a
base
certa.
Um
terceiro
elemento
no
sistema
GO
é
o
gene
mutT,
cujo
produto
não
é
uma
DNA
glicosilase.
A
inativação
de
mutT
causa
um
aumento
de
até
10.000
vezes
na
mutagênese
espontânea
gerando
transversões
A:T
C:G.
A
proteína
codificada
por
mutT
é
pequena
(15
kDa),
tem
uma
fraca
atividade
GTPase
trifosfatase,
mas
é
cerca
de
1.000
vezes
mais
ativa
sobre
a
8‐oxo‐dGTP
(8‐oxo‐7,8‐dihidro‐2’‐dGTP),
originada
da
oxidação
de
dGTP.
Sua
ação
gera
8‐oxo‐GMP
que
não
é
incorporada
ao
DNA.
A
inativação
de
mutT
leva
à
formação
de
A:GO
durante
a
replicação
e,
neste
caso,
a
proteína
MutY
conduz
à
mutagênese
A:T
G:C.
Em
verdade
foi
verificado
que
o
duplo
mutante
mutT
mutY
é
menos
mutável
espontaneamente
que
o
simples
mutante
mutT.
Evidentemente
a
deficiência
em
proteínas
MutY,
MutT
e
FaPy
acarreta
alta
taxa
de
mutagênese
espontânea,
devida
simplesmente
à
respiração
celular.
Em
seres
humanos
genes
semelhantes
a
mutY,
mutT
e
fpg/mutM
já
foram
detectados
e
a
não
funcionalidade
do
gene
fpg/mutM
humano
é
detectada
na
maioria
dos
cânceres
de
pulmão.
Em
células
humanas
o
sistema
GO
atua
de
maneira
semelhante
ao
descrito
para
E.
coli,
evitando
que
GO
(que
pareia
igualmente
com
A
e
C)
conduza
às
transversões
mutagênicas
GCTA
e
ATCG.
Além
disto,
o
sistema
GO
em
humanos
envolve
outros
sistemas
de
reparação
tais
como
BER,
MMR
e
NER,
como
pode
ser
vista
na
figura
VII.12.
VII
20
FIGURA
VII.12
–
Reparo
de
lesões
GO
em
mamíferos
A
proteína
MTH1
(
MTH
=
MutT
Homolog)
é
capaz
de
degradar
8‐oxo‐dGTP
assim
como
8‐oxo‐dATP
e
2
hidroxi‐dATP,
gerando
monofosfatos,
que
não
são
incorporados
ao
DNA.
A
localização
de
MTH1
é
ubíqua,
sendo
encontrada
no
núcleo,
citosol
e
mitocôndrias,
existindo
3
ou
4
variantes
(MTHa‐d)
nas
células.
Em
camundongos
mth‐/‐,
aumenta
muito
a
quantidade
de
tumores
espontâneos,
embora
as
transversões
ATCG
não
sejam
observadas
nesses
camundongos.
Entretanto
as
transversões
GCTA
aparecem
em
maior
número,
assim
como
inserções/deleções
de
1
base
em
microssatélites
de
mononucleotídeos.
A
segunda
linha
de
defesa
contra
a
lesão
GO
é
composta
de
diversas
DNA
glicosilases
que
são
capazes
de
remover
a
lesão
GO
do
DNA.
O
sistema
melhor
estudado
e
quantitativamente
dominante
é
a
OGG1
(
OGG
=
Oxo
Guanine
Glycolylase),
também
chamada
MMH
(
MutM
Homolog),
que
é
a
homóloga
humana
da
MutM/Fpg
de
E.
coli,
embora
a
homologia
ao
nível
de
aminoácidos
seja
muito
pequena.
Entretanto
é
muito
grande
com
a
de
leveduras
e
de
camundongos.
A
enzima
só
age
em
hélice
dupla
e
tem
alta
atividade
específica
para
GO
(ou
FaPyG)
emparelhados
com
C.
No
pareamento
com
A
foi
detectada
atividade
residual.
Mutações
no
gene
OGG1
assim
como
a
perda
de
heterozigose
neste
locus
foram
associadas
com
câncer
de
pulmão,
embora
a
freqüência
dessas
mutações
seja
muito
pequena.
Em
tumores
de
rim
aparecem
mais
freqüentemente
mutações
em
OGG1,
embora
mutações
no
gene
VHL,
um
supressor
localizado
ao
lado
de
OGG1
sejam
muito
mais
importantes
para
o
aparecimento
destes
carcinomas.
O
gene
humano
OGG1
codifica
duas
isoformas
da
enzima
α‐OGG1
e
β‐OGG1,
resultantes
de
“splicing”
alternativo
de
mRNA
e
as
duas
isoformas
têm
sinalização
mitocondrial,
entretanto,
somente
α‐OGG1
tem
sinalização
nuclear.
Recentemente
ortólogos
humanos
da
família
de
proteínas
Fpg/Nei
foram
detectados
e
designados
NEIL1‐
3
(NEIL
=
da
família
Fpg?Nei).
Estas
proteínas
mostraram‐se
ativas
em
pirimidinas
oxidadas
como
substrato.
Entretanto
NEIL1
mostrou
também
grande
capacidade
para
a
remoção
de
GO
do
par
GO:C
(cerca
de
10%)
de
OGG1.
VII
21
Em
células
humanas
ainda
não
se
detectaram
enzimas
para
a
remoção
de
GO
do
par
GO:A.
Entretanto,
em
leveduras,
a
proteína
Ogg2
(Ntg1)
tem
preferência
maior
para
GO:A
do
que
para
GO:C.
Em
células
HeLa
uma
proteína
com
as
mesmas
características
também
já
foi
identificada
e,
sua
atividade
é
diferente
de
NEIL1.
Adicionalmente
NEIL1
catalisa
β/δ‐eliminação
enquanto
OGG2
catalisa
somente
β‐eliminação.
As
células
de
mamíferos
estão
equipadas
com
uma
terceira
linha
de
defesa,
que
consiste
na
retirada
de
A
erroneamente
incorporada
em
frente
a
GO.
É
a
função
de
MYH
(MutY
Homolog),
uma
DNA
glicosilase
específica
para
DNA
em
hélice
dupla
que
retira
A
ou
2‐hidroxiadenina
(2‐OH‐A)
erroneamente
incorporadas
em
frente
a
G
ou
GO.
A
deficiência
de
MYH
é
associada
ao
aumento
de
mutações
somáticas
(transversões
GCTA)
em
tumores
coloretais.
MYH
é
regulada
pelo
ciclo
celular,
aparecendo
em
níveis
máximos
na
fase
S
e
co‐localiza
com
PCNA
e
também
interage
com
RPA
(Replication
Protein
A),
sugerindo
uma
ação
imediata
após
a
ação
do
sistema
BER,
como
foi
observado
para
UNG2
e
é
também
relacionada
com
a
reparação
dependente
de
PCNA,
portanto
com
o
BER
de
longos
fragmentos
(Figura
VII.12)
Dímero
de
pirimidina‐DNA‐glicosilase
(DP‐DNA‐glicosilase)
Certos
organismos
possuem
DNA
glicosilases
com
atividades
AP
liases
associadas
que
reconhecem
dímeros
de
pirimidinas
no
DNA.
A
UV‐endonuclease
de
Micrococcus
luteus
e
a
UV‐endonuclease
do
fago
T4,
codificada
pelo
gene
denV,
encontrada
em
bactérias
infectadas
são
exemplos
deste
tipo
de
enzimas.
Estas
enzimas
reconhecem
os
dímeros
e
cortam
a
ligação
glicosídica
na
posição
5'
do
dímero.
Posteriormente,
cortam
a
ligação
fosfodiéster,
deixando
uma
terminação
3'PO4.
Esta
terminação
é
removida
pelas
AP
endonucleases
e
a
DNA
polimerase
I
e
DNA
ligase
completam
a
reparação.
A
T4‐DP‐DNA‐glicosilase
(18
kDa)
é
absolutamente
específica
para
dímeros
de
pirimidina.
Em
sua
ação
AP
liase
ela
deixa
sempre
terminais
5’
(Figura
VII.13).
A
fotorreativação
libera
timina
o
que
comprova
a
ação
DNA
glicosilase.
A
de
M.
luteus
também
tem
18
kDa
e
age
da
mesma
maneira.
É
interessante
salientar
que
estas
endonucleases
podem
substituir
deficiências
de
excisão
em
E.
coli
assim
como
em
células
de
mamíferos,
entretanto
o
DNA
do
gene
denV
não
hibridiza
com
o
DNA
total
do
M.
luteus.
FIGURA
VII.13
–
Esquema
proposto
para
o
mecanismo
de
eliminação
de
dímeros
pela
PD‐DNA
glicosilase
do
bacteriófago
T4
(endo).
VII
22
DNA
endonuclease
III
(Timina
Glicol
DNA
glicosilase
ou
TG‐DNA
glicosilase)
Esta
enzima,
designada
endonuclease
III,
foi
purificada
e
mostrou
ser
uma
DNA
glicosilase/AP
liase
(β‐
eliminação)
que
ataca
lesões
de
pirimidinas,
mas
não
os
dímeros
ou
adutos
6‐4.
Ela
recebeu
numerosas
designações:
timina
glicol‐DNA
glicosilase,
uréia‐DNA
glicosilase,
endonuclease
de
raios
X,
endonuclease
de
raios
gama,
redoxiendonuclease
e
simplesmente
endonuclease.
Ela
é
capaz
de
reconhecer
resíduos
de
pirimidina
tais
como:
timina
glicol,
5,6‐dihidrotimina,
uréia,
ácido
beta‐ureidoisobutirico,
5‐hidroxi‐6‐hidrotimina,
uracil
glicol,
5,6‐dihidrouracil
e
5‐hidroxi‐6‐hidrouracil,
5‐
hidroxi‐2‐deoxicitidina
e
5‐hidroxi‐2’‐deoxiuridina
entre
outros,
como
substrato.
Recentemente
foi
reportado
que
a
endonuclease
III
também
ataca
resíduos
de
guanina
no
DNA
lesado
por
agentes
oxidantes.
A
enzima
é
codificada
pelo
gene
nth
(“endonuclease
three”)
e
tem
23,4
kDa.
Ela
tem
um
núcleo
Fe‐S
que
se
liga
ao
DNA,
conhecido
como
“dedo
de
zinco
primitivo”,
e
parece
ser
um
novo
domínio
que
aparentemente
também
existe
na
proteína
MutY.
Embora
a
maioria
das
bases
reparadas
pela
endonuclease
III
in
vitro
seja
formada
como
resultado
da
radiação
ou
oxidação,
os
mutantes
nth
não
são
mais
sensíveis
que
as
cepas
selvagens
ao
peróxido
de
hidrogênio
ou
à
radiação
ionizante.
Entretanto,
a
deficiência
neste
gene
em
E.
coli
leva
a
um
grande
número
de
mutações
espontâneas,
mostrando
a
existência
de
lesões
mutagênicas
não
reparadas
produzidas
por
agentes
endógenos.
Endonuclease
VIII
A
endonuclease
VIII
foi
purificada
em
mutantes
deficientes
em
endonuclease
III
e
mostrou
uma
atividade
TG‐DNA
glicosilase
assim
como
atividade
AP
liase.
O
gene
(nei)
foi
isolado
e
codifica
uma
proteína
similar
à
endonuclease
III,
exceto
que
ela
tem
atividade
β,
δ
liase
em
vez
de
somente
β.
Todos
os
substratos
para
endonuclease
III
são
também
para
endonuclease
VIII,
embora
ela
contribua
com
menos
de
10%
da
atividade
de
reparação
e
não
é
claro
por
que
a
E.
coli
teria
esta
enzima
redundante.
A
endonuclease
III
humana
ainda
não
foi
purificada
completamente,
entretanto,
duas
enzimas,
UV
endonuclease
I
de
43
kDa
e
II
de
28
kDa,
de
ratos,
foram
purificadas
e
são
homólogas
funcionais
da
endonuclease
III.
Estas
enzimas,
assim
como
as
humanas,
também
clivam
sítios
AP
pós
β‐eliminação.
Não
se
conhece
doença
humana
ou
modelo
animal
associado
com
a
deficiência
em
endonuclease
III.
FaPy
glicosilase/
Fpg/MutM‐DNA‐glicosilase
/8‐hidroxiguanina‐DNA
glicosilase
A
7‐metil‐guanina
é
a
mais
abundante
lesão
produzida
por
agentes
metilantes.
Este
aduto
não
é
letal,
mas
a
metilação
pode
levar
à
abertura
do
anel
imidazol
conduzindo
à
formação
de
2,6‐diamino‐4‐hidroxi‐5‐
(metil)formamidopirimidina
(FaPy),
que
inibe
a
replicação,
podendo
ser
letal.
Em
E.
coli,
a
glicosilase
Fpg/MutM
(formamidopirimidina‐DNA‐
glicosilase
ou
FaPy
glicosilase),
codificada
pelo
gene
fpg/mutM
elimina
esta
base
lesada,
sendo
também
capaz
de
eliminar
a
4,6‐diamino‐5‐
formamidopirimidina
gerada
pela
irradiação
com
raios
X
ou
γ
e
por
tratamentos
com
agentes
oxidantes
como
o
peróxido
de
hidrogênio.
Estudos
subseqüentes
mostraram
que
a
FaPy
e
outra
enzima
(8‐hidroxiguanina
endonuclease
ou
8‐oxoG‐DNA
glicosilase),
que
reconhece
8‐hidroxiguanina
(ou
GO)
no
DNA
eram
idênticas.
O
gene
fpg/mutM
foi
clonado
e
a
proteína
gerada
(31
kDa)
só
age
no
DNA
em
hélice
dupla.
Os
mutantes
fpg/mutM,
embora
não
sejam
sensíveis
às
radiações
ionizantes
ou
agentes
alquilantes,
demonstram
uma
taxa
um
pouco
elevada
de
mutagênese
espontânea
(transversão
G:C
T:A).
A
glicosilase
Fpg/MutM
difere
das
demais,
já
que
tem
uma
AP
liase
classe
I
associada,
que
faz
β,δ‐
eliminação
e
uma
atividade
desoxirribofosfodiesterase
(dRPase).
Assim,
a
FaPy
mesmo
tendo
muitas
ações
não
consegue
liberar
a
base,
clivar
a
cadeia
e
processar
os
terminais
para
a
síntese
de
reparação,
já
que
deixa
um
terminal
3’PO4,
que
necessita
uma
3’–diesterase
para
sua
remoção.
A
ação
de
FaPy
forma
uma
base
de
Schiff
intermediária,
um
mecanismo
idêntico
ao
descrito
para
a
endonuclease
III.
O
significado
biológico
para
as
atividades
AP
liase
e
dRPase
associadas
a
FaPy
ainda
não
é
conhecido.
VII
23
Além
das
lesões
citadas,
recentemente
foi
mostrado
que
a
FaPy
também
é
capaz
de
reconhecer
5‐
hidroxicitosina,
5‐hidroxiuracil
e
anéis
imidazol
abertos
contendo
aminofluoreno
ou
aflatoxina.
Uma
das
mais
abundantes
lesões
induzidas
no
DNA
pelas
radiações
ionizantes
e
estresses
oxidativos
é
a
7,8‐dihidro‐o‐oxoguanina
(GO).
A
8‐oxoG‐DNA
glicosilase
foi
primeiro
identificada
em
E.
coli
como
uma
atividade
que
liberava
formamido
pirimidinas
(geradas
como
produtos
secundários
de
purinas
alquiladas)
do
DNA.
A
enzima
foi
denominada
FaPy
e
o
gene
fpg/mutM
foi
clonado.
Mais
tarde
foi
detectado
que
ela
é
a
enzima
responsável
pela
eliminação
de
GO
no
DNA
de
E.
coli
e
de
células
de
mamíferos.
Esta
lesão,
a
GO,
é
uma
fonte
importante
de
mutações
espontâneas
e
a
expressão
do
gene
fpg/mutM
de
E.
coli
em
células
de
mamíferos
protege‐as
contra
a
mutagênese
induzida
pelos
raios
X.
Isto
pode
explicar
porque
tanto
em
procariotos
como
em
eucariotos
existem
quatro
mecanismos
para
a
eliminação
de
GO:
a)
Uma
8‐oxoGTPase
(MTH)
(MutT
Homolog),
que
hidrolisa
8‐oxodGTP
do
“pool”
de
nucleotídeos,
gerando
8‐
oxodGMP,
impedindo
sua
incorporação
no
DNA;
b)
A
8‐oxoG
DNA
glicosilase
que
remove
a
base
oxidada
do
DNA;
c)
A
metil
purina‐DNA
glicosilase
(MPG),
que
remove
GO
por
ação
glicosídica
e
d)
Uma
DNA
glicosilase,
MutY
em
E.
coli
e
MYH
em
humanos
que
remove
o
resíduo
adenina
do
par
GO:A.
A
lesão
GO
pareia
com
A
em
alta
freqüência
e
embora
o
par
GO:C
seja
um
bom
substrato
para
a
DNA
glicosilase,
o
par
GO:A
não
é.
Além
disto,
a
DNA
glicosilase
MYH
ajuda
a
reparação
da
lesão
GO
indiretamente,
iniciando
uma
reação
de
reparo
que
converte
GO:A
em
GO:C.
A
Fpg/MutM
de
E.
coli
é
um
monômero
de
30
kDa
e
tem
um
“dedo
de
zinco”,
responsável
pela
sua
afinidade
pelo
DNA.
A
enzima
libera
a
base
por
uma
ação
glicosídica
e
então
o
sítio
AP
é
clivado
por
β
e
δ‐
eliminação.
A
enzima
humana
também
libera
a
base
e
a
desoxirribose
em
uma
reação
em
duas
etapas.
Quando
o
cDNA
do
gene
MTH
é
expresso
em
mutantes
mutT
de
E.
coli
verifica‐se
aumento
significativo
de
atividade
8‐oxo‐dGTPase,
e
grande
diminuição
da
mutagênese
espontânea,
característica
destas
cepas.
A
proteína
codificada
tem
156
aminoácidos
e
homologia
com
a
proteína
MutT
de
E.
coli.
O
gene
MYH
contém
15
introns
e
7,1
kb.
Os
16
exons
codificam
uma
proteína
(MYH)
de
535
aminoácidos
(65
kDa),
com
41%
de
identidade
com
a
proteína
MutY
de
E.
coli.
O
gene
humano
mapeia
no
cromossomo
1,
entre
p32.1
e
p34.3.
Em
células
humanas
a
proteína
homóloga
de
FaPy
foi
denominada
OGG1,
entretanto
ela
tem
muito
pouca
homologia
com
a
proteína
bacteriana.
O
gene
OGG1
foi
localizado
no
cromossomo
3
entre
p25
e
p26,
em
uma
região
comumente
deletada
em
cânceres
de
pulmão.
Ele
pode,
possivelmente,
funcionar
como
um
gene
humano
supressor
de
tumores
e
a
perda
parcial
ou
total
das
proteínas
humanas
OGG1
pode
predispor
as
células
para
a
transformação
oncogênica,
como
visto
anteriormente.
AP
ENDONUCLEASES
Os
sítios
AP
podem
aparecer
espontaneamente
pela
hidrólise
da
ligação
glicosídica
e,
diversos
estudos
estimaram
que
mais
de
25.000
sítios
AP
são
gerados
por
dia
por
célula
humana
em
condições
fisiológicas
normais.
Um
mecanismo
alternativo
para
a
incisão
do
DNA
durante
o
reparo
por
excisão
de
bases
pode
ser
a
hidrólise
das
ligações
glicosídicas
seguida
da
hidrólise
da
ligação
fosfodiéster
catalisada
por
uma
5’
AP
endonuclease
deixando
terminais
3’OH
e
5’PO4,
portanto,
as
AP
liases
in
vivo
devem
ter
um
papel
secundário
na
incisão
do
DNA
nos
sítios
AP.
As
AP
endonucleases
clivam
as
ligações
fosfodiéster
adjacentes
aos
sítios
AP.
As
enzimas
da
classe
I
clivam
a
ligação
3’,
e
as
de
classe
II
clivam
a
ligação
5’
do
açúcar
abásico.
Todas
as
enzimas
de
classe
I
conhecidas
são
glicosilases
com
AP
liases
associadas.
As
de
classe
II
não
têm
AP
glicosilases
associadas
e
são
as
“verdadeiras”
AP
endonucleases.
AP
endonucleases
em
E.
coli
VII
24
Exonuclease
III
A
exonuclease
III
foi
caracterizada
como
uma
3’
→
5’
exonuclease
(necessita
de
terminal
3’OH
e
dupla
hélice)
com
uma
atividade
fosfatase
associada.
Além
destas
ações
ela
também
degrada
copolímeros
mistos
de
ribo
e
deoxiribonucleotídeos,
o
que
corresponde
a
uma
atividade
RNaseH.
A
exonuclease
III
tem
também
uma
atividade
fosfodiesterase
que
remove
resíduos
3’‐fosfoglicolato
do
DNA.
Esta
atividade
pode
também
remover
os
resíduos
aldeído
3’
α,
β
insaturados
gerados
após
a
β‐eliminação
nos
sítios
AP.
Isto
pode
ser
mostrado
pois
a
exonuclease
III
pode
ativar
o
DNA
incisado
pela
AP
liase
da
endonuclease
III
para
servir
de
“primer‐template”
para
a
PolI
de
E.
coli.
Além
disto
a
enzima
também
tem
uma
atividade
5’
AP
endonuclease,
que
antes
de
ser
caracterizada
foi
denominada
de
endonuclease
II
e
também
endonuclease
VI.
A
exonuclease
III,
produto
do
gene
xthA,
é
uma
proteína
de
28
kDa
e
a
atividade
endonuclease
tem
necessidade
absoluta
de
Mg2+
e
é
inibida
em
presença
de
EDTA.
A
enzima
catalisa
a
hidrólise,
em
hélice
dupla,
de
sítios
AP
no
lado
5’
da
perda
da
base
deixando
terminais
3’OH
e
5’dRPO4.
A
presença
de
diversas
funções
catalíticas
associadas
a
uma
pequena
proteína
sugerem
que
um
único
sitio
ativo
catalise
todas
as
reações
enzimáticas
da
exonuclease
III,
através
de
três
importantes
domínios
em
sua
estrutura.
Um
é
o
sítio
ativo
que
catalisa
a
clivagem
das
ligações
fosfodiéster
em
uma
das
hélices
do
DNA.
O
segundo
reconhece
a
estrutura
de
dupla
hélice
e
o
terceiro
reconheceria
o
espaço
deixado
pela
base
retirada,
facilitando
a
função
AP
endonuclease.
O
papel
biológico
da
atividade
AP
endonuclease
da
exonuclease
III
ainda
não
é
claro,
mas
os
mutantes
xthA
são
sensíveis
ao
peróxido
de
hidrogênio
e
às
radiações
UV
longas
que
produzem
lesões
oxidativas
no
DNA.
A
natureza
das
lesões
responsáveis
por
tal
fenótipo
não
é
conhecida,
mas,
os
radicais
livres
produzidos
pelo
peróxido
de
hidrogênio
podem
gerar
quebras
simples
com
terminais
3’PO4
e
a
exonuclease
III
é
responsável
por
mais
de
99%
da
atividade
3’‐fosfatase
em
E.
coli.
Além
disto,
a
exonuclease
III
também
ataca
DNA
contendo
produtos
de
fragmentação
de
timina
como
resíduos
de
uréia,
sugerindo
que
esta
enzima
tem
um
papel
no
reparo
de
lesões
oxidativas.
Mutações
no
gene
katF
(rpoS),
também
resultam
em
sensibilidade
aumentada
à
radiação
UV
longo
e
peróxido
de
hidrogênio.
Este
gene
codifica
o
fator
sigma
(σ
)
e
a
sua
deficiência
elimina
a
expressão
da
exonuclease
III,
sugerindo
de
o
gene
xthA
seja
regulado
por
katF.
Endonuclease
IV
A
endonuclease
IV
foi
identificada
como
uma
AP
endonuclease
resistente
a
EDTA.
Entretanto,
em
ausência
do
substrato
(DNA),
a
endonuclease
IV
pode
ser
inativada
por
pré‐incubação
com
agentes
quelantes
de
metais,
tais
como:
EDTA
ou
1,10‐fenantrolina,
sugerindo
que
a
enzima
contém
um
componente
metálico
essencial.
Parecida
com
a
atividade
da
exonuclease
III,
a
endonuclease
IV
ataca
as
ligações
fosfodiéster
no
lado
5’
da
perda
da
base,
deixando
grupos
3’OH.
Adicionalmente
ela
também
pode
remover
fosfoglicoaldeído,
3’‐
fosfato,
desoxirribose‐5‐fosfato
e
resíduos
4‐hidroxi‐2‐pentenal
do
terminal
3’
do
DNA
dupla
fita.
Ela
também
tem
uma
ação
contra
resíduos
de
uréia.
Em
verdade,
a
única
diferença
é
que
a
exonuclease
III
tem
uma
ação
3’‐exonuclease
que
não
está
presente
na
endonuclease
IV.
O
gene
que
codifica
a
endonuclease
IV
é
o
nfo
(“endonuclease
four”),
e
a
proteína
tem
31,6
kDa.
Os
mutantes
deficientes
em
endonuclease
IV
são
sensíveis
a
MMS,
mitomicina
C
e
aos
agentes
oxidantes
tert‐butil
hidroperóxido
e
bleomicina.
Em
mutantes
duplos
nfo
xthA
a
sensibilidade
a
estes
agentes
e
às
radiações
ionizantes
é
aumentada.
Os
mutantes
nfo
são
mais
sensíveis
ao
tert‐butil
hidroperóxido
e
à
bleomicina
que
os
mutantes
xthA
sugerindo
que
a
endonuclease
IV
pode
reconhecer
algumas
lesões
que
não
são
reconhecidas
pela
exonuclease
III.
Em
verdade,
recentemente,
foi
detectado
que
a
bleomicina
gera
uma
lesão
específica
no
DNA
que
requer
a
endonuclease
IV
para
um
reparo
eficiente.
VII
25
Agentes
químicos
como
paraquat
e
menadiona,
que
são
reduzidos
enzimaticamente
in
vivo
via
transferência
de
um
elétron
e
então
autooxidados
gerando
radicais
superóxido,
induzem
aumento
de
10
a
20
vezes
no
nível
de
endonuclease
IV.
A
endonuclease
IV
também
é
induzida
quando
as
células
deficientes
em
superóxido
dismutase
são
cultivadas
em
presença
de
oxigênio
puro,
e
esta
indução
é
independente
do
gene
oxyR
que
controla
o
regulon
de
estresse
oxidativo
induzido
por
peróxido.
A
endonuclease
IV
está
presente
nas
células
em
níveis
dez
vezes
menores
que
a
exonuclease
III,
entretanto
chega
a
níveis
equivalentes
à
exonuclease
III
após
tratamento
das
células
com
agentes
que
geram
superóxido
ou
pelo
oxido
nítrico,
que
ativam
o
regulon
SoxRS.
Na
figura
VII.14
estão
representadas
as
diferentes
vias
de
cortes
do
DNA
pelas
AP
liases
e
AP
endonucleases.
FIGURA
VII.14
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
as
formas
de
corte
na
cadeia
de
DNA
nas
diferentes
vias
de
excisão
de
bases:
hidrólise
da
ligação
N‐glicosídica
pelas
DNA
glicosilases;
atividade
desoxirribofosfodiesterase
das
AP‐endonucleases
e
atividade
de
β‐eliminação
das
AP‐liases.
Recentemente
foi
detectado
que
a
endonuclease
IV
também
é
capaz
de
clivar
o
DNA
do
lado
5’
de
algumas
pirimidinas
oxidadas,
independentemente
da
ação
das
glicosilases,
mecanismo
denominado
de
reparo
por
incisão
de
nucleotídeos.
AP
endonucleases
em
eucariotos
As
AP
endonucleases
clivam
as
ligações
fosfodiéster
adjacentes
aos
sítios
AP.
As
enzimas
da
classe
I
clivam
a
ligação
3’,
e
as
de
classe
II
clivam
a
ligação
5’
do
açúcar
abásico.
Todas
as
enzimas
de
classe
I
conhecidas
são
DNA
glicosilases/AP
liases.
As
de
classe
II
não
têm
atividades
AP
glicosilases
associadas.
Em
E.
coli
existem
duas
AP
endonucleases
de
classe
II
bem
caracterizadas,
a
exonuclease
III
e
a
endonuclease
IV.
A
exonuclease
III,
como
o
próprio
nome
indica
tem
uma
potente
atividade
3’→5’
exonuclease
específica
para
DNA
em
hélice
dupla.
A
endonuclease
IV
não
tem
outra
atividade
conhecida,
além
de
AP
endonuclease.
VII
26
Em
eucariotos
há
uma
dicotomia:
em
leveduras
existem
duas
AP
endonucleases
(Apn1
e
Apn2)
que
são
estruturalmente
e
funcionalmente
semelhantes
à
endonuclease
IV,
enquanto
em
Drosófila
e
em
humanos
existe
uma
endonuclease
estrutural
e
funcionalmente
homóloga
à
exonuclease
III.
Os
sítios
AP
bloqueiam
a
transcrição
e
a
replicação
sendo,
portanto,
citotóxicos
e
altamente
mutagênicos.
As
AP
endonucleases
realizam
duas
funções:
elas
eliminam
os
sítios
AP
gerados
pelas
DNA
glicosilases,
ou
perda
espontânea
de
bases
(depurinações
que
ocorrem
com
alta
freqüência),
posteriormente,
elas
“limpam”
os
terminais
3’
das
quebras
geradas
por
espécies
ativas
de
oxigênio
e
radiações
ionizantes.
Tais
quebras,
normalmente
deixam
3’‐fosfoglicolato
ou
3’‐fosfato.
As
AP
endonucleases
de
classe
II
eliminam
essas
espécies
gerando
um
terminal
3’‐OH
que
pode
ser
usado
pela
DNA
polimerase.
A
AP
endonuclease
humana
(APE
=
AP
Endonuclease,
HAP1,
APEX,
REF1)
é
um
monômero
de
36
kDa,
com
um
alto
grau
de
identidade
com
a
exonuclease
III
de
E.
coli
e
em
adição
à
atividade
5’AP
endonuclease
ela
também
tem
uma
atividade
3’→5’
exonuclease
específica
para
DNA
em
hélice
dupla.
Sua
atividade
exonucleásica
é
menor
do
que
a
de
E.
coli.
A
enzima
humana
tem
uma
função
adicional.
Ela
reduz
e
portanto
ativa
os
fatores
de
transcrição
FOS
e
JUN
através
do
resíduo
de
cisteína
na
metade
N‐terminal
da
APE,
daí
o
nome
fator
de
redução
1
(REF1).
A
enzima
bacteriana
não
pode
substituir
esta
função.
Não
se
conhece
doença
humana
associada
a
mutações
neste
gene.
O
gene
HAP1
(HAP
=
Human
AP)
é
constituído
por
5
exons
e
mapeia
no
cromossoma
14q11.2‐12.
A
seqüência
de
aminoácidos
da
proteína
tem
homologia
com
a
exonuclease
III
de
E.
coli,
BAP1
de
bovinos,
APEX
de
camundongos
e
RRP1
de
Drosófila.
Mutantes
duplos
dut
xth(Ts)
de
E.
coli,
inviáveis
a
420C
por
serem
incapazes
de
reparar
sítios
AP
causados
pela
excisão
de
uracil,
podem
ser
recuperados
pelo
gene
HAP1
humano.
Entretanto,
HAP1
não
complementa
nenhum
dos
fenótipos
de
mutantes
nfo.
O
polipeptídeo
codificado
por
HAP1
mostrou
ser
o
mesmo
da
proteína
regulatória
nuclear
chamada
REF1,
um
fator
redox
que
se
acredita
regular
o
fator
de
transcrição
AP1
do
heterodímero
Fos‐Jun
através
da
redução
de
um
resíduo
de
cisteína
localizado
no
domínio
de
ligação
ao
DNA.
O
domínio
N‐terminal
de
61
aminoácidos
da
proteína
humana
que
não
é
conservado
nos
outros
organismos
e
que
também
é
dispensável
para
a
função
AP
endonuclease,
é
essencial
para
a
atividade
de
ligação
ao
DNA
da
proteína
JUN
oxidada.
EVENTOS
PÓS‐INCISÃO
DNA
desoxiribofosfodiesterase
de
E.
coli.
Para
completar
a
excisão
o
processo
requer
a
remoção
do
resíduo
5’‐desoxirribose
fosfato.
Em
E.
coli
foi
detectada
uma
proteína
designada
DNA‐desoxirribofosfodisterase
(dRPase)
de
50‐55
kDa
que
cliva
por
hidrólise
o
2‐desoxirribo‐5’‐fosfato.
Preparações
altamente
purificadas
de
dRPase
parecem
ser
idênticas
ao
produto
do
gene
recJ
de
E.
coli,
um
gene
implicado
no
reparo
recombinacional
e
na
correção
de
erros
de
emparelhamento,
com
uma
atividade
exonuclease
5’
→
3’
para
hélice
simples.
A
ação
combinada
de
DNA
glicosilases,
AP
endonucleases
e
dRPase
deve
deixar
uma
lacuna
de
um
nucleotídeo
no
DNA
que
pode
ser
fechado
por
uma
das
DNA
polimerases.
Em
verdade,
quando
oligonucleotídeos
contendo
um
simples
resíduo
dUMP
são
incubados
com
extratos
de
E.
coli
ou
células
humanas
o
tamanho
do
evento
de
reparo
é
de
um
nucleotídeo.
No
caso
das
terminações
deixadas
pela
Endonuclease
III,
aparentemente
tanto
a
PolI
como
a
PolIII,
com
sua
ação
5’→3’
exonuclease
são
capazes
de
realizar
o
término
da
reparação,
e
talvez
por
isso
o
fago
T4
irradiado
com
UV
tenha
uma
sobrevivência
reduzida
em
hospedeiras
deficientes
em
PolI
comparada
com
a
obtida
na
cepa
selvagem.
Células
de
mamíferos
contêm
N‐glicosilases
e
AP‐endonucleases,
que
parecem
atuar
por
mecanismos
análogos
aos
observados
em
E.
coli;
da
mesma
forma,
uma
insertase
para
purinas
já
foi
isolada
destas
células
e
VII
27
uma
dRPase
também
foi
parcialmente
purificada
de
células
humanas.
Ela
tem
massa
molecular
de
47kDa
e
está
localizada
no
núcleo.
Síntese
de
reparo
DNA
polimerase
I
de
E.
coli
(PolI)
É
uma
proteína
com
109
kDa,
produto
do
gene
polA,
que
tem
funções
catalíticas
para
polimerização
do
DNA
na
direção
5’→3’,
pirofosforólise,
troca
PPi,
degradação
exonucleolítica
3’→5’
e
degradação
exonucleolítica
5’→3’.
Ela
tem
uma
propriedade
única
que
é
a
capacidade
promover
a
replicação
a
partir
de
uma
incisão,
sem
necessidade
de
outras
proteínas,
e
sua
atividade
exonucleolítica
5’→3’
pode
excisar
fragmentos
contendo
mais
de
10
nucleotídeos.
Além
disto,
um
ciclo
de
aproximadamente
20
etapas
de
polimerização
ocorre
antes
que
a
enzima
se
dissocie
lentamente
da
fita
molde.
Na
digestão
proteolítica
da
PolI
são
detectados
dois
fragmentos:
o
Klenow
(carboxi
terminal)
que
contém
a
função
editorial
3’→5’
e
o
pequeno
fragmento
que
possui
a
atividade
exonuclease
5’→3’
envolvida
na
degradação
da
porção
do
RNA
dos
fragmentos
de
Okazaki
e
separação
da
hélice
5’
durante
a
translação
de
quebras.
A
abundância
relativa
de
PolI
(200‐400
moléculas/célula)
comparada
com
a
PolII
(40
moléculas/célula)
e
PolIII
(10‐20
moléculas/célula)
também
sugere
um
papel
da
PolI
I
na
síntese
de
reparo.
No
entanto,
todas
as
polimerases
são
capazes
de
funcionar
in
vivo
e
in
vitro
no
DNA
com
lacunas
criadas
pelo
sistema
endonucleolítico
UvrABC
(ver
adiante).
DNA
polimerase
II
de
E.
coli
(PolII)
Esta
enzima,
produto
do
gene
polB
(90
kDa),
não
tem
atividade
exonucleásica
5’→3’,
necessitando
de
lacunas
de
perto
de
100
nucleotídeos
para
sua
ação.
O
gene
clonado
de
polB
mostrou
ser
o
dinA,
um
dos
diversos
genes
sob
controle
do
regulon
SOS
recA/lexA
(Ver
adiante).
DNA
polimerase
III
de
E.
coli
(PolIII)
A
DNA
polimerase
III
é
um
dímero
com
dois
complexos
multiprotéicos
com
10
subunidades
diferentes
e
tem
atividades
exonuclease
3’→5’
e
5’→3’.
A
DNA
polimerase
III
não
consegue
degradar
dinucleotídeos
e
requer
um
substrato
em
hélice
simples
para
sua
ação
exonucleásica
5’→3’.
Uma
forma
pequena
da
subunidade
β
da
PolIII(β*)
é
sintetizada
em
resposta
à
radiação
UV
e
este
fator
pode
agir
como
uma
unidade
alternativa
da
DNA
polimerase
III
durante
a
síntese
com
erros.
A
DNA
polimerase
III
é
necessária
para
o
reparo
correto
das
lesões
de
H2O2
e
MMS.
DNA
ligase
de
E.
coli
Para
que
a
reparação
se
complete,
a
DNA
polimerase
I
insere
alguns
nucleotídeos
(10
a
20)
na
lacuna
deixada
pelas
AP
endonucleases
e
a
DNA
ligase
completa
a
reparação.
A
DNA
ligase,
produto
do
gene
ligA
tem
77kDa
e
catalisa
aproximadamente
25
ligações
por
minuto
de
terminais
3’OH‐
5’PO4,
e
existem
de
200
a
400
moléculas/célula.
Na
figura
VII.15
está
representado
o
processo
geral
de
reparação
por
excisão
de
bases
em
E.
coli.
VII
28
FIGURA
VII.15
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
o
reparo
por
excisão
de
bases
em
E.
coli.
O
mecanismo
BER
em
mamíferos
Em
células
de
mamíferos
o
reconhecimento
das
lesões
é
feito
por
12
diferentes
glicosilases
caracterizadas
por
diferentes
substratos,
especificando
seus
modos
de
ação
(Tabela
VII.1)
Tabela
VII.1
–
DNA
glicosilase
em
humanos
Glicosilase
Especificidade
MBD4
U
e
T
na
frente
de
G
MPG
3‐MeA,
7‐MeG,
3‐MeG
etenoA,
hipoxantina
MYH
A
na
frente
8‐OxoG
NEIL1
Formamidopirimidina,
pirimidinas
oxidadas
(ex.
timina
glicol)
NEIL2
5‐hidroxiuracil:
hidroxicitosina
NEIL3
Pirimidinas
fragmentadas
e
oxidadas
NTH1
Pirimidinas
com
anel
saturado,
oxidadas
e
fragmentadas
OGG1
8‐OxoG
pareada
com
C,
T
e
G
OGG2
8‐OxoG
em
frente
de
G
e
A
SMUG1
Uracil
TDG
U,
T
ou
etenoC
na
frente
de
GT
na
frente
de
G,
C
e
T
UDG2
U
na
frente
de
A
UNG
Uracil
VII
29
As
do
tipo
I
removem
a
base,
gerando
um
sítio
AP
(Ex.
MPG),
enquanto
as
do
tipo
II
removem
a
base
e
subseqüentemente
clivam
o
sítio
AP
por
uma
atividade
3’endonuclease
(AP
liase)
gerando
quebras
simples
(Ex.
OGG1).
Após
a
ação
das
glicosilases
do
tipo
I
a
incisão
no
sítio
AP
ocorre
por
AP
endonucleases
[APE1
(APEx,
REF1
ou
HAP1)],
resultando
em
5’dRPO4
e
3’OH.
A
endonuclease
APE1
é
estimulada
por
XRCC1
(XRCC
=
X
Rays
Cross
Complementating)
e
o
resíduo
pode
ser
na
forma
de
furanose
ou
aldeído.
Basicamente
as
células
de
mamíferos
utilizam
duas
maneiras
distintas
de
completar
a
reparação
por
excisão
de
bases.
No
primeiro
caso
há
a
inserção
de
um
único
nucleotídeo,
através
da
Polβ
que,
após
essa
inserção,
retira
o
5’dRPO4,
já
que
ela
tem
atividade
liase
e
pode
liberar
a
forma
hemiacetal
do
5’dRPO4
por
β
eliminação.
Entretanto,
a
Polβ
também
age
na
reparação
em
longos
fragmentos,
inserindo
o
primeiro
nucleotídeo
nos
sítios
AP
reduzidos.
A
remoção
do
5’dRPO4
após
a
remoção
do
primeiro
nucleotídeo
é
o
ponto
de
decisão
entre
BER
curto
(1
nucleotídeo)
e
longo
(10‐13
nucleotídeos).
Sítios
AP
oxidados
ou
reduzidos,
aldeídos
3’‐insaturados
ou
3’
fosfatos
são
resistentes
à
β‐eliminação
pela
Polβ,
portanto,
após
a
inserção
do
primeiro
nucleotídeo
ela
se
dissocia
e
o
processamento
agora
depende
de
PCNA,
o
que
ocorre
com
aproximadamente
25%
das
lesões.
A
síntese,
após
a
dissociação
de
Polβ
é
processada
por
Polε
e
Polδ
junto
com
PCNA
e
RFC
(Replication
Factor
C),
resultando
na
incorporação
de
mais
de
10
nucleotídeos.
A
remoção
da
estrutura
resultante
(5’‐
dRPflap)
é
realizada
pela
FEN1
(FEN=
Flap
ENndonuclease)
estimulada
por
PCNA.
A
ligação,
neste
caso
é
feita
pela
DNA
ligase
I,
que
interage
com
Polβ
e
PCNA.
No
caso
anterior,
em
que
somente
1
nucleotídeo
é
incorporado,
a
ligação
é
feita
pela
DNA
ligase
III,
que
interage
com
a
Polβ
,
XRCC1
e
PARP
[poli(ADP‐ribose)polimerase‐1].
É
interessante
salientar
que
a
proteína
p53
estimula
BER
“in
vitro”
pela
interação
direta
com
APE
e
Polβ,
estabilizando
a
ligação
de
Pol
β
aos
sítios
AP.
Na
figura
VII.16
estão
representados
os
modelos
propostos
para
a
reparação
de
bases
em
células
de
mamíferos.
REPARAÇÃO
POR
EXCISÃO
DE
NUCLEOTÍDEOS
(NER)
A
reparação
por
excisão
de
nucleotídeos
consiste
em
uma
série
de
reações
enzimáticas
requeridas
para
remover
virtualmente
qualquer
lesão
do
DNA,
incluindo
a
maioria,
senão
todas,
as
removíveis
pela
reparação
por
excisão
de
bases.
Os
nucleotídeos
lesados
são
excisados
como
fragmentos
de
tamanho
fixo,
independentemente
da
natureza
da
lesão.
O
mecanismo
é
constituído
de
5
etapas
gerais:
reconhecimento
da
lesão,
incisão,
excisão,
síntese
de
reparo
e
ligação.
O
sistema
é
constituído
de
dois
mecanismos,
denominados:
reparo
genômico
global
(GGR)
e
reparo
acoplado
à
transcrição
(TCR).
O
GGR
é
independente
da
transcrição
e
remove
lesões
de
partes
do
genoma
que
não
estão
sendo
transcritas
e
da
fita
que
não
é
transcrita.
O
TCR
promove
a
remoção
de
danos
nos
genes
ativamente
transcritos.
No
reparo
global
em
E.
coli,
as
duas
primeiras
etapas
deste
processo
são
feitas
por
um
conjunto
de
três
proteínas,
UvrA,
UvrB
e
UvrC
codificadas
pelos
genes
uvrA,
uvrB
e
uvrC,
em
uma
série
de
reações
dependentes
da
hidrólise
de
ATP.
O
sistema
UvrABC
possui
um
amplo
espectro
de
especificidade
de
substratos
e
foi
proposto
que
ele
reconheça
modificações
da
conformação
do
DNA
e
não
necessariamente
as
bases
modificadas.
Em
estudos
realizados
na
década
de
60
sobre
a
reparação
de
dímeros
de
pirimidinas,
formados
no
DNA
pelas
radiações
ultravioleta
germicidas,
utilizando
cepas
resistentes
(E.
coli
B/r
e
K‐12)
e
os
mutantes
sensíveis
Bs‐1
e
AB1886
(uvrA),
foi
mostrado
que
os
dímeros
eram
removidos,
em
ausência
de
luz,
nas
cepas
resistentes
(uvr+)
mas
não
nos
mutantes
sensíveis
(uvr‐),
sendo
o
processo
designado
de
reparo
por
excisão,
já
que,
VII
30
diferentemente
da
fotorreativação,
em
que
não
se
verificavam
incisões,
neste
caso
as
incisões
eram
detectadas
após
a
irradiação
com
UV‐C.
Figura
VII.16
–
Reparo
por
excisão
de
base
em
mamíferos
Posteriormente
foi
verificado
que
nenhum
dos
mutantes
uvrA,
uvrB
ou
uvrC
eram
capazes
de
remover
dímeros
de
pirimidinas
do
seu
DNA
e
que
estes
mutantes
eram
também
sensíveis
a
outros
agentes
como:
alquilantes
bifuncionais,
ácido
nitroso,
mitomicina
C,
etc.
O
sistema
UvrABC
também
atua
na
reparação
de
lesões
produzidas
no
DNA
de
fagos
que
infectem
a
célula
bacteriana.
Assim,
a
capacidade
infecciosa
de
fagos
como
o
T1,
T3,
T7
e
λ,
se
previamente
lesados
pela
radiação
UV,
é
bem
maior
em
células
que
possuem
reparação
por
excisão
que
nos
mutantes
nela
deficientes,
fenômeno
que
constitui
a
reativação
pela
célula
hospedeira
(host
cell
reactivation
‐
hcr).
Este
tipo
de
reparação
não
ocorre
em
mutantes
uvrA,
B
ou
C,
e
é
bloqueado
por
determinados
compostos
que
atuam
sobre
o
sistema
UvrABC
de
E.
coli,
como
a
acriflavina
ou
a
cafeína.
Mediante
o
emprego
de
técnicas
de
seqüenciamento
de
bases
nitrogenadas
do
DNA,
acopladas
à
digestão
enzimática
de
fragmentos
contendo
extremidades
marcadas
com
um
precursor
radioativo,
foi
mostrado
que
o
sistema
UvrABC
é
capaz
de
produzir
duas
roturas
na
cadeia
polinucleotídica.
Quando
a
lesão
é
um
dímero
de
pirimidina,
o
sistema
promove
quebras
na
oitava
ligação
fosfodiéster
do
lado
5'
do
dímero
e
na
quarta
ligação
no
lado
3'
(no
caso
do
aduto
6‐4PP,
o
corte
é
na
quita
ligação),
deixando,
como
extremidades
livres,
3'OH
e
5'PO4.
O
gene
uvrA,
localizado
no
minuto
92
do
mapa
de
E.
coli,
tem
um
sítio
de
ligação
para
o
repressor
LexA
no
seu
promotor
e
codifica
uma
proteína
de
103
kDa
que
contém
dois
sítios
de
ligação
de
ATP
e
dois
dedos
de
zinco.
VII
31
O
gene
uvrB,
localizado
no
minuto
17,
tem
um
sítio
de
ligação
para
o
repressor
LexA
no
seu
promotor
P2
e
codifica
uma
proteína
de
76,6
kDa,
contendo
um
sítio
de
ligação
a
nucleotídeos.
O
gene
uvrC,
localizado
no
minuto
4l,5,
não
tem
sítio
de
ligação
para
o
repressor
LexA.
Codifica
uma
proteína
de
66
kDa.
A
proteína
UvrA
é
uma
ATPase
modulada
por
DNA
e
mutações
localizadas
no
domínio
C‐terminal,
onde
existe
um
dedo
de
zinco,
conferem
extrema
sensibilidade
ao
UV,
devido
à
sua
incapacidade
de
ligação
ao
DNA.
A
proteína
UvrB
purificada
não
apresenta
atividade
ATPase,
a
qual
só
é
observada
quando
UvrB
interage
com
UvrA
em
presença
de
DNA
lesado
ou
não
e
UvrB
só
se
liga
ao
DNA
em
presença
de
UvrA.
A
proteína
UvrC
tem
um
domínio
C‐terminal
com
um
alto
grau
de
homologia
com
o
C‐terminal
da
proteína
ERCC1
(ERCC
=
Excision
Repair
Cross
Complementing)
humana.
Ela
é
uma
proteína
que
se
liga
a
hélice
simples
com
grande
afinidade
e
também
se
associa
com
o
complexo
UvrB‐DNA.
Mecanismo
molecular
da
incisão
dupla
A
ligação
de
ATP
à
proteína
UvrA
conduz
à
sua
dimerização,
formando
UvrA2.
O
dímero
liga‐se
ao
DNA
lesado.
UvrB
então
se
liga
a
UvrA2
e
o
complexo
desloca‐se
para
o
local
da
lesão
e,
nesta
situação,
a
proteína
UvrA
“sente”
a
presença
da
lesão,
reconhecendo
o
sítio
lesado.
A
proteína
UvrB
liga‐se
à
lesão
e
o
dímero
UvrA2
é
liberado.
A
proteína
UvrC
liga‐se
ao
complexo
UvrB‐DNA
e
a
incisão
dupla
é
catalisada
por
UvrB
no
lado
3’
e
UvrC
no
lado
5’
da
lesão.
Recentemente
foi
mostrado
que,
in
vitro,
a
proteína
UvrC
pode
realizar
os
dois
cortes,
entretanto,
isto
ainda
não
foi
verificado
in
vivo.
A
proteína
UvrD
(helicase
II)
retira
UvrC
e
um
oligonucleotídeo
de
12
ou
13
bases
contendo
a
lesão,
entretanto,
UvrB
permanece
ligada
ao
DNA,
provavelmente
para
proteger
a
hélice
simples
formada.
A
PolI
desloca
UvrB
e
polimeriza
a
lacuna
que
é
selada
pela
DNA
ligase.
O
sistema
UvrABC
não
reconhece
um
grupo
químico
específico
ou
estrutura
no
nucleotídeo
lesado.
Ela
reconhece
uma
deformidade
especifica
na
hélice
dupla,
causada
por
uma
variedade
de
diferentes
agentes
genotóxicos.
Ela
reconhece
desde
grandes
lesões
tais
como
dímeros
de
pirimidinas,
adutos
de
pirimidinas,
adutos
de
2‐aminofluoreno,
adutos
de
aflatoxina
B1,
monoadutos
e
ligações
cruzadas
de
psoraleina
até
pequenas
lesões
como
O6MeG,
glicol
de
timina
e
sítios
AP.
A
excisão
de
dímeros
de
pirimidinas
é
precedida
pela
dupla
incisão.
A
ligação
de
UvrC
ao
complexo
UvrB‐
DNA
resulta
na
incisão
nos
dois
lados
adjacentes
à
lesão.
A
localização
precisa
das
incisões
é
afetada
pela
seqüência.
Os
cortes
são
feitos
no
lado
3’aparentemente
influenciados
pela
proteína
UvrB
e
esta
incisão
precede
o
corte
em
5’
pela
proteína
UvrC.
As
radiações
UV‐C
praticamente
não
produzem
quebras
na
cadeia
polinucleotídica;
entretanto,
se
após
a
irradiação,
as
células
forem
incubadas
em
meio
nutritivo
estas
quebras
começam
a
aparecer,
como
mostrado
na
figura
VII.17;
nestas
condições,
o
número
de
quebras
aumenta
até
atingir
um
máximo,
começando
depois
a
diminuir,
uma
vez
que
a
ocorrência
das
outras
etapas
do
processo
leva
à
sua
progressiva
eliminação.
A
liberação
do
fragmento
lesado
é
dependente
da
reação
coordenada
excisão‐ressíntese
por
UvrD
e
DNA
polimerase
na
presença
de
nucleotídeos.
O
fragmento
removido
pode
ter
12
ou
13
nucleotídeos.
UvrD
afeta
a
liberação
do
fragmento
e
de
UvrC,
entretanto
UvrB
só
é
liberada
após
a
entrada
da
PolI
e
dos
nucleotídeos.
Em
células
humanas
são
necessárias
pelo
menos
16
proteínas
para
realizar
a
mesma
dupla
incisão
(ver
adiante).
VII
32
FIGURA
VII.17
–
Cinética
de
produção,
pela
endonuclease,
de
quebras
na
cadeia
polinucleotídica,
após
irradiação
com
UV
germicida.
Uma
cultura
bacteriana
foi
exposta
ao
UV
germicida,
uma
alíquota
sendo
removida
para
análise
por
ultracentrifugação
em
gradiente
alcalino
de
sacarose;
o
restante
foi
incubado
a
37oC,
em
meio
nutritivo,
sendo
retiradas
alíquotas
para
análise
por
centrifugação
em
diferentes
momentos.
A)
perfis
de
sedimentação;
B)
representação
do
número
de
roturas
observadas
durante
a
pós‐irradiação.
Uma
vez
removido
o
segmento
do
DNA
que
contém
a
lesão,
novos
nucleotídeos
devem
ser
inseridos,
o
que
é
feito
mediante
complementação
da
seqüência
de
bases
existentes
na
hélice
oposta,
pela
atuação
de
uma
polimerase.
Em
E.
coli
foram
isoladas
e
caracterizadas
três
polimerases,
todas
dotadas
também
de
atividade
exonucleolítica,
designadas
como
PolI,
PolII
e
PolIII,
codificadas
respectivamente
pelos
genes
polA,
polB
e
polC.
Estas
enzimas
podem
degradar
o
DNA
no
sentido
oposto
ao
de
polimerização,
o
que
lhes
permite
atuar
também
na
eliminação
de
nucleotídeos
inseridos
incorretamente
durante
a
replicação
semiconservativa,
desempenhando,
portanto,
um
papel
de
"revisão
editorial",
já
referido
anteriormente.
A
PolI
I
atua
especificamente
sobre
DNA
em
dupla
hélice,
desde
que
este
contenha
uma
terminação
3'OH
e,
no
passado,
foi
considerada
como
a
enzima
responsável
pela
replicação
semiconservativa
do
DNA
de
E.
coli.
Posteriormente,
o
isolamento
de
cepas
deficientes
nesta
enzima,
levou
à
reavaliação
de
seu
papel,
admitindo‐
se
que
sua
ação
seja
a
de
preenchimento
das
lacunas
geradas
pela
atuação
da
endonuclease
UvrABC
e
de
outras
enzimas
tais
como
as
AP
endonucleases.
A
PolII
tem
atividade
bastante
limitada
em
relação
à
PolI
na
reparação
de
lesões,
parecendo
atuar
somente
quando
as
células
são
deficientes
nesta
última
enzima.
A
PolIII
é
a
principal
responsável
pela
replicação
semiconservativa,
mas
também
pode
substituir
a
PolI,
embora
com
eficiência
reduzida,
nos
processos
de
reparação
na
ausência
de
PolI.
A
verificação
experimental
da
neossíntese
de
fragmentos
da
cadeia
polinucleotídica
foi
tornada
possível
mediante
a
utilização
de
técnicas
análogas
às
empregadas
por
Meselson
e
Stahl
para
demonstrar
que
a
replicação
do
DNA
é
semiconservativa.
Tais
técnicas
fundamentam‐se
em
que
cadeias
polinucleotídicas
sintetizadas
em
presença
de
5‐bromouracil
(ou
do
isótopo
15N,
como
foi
feito
nos
experimentos
originais
para
o
estudo
da
replicação)
são
mais
densas
que
as
sintetizadas
em
sua
ausência
e,
desta
forma,
podem
ser
separadas
por
ultracentrifugação
em
gradientes
de
cloreto
de
césio.
Se
o
DNA
estiver
previamente
marcado
com
14C‐timina
e,
após
a
irradiação,
for
adicionado
5‐bromouracil
contendo
3H
ao
meio
de
cultura,
a
análise
das
densidades
e
da
distribuição
de
radioatividade
permite
verificar
ter
ocorrido
síntese
de
fragmentos
da
cadeia
polinucleotídica,
uma
vez
que
há
incorporação
no
DNA
do
precursor
marcado
com
3H,
mas
as
dimensões
dos
fragmentos
são
bastante
reduzidas,
já
que
não
alteram
a
posição
de
sedimentação
da
cadeia
polinucleotídica
(ou
seja,
não
modificam
sua
densidade
de
forma
perceptível
pela
técnica
empregada).
Esquemas
experimentais
desta
natureza
permitiram
verificar
que
os
segmentos
neossintetizados
são,
em
geral,
de
dimensões
reduzidas,
inferiores
a
20
nucleotídeos,
o
que
está
de
acordo
com
o
descrito
anteriormente
e
mostrado
na
figura
VII.18.
Em
mutantes
polA,
entretanto,
pode
ocorrer
neossíntese
de
VII
33
fragmentos
bastante
maiores,
contendo
entre
1.500
e
9.000
nucleotídeos,
processo
designado
como
reparação
por
excisão
de
longos
fragmentos
(long‐patch
repair)
e
também
observável,
embora
raramente,
em
células
selvagens
irradiadas
com
UV‐C
(somente
cerca
de
1%
dos
sítios
nos
quais
tenham
surgido
lesões
são
por
ele
reparados,
sendo
os
99%
restantes
corrigidos
pela
inserção
de
curtos
fragmentos).
Várias
características
desta
forma
de
reparação,
inclusive
a
necessidade
de
síntese
de
proteínas,
a
dependência
do
gene
recA
e
a
cinética
do
fenômeno
permitem
incluí‐la
entre
os
processos
indutivos,
que
serão
vistos
adiante.
Aliás,
recentemente
foi
mostrado
que
a
PolII
é
uma
das
enzimas
induzidas
quando
o
sistema
SOS
é
desreprimido.
FIGURA
VII.18
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
o
mecanismo
de
excisão
de
nucleotídeos
UvrABC
em
E.
coli.
A
última
etapa
do
processo
de
reparação
por
excisão
é
a
união
do
fragmento
neossintetizado
à
extremidade
livre
da
cadeia
pré‐existente,
mediante
o
estabelecimento
de
uma
ligação
fosfodiéster
entre
o
radical
3'OH
daquele
e
o
grupamento
fosfato
da
posição
5'
desta
última.
Em
E.
coli
esta
etapa
é
mediada
por
uma
polinucleotídeo
ligase,
codificada
pelo
gene
ligA,
cuja
atividade
é
dependente
da
presença
de
nicotinamida‐adenina
dinucleotídeo
(NAD);
células
deficientes
neste
gene
são
bastante
sensíveis
às
radiações
e
a
outros
agentes
que
provocam
lesões
no
DNA.
Em
células
humanas
pode‐se
detectar
o
processo
de
excisão
através
da
medida
de
síntese
de
DNA
fora
da
fase
S
(síntese
não
programada).
O
sistema
é
semelhante,
entretanto,
o
número
de
bases
eliminadas
no
fragmento
removido
é
maior
(27
‐
30
nucleotídeos
–
ver
adiante).
O
reparo
por
excisão
de
nucleotídeos
é
o
único
sistema
de
reparação
para
grandes
adutos
de
DNA
como
acetilaminofluoreno‐guanina,
cisplatina‐guanina,
psoraleina‐timina.
Adicionalmente,
todas
as
lesões
que
são
reparadas
primariamente
pelo
reparo
direto
e
pelo
reparo
por
excisão
de
bases
também
podem
ser
excisadas
VII
34
por
este
sistema
de
reparo.
Não
há
modificação
covalente
de
base
conhecida
que
não
seja
substrato
para
o
sistema
de
excisão
de
nucleotídeos
A
estratégia
básica
do
reparo
global
é
similar
em
pro
e
eucariotos.
Em
ambos
os
sistemas,
um
complexo
reconhece
o
sítio
da
lesão,
uma
nuclease
dependente
de
ATP,
constituída
de
subunidades,
faz
duplas
incisões,
uma
de
cada
lado
da
lesão
e
uma
helicase
excisa
o
oligonucleotídeo
contendo
a
lesão.
Tanto
o
sistema
UvrABC
de
E.
coli
como
o
sistema
humano
incisam
a
quinta
ligação
fosfodiéster
do
lado
3’da
lesão.
No
lado
5’
o
sistema
UvrABC
de
E.
coli
incisa
a
oitava
e
a
de
humanos
incisa
a
vigésima
quarta
ligação
fosfodiéster,
para
dímeros
de
pirimidinas.
Existe
variabilidade
nos
locais
exatos
das
incisões
dependendo
da
lesão
e
da
seqüência,
entretanto,
normalmente,
a
enzima
de
E.
coli
excisa
oligonucleotídeos
de
10‐13
bases
contendo
a
lesão
e
a
excinuclease
humana
remove
oligonucleotídeos
de
27‐29
bases,
também
contendo
a
lesão.
Em
E.
coli
três
subunidades
são
necessárias
e
suficientes
para
fazer
as
duas
incisões.
Em
humanos,
mais
de
16
polipeptídios,
nenhum
dos
quais
tem
qualquer
homologia
com
as
subunidades
UvrABC
de
E.
coli,
são
requeridos
para
fazer
a
dupla
incisão.
O
oligonucleotídeo
excisado
é
então
substituído
pela
síntese
de
reparo
pelas
DNA
polimerases
e
fatores
acessórios.
Recentemente
foi
detectado
que
UvrB
e
XPD
(proteína
humana
constituinte
do
fator
de
transcrição
TFIIH,
com
atividade
helicase)
possuem
identidade
estrutural.
Reconhecimento
da
lesão
em
eucariotos
Os
complexos
XPC‐HR23B
(XP
=
Xeroderma
Pigmentosum;
HR
=
Homolog
of
RAD)
e
RPA‐XPA
identificam
as
lesões
no
DNA.
O
primeiro
reconhece
6‐4PPs
induzidos
por
UV,
com
alta
especificidade,
mas
não
reconhece
CPDs,
GO
ou
O6MeG.
Por
outro
lado
o
complexo
RPA‐XPA
reconhece
os
6‐4PPs
e
adutos
de
cisplatina.
Alguns
autores
acreditam
que
o
complexo
XPC‐HR23B
liga‐se
primeiro
à
distorção
da
hélice,
enquanto
outros
sugerem
que
RPA‐XPA
reconhece
primeiro.
Outro
fator
envolvido
no
reconhecimento
das
lesões
do
UV
é
o
DDB
(Damaged
DNA
Binding
protein),
um
hetrodímero
de
DDB1
(p127)
e
DDB2
(p48),
que
pertencem
ao
grupo
de
complementação
XPE.
O
heterodímero
parece
estar
envolvido
no
reconhecimento
e
estimulação
da
excisão
de
CPDs
in
vitro
com
alta
eficiência,
enquanto
os
6‐4PPs
quase
não
são
reconhecidos.
Além
disto
as
células
mutadas
em
DDB
são
deficientes
em
reparo
global
(GGR),
entretanto
são
normais
para
o
reparo
acoplado
à
transcrição
(TCR).
Como
DDB
tem
uma
afinidade
500.000
vezes
maior
para
DNA
lesado
com
UV
em
relação
ao
não
lesado,
foi
proposto
que
DDB
se
ligue
à
lesão
e
recrute
XPC‐HR23B
para
a
lesão
no
mecanismo
GGR.
Entretanto,
também
foi
sugerido
que
DDB
recrute
RPA‐XPA
para
o
sítio
da
lesão.
Uma
observação
importante
é
que
fibroblastos
primários
deficientes
em
p53
apresentam
defeito
no
reparo
de
CPDs
e
eficiência
reduzida
na
GGR,
sugerindo
uma
atenuação
da
indução
de
XPC
e
DDB2,
que
são
induzidos
em
fibroblastos
humanos
após
UV‐C,
através
da
p53.
Em
verdade,
na
síndrome
de
Li‐Fraumeni,
que
se
caracteriza
por
deficiência
na
indução
de
DDB2
por
p53,
há
deficiência
no
reparo
de
CPDs.
Abertura
do
DNA
Após
a
o
reconhecimento
da
lesão,
o
fator
de
transcrição
TFIIH
(TF
–
Transcription
Factor),
constituído
de
sete
proteínas
diferentes
[XPB,
XPD,
GTF2H1,
GTF2H2,
GTF2H3,
GTF2H4,
CAK
(CDK7,
CCNH
e
MNAT1)]
é
recrutado
por
XPC‐HR23B,
para
o
sítio
da
lesão.
Este
fator
tem
atividade
helicase,
presente
nas
subunidades
XPB
e
XPD,
sendo
o
responsável
pelo
desenrolamento
do
DNA
em
torno
da
lesão.
Interessantemente
o
TFIIH
é
um
dos
diversos
componentes
da
RNA
polimerase
II,
requerida
para
a
iniciação
do
processo
de
transcrição.
Incisão
e
Excisão
das
lesões
Após
a
abertura
da
hélice
do
DNA,
a
excisão
da
lesão
é
feita
por
duas
incisões
em
posições
definidas
nos
lados
da
lesão.
A
incisão
no
lado
3’
é
feita
por
XPG
e
em
5’
pelo
complexo
XPF‐ERCC1.
VII
35
A
incisão
dupla
é
absolutamente
dependente
da
hidrólise
de
ATP.
Diferentemente
da
incisão
em
E.
coli,
na
qual
a
3’
precede
a
5’,
em
humanos
ela
é
randômica.
Não
há
evidência
da
existência
de
um
complexo
reparossoma.
Após
a
incisão
dupla
algumas
subunidades
permanecem
no
complexo
pós‐incisão,
assim
como
a
UvrB
em
E.
coli,
de
tal
maneira
que
uma
lacuna
em
hélice
simples
nunca
existe
como
intermediário.
O
fragmento
eliminado
contém
27‐30
nucleotídeos
e
a
polimerização
é
também
de
27‐30
nucleotídeos.
Síntese
de
reparo
e
ligação
O
complexo
pós‐excisão
é
dissociado
pelas
proteínas
de
replicação
de
reparo.
A
síntese
de
reparo
requer
PCNA
e,
desde
que,
entre
as
polimerases
humanas,
somente
a
Polδ
e
Pol
ε
requerem
PCNA,
é
sugerido
que
a
síntese
de
reparo
seja
processada
por
estas
enzimas.
Estudos
de
inibição
por
anticorpos
com
extratos
celulares
livres
de
células
sugerem
que
a
Polδ
seja
a
enzima
que
faz
a
síntese
de
reparo.
Em
sistemas
definidos,
Polδ,
Polε
e
mesmo
a
PolI
de
E.
coli
podem
fazer
a
síntese
de
reparo,
mas
não
a
Polβ.
Na
replicação
do
DNA
o
fator
RFC
age
como
um
casamenteiro
para
PCNA,
para
conduzí‐lo
ao
DNA
e
então
conferindo
processividade
para
Polδ
e
Polε.
Na
síntese
de
reparo
RFC/PCNA
parecem
ter
duas
funções:
a
dissociação
do
complexo
pós‐incisão
e
a
formação
de
um
local
de
entrada
para
a
síntese
de
reparo,
possivelmente
de
maneira
análoga
à
replicação.
A
lacuna
é
fechada
de
maneira
precisa,
sem
aumento
para
os
lados
3’ou
5’
e
então
o
tamanho
do
reparo
é
exatamente
igual
à
lacuna
da
excisão
(27‐30
bases).
O
reparo
é
terminado
por
uma
das
4
DNA
ligases
humanas,
possivelmente
pela
DNA
ligase
I.
Na
figura
VII‐19A
está
representado
o
mecanismo
proposta
para
a
excisão
de
nucleotídeos
(GGR)
em
células
humanas.
Figura
VII.19
–
Reparo
por
Excisão
de
Nucleotídeos
em
mamíferos
REPARAÇÃO
ACOPLADA
À
TRANSCRIÇÃO
(TCR)
O
DNA
transcrito
é
reparado
mais
rapidamente
que
o
não
transcrito
tanto
em
células
humanas
como
em
E.
coli.
Além
disto
este
reparo
preferencial
é
feito
na
fita
líder
e
em
humanos
somente
nos
genes
transcritos
pela
RNA
polimerase
II.
O
fator
que
modula
o
reparo
parece
ser
a
interação
da
RNA
polimerase
com
a
lesão.
VII
36
Reparação
acoplada
à
transcrição
Em
E.
coli
o
aumento
da
reparação
na
hélice
transcrita
é
mediado
por
TRCF
(Trancription‐Repair
Coupling
Factor),
codificado
pelo
gene
mfd
(mutation
frequency
decline).
O
TRCF
é
uma
proteína
de
130
kDa
com
estruturas
de
helicase
mas
sem
atividade
helicase
até
agora
demonstrada
in
vitro.
O
mecanismo
deste
reparo
consiste
no
reconhecimento
pelo
TRCF
da
RNA
polimerase
parada
na
lesão.
O
TRCF
libera
a
RNA
polimerase
e
o
transcrito
truncado
e
ao
mesmo
tempo
recruta
o
complexo
protéico
UvrA2B
do
sistema
de
excisão
de
nucleotídeos
ligando
especificamente
UvrA.
Os
sítios
de
ligação
de
TRCF
e
UvrB
à
proteína
UvrA
são
parcialmente
superponíveis,
assim,
após
recrutar
o
complexo
UvrA2B
para
o
sítio
da
lesão
o
TRCF
ajuda
a
dissociação
de
UvrA
facilitando
a
formação
do
complexo
pré‐incisão
UvrB‐DNA.
Neste
caso
a
reparação
na
hélice
transcrita
é
cerca
de
dez
vezes
mais
rápida
que
na
hélice
não
transcrita.
Aparentemente
a
ligação
da
RNA
polimerase
na
dupla
hélice,
na
lesão,
cria
a
distorção
necessária
para
a
translocação
do
complexo
UvrA2B
e
pré‐determina
onde
a
incisão
deve
ocorrer.
Os
mutantes
mfd
são
moderadamente
sensíveis
às
radiações
UV
e
a
mutagênese
espontânea
é
apenas
três
vezes
maior
que
nas
células
selvagens.
Em
humanos
o
mecanismo
é
similar
ao
de
E.
coli,
somente
mais
complexo.
Duas
proteínas
são
necessárias
para
fazer
a
ligação
transcrição‐reparo,
CSA
(CS
=
Cockayne
Syndrome)
e
CSB.
Deficiências
em
TCR
são
diretamente
relacionadas
com
a
síndrome
de
Cockayne,
que
é
caracterizada
pela
falta
de
reparo
acoplado
à
transcrição.
Os
genes
correspondentes
de
células
de
Hamster
Chinês
(CHO)
são
o
ERCC8
e
ERCC6.
As
células
CS
apresentam
sensibilidade
aumentada
à
radiação
UV
e
deficiência
em
TCR.
Entretanto,
apresentam
GGR
normal.
Nos
pacientes
CS
a
incidência
de
tumores
não
é
elevada,
o
que
pode
ser
explicado
pela
eficiente
eliminação
das
células
lesadas
através
de
apoptose.
O
reparo
acoplado
à
transcrição
ocorre
somente
em
genes
transcritos
pela
RNA
PolII,
é
observado
com
qualquer
lesão
que
bloqueie
a
transcrição
(em
geral
lesões
grandes
que
necessitam
o
sistema
de
excisão
de
nucleotídeos),
ocorre
mais
rapidamente
na
fita
transcrita
e
mutações
em
cinco
genes
causam
a
síndrome
de
Cockayne
[CSA/ERCC8,
CSB/ERCC6,
XPB
e
XPD
(como
parte
de
TFIIH)
e
XPG].
A
proteína
CSB,
mas
não
a
CSA,
interage
diretamente
com
RNA
PolII.
Quando
RNA
PolII
é
bloqueada
no
sítio
da
lesão,
CSA
e
CSB
ativam
o
TCR.
Estudos
recentes
sugerem
que
CSB
usa
a
sua
atividade
translocase
para
remover
o
complexo
RNA
PolII
da
lesão.
Em
verdade,
a
exposição
das
células
a
agentes
lesivos
como
cisplatina
e
radiação
UV‐C
induzem
a
ubiquitinação
de
RNA
PolII
dependente
de
CSA
e
CSB
nas
forquilhas
de
transcrição
facilitando
sua
liberação,
degradação
e
proteólise
quando
a
lesão
não
pode
ser
reparada.
Quando
a
reparação
é
possível
o
TFIIS
provoca
o
deslocamento
da
RNA
PolII
por
aproximadamente
20
nucleotídeos,
permitindo
a
reparação
do
DNA
e
que
a
RNA
PolII
alongue
o
transcrito
truncado.
A
maior
diferença
entre
este
modelo
e
o
de
procariotos
é
que
em
E.
coli
o
transcrito
truncado
é
descartado
e
em
células
humanas
ele
é
reusado.
Outra
síndrome
envolvida
na
reparação
acoplada
à
transcrição
de
CPDs
é
a
síndrome
de
sensibilidade
ao
UV
(UVSS),
que
não
pertence
ao
grupo
de
complementação
CS.
Isto
sugere
que
o
TCR
é
muito
mais
complexo
que
inicialmente
pensado,
o
que
não
acontece
com
o
GGR
que
está
melhor
estabelecido,
como
já
descrito.
Na
figura
VII.19B
está
representado
o
modelo
proposto
para
a
reparação
acoplada
à
transcrição
em
células
de
mamíferos.
REPARAÇÃO
PÓS‐REPLICATIVA
A
existência,
na
célula
bacteriana,
de
duas
ou
mais
cópias
de
determinada
seqüência
de
DNA
pode
favorecer
a
manutenção
da
viabilidade
após
tratamentos
físicos
ou
químicos,
pela
recombinação
de
fragmentos
não
lesados
entre
si.
VII
37
As
primeiras
evidências
sobre
a
existência
deste
fenômeno
foram
obtidas
com
bacteriófagos,
com
base
em
vários
tipos
de
estudos,
quais
sejam:
a)
a
reativação
por
multiplicidade,
que
consiste
em
um
aumento
do
número
de
centros
infecciosos
produzidos
quando
cada
bactéria
é
infectada
por
dois
ou
mais
fagos
irradiados;
o
fenômeno
é
conseqüência
da
recombinação
entre
genomas
lesados,
cada
um
deles
incapaz,
isoladamente,
de
se
replicar,
mas
podendo
fazê‐lo
se
existirem
vários
exemplares
no
interior
da
célula;
b)
a
reativação
cruzada,
análoga
à
anterior,
observável
quando
ocorre
infecção
da
célula
por
dois
tipos
distintos
de
fagos,
relacionados
geneticamente,
um
dos
quais
inativado
pela
radiação;
alguns
"marcadores"
genéticos
deste
último
são
encontrados
entre
os
fagos
produzidos
após
a
lise
bacteriana,
o
que
evidencia
a
ocorrência
de
recombinação;
c)
a
reativação
pelo
profago,
verificada,
por
exemplo,
quando
uma
bactéria
lisogênica,
portadora
do
profago
λ,
é
infectada
por
um
mutante
virulento
(λ
vir),
previamente
irradiado;
nestas
condições,
a
probabilidade
de
multiplicação
do
fago
é
maior
que
a
observável
se
a
bactéria
infectada
não
fosse
lisogênica,
o
que
costuma
ser
interpretado
como
conseqüência
de
recombinação
entre
o
DNA
infectante
e
o
profago,
que
apresentam
quase
100%
de
homologia.
A
conjugação
bacteriana
constitui
outro
fenômeno
importante
para
a
compreensão
da
reparação
pós‐
replicativa,
consistindo
na
incorporação,
ao
genoma
bacteriano,
de
segmentos
de
DNA
exógeno,
incorporação
esta
dependente
da
proteína
RecA,
codificada
pelo
gene
recA.
Neste
caso
particular,
uma
bactéria
("macho"),
transfere
uma
cópia
de
seu
cromossoma
para
outra
("fêmea"),
do
que
resulta
a
incorporação
ao
patrimônio
genético
da
receptora
de
um
ou
mais
genes
da
doadora,
como
visto
anteriormente.
O
fenômeno
só
ocorre
em
cepas
fêmeas
portadoras
do
alelo
selvagem
do
gene
recA
e
a
verificação
de
que
as
células
deficientes
neste
gene
são
bastante
sensíveis
às
radiações
e
a
diversos
agentes
químicos
levou
à
formulação
da
hipótese
de
que
a
recombinação
genética
estaria
ligada
a
alguma
forma
de
reparação.
Cepas
deficientes,
simultaneamente,
em
reparo
por
excisão
(uvrA,
por
exemplo)
e
em
recombinação
(recA)
são
muito
mais
fotossensíveis
que
as
células
deficientes
em
somente
um
destes
mecanismos,
o
que
permite
afirmar
tratarem‐se
de
duas
vias
independentes
de
reparo.
Por
outro
lado,
esta
constatação
justifica
a
utilização
de
mutantes
desprovidos
de
excisão
nos
estudos
visando
avaliar
a
eficiência
da
reparação
pela
recombinação
genética.
O
duplo
mutante
uvrA
recA
é
inativado
por
um
único
dímero
de
pirimidina
formado
no
DNA,
enquanto
células
deficientes
somente
em
excisão
serão
inativadas
quando
sofrerem,
em
média,
30
lesões
e
as
selvagens,
proficientes
nos
mecanismos
de
reparação,
cerca
de
700
lesões.
Os
resultados
experimentais
assim
obtidos
indicam
que:
a)
a
irradiação
das
células,
assim
como
tratamentos
com
diversos
agentes
químicos,
provocam
o
bloqueio
da
replicação
semiconservativa
do
DNA,
que,
em
muitos
casos,
não
é
permanente;
b)
a
replicação
que
então
ocorre
é
descontínua,
correspondendo
às
dimensões
médias
dos
segmentos
neossintetizados
às
distâncias
entre
as
lesões,
dependentes
da
dose
de
radiação
aplicada;
c)
à
medida
que
aumenta
o
tempo
transcorrido
desde
a
irradiação,
crescem
as
dimensões
dos
fragmentos
neossintetizados,
o
que
sugere
sua
progressiva
associação;
d)
as
lesões
provocadas
pelo
tratamento
físico
ou
químico
não
desaparecem
completamente
(ao
menos
em
mutantes
desprovidos
de
excisão),
diluindo‐se
ao
longo
das
divisões
celulares,
podendo
ser
detectados
por
três
ou
quatro
gerações
após
a
irradiação;
e)
em
mutantes
recA
o
fenômeno
não
é
observável.
Com
base
nestes
argumentos
experimentais
foram
apresentados
diversos
modelos
para
a
reparação
pela
recombinação.
As
trocas
de
material
genético
entre
as
moléculas
de
DNA,
aspecto
central
no
qual
fundamenta‐se
o
modelo
apresentado
na
figura
VII.20,
foram
verificados
por
meio
de
experimentos
nos
quais
as
hélices
parentais
foram
marcadas
com
isótopos
"pesados"
de
nitrogênio
ou
de
carbono,
sendo
a
análise
realizada
por
ultracentrifugação
em
gradientes
de
cloreto
de
césio.
Outro
método
fundamenta‐se
na
incorporação
de
bromodeoxiuridina
na
hélice
parental,
sendo
os
segmentos
que
contenham
este
análogo
de
timina
detectados
VII
38
nas
hélices
filhas
por
fotólise.
Outro
argumento
experimental
decorre
da
observação
da
presença
de
dímeros
de
pirimidinas
nas
hélices
filhas,
indicando
a
existência
de
recombinação
genética,
fato
este
observado
não
somente
em
procariotos,
mas
também
em
células
de
mamíferos.
FIGURA
VII.20
–
Modelo
proposto
para
o
mecanismo
de
recombinação
homóloga
pós‐replicativa
em
E.
coli.
A
estabilização
da
ligação
da
proteína
RecA,
no
sítio
da
recombinação
parece
ser
devida
à
ação
do
produto
do
gene
ssb,
uma
proteína
capaz
de
se
ligar
a
zonas
do
DNA
em
hélice
simples
("single
strand
binding
protein").
Nesta
situação
a
proteína
RecA
forma
longos
filamentos
que
envolvem
as
hélices
do
DNA
promovendo
a
troca
de
hélices.
Uma
vez
realizada
a
recombinação,
as
proteínas
RuvA
e
RuvB
promovem
a
migração
das
hélices
interligadas.
Este
sistema
gera
as
chamadas
"figuras
de
Holliday"
que
são
"resolvidas"
através
de
cortes
promovidos
pela
proteína
RuvC,
sendo
o
complexo
de
proteínas
Ruv
denominado
“resolvase”.
É
interessante
salientar
que
os
genes
ruvA
e
ruvB
fazem
parte
daqueles
controlados
pelo
sistema
SOS.
Em
mutantes
ruvA
ou
ruvB
o
processo
ainda
pode
ser
realizado
já
que
a
proteína
RecG
pode
substituir
as
proteínas
RuvA
e
RuvB.
Evidentemente,
a
reparação
recombinacional,
dada
sua
complexidade,
exige
a
atuação
de
várias
proteínas
intracelulares,
além
do
produto
do
gene
recA;
vias
competitivas
também
parecem
existir,
dependentes
de
diversas
outras
proteínas.
Assim,
por
exemplo,
em
células
proficientes
em
excisão,
este
tipo
de
reparação
exige
a
presença
dos
alelos
selvagens
dos
genes
recB,
recC
e
recD,
que
codificam
para
a
síntese
da
exonuclease
V,
que
funciona
também
como
uma
helicase
"desenrolase";
já
em
células
deficientes
em
excisão,
o
reparo
recombinacional
exige
o
produto
do
gene
recF,
provavelmente
uma
outra
nuclease.
O
fechamento
das
lacunas
formadas
durante
o
processo
de
reparo
recombinacional
é
realizado
por
PolI
e
PolIII.
A
etapa
final
do
processo
é
promovida,
à
semelhança
do
que
ocorre
na
reparação
por
excisão,
pela
DNA
ligase.
O
processo
de
recombinação
para
fechar
as
lacunas
em
frente
aos
dímeros
foi
a
primeira
sugestão
de
um
mecanismo
de
tolerância
de
lesões
em
E.
coli
.
A
existência
deste
mecanismo
em
células
humanas
não
está
definitivamente
provada.
Algumas
evidências
da
transferência
de
dímeros
de
pirimidinas
para
as
hélices
filhas
já
foram
obtidas.
Em
células
irradiadas
na
fase
G1,
de
1
a
3%
dos
dímeros
produzidos
na
hélice
parental
VII
39
podem
ser
detectados
na
hélice
filha,
assim
como
a
detecção
de
quebras
duplas
na
fase
S
após
a
irradiação
com
UV
(em
células
deficientes
em
excisão)
é
consistente
com
tal
modelo.
Os
detalhes
bioquímicos
das
reações
de
recombinação
em
células
humanas
ainda
é
desconhecido.
Reparação
de
quebras
duplas
Em
adição
ao
reparo
de
quebras
simples,
as
células
de
E.
coli
têm
a
capacidade
de
reparar
quebras
duplas
no
seu
DNA.
Estas
quebras
podem
ser
produzidas
pela
radiação
ionizante
assim
como
pelo
processamento
das
lesões
produzidas
pela
radiação
UV
(que
não
produzem
quebras
duplas
diretamente).
As
quebras
duplas
podem
ocorrer
em
células
selvagens
irradiadas
com
elevadas
doses
de
radiação
UV,
nas
quais
a
proximidade
dos
dímeros
pode
acarretar,
no
processo
de
excisão,
a
quebra
dupla.
Em
células
deficientes
em
excisão
as
quebras
podem
ocorrer
no
DNA
parental
opostas
a
uma
quebra
não
reparada
na
hélice
filha,
possivelmente
através
de
um
ataque
de
uma
endonuclease
específica
para
DNA
em
hélice
simples.
O
reparo
de
quebras
duplas
é
induzido
e
faz
parte
das
funções
SOS,
e
logicamente
requer
a
presença
de
outra
molécula
de
DNA
em
dupla
hélice,
contendo
a
mesma
seqüência
de
bases
da
hélice
quebrada,
o
que
ocorre
freqüentemente
quando
as
bactérias
são
cultivadas
em
meio
rico.
Este
fato
correlaciona‐se
com
a
observação
de
que
células
de
E.
coli
contendo
múltiplos
genomas
são
muito
resistentes
aos
raios
X.
O
modelo
aceito
para
este
tipo
de
reparação
pode
ser
visto
na
figura
VII.21.
De
acordo
com
o
modelo,
a
quebra
é
processada
por
ação
exonucleolítica
de
modo
a
gerar
terminais
3’OH
que
invadem
o
DNA
homólogo
intacto
e
para
a
síntese
de
reparo,
iniciada
nos
terminais
invasores.
Dependendo
de
como
as
junções
de
Holiday
são
resolvidas,
as
moléculas
resultantes
podem
ser
recombinantes
ou
não.
FIGURA
VII.21
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
o
reparo
de
quebras
duplas
no
DNA
de
E.
coli.
O
reparo
requer
o
gene
recA+
funcional.
A
proteína
RecA
catalisa
a
invasão
pela
hélice
3’.
Em
células
selvagens
o
reparo
de
quebras
duplas
também
depende
de
recB+
e
recC+
funcionais.
O
mecanismo
para
a
geração
dos
terminais
3’OH
envolve
a
entrada
do
complexo
RecBCD
na
quebra
dupla.
Este
complexo
VII
40
exonucleolítico
ao
encontrar
uma
seqüência
χ
(chi)
produz
uma
seqüência
invasiva
3’OH
de
alguns
nucleotídeos,
que
a
proteína
RecA
insere
na
hélice
dupla.
O
requerimento
para
RecBCD
em
células
selvagens
é
absoluto
uma
vez
que
uma
simples
quebra
dupla
é
letal
em
ausência
de
RecA
ou
RecBCD,
mas
não
impede
o
crescimento
celular
na
célula
selvagem.
O
reparo
de
quebras
duplas
é
um
processo
complexo
e
diversos
genes
além
de
recA
e
recBCD
estão
implicados
neste
reparo
(recN,
recF,
recJ,
radA,
e
uvrD).
O
gene
recN
é
de
particular
interesse,
desde
que
sua
expressão
é
regulada
pela
resposta
SOS
e
o
seu
produto
é
requerido
para
o
reparo
de
quebras
duplas
mas
não
para
o
reparo
de
quebras
simples.
A
recombinação
homóloga
não
é
favorecida
em
células
humanas
e
portanto
a
maioria
dos
eventos
de
integração
são
resultado
de
recombinações
ilegítimas,
envolvendo
homologias
em
trechos
muito
pequenos
de
DNA.
Estas
recombinações
ilegítimas
estão
envolvidas
no
reparo
de
quebras
duplas.
Terminações
abruptas
assim
como
pequenas
protuberâncias,
complementares
ou
não,
podem
ser
reunidas
com
eficiências
diferentes.
As
quebras
duplas
são
potentes
indutoras
de
efeitos
genotóxicos
(quebras
cromossomiais,
rearrajos,
trocas)
e
morte
celular.
Em
humanos
uma
única
quebra
dupla
não
reparada,
inativando
um
gene
especifico
pode
ser
suficiente
para
induzir
a
morte
celular
por
apoptose.
A
reparação
das
quebras
duplas
pode
ocorrer
pela
recombinação
homóloga
(HR
=
Homologous
Recombination)
(que
é
livre
de
erros)
ou
pela
recombinação
não
homóloga
(NHEJ
=
Non‐Homologous
End‐
Joining)
que
é
caracteristicamente
sujeita
a
erros.
Em
leveduras
predomina
a
HR
enquanto
em
mamíferos
a
predominância
é
da
NHEJ,
porém
isto
depende
do
ciclo
celular,
sendo
que
NHEJ
ocorre
mais
em
G0/G1
enquanto
HR
ocorre
preferencialmente
em
S
e
G2,
quando
a
cromátide
irmã
já
foi
sintetizada.
NHEJ
Este
tipo
de
recombinação
liga
as
pontas
sem
requerer
homologia
entre
a
terminações.
A
primeira
etapa
é
a
ligação
do
heterodímero
KU70
e
KU80
(XRCC5),
o
que
protege
o
DNA
da
digestão
exonucleolítica.
Após
a
ligação
ao
DNA
o
heterodímero
KU70‐KU80
associa‐se
à
DNA‐PK
(XRCC7
ou
DNA‐PKcs)
(PK
=
Protein
Kinase
:
cs
=
catalytic
subunit)
formando
a
DNA‐PK
holoenzima
ativa.
A
DNA‐PKcs
á
ativada
pela
interação
com
a
hélice
simples
no
sítio
da
quebra
dupla,
o
que
aciona
a
atividade
cinase
Ser‐Thr.
Um
dos
alvos
da
DNA‐PKcs
é
o
XRCC4,
o
qual
forma
um
complexo
estável
com
a
DNA
ligase
IV.
O
complexo
DNA
ligase
IV‐XRCC4
liga‐se
aos
terminais
e
junta
os
terminais
duplos
com
os
terminais
complementares
mas
não
ligáveis.
Como
o
complexo
não
pode
ligar
a
maioria
das
quebras
duplas
produzidas
por
muitos
agentes,
estas
devem
ser
processadas
primeiro.
O
processamento
dos
terminais
das
quebras
duplas
é
realizado
pelo
complexo
MRN
(MRE11‐RAD50‐
NBS1)
(MRE
=
Meiotic
REcombination,
RAD
=
RADiation,
NBS
=
Nijmegen
Breakage
Syndrome)
que
contém
atividades
exonuclease,
endonuclease
e
helicase,
e
remove
o
excesso
de
DNA
nos
“flaps”
3’.
Nos
“flaps”
5’
a
FEN1
é
a
responsável
pela
remoção
e
sua
deficiência,
bem
como
a
de
DNA
ligase
IV,
causam
redução
no
uso
da
via
do
NHEJ.
Outra
enzima
envolvida
no
processo
de
geração
de
saliências
durante
o
NHEJ
é
a
proteína
Artemis,
que
age
em
um
complexo
de
DNA‐PK.
Artemis
tem
uma
exonuclease
específica,
que
após
sua
ligação
na
DNA‐PK
e
sendo
fosforilada
pela
DNA‐PKcs
adquire
atividade
endonuclease,
degradando
DNA
em
hélice
simples
saliente
e
“grampos”,
o
que
parece
ser
necessário
para
o
processamento
de
saliências
5’
e
3’
durante
o
NHEJ.
Na
figura
VII.22A
está
representado
um
modelo
proposto
para
este
tipo
de
reparação.
VII
41
Figura
VII.22
–
Reparo
de
quebras
duplas
em
mamíferos
Recombinação
homóloga
(HR)
Na
recombinação
homóloga
o
cromossomo
lesado
entra
em
contacto
físico
com
o
não
lesado,
na
homologia
de
seqüência,
que
é
usada
como
iniciador
para
o
reparo.
O
processo
é
iniciado
pelo
complexo
MRN,
que
age
promovendo
a
digestão
na
direção
5’→
3’.
O
resultado
é
um
DNA
em
hélice
simples
com
final
3’
saliente,
no
qual
se
liga
um
anel
complexo
de
proteínas
RAD52,
que
o
protegem
da
digestão
nucleolítica.
RAD52
compete
com
Ku
o
que
determina
o
caminho
do
reparo
via
NHEJ
ou
HR.
RAD52
interage
com
RAD51,
estimulando
a
troca
de
hélices
promovida
pela
RAD51
(que
é
homóloga
da
RecA
de
E.
coli)
.
RAD51
forma
nucleofilamentos,
liga
DNA
de
hélice
simples
e
DNA
de
fita
dupla
e
promove
interações
entre
regiões
homólogas
lesadas
e
não
lesadas,
dependendo
de
ATP
e
estimulação
por
RPA.
RAD54,
uma
ATPase
DNA
dependente
que
interage
com
RAD51
é
capaz
de
induzir
o
superenrolamento
do
DNA
e
pode
estimular
indiretamente
a
recombinação
por
afastar
as
histonas
ou
outras
proteínas
ligadas
ao
DNA.
Este
processo
também
requer
BRCA2,
que
pode
estar
envolvida
na
tanslocação
de
BRCA1
e
RAD51
para
a
lesão.
RAD51
catalisa
a
troca
de
hélices
da
hélice
complementar
quando
a
hélice
lesada
invade
o
DNA
em
hélice
dupla
não
lesado.
A
junção
do
filamento
da
proteína
RAD51
é
facilitada
por
5
parálogos
de
RAD51
(RAD51B,
C
e
D
e
XRCC2
e
XRCC3)
que
têm
um
papel
importante
durante
a
pré‐sinapse.
Outra
interação
de
RAD51
é
com
RPA.
Há
sugestões
de
que
RPA
estabilize
o
pareamento
de
DNA
feito
pela
RAD51,
ligando‐se
à
hélice
deslocada.
Após
a
ação
das
proteínas
RAD,
as
estruturas
são
resolvidas
pelas
resolvases.
Na
figura
VII.22B
está
representado
um
modelo
proposto
para
este
tipo
de
reparação.
VII
42
REPARO
DE
LIGAÇÕES
CRUZADAS
(Interstrand
cross‐links
=
ICLs)
Estas
lesões
são
muito
tóxicas,
sendo
que
uma
única
lesão
é
capaz
de
matar
células
bacterianas
e
de
leveduras
deficientes
em
reparação
e
cerca
de
40
ICLs
podem
inativar
células
de
mamíferos
deficientes
em
reparação.
Diversas
substâncias
encontradas
no
meio
ambiente
são
capazes
de
provocar
ligações
cruzadas
tais
como
furocumarinas,
que
estão
presentes
em
muitas
plantas
e
cosméticos.
Além
disto
muitas
substâncias
são
utilizadas
como
quimioterápicos
no
tratamento
do
câncer,
devido
à
sua
propriedade
de
fazer
ligações
cruzadas
no
DNA,
o
que
acarreta
a
parada
da
replicação
e,
conseqüentemente,
a
morte
celular.
Entre
estas
substâncias
podemos
citar:
mitomicina
C,
cisplatina,
mostradas
nitrogenadas,
nitrosouréias,
etc.
Entretanto,
a
estrutura
tridimensional
das
ICLs
são
variáveis,
o
que
pode
influenciar
o
seu
reconhecimento
e
sua
reparação.
Uma
classe
especial
de
substâncias
capazes
de
fazer
ICLs
são
os
psoralenos,
os
quais
se
intercalam
nas
moléculas
de
DNA
e,
quando
as
células
são
iluminadas
com
radiação
UVA,
formam
ligações
com
a
timina,
como
visto
anteriormente.
Estas
substâncias
são
muito
utilizadas
no
tratamento
de
psoriasis,
vitiligo
e
micosis
fungóides,
um
tratamento
dermatológico
conhecido
como
PUVA
(psoraleno
+
UVA).
Em
E.
coli
proficientes
em
recombinação
genética,
o
reparo
de
ligações
cruzadas
é
realizado
em
diversas
etapas.
Ocorre
a
incisão
dupla
em
uma
das
hélices,
pelo
sistema
UvrABC,
na
nona
ligação
fosfodiéster
a
5’
da
ICL
e
na
terceira
ligação
no
lado
3’,
como
demonstrado
in
vitro.
Posteriormente,
a
atividade
exonucleolítica
5’
da
PolI
digere
o
DNA
formando
uma
lacuna
no
terminal
3’.
Isto
gera
a
estrutura
necessária
para
que
ocorra
a
recombinação
genética
com
outra
hélice
de
DNA.
Após
a
recombinação,
o
sistema
UvrABC
pode
agir
no
outro
lado
da
hélice,
liberando
a
lesão.
A
própria
PolI
faz
a
polimerização
da
lacuna
gerada
e
a
DNA
ligase
completa
a
reparação.
Em
bactérias
deficientes
em
recombinação
genética
ou
na
falta
de
uma
cópia
do
DNA,
a
reparação
das
ICLs
é
dependente
de
NER
e
da
PolII.
Na
falta
de
recombinação
genética,
após
a
dupla
incisão
feita
pelo
sistema
UvrABC
a
PolII
sintetiza
o
DNA
através
do
oligonucleotídeo
contendo
a
ligação.
Posteriormente
o
sistema
UvrABC
faz
a
segunda
incisão
dupla
e
a
DNA
polimerase
I
e
DNA
ligase
completam
a
reparação,
como
pode
ser
visto
na
figura
VII.23.
Figura
VII.23
–
Reparo
de
ligações
cruzadas
(“crosslink”
ou
“ICL”)
em
bactéria
VII
43
In
vivo
outras
proteínas
estão
envolvidas
neste
reparo,
já
que
mutantes
RecB,
C,
D,
F,
G,
O
e
R
são
sensíveis
a
agentes
que
causam
ICLs.
RecFOR
promove
a
ligação
de
RecA
ao
DNA
em
hélice
simples,
facilitando
o
emparelhamento
homólogo,
principalmente
em
ausência
de
quebras
duplas.
RecBCD
é
necessária
quando
uma
quebra
dupla
é
formada
durante
o
reparo
do
ICL.
A
quebra
dupla
pode
ser
formada
pela
ação
direta
de
nucleases
ou
quando
uma
quebra
é
feita
perto
do
ICL
e
a
forquilha
de
replicação
chega
à
lesão.
RecG
ou
RuvABC,
são
responsáveis
pela
resolução
dos
intermediários
da
recombinação.
Os
processos
de
reparação
de
ICLs
foram
conservados
em
eucariotos,
desde
leveduras
até
o
homem.
Nas
células
humanas
o
processo
necessita
de
NER,
recombinação
homóloga
e
reparação
translesão.
Diversos
genes
idênticos
aos
de
leveduras
estão
envolvidos
no
reparo
destas
lesões
em
humanos,
tais
como:
RAD6,
RAD18,
,
SNM1,
REV3
e
REV7.
Entretanto,
na
reparação
das
quebras
duplas
que
ocorrem
durante
o
processamento
das
lesões,
as
leveduras
normalmente
usam
a
recombinação
homóloga,
enquanto
a
maioria
das
células
humanas
usa
a
NHEJ.
Além
disto,
em
humanos
o
processo
é
mais
complexo,
envolvendo
muito
mais
proteínas
que
em
leveduras.
Um
exemplo
do
processo
de
reparação
de
quebras
duplas
em
leveduras
pode
ser
visto
na
figura
VII.24.
Figura
VII.24
–
Reparo
de
ligações
cruzadas
(“crosslink”
ou
“ICL”)
em
levedura
Naturalmente,
todos
os
mutantes
deficientes
em
reparo
e,
particularmente
RAD10,
RAD1,
ERCC1
e
ERCC4(XPF),
são
extremamente
sensíveis
a
agentes
que
fazem
ligações
cruzadas.
Adicionalmente,
linhagens
celulares
da
Anemia
de
Fanconi
são
sensíveis
a
agentes
que
fazem
ligações
cruzadas,
mas
não
são
particularmente
sensíveis
a
outras
lesões
que
são
reparadas
por
NER.
Algumas
proteínas
sem
homologia
com
as
de
leveduras
tais
como
BRCA
(BReast
CAncer)
e
FANC
(Fanconi)
têm
participação
na
reparação
de
ICLs
em
mamíferos.
Uma
grande
diferença
entre
mamíferos
e
leveduras
é
que
somente
ERCC1
e
XPF
(NER)
participam
do
reparo
em
mamíferos,
enquanto
muitas
outras
proteínas
do
NER
participam
do
reparo
em
leveduras.
Em
verdade
as
proteínas
responsáveis
pelo
reconhecimento
dos
ICLs
em
mamíferos
não
são
conhecidas.
Além
disto,
aparentemente
ERCC1
e
XPF,
em
mamíferos,
participam
principalmente
da
resolução
de
intermediários
da
recombinação.
VII
44
Em
leveduras
a
RAD52
é
mais
importante
que
a
RAD51
na
maioria
dos
eventos
recombinacionais,
enquanto
em
mamíferos
RAD51
é
a
mais
importante.
Os
mamíferos
dependem
mais
dos
parálogos
de
RAD
51
para
a
sua
ativação
na
estimulação
de
troca
de
hélices
do
que
para
RAD52.
As
proteínas
SNM1,
FANC
e
BRCA
podem
funcionar
na
regulação
das
respostas
celulares
aos
ICLs.
Por
exemplo,
as
proteínas
BRCA
estão
envolvidas
na
indução
de
pontos
de
checagem
via
ATM
(Ataxia
Telangiectasia
Mutated),
na
HR
e
BRCA1
está
associada
à
transcrição.
Além
disto
a
ligação
de
FANC2
e
BRCA1
é
consistente
com
um
papel
regulatório
das
proteínas
FANC.
ATM
e
ATR
–
Controle
da
sinalização
e
pontos
de
checagem
O
reconhecimento
e
a
sinalização
das
lesões
do
DNA
são
requisitos
para
a
indução
de
respostas
celulares
tais
como:
aumento
de
reparo,
parada
do
ciclo
celular
e
apoptose.
O
reconhecimento
é
feito
por
um
grupo
de
fosfotidilinositol‐3‐cinases
ATM,
ATR
(Ataxia
Telangiectasia
Related)
e
pela
subunidade
catalítica
da
DNA‐PK
(DNA‐PKcs),
cujo
alvo
para
fosforilação
é
a
seqüência
consenso
Ser‐Thr‐Gln‐Glu.
ATM
e
ATR
podem
ligar‐se
às
terminações
do
DNA
lesado,
o
que
resulta
na
ativação
da
função
cinase,
ou
possivelmente
a
ativação
da
ligação
nas
modificações
da
estrutura
da
cromatina
induzida
pelas
radiações
ionizantes.
Estas
modificações
poderiam
induzir
a
autofosforilação
da
ATM,
conduzindo
à
dissociação
dos
dímeros
ATM
nos
monômeros
ativos.
Diversas
proteínas
de
reparo
[BRCA1,
MSH2,
MSH6,
MLH1,
ATM,
BLM
e
o
complexo
MRN]
co‐precipitam
imunologicamente
no
complexo
BRCA1
de
vigilância
associada,
denominado
BASC.
MLH1
e
MSH2
então
diretamente
envolvidas
na
ativação
de
ATM.
Após
irradiação
com
radiações
ionizantes
MLH1
liga‐se
a
ATM
e
MSH2
liga‐se
a
CHK2
,
o
que
permite
especular
que
o
MMR
reconhece
as
lesões
induzidas
pelas
radiações
ionizantes,
formando
uma
configuração
que
permite
a
ATM
fosforilar
CHK2
e
ativar
o
ponto
de
checagem
da
fase
S.
ATM
fosforila
CHK2
enquanto
ATR
fosforila
CHK1.
Ambas,
CHK1
e
CHK2
são
capazes
de
fosforilar
p53,
levando
à
estabilização
de
p53,
isto
é,
impedindo
a
sua
ubiquitinização
e
degradação.
ATM
e
ATR
também
podem
fosforilar
diretamente
p53,
aumentando
sua
atividade
de
transativação.
A
estabilização
e
o
aumento
da
atividade
de
transativação
leva
à
indução
de
p21,
que
inibe
o
complexo
CDK2‐ciclina
E‐PCNA,
resultando
no
bloqueio
G1/S.
CHK1
ativada
por
ATR
pode
fosforilar
CDC25a,
levando
à
ubiquitinização
e
degradação
da
proteína,
que
não
pode
mais
ativar
o
complexo
CDK2‐ciclina
E
pela
desfosforilação
de
CDK2,
resultando
na
parada
G1/S
independente
de
p53.
CHK1
ativada
por
ATR
também
fosforila
CDC25c,
induzindo
a
ligação
de
CDC25c
à
proteína
14‐3‐3σ.
Este
complexo
é
levado
para
fora
do
núcleo
e
torna‐se
incapaz
de
desfosforilar
(ativar)
CDK1‐Ciclina
B,
conduzindo
à
parada
G2/M.
Além
do
papel
de
controle
dos
pontos
de
checagem,
ATM
e
ATR
também
regulam
o
reparo
do
DNA.
ATM
fosforila
diversas
proteínas
associadas
ao
reparo,
tais
como:
NBS1,
BRCA1,
RAD9
e
c‐ABLl,
o
que
resulta
na
fosforilação
de
RAD51.
Além
disto,
ATM
também
fosforila
a
histona
H2AX,
responsável
pela
criação
dos
“foci”
na
cromatina,
no
sítio
da
quebra,
para
onde
RAD50,
RAD51
e
BRCA1
serão
recrutadas.
A
fosforilação
de
NBS1
por
ATM,
em
resposta
à
radiação
ionizante,
é
necessária
para
a
formação
dos
“foci”
nucleares
MRN
no
sítio
da
lesão
do
DNA.
O
complexo
MRN
é
um
sensor
que
recruta
ATM
para
as
quebras
duplas
e
promove
sua
fosforilação.
A
ativação
de
NF‐κB
(NF
=
Necrosis
Factor)
em
resposta
às
quebras
duplas
é
mediada
pela
fosforilação
de
IκB
cinase
dependente
de
ATM.
ATR
também
fosforila
proteínas
de
reparação
ou
fatores
associados,
como:
RAD17
e
BRCA1.
Em
adição,
após
lesões
no
DNA
ATM
e
DNA‐PKcs
medeiam
a
fosforilação
de
c‐ABL.
Isto
atinge
p53
e
p73,
que
exercem
atividade
pro‐apoptótica.
De
um
modo
geral
a
fosforilação
mediada
por
ATM/ATR,
principalmente
de
CHK1,
CHK2
e
p53,
é
crucial
para
gerar
os
sinais
de
parada
do
ciclo
celular
em
G1/S
e
G2/M,
apoptose
e
aumentar
o
reparo
de
DNA.
VII
45
Convém
salientar
que
a
deficiência
em
ATM
causa
ataxia
telangiectasia,
cuja
característica
é
grande
sensibilidade
às
radiações
ionizantes.
Um
esquema
mostrando
a
ação
de
ATM/ATR
está
representado
na
figura
VII.25.
Figura
VII.25
–
Lesão
de
DNA.
Sinalização
via
ATM/ATR
Papel
de
PARP
no
reparo
de
DNA
Um
papel
importante
na
regulação
do
reparo
do
DNA
é
realizado
pelos
membros
da
família
PARP
[poli(ADP‐ribose)
polimerases].
Estas
enzimas
associadas
à
cromatina
modificam
diversas
proteínas
através
da
poli(ADP‐ribosilação).
PARP1,
além
de
regular
o
reparo
de
DNA
também
está
implicada
na
longevidade
dos
mamíferos
e
é
considerada
a
proteína
chave
entre
necrose
e
apoptose.
Ela
é
uma
proteína
de
113kDa,
com
dois
dedos
de
zinco
no
N‐terminal
e
com
o
sinal
de
localização
nuclear
no
C‐terminal.
Em
resposta
às
lesões
induzidas
pela
radiação
ionizante
ou
agentes
alquilantes,
PARP1
liga‐se
especificamente
a
SSBs.
Após
a
ligação
ao
DNA
ela
se
autorribosila,
o
que
permite
sua
interação
não
covalente
com
outras
proteínas.
Aparentemente,
PARP1
(e
possivelmente
PARP2)
está
envolvida
com
o
reparo
do
DNA
de
três
maneiras
diferentes:
(a) Pela
interação
direta
com
XRCC1
e
Polβ,
ambas
proteínas
chaves
para
o
mecanismo
BER.
PARP2
interage
com
XRCC1,
Polβ
e
DNA
ligaseIII.
In
vitro,
PARP1
estimula,
junto
com
FEN1
o
deslocamento
da
hélice
e
a
síntese
de
reparação
por
Polβ,
estimulando
o
BER
em
longos
fragmentos.
Deve
ser
salientado
que
camundongos
deficientes
em
PARP1
são
hipersensíveis
a
metil
nitroso
uréia
(MNU)
e
as
células
germinativas
desses
animais
são
hipersensíveis
a
MMS,
mostrando
redução
do
reparo
de
quebras
e
aumento
de
apoptose.
VII
46
(b) Pela
remodelação
da
estrutura
da
cromatina
após
a
indução
de
lesões
no
DNA,
foi
mostrado
que
PARP1
automodificada
interage
com
o
proteossoma
20s,
via
polímeros
ADP
ribose.
A
poli(ADP‐ribosilação)
do
proteossoma
20s
resulta
no
aumento
da
atividade
proteolítica
do
proteossoma,
que
é
o
responsável
pela
degradação
de
histonas
oxidadas.
A
degradação
das
histonas
leva
à
remodelação
da
estrutura
da
cromatina
dando
acesso
às
enzimas
de
reparação
do
DNA.
(c) Uma
seqüência
consenso
de
ligação
de
poli(ADP‐
ribose)
foi
detectada
em
diversas
proteínas
de
reparo
e
de
controle
de
pontos
de
checagem,
tais
como:
p53,
p21,
XPA,
MSH6,
DNA
ligase
III,
XRCC1,
DNA‐PKcs,
KU70,
NF‐κB,
sintetase
induzida
por
ácido
nítrico,
caspase
ativada
por
DNAase
e
telomerase.
Pela
interação
com
estes
“motivos”,
PARP1
pode,
potencialmente,
interferir
com
diversas
funções
destas
proteínas,
envolvidas
em
reparação
do
DNA,
regulação
do
ciclo
celular,
apoptose,
etc.
Na
figura
VII.26
está
representado
um
modelo
proposto
para
a
atuação
de
PARP.
Figura
VII.26
–
Papel
de
PARP
na
repação
de
DNA
PARADA
DA
REPLICAÇÃO
E
SÍNTESE
TRANSLESÃO
Em
E.
coli
foram
isoladas
cinco
polimerases.
A
PolI
é
requerida
para
a
maturação
da
hélice
descontínua
e
é
a
responsável
pela
complementação
dos
diferentes
sistemas
de
reparação.
A
Pol
III
é
a
polimerase
replicativa.
Após
exposição
a
agentes
que
lesam
o
DNA,
as
células
de
E.
coli
respondem
através
do
sistema
SOS,
induzindo
mais
de
30
genes
envolvidos
na
reparação
do
DNA.
Entre
os
genes
induzidos
três
codificam
para
DNA
polimerases
não
essenciais:
PolII,
PolIV
e
PolV.
A
PolII
é
requerida
para
reiniciar
a
replicação
livre
de
erros
nas
lesões
induzidas
por
UV.
A
replicação
pára
quando
PolIII
encontra
uma
lesão
bloqueadora.
A
forquilha
retrocede
e
a
hélice
filha
neossintetizada
serve
como
molde
para
a
síntese
posterior
por
PolII.
O
tamanho
sintetizado
depende
do
que
foi
sintetizado
na
hélice
não
lesada.
A
forquilha
é
restabelecida
por
migração
reversa
das
hélices,
atravessando
a
lesão
sem
repará‐la.
A
lesão
poderá
ser
reparada
mais
tarde
por
outros
mecanismos.
VII
47
In
vitro,
PolII
pode
sintetizar
através
de
sítios
AP
e
alguns
adutos
por
um
mecanismo
denominado
desalinhamento
de
“primers”,
que
ocorre
em
seqüências
repetidas.
Neste
caso
o
deslizamento
de
“primer”
e
“template”
provoca
“loops”
e
a
polimerização
leva
a
mutações
“frameshift”.
A
PolIV
é
o
produto
do
gene
dinB
(isolado
há
mais
de
20
anos)
mas
somente
recentemente
caracterizado
como
codificador
de
uma
DNA
polimerase.
Esta
polimerase
existe
normalmente
nas
células,
mas
é
induzida
cerca
de
10
vezes
na
resposta
SOS.
A
PolIV
não
é
capaz
de
atravessar
dímeros
de
pirimidinas
mas
algumas
lesões
parecidas
são
atravessadas
e
ela
também
é
capaz
de
estender
“primers”
desalinhados.
Além
disto
ela
também
pode
atuar
nas
forquilhas
paradas
nas
lesões,
estendendo
terminais
aberrantes.
Os
mutantes
dinB
não
são
deficientes
em
reparação
do
DNA
mas
têm
deficiência
em
mutagênese
não
dirigida,
portanto,
muito
mais
mutações
são
observadas
na
progênie
de
fagos
lambda
propagados
em
células
irradiadas
que
nas
não
irradiadas.
PolIV
também
é
responsável
pela
maioria
das
mutações
“frameshift”
adaptativas
do
gene
lacZ(‐1)
A
PolV
é
o
produto
dos
genes
umuDC.
Ela
é
capaz
de
atravessar
dímeros
de
pirimidinas
e
sítios
AP
in
vitro.
Além
disto,
a
mutagênese
observada
em
células
irradiadas
com
UV,
transições
T→C
nos
dímeros
de
timina
são
correlacionadas
com
a
capacidade
da
PolV
atravessar
os
dímeros.
A
expressão
desta
polimerase
é
altamente
regulada
tanto
ao
nível
de
transcrição
como
postranscricionalmente
possivelmente
para
evitar
grande
quantidade
de
mutações
no
DNA.
UmuC
é
a
mutapolimerase
e
UmuD,
após
processamento
por
RecA
co‐
protease
auxilia
UmuC.
Na
figura
VII.27
está
representado
um
modelo
proposto
para
a
atuação
dessas
polimerases.
Figura
VII.27
–
Replicação
translesões
Até
o
momento
foram
detectadas
16
polimerases
em
eucariotos.
Três
destas;
Polα,
Polδ
e
Polε
são
requeridas
para
replicação
do
cromossomo
e
outra,
a
Polγ
é
requerida
para
replicação
do
DNA
mitocondrial
e
para
reparação.
As
outras
12
parecem
ter
funções
especializadas
no
reparo
e
na
estabilidade
cromossômica.
As
proteínas
de
reparo
associadas
com
a
recuperação
e
a
ultrapassagem
do
bloqueio
da
replicação
são
denominadas
polimerases
sujeitas
a
erros
ou
mutapolimerases.
Grandes
lesões
bloqueiam
a
replicação
do
DNA
diretamente,
o
que
leva
ao
recrutamento
de
diversas
proteínas
de
reparo
para
o
local
da
lesão,
isto
é,
para
a
forquilha
de
replicação
parada.
Como
este
recrutamento
é
feito
ainda
não
se
sabe.
Durante
a
replicação
normal,
PCNA
forma
um
anel
deslizante
e
estimula
a
replicação
pelas
DNA
polimerases.
O
transportador
de
PCNA
é
feito
pelo
chamado
transportador
de
anéis,
que
é
idêntico
ao
fator
de
replicação
C
(RFC).
No
reparo
do
DNA
a
função
de
PCNA
é
terminada
por
VII
48
outro
transportador
específico
das
lesões
(complexo
RAD9‐1‐1),
formado
pelas
proteínas
RAD9,
HUS1
e
RAD1,
que
pode
servir
a
diversas
proteínas
de
reparo.
(Após
irradiação
com
radiações
ionizantes
HUS1
desloca‐se
do
citosol
para
o
núcleo,
onde
se
associa
com
PCNA
e
RAD9).
Após
a
irradiação,
outra
proteína,
a
RAD17
é
fosforilada
por
ATR
e
então
recruta
o
complexo
RAD9‐1‐1
para
a
cromatina.
Há
indicações
de
que
RAD17
substitui
RFC1,
a
maior
subunidade
do
complexo
RFC,
formando
um
novo
complexo
com
as
outras
unidades
do
RFC,
designado
RAD17‐RFC,
que
é
o
transportador
de
anéis
para
RAD9‐1‐1.
Em
leveduras
já
foi
mostrado
que
a
mutapolimerase
DINB
interage
com
HUS1/RAD1,
e
sua
associação
com
a
cromatina
é
dependente
de
RAD17.
A
síntese
de
DNA
translesão
é
feita
pelas
polimerases
eta,
kappa,
iota,
mu
e
zeta.
A
polimerase
eta
(Polη
=
POLH,
RAD30,
XPV)
é
uma
enzima
de
baixa
fidelidade
pois
não
tem
a
função
editorial
(atividade
exonuclease
3’→5’),
portanto
erra
muito
(10‐2
a
10‐3).
A
Polη
está
implicada
na
forma
variante
de
xeroderma
pigmentosum
(XPV)
e
reduz
a
sensibilidade
ao
UV
nas
células
XP.
Em
verdade
a
Polη
tem
a
capacidade
de
inserir
AA
em
frente
a
dímeros
de
timina.
No
XPV
ela
está
mutada
e
sua
função
é
substituída
por
Polι,
que
erra
muito
mais
e
introduz
mutações,
levando
ao
câncer.
A
polimerase
kappa
humana
(Polκ
=
POLK,
DINB)
é
homóloga
à
DNA
polimerase
IV
codificada
pelo
gene
dinB
de
E.
coli.
Polκ
também
exibe
alta
taxa
de
erros,
mas
em
contraste
com
as
outras
mutapolimerases
tem
moderada
processividade
e
pode
sintetizar
mais
de
25
nucleotídeos
durante
a
síntese
translesão.
A
polimerase
iota
(Polι
=
POLI,
RAD30B)
é
o
homólogo
de
RAD30
de
S.
cerevisiae,
e
tem
uma
taxa
de
erros
de
1x10‐2,
errando
mais
em
frente
a
timina
e
menos
em
frente
a
adenina.
A
polimerase
humana
mu
(Polµ
=
POLM)
tem
grande
analogia
com
a
deoxinucleotidil
transferase
terminal.
A
polimerase
zeta
(Polζ
=
POLG,
REV3L)
é
constituída
por
duas
sub‐unidades
(REV3
e
REV7)
que
cooperam
com
REV1.
Algumas
mutapolimerases,
além
de
fazer
a
síntese
translesão
parecem
também
estar
envolvidas
diretamente
na
remoção
de
lesões.
A
polimerase
lambda
humana
(Polλ
=
POLL)
tem
homologia
de
32%
com
Polβ
=
POLB,
e
tem
atividade
desoxirribose
fosfato
liase
(dRPase),
inserindo
nucleotídeos
em
pequenas
lacunas
contendo
5’‐fosfato,
sendo
portanto
associada
a
BER.
Polι
parece
atuar
em
BER
de
pares
G:U
e
A:U,
devido
à
sua
atividade
5’‐deoxiribose
fosfato
(dRP)
liase
Pouco
se
sabe
acerca
das
DNA
polimerases
humanas
sigma
[Polσ
=
POLS,
TRF4
(DNA
Topoisomerase
Related
Function)],
assim
como
da
DNA
polimerase
theta
(Polθ
=
POLQ),
que
é
homóloga
do
produto
do
gene
mus308
de
D.
melanogaster,
que
codifica
uma
DNA
polimerase‐helicase
talvez
envolvida
na
reparação
de
ligações
cruzadas.
Interessantemente
Polµ
está
envolvida
na
hipermutação
dos
genes
da
imunoglobulina
e
participa
no
fechamento
dos
terminais,
durante
a
recombinação
V(D)J
e
no
NHEJ.
As
mutapolimerases
são
as
maiores
responsáveis
pela
mutagênese
induzida
por
agentes
que
causam
lesões
no
DNA
capazes
de
parar
a
forquilha
de
replicação.
Elas
talvez
representem
o
elo
entre
as
funções
SOS
mutagênicas
de
E.
coli
(controladas
por
RecA
e
UmuDC)
e
as
funções
SOS
em
mamíferos.
Na
tabela
VII.2
estão
relacionadas
as
mutapolimerases
humanas
e
suas
respectivas
famílias.
Devido
a
grandes
confusões
relacionas
aos
nomes
das
polimerases
humanas
em
diferentes
trabalhos,
foi
proposta
uma
nova
nomenclatura
HUGO
(HUman
Genome
Organization),
que
também
consta
da
tabela.
VII
49
TABELA
VII.2
–
Famílias
de
DNA
polimerases
de
eucariotos.
Nomenclatura
HUGO
(Human
Genome
Organization).
NI
‐
ainda
não
identificado
FAMÍLIA
DESIGNAÇÃO
GREGA
S.
cerevisiae
NOME
HUGO
REPARAÇÕES
INDUTIVAS
Agentes
físicos
ou
químicos
podem
provocar
respostas
celulares
articuladas,
mediadas
por
determinados
sinais
e
expressadas,
fenotipicamente,
pela
desrepressão
de
um
ou
mais
genes,
que
são
transcritos
em
RNA
mensageiro
e
traduzidos
em
proteínas.
Respostas
adaptativas
Quando
células
procarióticas
ou
eucarióticas
são
incubadas
com
concentrações
reduzidas
(subletais)
de
determinados
agentes
químicos,
elas
podem
tornar‐se
mais
resistentes
a
tratamentos
posteriores
com
concentrações
elevadas
(letais)
do
mesmo
agente,
como
pode
ser
visto
na
figura
VII.28A.
Este
fenômeno,
conhecido
como
reparação
adaptativa,
é
explicado
pelo
acúmulo
intracelular
de
uma
ou
mais
enzimas
capazes
de
eliminar
lesões
provocadas,
no
DNA,
pelo
tratamento,
reduzindo
assim
seus
efeitos
letais
ou
mutagênicos;
para
que
ela
se
expresse,
é
indispensável
que
a
célula
possa
sintetizar
proteínas
após
o
primeiro
tratamento
"indutor".
a)
agentes
alquilantes
Em
E.
coli
e
em
algumas
outras
espécies
bacterianas,
pelo
menos
duas
enzimas
acumulam‐se
após
o
tratamento
indutor,
ambas
capazes
de
promover
a
eliminação
de
lesões
provocadas
no
DNA
por
agentes
alquilantes
e,
portanto,
de
reduzir
a
inativação
celular
e
a
mutagênese
produzidas
por
estes
agentes,
como
pode
ser
visto
na
figura
VII.28B.
VII
50
FIGURA
VII.28
–
Sobrevivência
e
mutagênese
de
culturas
bacterianas,
adaptadas
ou
não,
tratadas
com
agentes
alquilantes.
A
O6Metilguanina‐DNA
Metiltransferase,
produto
do
gene
ada
remove
grupamentos
alquil
inseridos
nas
posições
O6
da
guanina,
O4
da
timina
e
da
ligação
fosfotriéster,
transferindo‐os
para
uma
cisteína
constituinte
da
proteína,
o
que
justifica
a
sua
inativação
durante
o
processo.
Uma
vez
que
a
metilação
da
guanina
na
posição
O6
conduz,
durante
a
replicação
semiconservativa
do
DNA,
a
erros
de
emparelhamento,
torna‐se
fácil
entender
os
efeitos
mutagênicos
deste
tipo
de
lesão
e
a
importância
da
reparação
adaptativa
na
redução
da
mutagênese.
Em
células
de
E.
coli
não
adaptadas
existem
entre
20
e
60
moléculas
desta
enzima,
cuja
concentração
pode
ser
multiplicada
por
100
ou
200
em
conseqüência
do
tratamento
indutor.
Quando
a
transferência
é
feita
da
O6‐metil
guanina
ou
da
O4‐metil
timina
o
metil
é
capturado
pela
cisteína
321
do
sítio
ativo
C
terminal
(VIPCHRVI)
e
a
enzima
é
inativada,
entretanto
quando
o
metil
é
retirado
do
fosfotriéster
ele
é
capturado
pela
cisteína
38
(do
N
terminal)
e
não
pela
69
como
sugerido
previamente,
a
enzima
transforma‐se
em
um
ativador
do
seu
próprio
gene,
conduzindo
à
síntese
de
milhares
de
moléculas
da
proteína
Ada.
Quando
da
metilação
de
cys
38,
que
é
irreversível,
Ada
transforma‐se
na
ativadora
da
transcrição
dos
genes
da
resposta
adaptativa,
ada‐alkB,
alkA
e
aidB,
uma
vez
que,
neste
caso,
a
mudança
conformacional
de
Ada
aumenta
a
capacidade
de
ligação
aos
promotores
destes
genes,
facilitando
a
ligação
da
RNA
polimerase.
A
transformação
da
proteína
Ada
conduz
à
desrepressão
de
outro
gene,
o
alkA,
que
codifica
a
síntese
da
3‐metil
adenina
DNA
glicosilase
II
(AlkA)
que
remove
bases
metiladas
em
diferentes
posições
(N3
e
N7
da
guanina,
O2
da
citosina,
N3
e
N7
da
adenina
e
O2
da
timina,
entre
outras).
Na
figura
VII.29
está
representado
esquematicamente
o
processo
da
resposta
adaptativa
para
agentes
alquilantes.
VII
51
FIGURA
VII.29
–
Regulação
da
resposta
adaptativa
pela
proteína
Ada
e
expressão
dos
principais
genes
envolvidos
em
E.
coli.
Em
células
não
adaptadas
a
proteína
AlkA
atua
juntamente
com
a
Tag,
mas
a
quantidade
desta
não
se
altera
durante
a
adaptação;
em
células
adaptadas,
a
quantidade
de
AlkA
é
multiplicada
por
20,
e
esta
enzima
passa
a
ter
um
papel
importante
na
eliminação
de
bases
alteradas.
A
proteína
Ada
também
regula
outros
genes
tais
como
o
alkB
e
o
aidB.
O
papel
da
proteína
AlkB
é
o
reparo
de
N1MeA
e
N3MeC
em
DNA
em
hélice
simples,
já
descrito
anteriormente.
Por
outro
lado,
o
papel
da
proteína
AidB
ainda
não
está
bem
estabelecido.
Aparentemente
ela
inativa
agentes
alquilantes
antes
que
eles
causem
as
lesões,
não
participando
do
reparo
das
lesões.
Em
células
humanas
o
gene
da
O6MGT
foi
o
primeiro
que
mostrou
ser
indutível
por
estresses
genotóxicos
e
por
glicocorticóides,
conduzindo
à
resposta
adaptativa
das
células
aos
efeitos
citotóxicos
e
mutagênicos
de
agentes
alquilantes
simples.
A
expressão
de
O6MGT
é
regulada
pela
metilação
do
gene
e
do
promotor.
A
metilação
do
promotor
provoca
a
inibição
e
a
metilação
do
gene
resulta
no
aumento
da
expressão
da
proteína.
A
metilação
também
está
envolvida
na
resistência
adquirida
por
células
de
melanoma
contra
drogas
anticâncer
contendo
cloroetila.
Em
células
eucarióticas
ainda
não
se
detectou
a
reparação
das
metilações
nas
ligações
fosfotriéster.
b)
agentes
oxidantes
A
resposta
adaptativa
tem
sido
descrita
após
tratamento
com
diversos
agentes
químicos,
inclusive
com
peróxido
de
hidrogênio,
substância
que
atua
tendo
como
intermediários
radicais
livres,
especialmente
o
radical
hidroxil.
Existem
evidências
de
que
células
pré‐tratadas
com
peróxido
de
hidrogênio
tornam‐se
mais
resistentes
ao
UV
longo,
reforçando
a
idéia
deste
tipo
de
radiação
atuar
por
meio
de
EAO.
O
gene
oxyR
codifica
a
proteína
OxyR,
responsável
pelo
aumento
da
resistência
celular
ao
peróxido
de
hidrogênio.
O
produto
do
gene
oxyR
é
um
regulador
positivo
de
pelo
menos
9
genes.
Pelo
tratamento
com
peróxido
de
hidrogênio
a
proteína
OxyR
é
oxidada
em
dois
de
seus
resíduos
cisteína
acarretando
sua
ativação.
Uma
vez
ativada,
OxyR
ativa
a
transcrição
de
diversos
genes
tais
como:
katG
(catalase
hidroperoxidase
I),
ahpCF
(alquilhidroperóxido‐NADPH
oxido‐redutase),
grxA,
(glutaredoxina),
gor
(glutationa
redutase),
dps
(uma
VII
52
proteína
que
protege
o
DNA
das
lesões
de
peróxidos)
e
fur
(um
controlador
do
transporte
de
ferro
para
a
célula).
Os
outros
genes
ativados
ainda
não
foram
detectados.
Além
disto,
OxyR
ativa
a
síntese
de
oxyS,
que
codifica
um
mRNA
não
transcrito
que
parece
regular
mais
de
20
genes
adicionais,
possivelmente
por
um
mecanismo
antissense.
Recentemente
foi
detectado
mais
um
gene
que
requer
OxyR
para
a
sua
indução;
henF,
cujo
produto
é
requerido
para
a
ativação
de
hidroperoxidase
I
e
hidroperoxidase
II.
E
por
técnicas
de
“microarray”
foram
detectados
diversos
genes
ativados
por
OxyR:
henH,
cujo
produto
atua
na
síntese
do
heme,
seis
genes
do
operon
suf
que
parecem
participar
na
reparação,
no
“cluster”
de
Fe‐S,
e
mais
quatro
genes
de
função
desconhecida
Além
do
gene
oxyR
as
células
tratadas
com
peróxido
de
hidrogênio
induzem
um
conjunto
de
21
proteínas,
três
das
quais
são
também
induzidas
pelo
choque
térmico.
O
mecanismo
molecular
da
indução,
pelo
peróxido
de
hidrogênio,
dos
genes
independentes
de
oxyR
ainda
não
é
conhecido.
Da
mesma
forma
que
para
o
peróxido
de
hidrogênio,
o
tratamento
com
substâncias
que
geram
radicais
superóxido,
tais
como:
paraquat
e
menadiona,
torna
as
células
resistentes
a
altas
doses
desses
agentes,
na
dependência
da
integridade
do
locus
soxRS.
Este
sistema
regulatório
age
em
duas
etapas,
sendo
SoxR
uma
proteína
sensora
e
ativadora.
Quando
ativada
pela
oxidação
dos
clusters
2Fe‐2S,
SoxR
induz
a
transcrição
de
soxS,
um
regulador
positivo
que
estimula
a
transcrição
de
mais
de
16
outros
genes
responsáveis
pela
resposta
a
superóxido.
Normalmente
este
sistema
não
é
ativado
por
peróxido
de
hidrogênio,
entretanto
foi
demonstrado
recentemente
que,
em
condições
muito
especiais
tanto
o
H2O2
como
o
oxigênio
singleto,
podem
ativar
SoxRS.
Os
produtos
do
regulon
soxRS
induzido
incluem:
Mn‐superóxido
dismutase
(sodA),
endonuclease
IV
(nfo),
glicose‐6‐fosfato
desidrogenase
(zwf),
aconitase
(acnA),
fumarase
estável
(fumC),
ferridoxina
redutase
(fpr),
bomba
de
efluxo
de
toxinas
e
antibióticos
(acrAB),
mRNA
antissense
para
a
porina
OmpF
(micF)
e
o
controlador
de
transporte
de
ferro
para
a
célula
(fur)
e
outros
ainda
não
conhecidos.
Os
radicais
superóxido
induzem
proteínas
que
são
diferentes
das
induzidas
pelo
produto
do
gene
oxyR.
Uma
destas
proteínas
é
a
endonuclease
IV
(produto
do
gene
nfo),
que
é
a
única
enzima
de
reparação
conhecida
induzida
por
esta
via
de
estresse
oxidativo.
Em
células
de
mamíferos
ainda
não
foi
detectada
uma
resposta
articulada
induzida
pelo
estresse
oxidativo.
c)
termotolerância
Quando
células
são
expostas
a
altas
temperaturas
(não
letais)
uma
série
de
proteínas
de
choque
térmico
(HSPS)
são
induzidas
e,
neste
caso,
as
células
ficam
protegidas
contra
o
efeito
de
temperaturas
mais
elevadas
(letais).
Em
E.
coli
o
aumento
da
temperatura
de
37°C
para
42°C
induz
estas
proteínas
e
as
células
ficam
protegidas
contra
os
efeitos
letais
de
subseqüente
aquecimento
a
52°C.
Em
E.
coli
o
aumento
da
temperatura
ativa
e
estabiliza
o
fator
de
transcrição
das
HSPS
(σ32),
produto
do
gene
rpoH
(htpR),
impedindo
sua
ligação
com
duas
das
proteínas
induzidas,
DnaK
e
DnaJ.
Algumas
destas
proteínas
são
induzidas
por
outros
agentes
tais
como
análogos
de
aminoácidos,
deprivação
de
fontes
de
carbono,
infecção
por
fagos,
tratamento
com
etanol,
etc,
sugerindo
que
as
HSPS
podem
proteger
as
células
contra
uma
variedade
de
estresses
ambientais.
Durante
o
choque
térmico
são
induzidas
pelo
menos
20
proteínas
em
E.
coli
e
quase
todas
são
homólogas
às
induzidas
em
células
eucarióticas.
A
maioria
destas
proteínas,
incluindo
DnaK,
DnaJ,
GrpE,
GroEL,
etc,
são
denominadas
chaperonas
ou
chaperoninas
("protetores"),
uma
vez
que,
quando
superproduzidas
podem
proteger
várias
outras
proteínas
da
inativação
pelo
calor.
Algumas
delas
(DnaK,
DnaJ
e
GrpE)
conseguem
reativar
proteínas
desnaturadas
tais
como
a
RNA
polimerase
e
proteínas
ribossomais.
VII
53
Por
outro
lado,
pelo
menos
três
(Lon,
Clp
e
DegP)
são
proteases
que
estão
envolvidas
na
degradação
de
proteínas
desnaturadas
não
"reparáveis",
que
se
acumulam
durante
o
crescimento
normal
ou
em
condições
de
estresse.
Em
células
humanas
as
proteínas
induzidas
pelo
choque
térmico
são
homólogas
às
induzidas
nas
bactérias.
FUNÇÕES
SOS
Em
termos
de
reparo,
particular
importância
tem
sido
dada
a
um
conjunto
de
funções
celulares
desreprimidas
quando
surgem
lesões
no
DNA,
as
chamadas
funções
SOS,
cuja
expressão
é
dependente
da
existência
de
alelos
selvagens
de
dois
genes,
recA
e
lexA.
Em
E.
coli,
pelo
menos
40
genes
já
foram
identificados
como
capazes
de
se
desreprimir
nestas
condições,
o
que
caracteriza
a
pleiotropia
da
unidade
genética
constituída
por
recA
e
lexA.
Em
muitos
casos,
estas
respostas
só
se
expressam
em
condições
de
máxima
eficiência
quando
a
biossíntese
protéica
encontra‐se
plenamente
funcionante.
a)
controle
molecular
das
funções
SOS
O
sistema
de
controle
de
expressão
das
funções
SOS
é
relativamente
complexo,
envolvendo
as
proteínas
RecA
e
LexA.
O
modelo
hoje
admitido
fundamenta‐se
nos
seguintes
princípios,
todos
já
verificados
experimentalmente,
ao
menos
em
E.
coli,
e
mostrados
esquematicamente
na
figura
VII.30.
FIGURA
VII.30
–
Esquema
do
modelo
proposto
para
a
regulação
da
expressão
gênica
das
funções
SOS
em
E.
coli.
(Miroslav
Radman,
1973)
a) o
produto
do
gene
lexA
(proteína
LexA)
é
o
repressor
de
diversos
genes,
entre
os
quais
encontram‐se
o
próprio
gene
lexA,
o
gene
recA,
genes
ligados
a
processos
de
reparação,
genes
ligados
a
outras
funções
celulares
como
a
filamentação,
etc.;
b) a
proteína
RecA
é
uma
enzima
multifuncional,
desempenhando
diversos
papéis
na
célula
(controle
da
recombinação
genética
e
da
reparação
pós‐replicativa,
por
exemplo);
quando
ocorre
o
sinal
indutor,
algumas
moléculas
desta
proteína
passam
ao
estado
co‐proteolítico
(co‐protease
RecA),
cuja
VII
54
interação
com
a
proteína
LexA
promove
a
auto‐clivagem
desta
última;
como
esta
é
o
repressor
de
diversos
genes,
estes
se
desreprimem,
inclusive
o
próprio
gene
recA,
do
que
resulta
o
aumento
da
quantidade
intra‐celular
das
proteínas
RecA,
LexA
e
outras
que
estavam
reprimidas
por
LexA;
c) após
a
eliminação
das
lesões
(e
conseqüentemente
do
sinal
indutor),
o
nível
de
co‐protease
RecA
se
reduz
e
a
proteína
LexA,
neste
momento
acumulada
na
célula,
volta
a
reprimir
os
genes
indutíveis;
d) mesmo
seqüências
informacionais
que
não
sejam
reprimidas
pela
proteína
LexA
poderão
ser
liberadas
do
controle
se
seus
repressores
possuírem
estrutura
relativamente
semelhante
à
da
proteína
LexA,
pois
a
protease
RecA
será
também
capaz
de
clivá‐los,
o
que
ocorre,
por
exemplo,
com
o
repressor
do
profagoλ.
Além
dos
danos
produzidos
no
DNA
por
agentes
físicos
ou
químicos,
outros
fenômenos
podem
provocar
o
aparecimento
do
sinal
indutor,
tais
como
o
bloqueio
da
replicação
semiconservativa
do
DNA
ou,
no
caso
de
certos
mutantes
bacterianos
termossensíveis,
a
incubação
das
células
em
temperaturas
não
permissíveis.
b)
papel
dos
genes
recA
e
lexA
Grande
parte
dos
conhecimentos
que
tornaram
possível
a
proposição
dos
modelos
SOS
foi
obtida
mediante
o
isolamento
e
caracterização
de
diversos
mutantes
de
E.
coli,
possuidores
de
alterações
nas
seqüências
informacionais
dos
genes
recA
e
lexA.
A
análise
do
papel
destes
genes
foi
também
bastante
facilitada,
nos
últimos
anos,
pelo
emprego
de
técnicas
de
DNA
recombinante.
As
principais
mutações
isoladas
no
gene
recA
são:
recA
(Def),
que
acarreta
bloqueio
de
todas
as
funções
das
quais
participa
a
proteína
RecA,
incluindo
a
inexistência
de
recombinação
genética,
de
reparo
pós
replicativo
e
a
impossibilidade
de
expressão
das
funções
SOS,
uma
vez
que
não
há
produção
de
co‐protease
RecA;
recA
441,
que
faz
ser
a
proteína
RecA
ativável
para
o
estado
proteolítico,
mesmo
na
ausência
de
lesões
no
DNA
ou
de
bloqueio
da
replicação
semiconservativa,
por
simples
aumento
de
temperatura
(37°C
para
42°C);
recA
430,
que
bloqueia
a
função
de
co‐protease
da
proteína
RecA,
mantendo
intacta
a
função
recombinacional;
recA
142,
que
bloqueia
a
função
recombinacional
da
proteína
RecA,
mantendo
intacta
a
função
de
co‐protease.
As
principais
mutações
isoladas
no
gene
lexA
são:
lexA
(Ind‐),
que
acarreta
a
síntese
de
uma
proteína
LexA
resistente
à
clivagem;
desta
forma,
os
genes
não
podem
ser
desreprimidos
e
as
funções
SOS
não
se
expressam;
lexA
(Ts),
que
leva
à
síntese
de
uma
proteína
LexA
termossensível,
de
tal
forma
que,
mesmo
em
ausência
de
lesões
no
DNA,
as
funções
SOS
se
expressam
a
42°C;
lexA
(Def),
que,
pela
deficiência
em
proteína
LexA,
leva
à
expressão
permanente
(constitutiva)
das
funções
SOS.
Muitos
dos
atuais
conhecimentos
sobre
o
controle
exercido
pela
unidade
genética
recA‐lexA
foram
obtidos
por
meio
de
experimentos
realizados
com
o
emprego
do
bacteriófago
Mu,
cujo
DNA,
após
infectar
uma
célula
bacteriana,
pode
incorporar‐se
aleatoriamente
no
DNA
celular,
ou
seja,
pode
inserir‐se
nos
mais
diversos
sítios
do
cromossomo.
Por
meio
de
técnicas
de
DNA
recombinante
foi
construído
um
fago
Mu
com
as
seguintes
características:
(i)
operador
não
funcionante,
o
que
torna
a
expressão
de
seus
genes
dependente
do
operador
do
cromossomo
da
bactéria;
(ii)
inserção,
no
conteúdo
informacional
do
DNA
do
fago,
do
gene
lacZ,
gene
estrutural
que
codifica
para
a
síntese
da
β‐galactosidase;
(iii)
sítios
normais
e
funcionais
para
integração
no
cromossomo
bacteriano.
Quando
este
DNA
viral
insere‐se
no
gene
estrutural
de
uma
determinada
proteína
bacteriana,
esta
não
é
mais
sintetizada,
mas
o
operador
deste
gene
passa
a
controlar
a
formação
de
β
‐galactosidase.
Se
a
inserção
ocorre
em
um
operon
que
se
expresse
constitutivamente,
a
enzima
será
permanentemente
sintetizada
em
níveis
correspondentes
à
proteína
constitutiva
controlada
pelo
operon;
quando
a
inserção
se
processa
em
um
gene
indutível,
a
síntese
de
β‐galactosidase
obedecerá
ao
comando
do
VII
55
operador,
isto
é
ocorrerá
em
nível
basal
nas
células
não
induzidas
e
aumentará
em
presença
do
agente
indutor.
Nos
experimentos
visando
ao
estudo
das
funções
SOS,
a
bactéria
a
ser
infectada
era,
adicionalmente,
portadora
de
uma
deleção
no
gene
lacZ,
de
tal
forma
que
todas
as
moléculas
desta
enzima
formadas
podem
ser
atribuídas
à
transcrição
do
gene
contido
no
DNA
viral.
Assim,
para
acompanhar
a
desrepressão
de
uma
determinada
região
do
cromossomo
bacteriano,
basta
dosar,
quimicamente,
a
β‐galactosidase.
Nestas
condições,
em
mutantes
lexA
(Ind‐)
a
síntese
de
β‐galactosidase
será
basal
em
qualquer
situação
e
nos
mutantes
lexA
(Def)
será
constitutivamente
alta
quando
a
inserção
do
fago
se
der
em
um
gene
indutível
pelo
sistema
SOS.
Com
base
neste
tipo
de
procedimento,
e
em
outros
análogos,
foram
determinadas
as
posições,
no
mapa
cromossômico
de
E.
coli,
de
diversos
genes
desreprimidos
pelo
sinal
indutor
das
funções
SOS,
alguns
dos
quais
estão
relacionados
na
tabela
VII.3,
juntamente
com
as
funções
que
provavelmente
desempenham
na
célula.
Adicionalmente
alguns
genes
contidos
em
plasmídeos
podem
também
se
expressar
nestas
condições,
como
ocorre
com
os
genes
mucA
e
mucB,
participantes
do
controle
de
processos
incorretos
de
reparação
e
da
mutagênese
e
que
provavelmente,
são
alelos
dos
genes
bacterianos
umuC
e
umuD.
Alguns
genes
responsáveis
pela
síntese
de
colicinas,
também
contidos
em
plasmídeos,
desreprimem‐se
quando
ocorrem
lesões
no
DNA.
A
natureza
do
sinal
indutor
ainda
é
bastante
controvertida,
embora
dele
participem,
provavelmente,
regiões
do
DNA
em
hélice
simples
(pelas
lesões
ou
pela
inibição
da
replicação)
e
o
trifosfato
de
adenosina
(ATP).
Nestas
condições,
como
mostrado
na
figura
VII.30.
algumas
moléculas
da
proteína
RecA
passam
ao
estado
co‐proteolítico
e,
desta
forma,
adquirem
a
capacidade
de
promover
a
auto‐clivagem
da
proteína
LexA
e
outros
repressores,
cuja
estrutura
primária
tenha
algumas
afinidades
com
aquela,
o
que
ocorre,
por
exemplo,
com
o
repressor
do
profago
λ.
A
análise
da
seqüência
de
bases
nitrogenadas
nos
operadores
de
vários
genes
que
se
expressam
quando
as
funções
SOS
são
induzidas
permitiu
verificar
a
existência
de
significativas
homologias
entre
elas,
provável
razão
de
serem
reprimidos
pela
mesma
proteína
(LexA).
TABELA
VII.3
–
Alguns
genes
reprimidos
pela
proteína
LexA
em
E.
coli
Gene
Localização
(min)
Função
c)
principais
funções
SOS
Embora
todas
as
funções
SOS
sejam,
provavelmente,
induzidas
por
um
mecanismo
comum,
isto
não
significa
que
elas
se
desreprimam
simultaneamente.
As
diferenças
de
cinética
já
observadas
para
a
desrepressão
das
diversas
funções
talvez
possam
ser
explicadas
por
diferentes
graus
de
afinidade
entre
a
proteína
LexA
e
o
operador
ao
qual
ela
se
fixa.
Algumas
destas
funções
serão
resumidamente
abordadas
a
seguir.
Reativação
e
mutagênese
induzidas
de
fagos
Quando
um
fago,
lesado
pela
radiação
ou
por
um
agente
químico,
infecta
uma
bactéria,
os
sistemas
enzimáticos
desta
podem,
em
muitos
casos,
reparar,
total
ou
parcialmente,
as
lesões
formadas
no
DNA
viral,
o
que
constitui
o
fenômeno
da
reativação
pela
célula
hospedeira.
Quando,
entretanto,
a
bactéria
foi
VII
56
previamente
também
irradiada,
verifica‐se
um
significativo
aumento
da
capacidade
de
multiplicação
viral,
o
que
constitui
a
reativação
induzida
do
fago,
também
denominada
Weigle‐reativação.
Esta
reativação
é
acompanhada
de
elevada
mutagênese
entre
os
fagos
produzidos,
fenômeno
designado
como
mutagênese
induzida
do
fago
ou
Weigle‐mutagênese.
A
Weigle‐reativação
e
a
Weigle‐mutagênese
encontram‐se
esquematicamente
representadas
na
figura
VII.31.
FIGURA
VII.31
–
Weigle‐reativação
e
Weigle‐mutagênese.
A)
Esquema
experimental
para
observação
dos
fenômenos;
B)
Aumento
da
sobrevivência
de
fagos
irradiados,
quando
utilizados
para
infectar
células
também
lesadas;
C)
aumento
da
mutagênese,
nas
mesmas
condições.
Uma
vez
que
a
expressão
dos
dois
fenômenos,
depende
de
mecanismos
bioquímicos
que
se
processam
no
interior
da
célula,
é
fácil
prever
que
eles
alcancem
suas
máximas
amplitudes
algum
tempo
após
a
irradiação,
tempo
este
que,
em
E.
coli,
corresponde
a
cerca
de
30
minutos;
assim,
sua
visualização
torna‐se
mais
fácil
se
os
fagos
irradiados
infectarem
as
bactérias
meia
hora
após
a
exposição
destas
à
radiação,
ficando
as
células,
durante
este
tempo,
em
condições
que
assegurem
síntese
protéica.
Embora
existam
significativas
analogias
entre
a
Weigle‐reativação
e
a
Weigle‐mutagênese,
os
dois
fenômenos
não
podem
ser
considerados
como
expressão
de
um
único
mecanismo.
O
aumento
de
sobrevivência
depende
da
funcionalidade
dos
genes
uvrA,
uvrB,
uvrC,
umuC
e
umuD,
mas
pode
ocorrer
em
duplos
mutantes
recA(Def)
lexA(Def),
nos
quais
a
mutagênese
não
é
observada.
Assim,
é
possível
admitir
que
a
reativação
exija
somente
a
desrepressão
dos
genes
implicados
nas
funções
SOS,
requisito
atendido
nos
referidos
mutantes,
dada
a
alteração
da
proteína
LexA,
mas
mutações
no
fago
parecem
exigir,
além
da
desrepressão
destes
genes,
a
funcionalidade
da
proteína
RecA.
Mutagênese
bacteriana
VII
57
Como
já
foi
referido,
mutações
podem
ocorrer
por
erros
de
emparelhamento
durante
a
replicação
semiconservativa
do
DNA,
como
ocorre
em
células
tratadas
com
certos
agentes
alquilantes
(EMS,
MMS,
nitrosoguanidina,
etc.),
constituindo
a
mutagênese
direta.
Adicionalmente
também
ocorre
a
chamada
mutagênese
espontânea,
que
engloba
todas
as
mutações
para
as
quais
os
conhecimentos
atuais
não
permitem
identificar
um
agente
causal
(as
EAO
e
os
sítios
AP,
talvez
possam
justificar
algumas
ou
muitas
destas
mutações).
Mas
estas
formas
de
alteração
do
conteúdo
informacional
representam
somente
uma
pequena
fração
do
total
de
mutações
produzidas
nas
células.
A
maior
parte
é
conseqüência
de
processos
incorretos
de
reparação
das
lesões
provocadas
no
material
genético
o
que
constitui
a
mutagênese
indireta.
As
mutações
gênicas
consistem
em
modificações
da
seqüência
de
nucleotídeos
de
um
determinado
gene,
do
que
resulta
a
perda
da
atividade
do
produto
por
ele
codificado,
ou
sua
alteração;
no
nível
molecular,
este
tipo
de
mutação
pode
ser
provocado
por
dois
mecanismos
básicos,
quais
sejam:
a) a
substituição
de
uma
base
nitrogenada
por
outra,
fenômeno
que
inclui
as
transições
(substituição
de
uma
purina
por
outra
purina
ou
de
uma
pirimidina
por
outra
pirimidina)
e
as
transversões
(situação
na
qual
uma
base
purínica
é
substituída
por
uma
pirimidínica,
ou
vice
versa),
mostradas
na
figura
VII.32.
b) o
deslocamento
do
referencial
de
leitura
do
código
genético
("frameshift"),
conseqüente
à
inserção,
ou
à
deleção,
de
um
ou
mais
nucleotídeos
do
DNA,
como
pode
ser
visto
na
figura
VII.33.
FIGURA
VII.32
–
Mecanismos
de
mutagênese
por
substituição
de
bases
nitrogenadas.
A)
transição;
B)
transversão.
VII
58
FIGURA
VII.33
–
Mecanismos
de
mutagênese
por
defasagem
do
referencial
de
leitura.
A)
inserção
de
um
par
de
bases
nitrogenadas;
B)
deleção
de
um
par
de
bases
nitrogenadas;
C)
inserção
de
um
par
de
bases
e
deleção
de
outro,
em
sítios
próximos.
A
ocorrência
de
uma
mutação
gênica
em
uma
célula
pode
ser
detectada
mediante
a
verificação
da
alteração
fenotípica
dela
dependente,
tal
como
a
impossibilidade
de
sintetizar
uma
certa
enzima.
Em
muitos
casos,
é
possível
verificar
que
esta
enzima
não
está
presente
nas
células
mutadas,
ao
contrário
do
que
ocorre
nas
células
originais,
ditas
do
tipo
selvagem
em
relação
ao
caráter
genético
considerado;
em
outras
situações,
a
enzima
ainda
é
sintetizada,
mas
em
quantidades
reduzidas,
ou
com
atividade
diminuída.
Uma
vez
que
a
seqüência
de
nucleotídeos
de
um
gene
pode
ser
determinada,
torna‐se
relativamente
fácil,
analisar
a
mutação.
A
expressão
fenotípica
de
uma
mutação
gênica
pode
ser
alterada
pela
introdução,
no
patrimônio
genético
da
célula,
de
outra
mutação,
capaz
de
atuar
como
supressora
da
primeira.
A
mutação
supressora
pode
ocorrer
no
próprio
gene
mutado
(isto
é,
ser
intragênica,
como
ocorre
pela
inserção
ou
deleção,
de
um
nucleotídeo
em
uma
seqüência
na
qual
tenha
ocorrido
defasagem
do
referencial
de
leitura),
ou
processar‐se
em
um
gene
distinto
(supressão
intergênica,
que
se
expressa
mediante
modificação,
por
exemplo,
da
tradução
do
RNA
mensageiro
correspondente
ao
gene
mutado,
acarretando
a
síntese
de
uma
proteína
ativa).
À
luz
dos
conhecimentos
atuais,
deixando
de
lado
alguns
mecanismos
que
ainda
não
estão
esclarecidos,
a
mutagênese
indireta
parece
ser
uma
forma
de
expressão
das
funções
SOS.
Uma
evidência
de
sua
existência
foi
obtida
por
meio
de
experimentos
nos
quais
o
DNA
do
fago
ΦX174,
após
irradiação
com
UV,
foi
adicionado
a
extratos
celulares
obtidos
de
culturas
de
E.
coli,
irradiadas
ou
não.
Nesta
última
situação,
a
síntese
semiconservativa
é
interrompida
quando
a
polimerase
encontra
uma
lesão,
enquanto
na
primeira
ela
ultrapassa
as
fotolesões,
o
que
sugere
a
existência,
nos
extratos
acelulares
de
bactérias
irradiadas,
de
uma
polimerase
que
consegue
replicar
o
DNA
mesmo
ultrapassando
lesões
e,
conseqüentemente,
não
obedecendo
rigorosamente
às
informações
contidas
na
outra
hélice,
o
que
representa
um
requisito
para
o
reparo
mutagênico.
A
mutagênese
indireta
não
é
observada
em
mutantes
recA
(Def)
ou
lexA
(Ind‐),
nem
em
ausência
de
biossíntese
protéica,
o
que
permite
incluí‐la
entre
as
funções
SOS.
Adicionalmente,
em
células
de
E.
coli
portadoras
de
mutações
nos
genes
umuC
e
umuD
não
ocorre
mutagênese
indireta,
o
que
permite
supor
tenham
estes
genes
papéis
fundamentais
no
processo;
admite‐se,
assim,
que
eles
sejam
responsáveis
pelo
surgimento,
na
célula,
de
uma
polimerase
incorreta,
a
mutapolimerase
(em
verdade
a
PolV,
já
descrita).
VII
59
Esta
enzima
talvez
também
possa
provocar
erros
de
emparelhamento
durante
a
replicação
semiconservativa
de
moléculas
de
DNA
não
lesadas,
o
que
justificaria
o
aumento
de
mutagênese
observado
quando
fagos
não
irradiados
infectam
células
previamente
expostas
a
agentes
físicos
ou
químicos.
A
PolIV
foi
recentemente
implicada
neste
processo.
A
proteína
RecA,
além
de
desreprimir
os
genes
umuC
e
umuD,
quando
se
transforma
em
co‐protease,
deve
também
desempenhar
outro
papel
na
mutagênese
indireta,
uma
vez
que
o
fenômeno
não
ocorre
em
duplos
mutantes
recA
(Def)
lexA
(Def),
nos
quais
os
genes
umuC
e
umuD
estão
desreprimidos.
Recentemente
foi
detectado
que
a
co‐protease
RecA
também
está
envolvida
na
clivagem
da
proteína
UmuD,
gerando
UmuD’.
UmuD’
na
forma
de
dímero
e
em
conjunto
com
UmuC
constituem
a
mutapolimerase
DNA
polimerase
V,
a
maior
geradora
de
mutagênese
em
E.
coli.
Indução
lisogênica
Já
foi
visto
que
um
fago
temperado
pode
incorporar‐se
ao
cromossomo
bacteriano,
sob
a
forma
de
profago,
mantendo‐se
em
uma
espécie
de
equilíbrio,
graças
à
atuação
de
um
repressor,
de
natureza
protéica,
codificado
pelo
profago.
A
inativação
deste
repressor
leva
ao
rompimento
do
equilíbrio,
permitindo
a
chamada
indução
lisogênica.
A
destruição
do
repressor
(ou
mais
precisamente
a
sua
clivagem)
pode
ser
desencadeada
por
diversos
tratamentos
físicos
(como
irradiações)
ou
com
certos
agentes
químicos
(compostos
mutagênicos
e
cancerígenos,
por
exemplo).
Em
culturas
bacterianas,
já
foi
possível,
após
o
tratamento
indutor,
acompanhar
o
acúmulo
de
proteína
RecA,
sua
parcial
transformação
em
co‐protease
RecA
e
a
clivagem
do
repressor,
o
que
também
foi
visto
in
vitro,
empregando
repressor
purificado,
proteína
RecA
e
um
meio
adequado,
contendo
oligonucleotídeos.
A
cinética
de
clivagem
de
repressor
do
fago
pela
co‐protease
RecA
é
bem
mais
lenta
que
a
da
proteína
LexA,
apesar
das
analogias
estruturais
existentes
entre
elas.
Na
figura
VII.34
pode
ser
vista
a
cinética
de
indução
de
uma
cultura
lisogênica
de
E.
coli,
evidenciando‐se
a
produção
de
fagos
após
a
exposição
a
um
agente
que
lesa
o
DNA,
no
caso
a
radiação
UV.
É
interessante
ressaltar
que
esta
indução
não
ocorre
em
cepas
recA
(Def),
mas
pode
ser
detectada
em
células
lexA
(Ind‐),
embora
seja
mais
lenta
e
conduza
a
uma
menor
produção
de
fagos;
como,
nestas
condições,
não
deve
ocorrer
desrepressão
dos
genes
sob
o
controle
da
proteína
LexA,
é
possível
que
as
quantidades
basais
da
proteína
RecA
possam
redundar
na
formação
de
co‐protease
RecA
em
quantidades
suficientes
para
a
clivagem
do
repressor.
Aliás,
indução
lisogênica
em
cepas
selvagens
foi
observada
em
condições
de
bloqueio
da
biossíntese
protéica
por
um
antibiótico,
a
rifampicina,
que
inibe
a
transcrição
do
DNA.
FIGURA
VII.34
‐
Cinética
de
indução
de
uma
cultura
lisogênica
de
E.
coli,
após
irradiação
com
UV.
A
produção
de
fagos
está
expressa
pelo
número
de
unidades
formadoras
de
placas
de
lise
(ufp)
por
mililitro
de
cultura.
VII
60
Filamentação
Quando
uma
célula
bacteriana
sofre
lesões
produzidas
por
agentes
físicos
ou
químicos,
pode‐se
evidenciar
o
fenômeno
da
filamentação,
que
consiste
no
progressivo
aumento
das
dimensões
celulares,
especialmente
do
comprimento,
sem
que
ocorra
a
septação.
Se
o
fenômeno
atingir
uma
amplitude
excessiva,
ele
será
irreversível
e
conduzirá
à
inativação;
em
caso
contrário,
o
filamento
pode
sofrer
septação,
dando
origem
a
duas
ou
mais
células
viáveis,
isto
é,
capazes
de
formar
colônias
em
meio
de
cultura
gelosado.
A
filamentação
pode
ser
provocada
pela
expressão
fenotípica
de
algumas
mutações
em
genes
que
controlam
a
replicação
do
DNA,
assim
como
pela
indução
das
funções
SOS.
Em
E.
coli,
a
formação
de
filamentos
após
tratamento
com
agentes
físicos
ou
químicos
é
dependente
do
produto
de
dois
genes,
sulA
e
sulB,
anteriormente
designados
como
sfiA
e
sfiB,
ambos
sendo
reprimidos
pela
proteína
LexA,
o
que
explica
possam
ser
transcritos
quando
a
célula
acumula
co‐protease
RecA.
É
bastante
provável
que
a
filamentação,
desde
que
não
excessiva,
propicie
melhores
condições
para
a
manutenção
da
viabilidade
celular
após
a
produção
de
lesões
no
DNA.
Um
dos
modelos
aceitos
para
explicar
o
fenômeno
consiste
em
admitir
que
a
desrepressão
dos
genes
da
filamentação
levaria
à
biossíntese
de
um
ou
mais
fatores
protéicos,
capazes
de
inibir
a
septação
celular
e,
conseqüentemente,
a
divisão;
corrigidas
as
lesões
do
DNA,
a
síntese
deste
fator
cessaria
e
o
filamento
se
dividiria
em
duas
ou
mais
células.
Outras
funções
SOS
Como
já
foi
mencionado
na
tabela
VII.3,
diversas
outras
funções
SOS
foram
caracterizadas,
todas
dependentes
da
funcionalidade
dos
produtos
dos
genes
recA
e
lexA,
cujos
mecanismos
moleculares
só
agora
começam
a
ser
esclarecidos.
Entre
elas,
merecem
especial
menção
o
bloqueio
da
respiração
celular,
a
degradação
do
DNA
pós‐irradiação
e
a
radiorresistência
induzida.
O
bloqueio
da
respiração
celular
pós‐irradiação
constitui
uma
função
SOS
cuja
natureza
molecular
ainda
não
está
esclarecida,
não
ocorrendo
em
mutantes
recA
(Def)
ou
lexA
(Ind‐),
nem
em
ausência
de
biossíntese
de
proteínas.
É
possível
que
este
bloqueio
da
respiração
forneça
melhores
condições
à
célula
para
sobreviver
após
exposição
à
radiação.
A
degradação
do
DNA
pós‐irradiação
é,
em
grande
parte,
mediada
pela
exonuclease
V,
produto
dos
genes
recB,
recC
e
recD,
cuja
ação
é
controlada
pela
proteína
RecA.
Assim,
torna‐se
fácil
entender
que
em
mutantes
recA
(Def)
esta
degradação
seja
intensa
e
possa,
em
muitos
casos,
conduzir
à
inativação
celular.
Logo,
à
semelhança
do
que
foi
visto
para
a
filamentação,
um
certo
nível
de
degradação
do
DNA
parece
favorecer
a
manutenção
da
viabilidade
celular,
mas,
se
exagerada,
ela
deve
conduzir
ao
resultado
oposto.
A
radiorresistência
induzida
consiste
no
fato
de
que
células
previamente
expostas
a
doses
relativamente
reduzidas
de
UV
ou
de
radiações
ionizantes
tornam‐se
mais
resistentes
a
uma
nova
irradiação
com
estas
últimas;
uma
vez
que
este
fenômeno
depende
dos
mesmos
requisitos
que
as
funções
SOS,
ele
costuma
ser
incluído
entre
as
respostas
celulares
induzidas
pela
presença
de
lesões
no
DNA.
Como
algumas
enzimas
ligadas
ao
reparo
são
acumuladas
intracelularmente
após
a
exposição
à
radiação
ou
a
agentes
químicos,
torna‐
se
lógico
supor
que
este
acúmulo
crie
melhores
condições
para
a
sobrevivência
a
uma
segunda
irradiação.
Funções
SOS
em
eucariotos
?
A
existência,
em
células
de
mamíferos,
de
funções
análogas
às
que
acabam
de
ser
descritas
em
bactérias
constitui
um
dos
pontos
mais
polêmicos
entre
os
foto
e
radiobiologistas.
Diversos
fenômenos
foram
observados
e
interpretados
como
uma
forma
de
expressão
de
mecanismos
induzidos
de
reparação
do
DNA
em
eucariotos,
mas,
em
muitos
casos,
outras
interpretações
são
igualmente
possíveis.
Entre
os
mecanismos
descritos,
o
aumento
de
sobrevivência
de
vírus
irradiados,
quando
infectam
células
de
diversas
linhagens
também
lesadas
por
tratamentos
físicos
ou
químicos,
parece
constituir
a
menos
controvertida
forma
de
expressão
de
funções
análogas
às
SOS.
Este
fenômeno
foi
observado,
por
exemplo,
com
fibroblastos
humanos,
células
de
rim
de
macaco,
células
HeLa
e
células
de
xeroderma
pigmentosum,
após
exposição
ao
UV
ou
aos
raios
X.
Mas
a
parcial
sincronização
da
divisão
celular
promovida
por
estes
tratamentos
talvez
possa
justificar
o
aumento
de
sobrevivência,
independentemente
de
alguma
forma
de
desrepressão
gênica.
VII
61
A
hipótese
da
existência
de
um
mecanismo
geral
do
controle
de
diversos
genes
em
eucariotos
é
bastante
atraente,
pois,
se
verificada
experimentalmente,
ela
poderia
justificar
inúmeros
fenômenos
da
maior
relevância,
entre
os
quais
a
própria
transformação
neoplásica.
Genes
e
proteínas
induzidas
por
lesões
no
DNA
Existem
cerca
de
20
genes
GADD
(Growth
Arrest
by
DNA
Damage),
definidos
por
um
aumento
de
seus
transcritos
após
o
aparecimento
das
lesões.
Entre
as
proteínas
de
reparação
a
indução
de
Polβ
por
agentes
alquilantes
é
bem
documentada
e
existem
evidências
que
O6MGT
é
induzida
por
MNNG
e
outros
agentes,
incluindo
UV,
por
mecanismos
ainda
desconhecidos.
Uma
proteína
que
se
liga
a
lesões
do
DNA
(DDB)
é
induzida
por
UV
e
cisplatina.
Ela
se
liga
ao
fotoproduto
6‐4
mas
não
ao
dímero
ou
adutos
de
cisplatina
e
está
ausente
em
alguns
pacientes
XPE,
mas
não
em
outros.
A
heme
oxigenase,
que
faz
o
heme
ser
convertido
em
bilirrubina
(aceptor
de
EAO)
é
altamente
induzida
por
UV
longo
e
H2O2
e
existem
algumas
evidências
de
que
ela
tenha
um
papel
na
defesa
celular
como
antioxidante.
Reativação
de
vírus
Como
descrito
para
E.
coli
,
uma
das
respostas
SOS
é
o
aumento
da
sobrevivência
e
mutagênese
de
bacteriófagos
em
células
irradiadas
(W‐reativação
e
W‐mutagênese).
Experimentos
similares
foram
realizados
em
células
humanas
usando
uma
grande
variedade
de
tratamentos
e
vários
tipos
de
vírus
(herpes
simplex,
citomegalovírus,
etc).
Os
pré‐tratamentos
das
células
foram
feitos
com
UV,
raios
X,
agentes
alquilantes,
cafeína,
hidroxiuréia,
etc.,
e
os
vírus
foram
submetidos
aos
mesmos
tratamentos
ou
com
outros
agentes
lesivos.
Na
maioria
dos
casos
os
resultados
foram
negativos
e,
quando
positivos,
foram
altamente
variáveis
e
muito
menores
do
que
os
observados
para
a
W‐reativação
em
E.
coli.
A
reativação
foi
observada
em
células
XP
e
vírus
herpes
simplex,
mostrando
que
o
fenômeno
seria
independente
da
reparação
por
excisão
de
nucleotídeos,
entretanto,
muitos
estudos
foram
realizados
posteriormente
e
os
resultados
não
foram
confirmados,
e
principalmente,
nunca
foi
detectado
aumento
de
mutagênese
em
vírus
herpes
tratados
com
radiação
UV.
ALTERAÇÕES
GENÉTICAS
E
REPARO
DO
DNA
NA
CARCINOGÊNESE
HUMANA
Alterações
genéticas
Dados
experimentais
e
epidemiológicos
suportam
uma
associação
causal
entre
alterações
genéticas
e
câncer.
A
inativação
mutacional
de
genes
supressores
de
tumor
e
a
ativação
de
oncogenes
estão
associadas
à
maioria
dos
cânceres,
sendo
que
a
maioria
das
substâncias
mutagênicas
é
cancerígena.
Além
disto,
a
deficiência
em
reparação
do
DNA
é
associada
ao
risco
de
cancerização,
já
que
a
deficiência
em
reparação
pode
conduzir
à
mutagênese.
É
postulado
que
a
mutagênese
tem
um
papel
tanto
na
iniciação
como
na
progressão
da
carcinogênese,
já
que
o
processo
celular
que
suprime
a
mutagênese
está
comprometido.
A
associação
entre
alterações
genéticas
e
câncer
foi
observada
há
muitos
anos.
Por
exemplo,
a
translocação
cromossômica
denominada
Philadelphia
é
encontrada
na
maioria
dos
glóbulos
brancos
de
pacientes
com
leucemia.
Adicionalmente
as
células
tumorais
apresentam
instabilidade
genética,
aberrações,
rearranjos,
aneuploidia,
etc.
O
início
do
entendimento
das
alterações
genéticas
veio
dos
estudos
de
vírus
oncogênicos.
Vírus
oncogênicos
a
RNA
expressam
oncogenes
c‐ras
e
c‐myc,
que
permitem
a
transformação
pelos
vírus
e
têm
homologia
com
proto‐oncogenes
humanos
RAS
e
MYC.
Posteriormente
foi
detectado
que
RAS
e
MYC
são
superexpressos
em
células
cancerosas
através
de
potentes
promotores
heterólogos.
VII
62
O
estudo
do
retinoblastoma
humano
levou
à
detecção
do
gene
supressor
de
tumor
RB
(RetionoBlatoma),
cuja
perda
de
função
leva
à
formação
de
tumores
na
retina
de
crianças.
Outro
supressor
de
tumores
é
a
proteína
p53,
que
inicialmente
foi
identificada
como
o
alvo
do
vírus
tumoral
SV40
e
mais
tarde
foi
mostrado
estar
inativada
em
uma
série
de
células
tumorais.
Mutações
puntiformes
e
deleções
são
encontradas
em
RB
e
TP53
e,
a
perda
do
segundo
alelo
em
cânceres
hereditários
ocorre
com
freqüência
aumentada.
Diversos
genes
supressores
são
conhecidos
atualmente.
Foi
postulado
que
o
mínimo
de
mutações
requeridas
para
a
transformação
oncogênica
em
humanos
inclui
inativação
de
TP53
e
RB,
ativação
de
RAS
(ou
outros
membros
desta
via)
e
expressão
constitutiva
de
TERT,
genes
que
controlam
a
proliferação
celular.
As
mutações
mais
prevalentes
nos
cânceres
humanos
são
nos
genes
repressores
TP53
e
RB,
e
são
representadas
tanto
por
troca
de
bases
como
por
deleções/inserções.
A
proteína
RB
é
o
regulador
chave
do
ciclo
celular
e
a
perda
desta
função
leva
à
proliferação
celular
e
falência
da
diferenciação
terminal,
isto
é,
um
aumento
do
“nascimento
celular”.
A
proteína
p53
é
importante
na
resposta
celular
ao
estresse,
controlando
o
reparo
do
DNA
o
ciclo
celular
e
a
apoptose,
por
isso
a
perda
de
função
da
p53
pode
levar
à
diminuição
da
apoptose,
isto
é,
um
decréscimo
da
“morte
celular”,
por
isto,
a
inativação
destes
genes
leva
a
um
aumento
do
número
de
células,
isto
é,
à
proliferação
celular.
O
desenvolvimento
do
câncer
pode
ser
também
promovido
por
mutações
que
ativam
a
expressão
de
proto‐oncogenes
que
regulam
a
proliferação
celular,
através
da
secreção
de
fatores
de
crescimento
(PDGF),
receptores
de
tirosina
cinase
de
superfície
(EGFR,
HER),
sinais
de
tradução
de
proteínas
G
(RAS)
e
fatores
de
transcrição
nuclear
(MYC).
Mutações
“missense”
em
RAS
são
encontradas
em
cerca
de
20%
dos
cânceres
estudados.
O
gene
MYC
é
normalmente
ativado
por
rearranjos
que
colocam
o
gene
sob
o
comando
de
promotores
fortes,
levando
ao
aumento
do
número
de
cópias
de
mRNA.
Estes
fatores
conduzem
à
estimulação
da
proliferação
celular,
levando
à
expansão
da
população
celular,
acumulando‐se
com
os
efeitos
da
perda
da
função
da
supressão
de
tumores.
Um
requerimento
adicional
peara
o
desenvolvimento
do
câncer
é
a
“imortalização”
celular.
Células
normais
têm
um
número
finito
de
divisões
e
morrem.
Isto
é
atribuído
ao
encurtamento
gradual
das
seqüências
repetidas
teloméricas
no
final
dos
cromossomos,
que
os
protegem
contra
a
degradação
e
junção
dos
seus
terminais.
A
ausência
de
telômeros
leva
à
instabilidade
genética
e
morte
celular
por
apoptose.
As
células
tumorais
conseguem
se
“perpetuar”
ligando
o
gene
da
telomerase
(TERT),
que
codifica
uma
enzima
que
mantém
o
comprimento
do
telômero.
Na
figura
VII.35
pode
ser
visto
um
esquema
das
alterações
genéticas
no
processo
de
cancerização.
Reparo
do
DNA
e
vias
de
pontos
de
checagem
As
células
elaboraram
mecanismos
para
salvaguardar
a
integridade
informacional
do
genoma
pela
supressão
de
mutações.
Estes
mecanismos
incluem:
(a)
pontos
de
checagem
no
ciclo
celular
para
assegurar
alta
fidelidade
na
replicação
(1
erro
em
106
nucleotídeos
incorporados);
(b)
vias
que
suprimem
o
estresse
oxidativo,
impedindo
as
lesões
oxidativas;
(c)
vias
que
regulam
a
progressão
do
ciclo
celular
e
(d)
vias
de
reparo
de
DNA
que
corrigem
todos
os
tipos
de
lesões
endógenas
e
exógenas.
Mais
de
130
genes
de
reparação
do
DNA
já
foram
detectados
em
células
humanas.
Uma
das
primeiras
doenças
hereditárias
estudadas
e
associadas
com
o
risco
de
câncer
foi
o
xeroderma
pigmentosum,
caracterizado
como
um
dramático
aumento
do
risco
de
câncer
induzido
pela
exposição
ao
sol,
devido
à
deficiência
de
reparação
por
excisão
de
nucleotídeos,
um
processo
que
nos
seres
humanos
requer
mais
de
30
proteínas.
VII
63
Figura
VII.35
–
Alterações
genéticas
no
câncer
XPA
a
XPG
são
requeridos
para
o
reparo
genômico
global
(GGR)
enquanto
o
reparo
ligado
à
transcrição
requer
os
genes
da
síndrome
de
Cockayne
(CSA
e
CSB)
assim
como
algumas
proteínas
XP,
cuja
deficiência
causa
os
riscos
de
câncer.
A
alta
fidelidade
da
replicação
é
normalmente
atribuída
à
Polδ
pela
sua
função
editorial.
Por
outro
lado
o
aumento
da
atividade
da
Polβ,
menos
acurada
na
reparação,
pode
aumentar
a
mutagênese
e
o
risco
de
aparecimento
de
câncer.
Outras
DNA
polimerases
menos
acuradas
também
podem
contribuir
para
o
aparecimento
de
câncer,
como
é
o
caso
da
Polη,
que
em
frente
aos
dímeros
TT
coloca
as
bases
certas
AA.
Na
sua
falta
(caso
do
XPV)
ela
é
substituída
pela
Polι
que
é
muito
menos
acurada,
causando
mutações
que
levarão
ao
alto
risco
de
câncer.
Outro
sistema
de
reparação
associado
ao
câncer
é
o
MMR,
cujo
defeito
conduz
ao
alto
risco
de
câncer
de
cólon
(HNPCC).
As
mutações
nos
genes
MMR,
também
estão
associadas
à
instabilidade
de
microssatélites
e
a
um
grande
aumento
de
mutações
somáticas,
como
visto
anteriormente.
Outros
genes
associados
a
risco
de
câncer
são
os
envolvidos
com
a
sinalização
de
lesões,
pontos
de
checagem
no
ciclo
celular
e
reparo
de
quebras
duplas
do
DNA
Quando
a
progressão
das
forquilhas
de
replicação
é
bloqueada
por
lesões
no
DNA,
alguns
mecanismos
de
reparação
são
induzidos,
entre
os
quais
helicases
tipo
RECQ,
tais
como
BLM
e
WRN.
Estas
paradas
da
forquilha
também
podem
causar
quebras
duplas
que
necessitam
do
complexo
MRN
(MRE11,RAD50
e
NSB)
para
seu
reparo,
assim
como
BRCA1
e
BRCA2.
Por
outro
lado
os
genes
FANC
são
necessários
para
a
reparação
de
ligações
cruzadas.
As
células
humanas
também
têm
diversos
mecanismos
regulatórios
denominados
de
pontos
de
checagem,
que
entram
em
ação
bloqueando
a
progressão
do
ciclo
celular
para
permitir
a
reparação
das
lesões.
Por
exemplo,
a
proteína
cinase
codificada
pelo
gene
ATM,
o
qual
está
mutado
em
pacientes
com
ataxia
telangiectasia
(AT)
é
um
dos
mais
importantes
reguladores.
Esta
cinase
é
ativada
em
resposta
a
vários
tipos
de
lesão
e
então
passa
a
ativar
proteínas
regulatórias
do
ciclo
celular
como
p53
e
de
reparação
(NBS1),
como
visto
anteriormente.
A
perda
destas
funções
resulta
em
instabilidade
genômica
e
risco
de
câncer.
VII
64
Uma
vez
que
a
reparação
do
DNA
é
essencial
para
o
não
aparecimento
de
mutações
e
câncer,
substâncias
de
bloqueiem
a
reparação
podem
agir
como
co‐carcinogênicos.
Um
exemplo
é
o
arsênico.
Esta
substância,
por
si,
não
é
mutagênica
nem
cancerígena,
entretanto,
por
ser
capaz
de
bloquear
os
mecanismos
de
reparação,
principalmente
aqueles
envolvidos
na
reparação
das
lesões
da
radiação
UV,
é
considerada
um
potente
co‐carcinogênico.
Portanto,
é
possível
que
outros
agentes
possam
aumentar
o
risco
de
câncer
pelos
mesmos
mecanismos.
Mutadores,
proliferação
e
desenvolvimento
de
câncer
Foi
estimado
que
muitas
células
tumorais
têm
milhares
de
mutações.
Entretanto,
não
está
claro
se
a
instabilidade
genética
é
a
causa
ou
a
conseqüência
do
fenótipo
do
câncer.
Diversos
argumentos
sugerem
que
o
fenótipo
mutador
seja
a
causa
do
câncer.
Por
esta
hipótese
é
assumido
que
pelo
menos
5
eventos
(mutações)
são
requeridos
para
o
desenvolvimento
do
câncer
Assumindo
que
as
mutações
somáticas
são
em
torno
de
10‐6
por
divisão
celular,
a
probabilidade
de
5
eventos
independentes
ocorrerem
em
uma
célula
seria
de
10‐30
por
divisão.
Mesmo
considerando
que
temos
1014
células
no
corpo
e
em
torno
de
50
divisões
durante
a
vida,
isto
leva
a
um
risco
calculado
de
10‐15.
Desde
que
o
câncer
é
muito
mais
prevalente
que
isto,
é
sugerido
que
um
aumento
da
freqüência
de
mutações
seja
necessário
para
o
desenvolvimento
do
câncer.
Embora
seja
claro
que
um
aumento
da
mutagênese
possa
promover
o
desenvolvimento
do
câncer,
pode
ser
questionado
que
em
tecidos
altamente
proliferativos
a
indução
do
fenótipo
mutador
não
seja
um
pré‐
requisito
para
o
desenvolvimento
do
câncer.
Neste
caso,
podem
ocorrer
divisões
suficientes
de
células
promovendo
acumulação
de
mutações
que
promovem
vantagem
seletiva
e
expansão
clonal.
Se
o
primeiro
evento
provoca
uma
vantagem
no
crescimento
da
célula,
ela
irá
proliferar,
aumentando
a
probabilidade
do
segundo
evento
dentro
da
população
expandida.
Isto
está
de
acordo
com
o
aumento
de
câncer
com
a
idade.
Tempo
maior
e
maior
número
de
divisões
aumentam
a
probabilidade
de
geração
do
estado
mutador
ou
mais
mutagênese
e
expansão
clonal.
É
bem
conhecido
que
a
estimulação
da
proliferação
celular
tanto
por
injuria
como
por
promotores
de
tumor
ou
hormônios
podem
aumentar
os
efeitos
mutagênicos
de
agentes
genotóxicos.
Por
exemplo,
o
promotor
de
tumor
TPA
(forbol
12‐miristato
13
acetato)
aumenta
a
freqüência
de
mutações
induzidas
pelo
benzo[a]pireno,
em
camundongos,
devido
ao
aumento
da
proliferação
das
células
lesadas.
Isto
é
também
observado
com
N‐etil‐N‐nitrosoureia,
cuja
mutagenicidade
é
dramaticamente
aumentada
em
fígado
com
hepatectomia
parcial
(que
aumenta
a
proliferação
celular).
É
possível
que
a
proliferação
celular
induzida
por
hormônios
como
estrogênio
ou
hiperplasia
por
agentes
externos
como
arsênico
possam
aumentar
a
mutagênese.
Tais
agentes
estimulam
a
expansão
da
população
mutante,
que
adquiriu
vantagem
seletiva
e
ambos
os
efeitos
contribuem
para
a
ligação
entre
proliferação
celular
e
aumento
do
risco
de
câncer.
Mecanismos
epigenéticos
Alterações
na
expressão
de
genes
ligados
ao
câncer
podem
ocorrer
por
mecanismos
epigenéticos.
O
mais
conhecido
mecanismo
epigenético
envolve
e
metilação
do
DNA
e
a
acetilação,
metilação
e
fosforilação
de
histonas.
A
desmetilação
de
regiões
promotoras
nas
seqüências
GpC
podem
levar
à
superexpressão
de
proto‐
oncogenes
e
o
silenciamento
da
expressão
gênica
pode
ocorrer
como
resultado
da
hipermetilação,
podendo
conduzir
à
condensação
cromossômica.
Parece
haver
uma
relação
entre
a
metilação
do
DNA
e
modificações
nas
histonas.
Algumas
desacetilações
e
metilações
de
histonas
estão
associadas
com
a
metilação
do
DNA
e
silenciamento
de
genes.
Estas
mudanças
epigenéticas
também
podem
tornar
os
genes
mais
suscetíveis
a
lesões,
alterando
a
sensibilidade
de
algumas
seqüências
à
mutação.
VII
65
DOENÇAS
HUMANAS
ASSOCIADAS
A
DEFICIÊNCIAS
EM
REPARO
DE
DNA
O
mecanismo
melhor
conhecido
é
o
que
correlaciona
a
deficiência
na
correção
de
erros
de
emparelhamento
e
o
aparecimento
de
câncer
de
cólon
(HNPCC).
No
homem
existem,
pelo
menos,
três
doenças
caracterizadas,
em
parte,
por
uma
deficiência
do
mecanismo
de
Reparo
por
Excisão
de
Nucleotídeos:
xeroderma
pigmentosum
(XP),
tricotiodistrofia
(TTD)
e
síndrome
de
Cockayne
(CS).
Somente
os
pacientes
XP
são
caracterizados
por
uma
forte
incidência
de
cânceres
cutâneos
localizados
nas
zonas
expostas
ao
sol.
Essas
três
doenças
raras
são
hereditárias
e
transmitidas
de
modo
autossômico
e
recessivo;
além
disso,
várias
outras
patologias
humanas
decorrem
do
mau
funcionamento
de
outros
mecanismos
de
reparação
de
lesões
de
DNA.
Entre
elas
podemos
citar
a
Anemia
de
Fanconi,
Ataxia
Telangiectasia,
Síndrome
de
Nigmegen,
Síndrome
de
Werner,
Síndrome
de
Bloom,
Síndrome
de
Rapadilino
e
Síndrome
de
Rothmund
Thomson.
De
maneira
geral,
a
vinculação
entre
essas
patologias
e
os
sistemas
de
reparação
de
lesões
de
DNA
resulta
do
fenótipo
de
hipersensibilidade
das
células
provenientes
desses
pacientes
aos
mais
diversos
agentes
genotóxicos
(radiação
UV,
radiação
ionizante,
agentes
promotores
de
ligações
cruzadas,
etc)
e
do
fenótipo
de
predisposição
ao
desenvolvimento
de
neoplasias.
Isto
porque,
os
genes
que
participam
dos
diferentes
mecanismos
de
reparação
de
lesões
de
DNA
pertencem
à
categoria
dos
assim
chamados
“guardiões”.
A
inativação
desses
genes
gera
instabilidade
no
genoma,
abrindo
caminho,
desta
forma,
para
o
estabelecimento
de
uma
neoplasia.
Deficiência
de
correção
de
erros
de
emparelhamento
(HNPCC)
A
Síndrome
de
Lynch
é
uma
das
principais
síndromes
que
causam
predisposição
para
câncer
e
que
afeta
1
em
cada
200
indivíduos
da
população
mundial.
Células
de
alguns
cânceres
esporádicos
e
virtualmente
de
todos
os
tumores
associados
com
o
câncer
coloretal
hereditário,
não‐polipose
(HNPCC
=
Síndrome
de
Lynch)
são
altamente
mutáveis.
Assim
como
as
bactérias
deficientes
na
correção
de
erros
de
emparelhamento,
linhagens
celulares
derivadas
destes
tumores
acumulam
mutações
em
números
que
podem
ser
mais
de
cem
vezes
maiores
que
nas
células
normais
e
a
análise
bioquímica
demonstra
que
na
maioria
das
linhagens
há
deficiência
no
reparo
de
erros
de
emparelhamento.
A
Síndrome
(HNPCC)
é
herdada
de
maneira
autossômica
dominante,
com
células
normais
de
indivíduos
afetados
contendo
uma
cópia
funcional
e
uma
deficiente
do
gene
de
reparo
em
questão.
Portanto,
células
normais
de
pacientes
HNPCC
são
pouco
mutáveis
já
que
têm
uma
cópia
selvagem
do
gene.
Células
tumorais,
por
outro
lado,
são
deficientes
nas
duas
cópias
do
gene
afetado
devido
à
inativação
do
gene
selvagem
como
resultado
de
uma
mutação
somática.
Associada
à
demonstração
do
defeito
de
reparo
nas
células
cancerosas,
esta
observação‐chave
implica
que
o
evento
inicial
dos
tumores
HNPCC
é
a
perda
funcional
de
uma
atividade
crítica
de
correção
de
erros
de
emparelhamento,
com
a
resultante
desestabilização
genética
presumivelmente
conduzindo
a
mutações
que
modificam
os
sistemas
regulatórios
que
controlam
a
proliferação
celular.
Famílias
HNPCC
são
definidas
comumente
como
aquelas
nas
quais
pelo
menos
três
parentes
em
duas
gerações
tiveram
câncer
coloretal,
com
um
dos
parentes
tendo
sido
diagnosticado
com
menos
de
50
anos
de
idade.
Foi
observada
instabilidade
genética,
tumor‐específica,
em
HNPCC
e
em
alguns
cânceres
esporádicos.
Famílias
Lynch
I
são
precocemente
susceptíveis
ao
câncer
coloretal,
enquanto
famílias
Lynch
II
têm
também
um
risco
para
tumores
epiteliais
extracólon,
do
endométrio,
ovário,
estômago,
intestino
delgado,
rim
e
ureter.
Em
adição
aos
cânceres
extracólon,
característica
de
Lynch
II,
famílias
Muir‐Torre
compreendem
uma
terceira
e
rara
classe
de
pacientes
HNPCC
também
sujeitos
a
tumores
de
glândulas
sebáceas.
A
primeira
evidência
de
aumento
de
mutabilidade
e
câncer
veio
do
fato
de
que
alguns
tumores
de
cólon
e
a
maioria
dos
tumores
que
ocorrem
em
pacientes
HNPCC
contêm
mutações
freqüentes
em
seqüências
simples
repetidas
(A)n,
(GGC)n
ou
(CA)n.
Mutações
nestas
seqüências
repetidas
(microssatélite)
são,
tipicamente,
tumor‐
específicas,
indicativas
de
origem
somática
e,
sua
incidência
é
dramática.
As
células
tumorais
acumulam
milhares
de
mutações
em
microssatélites.
VII
66
Foi
descrita
instabilidade
de
microssatélites
para
muitos
tumores
incluindo
o
coloretal
(12‐28%),
endometrial
(17‐23%),
de
estômago
(18‐39%),
ovariano
(16%),
cervical
(15%),
pancreático
(67%),
adenoma
esofágico
(22%),
de
células
escamosas
da
pele
(50%)
e
próstata
(20‐38%).
A
presença
de
numerosas
mutações
em
microssatélites
de
tumores
foi
postulada
ser
o
reflexo
da
quebra
da
fidelidade
da
replicação
do
DNA
ou
do
seu
reparo,
e
o
fenótipo
MIN+
(Microsatellite
INstability)
é
usado
para
designar
tumores
que
têm
instabilidade
de
microssatélites.
O
estabelecimento
do
fenótipo
hipermutável
é
um
evento
primário
na
tumorigênese
coloretal
MIN+,
e
a
instabilidade
genética
permanece
após
a
transformação.
Existem
diversas
categorias
de
células
tumorais
de
cólon
hipermutáveis,
com
variação
de
seus
espectros
de
mutação.
Por
exemplo,
taxas
de
mutação
em
seqüências
(CA)n
e
HPRT
[Hypoxantin
PhosphoRibosyl
Transferase
(células
ficam
resistentes
a
6‐tioguanina)]
são
ambas
elevadas
centenas
de
vezes
em
MIN+
HCT116
(também
chamada
H6)
e
na
linhagem
RKO,
enquanto
a
linhagem
HCT‐15
é
caracterizada
pelas
centenas
de
mutações
em
HPRT,
mas,
somente
um
aumento
muito
pequeno
de
mutações
em
seqüências
de
dinucleotídeos
(CA)n,
sendo,
portanto,
uma
linhagem
MIN±.
Uma
terceira
classe,
Vaco410,
foi
designada
MIN‐,
embora
seja
hipermutável
para
HPRT.
A
maioria
das
famílias
HNPCC
examinadas
tem
mutações
em
MSH2
ou
MLH1.
Mutações
em
PMS2
são
responsáveis
por
uma
pequena
fração
dos
casos
de
HNPCC.
Como
esperado
pela
herança
dominante
de
HNPCC,
as
células
normais
dos
indivíduos
afetados
são
tipicamente
MIN‐
e,
heterozigotas
para
um
defeito
em
um
dos
alelos.
Em
contraste,
as
células
tumorais
são
deficientes
em
ambos
os
alelos
do
gene
em
questão,
com
a
perda
do
alelo
selvagem
por
uma
mutação
somática
ou
perda
da
heterozigose,
o
que
conduz
ao
desenvolvimento
do
tumor.
As
células
tumorais
apresentam
deficiência
no
sistema
de
correção
de
erros
de
emparelhamento,
sendo
que
as
linhagens
mais
estudadas
(H6,
LoVo
e
HEC‐1‐A)
são
deficientes
em
ambos
os
alelos
de
MLH1,
MSH2
ou
PMS2,
respectivamente.
O
desenvolvimento
do
tumor,
entretanto,
necessita
de
outros
estímulos
para
assegurar
a
sua
capacidade
proliferativa,
necessária
para
suportar
a
expansão
clonal,
requerida
para
produzir
uma
massa
tumoral.
Possivelmente,
isto
é
conseguido
pelas
muitas
mutações
que
se
acumulam
nas
células
deficientes
na
reparação
de
erros
de
emparelhamento
e
a
outros
fatores
genéticos
ou
epigenéticos.
Outra
questão
intrigante
é
a
especificidade
dos
tecidos
onde
aparecem
os
cânceres
devidos
a
erros
de
emparelhamento.
Recentemente
foi
documentada
uma
grande
correlação
entre
defeitos
no
gene
do
receptor
do
TGF‐β
tipo
II
e
o
fenótipo
MIN+
em
células
de
câncer
coloretal.
As
mutações
neste
gene
são
raras
em
células
MIN‐,
mas
são
comuns
em
células
tumorais
MIN+,
com
as
mutações
localizadas
na
repetição
(A)10
em
sete
casos
e
na
(GT)3
em
um
caso.
Desde
que
a
falha
de
resposta
à
inibição
do
crescimento
por
TGF‐β
é
característica
de
alguns
tumores
epiteliais
estes
achados
ligam
diretamente
hipermutabilidade
de
“pontos
quentes”
de
mutagênese
em
um
locus
envolvido
com
o
controle
da
proliferação
celular.
Em
contraste
com
o
gene
humano,
o
gene
do
receptor
TGF‐β
tipo
II
de
camundongos
não
tem
o
ponto
quente
(A)10,
o
que
possivelmente
explica
o
não
desenvolvimento
de
câncer
coloretal
em
camundongos
com
mutações
em
PMS2
ou
MSH2.
Neste
caso
aparecem
linfomas.
Portanto,
pontos
quentes
para
mutagênese
em
genes
reguladores
da
proliferação,
cuja
função
é
restrita
com
respeito
ao
tecido,
podem,
em
princípio,
ser
uma
explicação
para
a
distribuição
tecidual
de
cânceres
MIN+.
Ainda
não
se
sabe
se
a
deficiência
das
proteínas
que
reparam
erros
de
emparelhamento
em
humanos
também
pode
conduzir
à
desestabilização
da
recombinação
genética,
como
ocorre
em
bactérias,
podendo
se
especular
que
talvez
a
recombinação
ilegítima
poderia
contribuir
para
o
aparecimento
do
câncer.
Defeitos
em
MSH2
causam
perda
do
MMR
e
junto
com
defeitos
em
MLH1
são
responsáveis
por
60
a
70%
dos
cânceres
HNPCC.
Defeitos
em
MSH6
estão
implicados
em
câncer
coloretal
familiar,
um
tipo
de
câncer
diferente
de
HNPCC,
que
é
caracterizado
por
muitas
mutações
espontâneas
devidas
ao
acúmulo
de
erros
de
emparelhamento.
VII
67
Xeroderma
pigmentosum
(XP)
Assim
nomeada
em
1870
por
M.
Kaposi,
esta
síndrome
manifesta‐se
primordialmente
pela
presença
de
pigmentação
heterogênea
na
pele
exposta
ao
sol.
Existem
também
desordens
neurológicas
associadas
devido
à
degeneração
neural,
levando
ao
nanismo
e
desenvolvimento
sexual
incompleto.
A
visão
é
afetada
por
intensa
fotofobia
e
lesões
oculares.
A
característica
mais
marcante
dessa
doença
é
a
presença
de
uma
taxa
elevada
de
carcinomas
cutâneos
observados
nas
zonas
da
pele
expostas
ao
sol.
Este
fato
reside
na
descoberta
de
J.
Cleaver
que
mostrou
a
incapacidade
de
células
retiradas
de
pacientes
XP
em
repararem
lesões
produzidas
pela
radiação
UV‐C.
‐ Epidemiologia
–
a
doença
aparece
em
todo
o
mundo
e
se
transmite
hereditariamente
de
uma
forma
autossômica
recessiva
em
freqüências
variáveis
(de
1:1.000.000
na
Europa
e
Estados
Unidos
a
1:100.000
no
Japão
e
norte
da
África
do
Norte,
onde
os
casamentos
consangüíneos
são
mais
freqüentes).
Os
heterozigotos
para
o
caráter
não
apresentam
sintomatologia.
‐ O
XP
clássico
–
assim
é
chamada
a
forma
mais
comum
da
doença,
com
75%
dos
doentes
apresentando
sintomas
entre
2
e
4
anos,
decorrentes
de
exposição
ao
sol.
Além
das
anomalias
cutâneas,
alterações
no
sistema
visual
são
extremamente
comuns,
tais
como:
fotofobia,
lesões
na
conjuntiva
e
na
córnea.
A
característica
mais
marcante
da
forma
XP
clássica
é
a
aparição
de
tumores
malignos
cutâneos
ou
oculares
numa
idade
média
de
8
anos
(50
anos
mais
cedo
do
que
a
população
em
geral)
e,
em
97%
dos
casos,
nas
áreas
expostas
ao
sol.
Cerca
de
5%
do
total
de
pacientes
XP
desenvolvem
tumores
malignos,
número
que
representa
um
risco
duas
mil
vezes
maior
que
a
população
em
geral.
O
XPA
é
predominante
no
Japão,
o
XPC
na
Europa
e
Egito
e
o
XPD
na
Europa.
Na
figura
VII.36
está
representada
a
incidência
dos
sintomas
e
do
aparecimento
do
câncer
de
pele
em
indivíduos
XP,
em
função
do
tempo
de
vida,
comparada
com
a
incidência
de
câncer
de
pele
em
indivíduos
normais.
Figura
VII.36
–
Idade
(anos)
de
aparecimento
das
manifestações
cutâneas
em
pacientes
XP
e
de
desenvolvimento
de
tumor
em
indivíduos
XP
e
sadios
O
XP
variante
–
10‐15%
dos
pacientes
XP
expressam
sintomas
em
idade
maior
que
o
XP
clássico,
entre
15
e
45
anos.
Nesses
pacientes,
a
progressão
da
doença
é
mais
lenta
e
a
expectativa
de
vida
é
consideravelmente
maior.
A
alteração
bioquímica
existente
nessas
células
é
diferente
da
do
XP
clássico,
como
já
descrito.
Características
genéticas
da
célula
XP
–
células
obtidas
a
partir
de
pacientes
XP
são
incapazes
de
reparar
uma
série
de
lesões
no
seu
DNA,
como
aquelas
induzidas
por
UV‐C,
radiação
ionizante,
agentes
intercalantes
de
DNA,
psoralenos,
etc.
Testes
de
sensibilidade
ao
UV
revelam,
contudo,
não
existir
apenas
uma
forma
da
doença.
Dependendo
do
grau
de
tolerância
ao
UV‐C,
por
exemplo,
foram
identificadas
formas
clássicas
XPA,
XPB,
etc.
sendo
as
formas
clássicas
mais
sensíveis
que
a
forma
XP
variante.
VII
68
Além
das
diferenças
quantitativas
no
reparo
das
lesões,
existem
particularidades
qualitativas
na
forma
de
reparar
essas
lesões,
observadas
entre
os
diferentes
tipos
de
células
XP.
Células
obtidas
a
partir
de
pacientes
do
grupo
XPC,
por
exemplo,
possuem
reparo
preferencial,
ou
seja,
são
capazes
de
reparar
lesões
nas
regiões
de
DNA
onde
haja
grande
atividade
replicativa
ou
transcripcional,
enquanto
o
genoma
em
geral
não
sofre
qualquer
tipo
de
reparo.
Células
da
forma
XP
variante
são
apenas
ligeiramente
mais
sensíveis
ao
UV
do
que
as
células
normais
e
uma
atividade
de
reparo
por
excisão
–
ressíntese
normal.
Clinicamente,
o
paciente
portador
da
forma
XP
variante
tem
sinais
semelhantes
aos
da
forma
XP
clássica,
entretanto
os
tumores
cutâneos
malignos
aparecem
bem
mais
tarde,
entre
15
e
40
anos.
O
defeito
bioquímico
dessas
células
está
na
ausência
de
tolerância
às
lesões
no
momento
da
replicação
do
DNA.
Uma
célula
normal
bloqueia
a
sua
replicação
transientemente
após
irradiação
com
UV,
e
a
reparação
pós‐replicativa
restaura
a
massa
normal
de
DNA
nas
horas
pós‐irradiação.
Nas
células
XP
variantes,
a
Polη
está
mutada
e
é
substituída
pela
Polι,
que
erra
muito
e
conduz
às
mutações
que
gerarão
o
câncer.
Mutagênese
–
culturas
de
células
obtidas
a
partir
de
pacientes
XP
clássicos
ou
variantes
apresentam
uma
taxa
muito
elevada
de
mutagênese
quando
tratadas
com
UV
ou
agentes
químicos
mutagênicos.
As
anomalias
pigmentares
observadas
na
pele
dos
pacientes
parece
derivar
de
proliferação
de
clones
mutados
e
a
aparição
de
tumores
nas
áreas
da
pele
expostas
ao
sol
reforça
a
teoria
de
que
a
hipermutabilidade
pode
ser
a
origem
da
cancerização
de
uma
célula.
O
XP
é
o
melhor
exemplo
para
correlacionar
acúmulo
de
lesões
não
reparadas
no
DNA
com
aumento
da
taxa
de
mutagênese
induzida
e
a
proliferação
precoce
de
tumores.
Atividade
catalase
–
as
células
XP
de
qualquer
tipo
são
deficientes
em
atividade
catalase,
sendo
incapazes
de
detoxificar
a
água
oxigenada
produzida
pelo
seu
metabolismo.
O
acúmulo
de
produtos
tóxicos
e
as
lesões
celulares
geradas
por
eles
pode
explicar
a
degeneração
progressiva
das
células
nervosas
e
os
tumores
cerebrais
observados
nesses
pacientes.
Ativação
de
oncogenes
em
tumores
isolados
de
pacientes
XP
–
os
proto‐oncogenes
são
genes
indispensáveis
ao
desenvolvimento
normal
dos
tecidos.
A
regulação
anormal
ou
modificações
em
sua
mensagem
genética
podem
resultar
em
conseqüências
importantes
para
a
célula.
A
ativação
de
oncogenes
pode
dever‐se
a
uma
de
quatro
possibilidades:
a)
aumento
da
quantidade
de
proteína
codificada
por
ele
por
amplificação
gênica;
b)
modificação
das
seqüências
de
nucleotídeos
nas
suas
regiões
regulatórias
por
translocação
gênica;
c)
mudança
na
estrutura
primária
da
proteína
codificada
pelo
oncogene
devido
a
alteração
pontual
na
sua
seqüência
gênica;
d)
aumento
da
transcrição
do
gene
devido
à
inserção
de
elementos
regulatórios
de
oncovírus.
A
análise
genética
de
células
colhidas
de
tumores
espino‐
ou
basocelulares
de
pacientes
XP
revelou
a
presença
de
mutações
puntiformes
no
códon
61
do
gene
N‐ras
ou
no
códon
12
do
gene
Ki‐ras.
Essas
mutações
podem
decorrer
de
danos
produzidos
pela
radiação
UV.
Após
exposição
da
pele
ao
UV,
lesões
do
tipo
dímero,
formadas
entre
timinas
adjacentes
no
gene
ras,
na
ausência
de
sua
reparação,
pode
levar
à
replicação
errônea
do
DNA
e
à
incorporação
indevida
de
uma
adenina
no
lugar
da
timina.
Este
tipo
de
mutação
é
observada
no
DNA
de
células
cultivadas
in
vitro
ou
em
DNA
de
vírus
SV‐40
irradiados
com
UV
e
usados
para
transformar
essas
células.
Importante
frisar
que
este
tipo
de
mutação
no
gene
N‐ras
não
é
encontrada
nos
fibroblastos
não‐
transformados
do
mesmo
paciente,
sugerindo
que
a
predisposição
genética
que
leva
ao
desenvolvimento
de
câncer
nos
pacientes
XP
deve‐se
à
transmissão
hereditária
de
um
gene
N‐ras
mutado.
Obviamente,
a
tumorização
das
células
mutadas
pontualmente
em
ras
depende
de
outras
alterações
genéticas
como,
por
exemplo,
a
amplificação
gênica
e/ou
o
rearranjo
de
seqüências
de
DNA
dos
genes
c‐myc
e
Ha‐ras.
Tricotiodistrofia
(TTD)
Sob
a
designação
de
TTD
são
incluídas
várias
síndromes
que
se
originam
de
disfunções
neuroectodérmicas,
como,
por
exemplo,
as
síndromes
de
Sabinas,
de
Pollit
e
de
Tay,
e
descrições
feitas
por
VII
69
Brown,
Jackson,
Arbisser,
e
outros.
Trata‐se
de
uma
doença
autossômica
recessiva
provavelmente
transmitida
hereditariamente
pelo
cromossoma
X.
Atualmente
são
divididos
em
três
grupos
de
complementação,
TTD‐A,
TTD‐B
e
TTD‐C.
A
microinjeção
de
TFIIH
só
consegue
complementar
o
grupo
TTD‐A,
sugerindo
ser
esta
forma
de
TTD
associada
à
deficiência
em
algum
fator
de
transcrição.
Os
demais
grupos
têm
deficiências
nos
genes
XPB
ou
XPD.
Ocorre
uma
hipoplasia
de
todos
os
pelos
e
dos
cabelos
que
apresentam‐se
secos,
curtos
e
frágeis.
Sob
o
microscópio
óptico
os
fios
aparecem
com
bandas
claras
transversais,
correspondendo
a
pontos
de
fratura
gerando
o
quadro
chamado
“trichoschisis”.
Existe
uma
diminuição
característica
–
pelo
menos
50%
‐
nos
teores
de
cisteína.
Outras
anomalias
incluem
retardamento
mental,
pequeno
porte,
ictiose,
fotossensibilidade,
catarata,
hipogonadismo,
microcefalia
e
orelhas
proeminentes.
Cerca
de
50%
dos
pacientes
TTD
apresentam
células
com
reparo
de
DNA
deficiente.
Como
nas
células
XPD,
elas
podem
ser
deficientes
na
atividade
helicase
associada
ao
gene
ERCC2,
mas
também
nas
atividades
dos
genes
XPB,
XPG
e
de
co‐fatores
do
acoplamento
transcrição‐reparo.
Ainda
assim,
os
quadros
clínicos
XP
e
TTD
guardam
características
próprias
diferentes
entre
si,
como,
por
exemplo,
a
baixa
ocorrência
de
câncer
cutâneo
em
pacientes
TTD,
que
é
elevada
em
pacientes
XPD.
Em
ensaios
de
reparo
de
plasmídeos‐vetor
irradiados
com
UV‐C,
e
depois
fotorrestaurados
para
retirada
dos
dímeros
ciclobutano,
verificou‐se
que
células
TTD
são
normais
para
reparação
de
outros
fotoprodutos
não‐dímero.
Quando
os
dímeros
ciclobutano
estão
presentes,
entretanto,
o
nível
de
mutagênese
aumenta
consideravelmente
nessas
células.
A
deficiência
de
reparo
encontrada
em
TTD
e
XPD
é
a
mesma,
mas
são
diferentes
as
taxas
de
incidência
de
câncer
de
pele
nas
duas
síndromes.
Isso
implica
em
que
a
disfunção
de
reparo
em
si
não
deve
ser
responsável
pela
propensão
ao
câncer,
que
parece
decorrer
de
outras
disfunções
fenotípicas
geradas
pela
deficiência
nos
processos
de
metabolismo
de
DNA.
Ainda
que
hipotéticas,
as
explicações
propostas
para
esses
fatos
sugerem
que
os
pacientes
XPD
são
imunossensíveis
e
essa
característica,
sim,
poderia
favorecer
o
aparecimento
dos
tumores
nesse
grupo.
Mais
recentemente,
foi
constatado
que
as
células
TTD
poderiam
ter
transcrição
geral
defectiva
ou
então
níveis
reduzidos
de
TFIIH,
o
que
evitaria
a
expressão
gênica
das
anomalias
de
pele
derivadas
da
transcrição
de
genes
alterados
pela
disfunção
de
reparo.
Síndrome
de
Cockayne
(CS)
É
uma
doença
transmitida
hereditariamente,
autossômica
e
recessiva.
As
pessoas
afetadas
apresentam
nanismo,
surdez,
pigmentação
granulada
na
retina,
microcefalia
e
retardo
mental.
A
face
é
estreita,
pequena,
com
olhos
pequenos,
arcadas
supraciliares
salientes,
retrognatia
do
maxilar
inferior,
orelhas
descoladas
com
perda
de
gordura
subcutânea.
Em
conjunto,
essas
características
fazem
o
paciente
ter
uma
aparência
envelhecida
e
similar
à
figura
de
um
camundongo.
A
deficiência
genética
de
células
CS,
assim
como
das
XP,
causa
grande
sensibilidade
ao
UV,
sem,
contudo,
apresentarem
tendência
à
cancerização.
Os
pacientes
CS
fotossensíveis
estão
divididos
em
cinco
grupos.
Os
grupos
CSA
e
CSB
compreendem
os
pacientes
que
somente
apresentam
os
sintomas
CS,
com
a
maioria
dos
pacientes
estudados
mutados
no
gene
CSB.
Os
outros
três
grupos
estão
associados
aos
grupos
XPD,
XPB
ou
XPG
e
apresentam
os
sintomas
combinados
de
XP
e
CS.
A
deficiência
é
em
reparo
de
DNA
que
esteja
sendo
ativamente
transcrito
(TCR).
A
transcrição
de
RNA
pós‐UV
é
defectiva
nessas
células.
As
seqüências
de
DNA
não‐transcrito
são,
todavia,
reparadas
normalmente.
Desse
modo,
as
células
CS
não
apresentam
o
acoplamento
transcrição‐reparo,
podendo
ser
deficientes
nos
genes
CSB,
XPB
e
XPD.
Sugere‐se
que
os
genes
CSB
e
CSA
possam
desempenhar
um
papel
de
TRF
(Transcription
Repair
Factor).
As
proteínas
XPB
e
XPD
codificadas,
pelos
genes
mutados
em
certos
grupos
XP,
TTD
e
CS
têm
um
papel
no
reparo
e
também
na
transcrição.
Para
explicar
a
heterogeneidade
dos
sintomas
clínicos
associados
às
mutações
XPB
e
XPD,
a
hipótese
da
síndrome
de
transcrição/reparo
foi
colocada
em
questão:
uma
mutação
em
uma
das
proteínas
poderia
afetar
o
reparo,
provocando
os
sintomas
de
XP
e
a
fotossensibilidade
dos
pacientes
TTD
e
Cockayne,
mas
também
diminuir
a
transcrição
de
certos
genes,
provocando
os
sintomas
especificamente
associados
a
TTD
e
a
CS,
como
anomalias
do
desenvolvimento
físico,
neurológico
e
sexual,
assim
como
as
anomalias
dos
pêlos
do
TTD
e
a
dismielinização.
VII
70
Recentemente,
o
estudo
do
efeito
das
mutações
XPD
sobre
o
reparo
e
iniciação
da
transcrição
revelou
que
segundo
suas
posições
no
gene
XPD,
as
mutações
XPD
diminuiriam
o
reparo
e/ou
a
iniciação
da
transcrição.
O
defeito
na
iniciação
da
transcrição
não
seria
devido
à
diminuição
da
atividade
helicase
de
XPD,
mas
devido
à
troca
de
conformação
do
complexo
TFIIH
induzida
por
essa
mutação.
Quanto
maior
for
a
troca
de
conformação
do
complexo
TFIIH,
maior
será
o
dano
produzido
na
transcrição,
podendo
até
ocasionar
mutações
letais
se
essa
troca
de
conformação
do
TFIIH
for
de
grande
importância.
Contrariamente
a
XPD,
a
atividade
helicase
de
XPB
é
necessária
para
a
iniciação
da
transcrição.
As
mutações
afetando
a
atividade
helicase
de
XPB
seriam
letais
e
isso
explicaria
o
número
reduzido
de
pacientes
XPB
em
relação
aos
pacientes
XPD.
Ataxia
telangiectasia
(AT)
A
Ataxia
telangiectasia
é
uma
doença
autossômica
recessiva
caracterizada
por
uma
sensibilidade
aumentada
às
radiações
ionizantes.
A
incidência
é
de
1
pessoa
afetada
a
cada
40.000
nascimentos
e
apresenta‐se
sob
quatro
grupos
de
complementação.
Seus
primeiros
sintomas
geralmente
aparecem
na
infância
e
caracterizam‐se
por
uma
ataxia
cerebelar
progressiva.
Seguem‐se
anomalias
cutâneas
e
do
globo
ocular
–
dilatação
de
pequenos
vasos
–
aos
distúrbios
neurológicos.
A
telangiectasia
não
é
restrita
às
áreas
expostas
ao
sol
e
ainda
podem
ocorrer
vitiligo
ou
hiperpigmentação
na
pele.
O
sistema
imunológico
também
é
afetado
pela
doença,
seja
pela
presença
de
múltiplas
infecções
ou
pelo
aparecimento
de
câncer,
em
geral
das
próprias
células
imunitárias,
por
volta
dos
20
anos
de
idade.
A
idade
média
para
aparecimento
de
neoplasias
na
população
em
geral
é
de
55
anos.
Os
pais
de
indivíduos
AT,
heterozigotos
para
o
caráter,
já
são
mais
suscetíveis
ao
desenvolvimento
de
linfomas
quando
comparados
com
a
população
em
geral.
Estima‐se
que
a
presença
do
gene
AT
na
população
é
responsável
por
5%
dos
casos
de
cânceres
fatais
antes
dos
45
anos.
Além
de
sua
alta
sensibilidade
às
radiações
ionizantes,
as
células
de
indivíduos
AT
apresentam
taxa
elevada
de
anomalias
cromossômicas.
As
alterações
citogenéticas
envolvem
majoritariamente
os
cromossomos
2,
7,
14
e
22,
correlacionados
com
a
localização
de
genes
da
superfamília
de
imunoglobulinas
e
de
rearranjos
ilegítimos.
Os
clones
pré‐tumorais
e
tumorais
presentes
em
10%
dos
pacientes
AT
têm
rearranjo
na
banda
q11.2
do
cromossomo
14,
levando
ao
desenvolvimento
de
leucemias
crônicas
de
células
T.
Contudo,
a
grande
sensibilidade
às
radiações
ionizantes
ligada
ao
quadro
AT
torna
inviável
o
tratamento
desses
tumores
com
radioterapia
ou
radiomiméticos.
As
lesões
produzidas
pelas
radiações
ionizantes
são
reparadas
normalmente;
entretanto,
a
parada
na
síntese
de
DNA
que
ocorre
após
a
irradiação
de
células
normais
não
é
encontrada
em
células
AT.
Para
explicar
o
efeito
pleiotrópico
da
mutação
AT
que
afeta
tanto
a
resposta
a
danos
oxidativos
no
tecido
nervoso
quanto
a
formação
de
imunoglobulinas
maduras,
tem
sido
sugerido
que
o
defeito
presente
nessas
células
pode
ser
em
alguma
DNA‐topoisomerase
ou
recombinase,
responsáveis
por
rearranjos
genéticos
necessários
à
formação
de
imunoglobulinas
e
pela
recuperação
de
lesões
no
DNA.
Achados
de
citogenética
apontam
que
o(s)
gene(s)
associado(s)
ao
fenótipo
AT
encontra(m)‐se
localizados
na
posição
q22‐23
do
cromossomo
11.
Recentemente,
foi
descoberto
que
todos
os
quatro
grupos
AT
têm
mutações
no
gene
que
codifica
uma
Fosfatidil‐inositol
3’
cinase,
denominado
ATM,
envolvida
com
controle
do
ciclo
celular.
Mesmo
após
irradiação
com
radiação
ionizante,
a
síntese
de
DNA
não
é
interrompida,
indicando
serem
as
células
AT
deficientes
em
pontos
de
checagem,
“checkpoints”,
do
ciclo
celular.
ATM
é
o
regulador
máximo
numa
rede
de
sinalizações
responsáveis
por
coordenar
o
reparo
de
quebras
duplas,
funções
de
pontos
de
checagem
e
outros
processos
de
sinalização
que
promovem
sobrevivência
e
recuperação
celular.
ATM
cinase
tem
numerosos
substratos
que
estão
envolvidos
na
ativação
de
funções
celulares
em
resposta
às
quebras
duplas
no
DNA,
espontâneas
ou
induzidas.
Enquanto
algumas
dessas
proteínas
alvo
estão
diretamente
envolvidas
no
reparo
pela
Recombinação
Homóloga
‐
HR
(como
NBS1
e
RPA),
muitas
delas
participam
em
outros
processos
de
sinalização
e
funções
“checkpoints”
(como
H2AX,
TP53,
MDM2,
BRCA1,
CHK1,
CHK2),
ou
outras
respostas,
promovendo
apoptose
ou
proliferação
celular
(como
c‐ABL
e
E4‐BP1).
VII
71
Anemia
de
Fanconi
(FA)
Trata‐se
de
uma
anomalia
autossômica
recessiva
associada
a
uma
instabilidade
cromossômica
espontânea
ou
induzida
e
por
uma
marcante
predisposição
a
ocorrência
de
leucemias
e
tumores
sólidos.
A
anemia
característica
da
doença
manifesta‐se
por
volta
dos
10
anos
de
idade,
afetando
progressivamente
todos
os
elementos
sangüíneos,
sugestivo
de
uma
disfunção
da
medula
óssea.
Cerca
de
80%
dos
pacientes
apresentam
anomalias
cutâneas:
hiperpigmentação
difusa,
manchas
marrons
ou
acromáticas.
A
incidência
de
leucemias
mielogênica
ou
pré‐leucemias
manifesta‐se
em
15%
dos
pacientes,
uma
taxa
~15.000
vezes
superior
àquela
da
população
em
geral.
Como
cada
doença
está
associada
à
sensibilidade
a
um
agente
específico
–
UV
para
XP
e
radiação
ionizante
para
AT
–
as
células
FA
são
sensíveis
a
agentes
que
formem
ligações
inter‐hélice
com
o
seu
DNA
(crosslinks),
como
os
quimioterápicos
antitumorais
Mitomicina
C
(MMC)
ou
Mostardas
Nitrogenadas
ou
agentes
anti‐psoríase
como
os
Psoralenos
ativados
por
UVA
(PUVA).
A
sensibilidade
dessas
células
a
esses
agentes
é
tão
marcante
que
o
aumento
no
número
de
aberrações
cromossômicas
causadas
pelo
agente
diepoxibutano
em
células
do
líquido
amniótico
é
usado
para
diagnóstico
pré‐natal
da
doença.
Ainda
que
alguns
tipos
de
células
FA
sejam
capazes
de
fazer
incisões
nos
sítios
de
ligações
inter‐hélice,
essas
lesões
são
reparadas
mais
lentamente
do
que
nas
células
normais
e
é
acompanhado
de
uma
mutagênese
reduzida,
sugerindo
que
a
via
ausente
nessas
células
é
sujeita
a
erros.
No
grupo
de
complementação
A
(FA‐A),
a
atividade
de
incisão
endonucleolítica
nos
sítios
de
crosslinks
está
ausente
mas
as
incisões
são
verificadas
nos
sítios
de
monoadutos.
Em
geral,
todos
apresentam
alta
taxa
de
recombinação
e
apoptose
desregulada,
sugerindo
que
os
genes
FA
regulem
o
metabolismo
de
DNA
e
apoptose.
A
anemia
de
Fanconi
é,
geneticamente,
muito
heterogênea,
apresentando
vários
grupos
de
complementação,
tendo
sido
clonados
e
identificados
genes
FANC
para
os
subtipos:
A,
C,
D1,
D2,
E,
F,
G
e
L.
Algumas
proteínas
FA
parecem
ter
tanto
funções
nucleares
como
citoplasmáticas.
O
complexo
nuclear
de
FA,
composto
das
proteínas
FANCA,
C,
E,
F,
G
e
L
é
essencial
para
a
proteção
contra
quebra
cromossômica
após
tratamento
com
MMC.
Após
tratamento
com
MMC
ou
radiação
ionizante,
as
proteínas
FANCA,
C,
E,
F,
G
e
L
são
todas
necessárias
para
ativação
da
proteína
FANCD2.
FANCD2
é
ubiquitinada
pela
proteína
FANCL
após
o
que
sofre
redistribuição
dentro
do
núcleo,
sendo
encontrada
nos
mesmos
“foci”
nucleares
que
BRCA1.
Os
modelos
de
camundongos
nocaute
construídos
para
FANCA,
FANCC
e
FANCG
não
demonstraram
nenhum
defeito
no
desenvolvimento
e
nem
anemia
progressiva.
Verificou‐se
também
que
FANC
interage
com
ATM,
já
que
FANCD2
é
fosforilada
pela
ATM
cinase.
A
fosforilação
de
FANCD2
é
necessária
para
o
checkpoint
da
fase
S,
isto
é,
inibição
da
iniciação
da
replicação
do
DNA,
uma
característica
das
células
AT.
Mais
recentemente
foram
identificadas
mutações
bialélicas
no
gene
BRCA2
em
pacientes
FA
do
grupo
de
complementação
D1.
Após
transfecção
com
plasmídeo
contendo
o
cDNA
que
codifica
a
proteína
BRCA2
selvagem
as
células
mutantes
FANCD1
exibiram
sensibilidade
ao
quimioterápico
MMC
em
níveis
compatíveis
aos
das
células
normais.
Estas
observações
sugerem
que
BRCA2
é,
na
verdade,
o
gene
Fanconi
FANCD1
,
até
então
desconhecido.
A
comparação
entre
diferentes
fenótipos
sugere
alguns
outros
papéis
para
as
proteínas
FANC
como
na
replicação
do
DNA,
transcrição
ou
remodelamento
da
cromatina.
Síndrome
de
Nijmegen
A
síndrome
de
Nijmegen
("Nijmegen
Breakage
Syndrome”
‐NBS)
é
uma
desordem
genética
que
foi
descrita
em
1981,
é
muito
próxima
a
Ataxia
Telangiectasia
(AT)
e
envolve
um
gene
distinto
que
foi
identificado
em
1998.
Os
pacientes
com
a
síndrome
da
quebra
Nijmegen
(NBS)
parecem
pacientes
AT
com
respeito
à
imunodeficiência,
radiossensibilidade,
e
predisposição
a
câncer,
mas
eles
não
apresentam
nem
ataxia
e
nem
telangiectasia.
O
fenótipo
celular
de
NBS
é
remarcadamente
similar
àquele
das
células
AT.
NBS
cresce
pobremente
e
exibe
um
defeito
parcial
no
checkpoint
da
fase
G1
em
resposta
à
lesão
provocada
pela
radiação
ionizante,
e
um
defeito
parcial
no
checkpoint
da
fase
S,
manifestado
como
síntese
de
DNA
radiorresistente.
Estudos
com
fibroblastos
NBS
não
imortalizados
tendo
respostas
normais
aos
checkpoints,
conduziram
à
conclusão
de
que
a
sensibilidade
à
radiação
ionizante
é
causada
pelo
defeito
no
reparo
de
duplas‐quebras
e
VII
72
não
falha
nos
“checkpoints”.
Um
defeito
no
reparo
de
DNA
parece
explicar
a
classe
deficiente
nos
rearranjos
dos
genes
da
imunoglobulina
que
prejudicam
o
desenvolvimento
do
sistema
imune.
Além
disso,
mutações
no
gene
NBS1
podem
ser
associadas
ao
encurtamento
dos
telômeros.
NBS
é
um
componente
de
um
complexo
estável,
contendo
homólogos
de
mamíferos
das
proteínas
de
levedura
MRE11
e
RAD50.
O
complexo
MRN
se
associa
com
duplas
quebras
após
exposição
à
radiação
ionizante
e
forma
“foci”
nucleares
em
torno
de
8
horas
depois
de
muitas
junções
de
quebras
duplas
terem
ocorrido.
A
interação
direta
de
NBS1
com
MRE11
através
da
sua
região
C‐terminal
é
necessária
para
a
localização
nuclear
e
resistência
normal
à
radiação.
A
fosforilação
de
NBS1
na
Ser343
e
em
outros
locais
por
ATM
é
necessária
para
a
resistência
à
radiação
ionizante.
Além
do
mais,
a
fosforilação
e
ativação
da
cinase
CHK2
por
ATM
requerem
a
fosforilação
de
NBS1
na
Ser343.
A
relevante
funcionalidade
do
gene
NBS1
deve
estar
relacionada
à
participação
deste
no
complexo
MRN.
Recentemente
mutações
no
gene
MRE11
foram
identificadas
em
4
pacientes
de
duas
famílias,
que
foram
descritas
tendo
“Ataxia
Telangiectasia‐Llike
Disorder”
(ATLD).
O
fenótipo
dessas
células
mutantes
parece
com
o
fenótipo
das
células
AT,
mas
os
fibroblastos
ATLD
mostram
sensibilidade
branda
à
radiação.
A
idéia
da
necessidade
do
complexo
MRN
estar
intacto
para
a
resposta
celular
normal
às
quebras
duplas
é
evidenciada
por
vários
estudos.
Em
células
ATLD
a
estabilidade
das
interações
com
RAD50
e
NBS1
é
reduzida,
e
a
formação
dos
“foci”
nucleares
induzidos
pela
radiação
ionizante
para
NBS1
e
MRE11
é
grandemente
diminuída.
A
deficiência
transitória
de
MRE11
provoca
grande
aumento
na
radiossensiblildade
e
reduz
fortemente
a
freqüência
de
integrações
com
outros
alvos,
o
que
superestima
a
importância
de
MRE11
na
recombinação
homóloga
e
na
estabilidade
cromossômica.
Da
mesma
forma,
a
proteína
RAD50
é
também
indispensável
para
a
viabilidade
celular.
Análises
do
duplo‐mutante
ku70
mre11
sugerem
que
MRE11
atua
primariamente
no
reparo
pela
Recombinação
Homóloga
(HR)
e
não
no
reparo
por
Junção
das
Extremidades
Não
Homólogas
(NHEJ).
Síndrome
de
Werner
A
síndrome
de
Werner
(WS)
é
uma
desordem
genética
autossômica
recessiva
rara,
com
uma
freqüência
estimada
de
1/22
casos
por
milhão
de
pessoas
da
população
do
mundo
inteiro.
Interessantemente,
a
maioria
dos
casos
de
WS
tem
sido
descrita
no
Japão:
de
aproximadamente
1200
casos
relatados
no
mundo
inteiro,
cerca
de
850
são
do
Japão,
onde
a
prevalência
de
portadores
heterozigóticos
na
população
é
predita
por
ser
maior
que
6
em
1000.
Conseqüentemente,
existem
aproximadamente
35
pacientes
WS
por
milhão
na
população
japonesa.
WS
foi
descrita
primeiramente
por
Otto
Werner
em
1904
em
sua
tese
de
doutorado
pela
Universidade
de
Kiel.
Até
1945
não
era
feita
uma
clara
distinção
entre
as
síndromes
de
Werner
e
Rothmund‐Thomson,
devido
à
grande
similaridade
entre
os
seus
sintomas
clínicos.
Com
o
trabalho
de
Thannhauser
em
1945,
que
listou
as
principais
características
de
Werner,
o
diagnóstico
dessas
doenças
passou
a
ser
mais
facilitado.
Geralmente,
a
síndrome
torna‐se
aparente
na
adolescência
devido
à
perda
da
habitual
aceleração
de
crescimento
nessa
época,
portanto,
os
paciente
WS
são
de
estatura
baixa.
Outras
características
clínicas
tornam‐se
aparentes
entre
os
20
e
30
anos
de
idade.
Ocorrem
mudanças
na
face,
com
afinamento
do
nariz,
a
pele
é
fina
e
seca
com
pigmentação
variável.
Os
pacientes
WS
apresentam
eritemas
(manchas
ou
placas
avermelhadas)
acompanhadas
de
edemas
(inchaço),
freqüentemente
sobre
as
áreas
dos
ossos,
que
podem
tornar‐se
ulceradas.
Cataratas
aparecem
numa
idade
bem
precoce
e
são
freqüentemente
bilaterais.
Um
dos
sinais
precoces
da
doença
é
o
prematuro
embranquecimento
e
perda
dos
cabelos.
Há
alta
incidência
de
osteosporose,
calcificação
dos
tecidos
flexíveis
e
“diabetes
mellitus”.
Vários
sintomas,
comuns
ao
envelhecimento
normal
surgem
precocemente
nos
pacientes
com
a
síndrome
de
Werner,
incluindo
VII
73
aterosclerose,
atrofia
cerebral
cortical,
depleção
linfóide
e
atrofia
do
timo.
Entretanto,
vários
outros
sintomas
diferem
entre
as
duas
“condições”.
Assim,
por
exemplo,
entre
os
pacientes
WS
encontramos
alta
incidência
de
cânceres
em
indivíduos
jovens,
mas,
por
outro
lado,
observa‐se
baixa
incidência
de
neuropatologias
como
Alzheimer.
A
causa
mais
freqüente
da
morte
dos
pacientes
WS
é
o
câncer
e
as
doenças
cardiovasculares,
sendo
47
anos
a
idade
média
de
vida.
WS
está
associada
com
uma
taxa
muito
alta
de
cânceres
de
tipos
raros.
A
razão
de
cânceres
de
origem
epitelial
e
mesenquimal
é
normalmente
de
10:1
na
população
normal,
mas
em
pacientes
WS
é
de
1:1.
Conseqüentemente,
existe
um
excesso
de
sarcomas
de
tecido
flexível,
mas
também
carcinomas
de
tiróide,
meningiomas,
melanomas
e
osteosarcomas.
O
gene
WRN
foi
mapeado
na
região
p11‐p12
do
cromossomo
8.
Todas
as
mutações
em
WRN
já
identificadas
conduzem
a
uma
terminação
prematura
da
tradução
através
da
criação
de
um
códon
de
terminação,
ou
de
uma
mudança
no
quadro
de
leitura
(“frameshift”),
levando
também
à
terminação
prematura,
ou,
através
de
um
erro
de
“splicing”,
gerando
alterações
no
quadro
de
leitura.
Os
transcritos
mutantes
são
freqüentemente
de
baixa
regulação,
provavelmente
devido
ao
decaimento
dos
RNA
mensageiros
mediado
por
códons
“nonsense”.
Os
níveis
de
mRNA
de
WRN
,
bem
como
os
níveis
da
proteína
WRN
em
células
de
portadores
heterozigóticos
são
aproximadamente
a
metade
daqueles
vistos
em
indivíduos
normais,
e
as
células
desses
pacientes
mostram
níveis
intermediários
de
sensibilidade
a
agentes
que
lesam
o
DNA.
A
característica
mais
relevante
destas
células
é
sua
sensibilidade
aumentada
a
4‐nitroquinolina
1‐oxide
(4NQO),
relatada
por
muitos
grupos
de
pesquisa.
As
células
WS
são
também
mais
sensíveis
a
drogas
indutoras
de
“crosslinks”,
como
cisplatina,
mitomicina
C,
clorambucil
e
melfalan.
As
células
WS
são
levemente
mais
sensíveis
à
irradiação
γ
do
que
as
células
normais
e
essa
sensibilidade
é
revertida
pela
complementação
com
o
gene
de
WRN.
Outros
pesquisadores
encontram
também
uma
sensibilidade
incomum
das
células
WS
ao
peróxido
de
hidrogênio
(H2O2).
Existe
uma
grande
evidência
de
que
WRN
participe
no
reparo
pela
Recombinação
Homóloga
(HR).
Esse
papel
na
HR
é
evidenciado
pela
atividade
helicase
de
WRN,
assim
como
a
de
BLM,
pois
funcionam
em
estruturas
específicas
de
DNA
como
as
junções
de
Holliday.
A
evidência
de
uma
associação
de
WRN
com
BLM
reforça
essa
idéia.
E
além
do
mais,
WRN
é
encontrada
nos
“foci”
nucleares
que
parcialmente
se
co‐localizam
com
RPA
e
RAD51
após
a
parada
na
replicação,
provocada
por
hidroxiuréia,
ou
lesão
no
DNA,
em
conseqüência
do
tratamento
com
camptotecina,
etoposídeo,
4‐NQO
e
bleomicina.
Tem
sido
sugerido
que
WRN
pode
evitar
eventos
de
recombinação
aberrante
em
sítios
da
forquilha
de
replicação
estagnada
pela
dissociação
de
intermediários
de
recombinação.
Entretanto,
as
funções
exatas
das
atividades
helicase
e
exonucleásica
de
WRN
ainda
não
foram
determinadas.
Síndrome
de
Bloom
(BS)
Trata‐se
de
um
exemplo
de
extrema
instabilidade
cromossômica
espontânea
gerando
aberrações
cromossômicas
e
trocas
entre
cromátides
irmãs
(SCE
=
Sister
Chromatid
Exchange)
),
que
aparentemente
representam
eventos
de
recombinação
homóloga,
ocorrendo
durantes
as
fases
S
e
G2
do
ciclo
celular.
Os
pacientes
apresentam
telangiectasia,
sensibilidade
ao
sol
e
alta
incidência
de
leucemias
e
linfomas.
É
muito
freqüente
entre
os
judeus
Ashkenazins,
que
apresentam
risco
de
câncer
300
vezes
maior
do
que
a
população
em
geral.
Citogeneticamente,
as
células
BS
apresentam
várias
figuras
de
cromossomos
quadrirradiais.
As
crianças
portadoras
da
doença
nascem
com
baixíssimo
peso
e
têm
crescimento
deficiente.
A
teleangiectasia
induzida
por
luz
desenvolve‐se
na
face,
criando
aí
uma
lesão
em
forma
de
borboleta.
VII
74
As
células
afetadas
são
variavelmente
sensíveis
ao
UV.
Tem
sido
relatado
que
pode
haver
alguma
deficiência
na
atividade
da
DNA
ligase,
de
modo
que,
o
alongamento
das
cadeias
de
DNA
torna‐se
mais
lento.
Não
foram
confirmados
os
achados
de
que
células
BS
sejam
deficientes
em
atividade
SOD
ou
uracil
DNA‐
glicosilase,
como
relatado,
uma
vez
que
a
complementação
com
o
cromossoma
15
restaura
o
fenótipo
normal
dessas
células
e
ele
não
é
portador
dos
genes
que
codificam
essas
enzimas.
O
gene
deficiente
em
BS
foi
identificado
e
denominado
BLM.
O
gene
BLM
codifica
uma
proteína
de
1417
aminoácidos
que
é
membro
da
família
das
DNA
helicases
RECQ.
Esta
família
das
helicases
também
inclui
a
proteína
da
síndrome
de
Werner
e
RECQL4
e
a
proteína
defeituosa
na
síndrome
de
Rothmund‐Thomson.
O
papel
da
proteína
BLM
na
HR
é
também
sugerido
pois
BLM
interage
diretamente
com
RAD51
e
se
co‐
localiza
parcialmente
com
RAD51
e
RPA
em
células
não
tratadas.
Após
a
lesão
decorrente
da
radiação
ionizante
a
fração
de
co‐localização
entre
BLM
e
RAD51
é
grandemente
aumentada.
Além
disso,
após
a
radiação
ionizante
BLM
é
fosforilada
pela
cinase
ATM
e,
como
também
ocorre
com
RAD51,
se
associa
nos
sítios
de
DNA
simples
fita,
reforçando
assim
seu
provável
papel
no
HRR.
Em
resposta
à
hidroxiuréia,
mas
não
à
irradiação
ionizante,
BLM
se
relocaliza
com
o
complexo
MRN
nos
sítios
de
parada
da
replicação.
Esta
relocalização
de
MRN,
dependente
de
BLM,
requer
a
fosforilação
de
BLM
pela
cinase
ATR.
Embora
algumas
evidências
envolvam
a
proteína
BLM
na
HR,
seu
papel
preciso
não
está
claro.
Um
modelo
sugere
que
a
helicase
BLM
possua
uma
função
anterior
à
HR,
que
seria
diminuindo
a
fração
da
forquilha
de
replicação
estagnada,
que
é
reparada
pela
recombinação,
explicando
assim,
a
alta
troca
de
cromátides
irmãs.
Síndrome
de
Rapadilino
Outra
desordem
clínica
relacionada
a
mutações
no
gene
RECQL4
é
a
Síndrome
de
Rapadilino.
Esta
síndrome
é
uma
desordem
autossômica
recessiva
cujas
principais
características
clínicas
são:
hipoplasia
radial,
hipoplasia
patelar,
fenda
palatar,
diarréia,
juntas
deslocadas,
baixa
estatura,
má
formação
dos
membros
superiores
e
inferiores,
nariz
muito
fino
e
inteligência
normal.
Rapadilino
é
uma
doença
hereditária
que
apresenta
uma
grande
concentração
de
pacientes
na
Finlândia,
provavelmente
em
função
de
um
efeito
fundador.
Encontramos
na
literatura
cerca
de
quatorze
pacientes
finlandeses
e
dois
não
finlandeses.
As
principais
manifestações
clínicas
que
afetam
os
pacientes
Rothmund‐
Thomson
e
Rapadilinos
se
sobrepõem.
As
similaridades
e
diferenças
observadas
no
quadro
clínico
entre
RTS
e
Rapadilino
suscitam
a
possibilidade
dessas
doenças
resultarem
de
uma
única
desordem
com
múltiplas
características
clínicas.
Foram
encontradas
4
mutações
no
gene
RECQL4
em
pacientes
finlandeses,
sendo
a
mutação
mais
comum,
uma
deleção
no
exon
7,
sendo
que
esta
mutação
preserva
o
domínio
helicase
da
proteína
e
mostra
efeito
dominante
sobre
outras
3
mutações
“nonsense”
(códon
de
terminação
prematuro),
que
igualmente
encontram‐se
fora
do
domínio
helicase.
Síndrome
de
Rothmund‐Thomson
A
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
(RTS)
foi
descrita
primeiramente
por
um
oftalmologista
alemão
August
Rothmund,
em
1868.
Em
seu
relatório,
ele
descreveu
10
pessoas
aparentadas
de
uma
mesma
cidade
da
região
da
Bavária
que
desenvolveram
precocemente
poikiloderma
e
catarata
juvenil.
Setenta
anos
mais
tarde,
Sidney
Thomson,
um
dermatologista
britânico,
relatou
três
pacientes
com
anormalidades
de
pele
semelhantes
mas
acompanhada
de
má
formação
do
esqueleto
e
denominou
a
doença
como
“poikiloderma
congenitale”.
Um
paciente
morreu
na
infância
e
os
outros
nunca
VII
75
desenvolveram
cataratas.
Taylor,
mais
tarde,
reconheceu
que
os
sintomas
descritos
por
Rothmund
e
Thomson
eram
manifestações
da
mesma
doença,
e
cunhou
o
termo
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
.
Mais
tarde,
mais
de
200
casos
foram
revisados
pela
literatura
médica
e
a
RTS
foi
estabelecida
como
uma
desordem
genética
autossômica
e
recessiva
rara.
Essa
síndrome
é
caracterizada
por
anormalidades
na
pele
e
esqueleto,
cataratas
juvenis,
envelhecimento
precoce,
instabilidade
cromossômica
e
predisposição
ao
câncer,
principalmente
osteosarcoma.
A
característica
predominante
de
RTS
é
a
poikiloderma
da
face
e
extremidades,
que
começa
bem
cedo
na
infância
(3
a
6
meses
de
vida),
progredindo
e
persistindo
na
idade
adulta.
A
poikiloderma
se
caracteriza
por
eritemas
(manchas
ou
placas
avermelhadas)
acompanhadas
de
edemas
(inchaço),
algumas
vezes
com
bolhas
e
pruridos.
Essa
anomalia
se
inicia
nas
bochechas,
espalhando‐se
depois
pelo
rosto,
orelhas
e
pescoço;
e
se
manifesta
também
nas
extremidades,
como
dorso
das
mãos,
braços,
pernas
e
nádegas.
A
poikiloderma
é
mais
grave
nas
áreas
do
corpo
expostas
ao
sol,
mas
também
está
presente
nas
áreas
não
expostas.
A
fase
aguda
de
manifestações
cutâneas
pode
durar
de
meses
até
muitos
anos,
deixando
depois
traços
marcantes
como
atrofia,
despigmentação
e
telangiectasias
(lesão
constituída
pela
dilatação
de
grupos
de
pequenos
vasos
sangüíneos
ou
de
vasos
linfáticos).
A
fotossensibilidade
também
é
outra
característica
marcante
nos
pacientes
RTS,
agravando
os
sintomas
de
poikiloderma.
A
maioria
dos
pacientes
RTS
apresenta
anomalias
dos
pêlos,
distrofia
das
unhas,
anomalias
do
esqueleto
(macrocefalia
frontal,
nariz
achatado
e
queixo
proeminente,
sindatilia
dos
dedos
das
mãos
e
pés,
atraso
na
formação
de
ossos,
etc).
A
catarata
é
outra
anormalidade
bem
freqüente
nos
pacientes
RTS
e
se
apresenta
em
50%
dos
casos.
Essa
anomalia
se
manifesta
até
a
idade
de
13
anos
com
aparecimento
rápido.
Os
distúrbios
orais
se
apresentam
em
40%
dos
pacientes
e
se
manifestam
essencialmente
por
microdentia
com
modelo
cônico
(as
bases
dos
dentes
são
maiores
do
que
os
ápices),
concomitantemente,
há
uma
grande
incidência
de
cáries.
A
incidência
de
câncer
nos
pacientes
com
a
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
é
relevante
e
deve
estar
em
torno
de
20%.
O
tipo
mais
freqüente
é
o
osteosarcoma
e
todos
mostraram
alguma
evidência
radiológica
de
anormalidade
óssea,
aparecendo
bem
cedo,
entre
a
idade
de
5
e
19
anos
A
incidência
dos
cânceres
de
pele
também
é
maior
do
que
a
esperada,
como
os
carcinomas
de
células
escamosas,
os
carcinomas
basocelulares
e
os
espinocelulares.
Outros
cânceres
não
cutâneos
incluem
fibrosarcoma,
adenoma
paratireóide,
sarcoma
de
Hodgkins
(nos
vasos
linfáticos),
carcinoma
gástrico
e
leucemia
mielóide.
A
síndrome
de
Rothmund‐Thomson
mostra
muitas
similaridades
clínicas
com
outras
síndromes
de
instabilidade
cromossômica
e
envelhecimento
precoce
como
as
síndromes
de
Werner
e
Bloom.
As
características
clínicas
e
genéticas
da
síndrome
de
Werner
têm
sido
atribuídas
às
mutações
na
helicase
RECQL3,
enquanto
os
distúrbios
da
síndrome
de
Bloom
têm
sido
atribuídos
às
mutações
na
helicase
RECQL2.
Células
provenientes
de
oito
indivíduos
diagnosticados
como
RTS
foram
seqüenciadas
no
gene
RECQL4.
Entretanto,
mutações
nesse
gene
que
codifica
uma
helicase
desconhecida
até
então,
foram
localizadas
em
somente
quatro
indivíduos
de
duas
famílias
com
RTS.
Isso
sugere
que
deva
existir
outro
gene
ou
genes
implicados
nessa
síndrome.
RECQL4
é
um
gene
que
codifica
uma
proteína,
DNA
helicase
humana,
pertencente
à
família
das
helicases
RecQ.
Essa
família
inclui
quatro
outros
genes:
(a)
RECQL,
(b)
RECQL2,
(o
gene
afetado
na
síndrome
de
Bloom),
(c)
RECQL3,
(o
gene
afetado
na
síndrome
de
Werner),
e
(d)
RECQL5.
Os
genes
RECQL
e
RECQL5
não
foram
associados
a
nenhuma
desordem
genética
humana.
Vários
estudos
com
células
de
pacientes
RTS
têm
sido
feitos;
entretanto
os
resultados
na
sua
maioria
revelam‐se
inconsistentes.
Experimentos
com
exposição
de
células
RTS
à
irradiação
UV‐C
e
à
radiação
gama
indicaram
reduzida
capacidade
no
reparo
de
DNA.
Por
outro
lado,
células
de
RTS
mostraram
sensibilidade
VII
76
normal
à
mitomicina
C,
bleomicina,
vincristina,
metotrexato,
cisplatina
e
adriamicina.
Em
trabalhos
recentes
foi
mostrado
que
as
células
RTS
são
sensíveis
a
Mostarda
nitrogenada
(HN2).
Entretanto,
ainda
é
discutível
o
mecanismo
de
reparação
que
deve
estar
atuando
neste
caso.
Esclerose
Lateral
Amiotrófica
Esta
doença
caracteriza‐se
por
uma
progressiva
degeneração
neuro‐motora.
A
forma
hereditária
transmite‐se
de
forma
autossômica
dominante
e
alguns
desses
grupos
afetados
são
portadores
de
mutações
truncando
no
gene
Cu/Zn
SOD.
O
acúmulo
de
radicais
superóxido
decorrente
da
ausência
de
atividade
SOD
danificaria
particularmente
as
células
nervosas
das
vias
motoras.
Famílias
portadoras
de
mutações
em
outros
genes
que
não
SOD
também
foram
encontradas;
todavia,
a
atividade
enzimática
SOD
estava
afetada.
Desse
modo,
pode‐se
correlacionar
o
metabolismo
deficiente
de
EAO
com
esta
patologia.
Câncer
de
Mama
(BRCA)
Algumas
famílias
tendem
a
ter
indivíduos
com
propensão
hereditária
a
câncer
de
mama.
Os
dois
genes
mutados
nessas
famílias,
BRCA1
e
BRCA2,
foram
clonados
recentemente
e
seus
produtos
gênicos
caracterizados
como
proteínas
envolvidas
com
reparo
de
DNA.
Na
tabela
VII.4
estão
listadas
as
principais
doenças
associadas
a
defeitos
de
reparação.
TABELA
VII.4
–
Doenças
associadas
a
defeitos
de
reparação
do
dna
Mecanismo
de
reparo
Genes
Síndrome
Tipo
de
câncer