Biotecnologias Reproductivas

1
BIOTECNOLOGAS REPRODUCTIVAS APLICABLES A LA

PRODUCCIN BOVINA EN COLOMBIA
POR:
GIOVANNI RESTREPO BETANCUR
GRUPO DE INVESTIGACIN EN BIOTECNOLOGA ANIMAL -GIBAPOLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID

MEDELLN
2007
A mis tres amores: Gloria, Jimena y Sarah
PREFACIO
La publicacin de esta obra se fundamenta en el papel cada vez ms importante que cumplen las
biotecnologas reproductivas, en los ndices de productividad y rentabilidad de las empresas
ganaderas. La reproduccin eficiente de animales de alto valor gentico representa para las
ganaderas la base para su desarrollo productivo, y representa para el sector ganadero del pas, la
posibilidad de incrementar su crecimiento econmico al aumentar la disponibilidad de sus productos
y servicios. La biotecnologa reproductiva ha demostrado en muchas latitudes del mundo, que
aporta en gran medida a la difusin de la gentica proveniente de animales de elite para rasgos
productivos, reproductivos y confomacionales, de manera que participa en forma considerable en la
consecucin de una alta eficiencia en los procesos productivos del sector. En Colombia, a pesar del
auge mundial de aplicacin de las biotecnologas reproductivas en explotaciones bovinas, an es
escasa la cobertura que las mismas poseen en los procesos reproductivos de la ganadera nacional,
e incluso varias de las biotecnologas ms importantes no han sido todava suficientemente
introducidas al pas, a pesar de que podrn en un futuro representar la diferencia entre un sector
ganadero competitivo y uno que no lo es.
Con esta publicacin se busca plantear el anlisis de la situacin actual y futura de la biotecnologa
reproductiva bovina en Colombia, se busca contribuir a la disponibilidad de material de consulta
actualizado, accesible y en el idioma espaol, referente al desarrollo de dichas biotecnologas, que
considere adems de aspectos tcnicos y metodolgicos, el estudio de investigaciones de
vanguardia en el tema, de manera que pueda alentarse en los estudiantes y profesionales de las
reas pecuarias, el animo investigativo y de actualizacin permanente. Todo con la finalidad de
contribuir al desarrollo cientifico y productivo del sector agropecuario de nuestro pas.
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
INTRODUCCIN GENERAL
10
CAPTULO I: LA INSEMINACIN ARTIFICIAL BOVINA
12
1.1 INTRODUCCIN
12
1.2 REFERENCIAS HISTRICAS
12
1.3 IMPORTANCIA Y CONSIDERACIONES GENERALES
13
1.4 LA DETECCIN DEL CELO PARA LA INSEMINACIN ARTIFICIAL
17
1.5 INSEMINACIN ARTIFICIAL A TIEMPO FIJO Y SINCRONIZACIN HORMONAL
21
1.6 EVALUACIN DEL SEMEN PARA INSEMINACIN ARTIFICIAL
25
1.7 TCNICA DE INSEMINACIN ARTIFICIAL
26
1.8 ANLISIS Y DISCUSIN
28
1.9 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
29
CAPTULO II: ESTIMULACIN HORMONAL Y SUPEROVULACIN EN BOVINOS
31
2.1 INTRODUCCIN
31
32
2.3 ASPECTOS TCNICOS DE LA ESTIMULACIN HORMONAL
33
37
38
CAPTULO III: TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS
39
3.1 INTRODUCCIN
39
39
40
3.4 ASPECTOS TCNICOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
43
3.5 ACTUALIDAD DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN COLOMBIA
51
52
53
Pg.
CAPTULO IV. PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS
55
4.1 INTRODUCCIN
55
56
56
4.4 ASPECTOS TCNICOS DE LA PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES

Y OTRAS CONSIDERACIONES
58
4.5 ACTUALIDAD DE LA PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES EN COLOMBIA 70

72
73
CAPTULO V: ASPIRACIN FOLICULAR DE OOCITOS BOVINOS GUIADA POR ULTRASONIDO
77
5.1 INTRODUCCIN
77
78
5.3 ASPECTOS TCNICOS DE LA ASPIRACIN FOLICULAR GUIADA POR

ULTRASONIDO
5.4 ESTIMULACIN HORMONAL PREVIA A LA ASPIRACIN FOLICULAR
80
85
5.5 ACTUALIDAD DE LA ASPIRACIN FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONIDO

EN COLOMBIA
86
87
88
CAPTULO VI: CRIOPRESERVACIN DE GAMETOS Y EMBRIONES BOVINOS
91
6.1 INTRODUCCIN
91
6.2 CRIOPRESERVACIN DE SEMEN BOVINO
92
6.2.1 Aspectos tcnicos de la criopreservacin de semen bovino

6.3 CRIOPRESERVACIN DE OOCITOS Y EMBRIONES BOVINOS
93
96
6.3.1 Aspectos tcnicos de la criopreservacin de oocitos y embriones

bovinos
6.3.2 Actualidad de la criopreservacin de embriones en Colombia
98
109
109
111
Pg.
CAPTULO VII: SEXAJE DE ESPERMATOZOIDES Y EMBRIONES BOVINOS
114
7.1 INTRODUCCIN
114
7.2 SEXAJE DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS
115
7.2.1 Aspectos tcnicos del sexaje de espermatozoides bovinos
116
7.2.2 Importancia y consideraciones generales
122
7.3 SEXAJE DE EMBRIONES BOVINOS
125
7.3.1 Aspectos tcnicos del sexaje de embriones bovinos
125
7.3.2 Actualidad del sexaje de embriones bovinos en Colombia
127
129
130
ANLISIS GENERAL
132
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Respuesta superovulatoria de vacas Bos taurus, superestimuladas con FSH y
cantidades variables de LH.
Tabla 2. Datos de actividad de transferencia de embriones en el mundo en el 2000.
Tabla 3. Categoras de complejos cumulus - oocito (CCOs) para procedimientos de PIVE.
Tabla 4. Tasas de sobrevivencia despus de la criopreservacin de oocitos.
Tabla 5. Resultados de congelacin de oocitos de animales domsticos.
Tabla 6. Resumen de campo realizado por XY, Inc., usando semen sexado en novillas Holstein
en Colorado (EEUU).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Dispositivos detectores de presin de monta.
Figura 2.
Bozal marcador.
Figura 3.
Podmetros y collares para la deteccin de estro.
Figura 4.
Sincronizacin del estro con una prostaglandina.
Figura 5.
Programa Ovsynch para sincronizacin de estro.
Figura 6.
Trabajo de inseminacion artificial.
Figura 7.
Mtodo de ovulacin mltiple y transferencia de embriones (MOET).
Figura 8.
Localizacin del catter Foley con baln inflable en un cuerno uterino.
Figura 9.
Recoleccin de embriones.
Figura 10. Empacado de un embrin para transferencia en una pajilla de 0.25 ml.
Figura 11. Procedimiento de PIVE.
Figura 12. Montaje de embriones u oocitos en pajillas antes de la congelacin lenta.
Figura 13. Montaje de embriones u oocitos en pajillas antes de la vitrificacin en pajilla de
0,25ml.
Figura 14. Open pulled straw (OPS), pajilla de 0,25 ml.
Figura 15. Criopreservacin en crioloop.
Figura 16. Estructura de un citmetro de flujo.
Figura 17. Proceso de clasificacin y separacin de espermatozoides por citometra de flujo
segn su contenido de ADN.
Figura 18. Clasificador de semen de alta velocidad y re-anlisis del contenido de ADN.
Figura 19. Biopsia embrionaria para la determinacin del sexo por medio de PCR.
10
LISTA DE IMGENES
Imagen 1.
Inseminacin artificial en bovinos.
Imagen 2.
Ovario bovino multifolicular por tratamiento para superovulacin, imagen

laparoscopica.
Imagen 3.
Catter Foley de 2 vas, con y sin baln inflable.
Imagen 4.
Bsqueda y localizacin de embriones mediante un estereoscopio.
Imagen 5.
Microgotas para PIVE bajo aceite mineral.
Imagen 6.
Semen + gradiente percoll para la seleccin de espermatozoides.
Imagen 7.
Desarrollo embrionario desde el complejo cmulus-oocito hasta el clivaje.
Imagen 8.
Desarrollo embrionario temprano.
Imagen 9.
Aspiracion folicular guiada por ultrasonido.
Imagen 10.
Ubicacin y equipo para AFGU.
Imagen 11.
Oocitos bovinos puestos en un crioloop de nylon.
Imagen 12.
Determinacin del sexo de embriones bovinos.
11
INTRODUCCIN GENERAL
La reproduccin en la explotacin pecuaria del ganado bovino es el eje de esta actividad productiva, ya
que la eficiencia en la produccin de cras permite cubrir las demandas comerciales al favorecer la
obtencin de animales especializados para la lechera, a travs de la generacin de hembras de alta
capacidad y calidad productiva, como en la industria de la carne con la disponibilidad de ejemplares, no
solo cada vez mejores en la produccin, sino tambin en la bsqueda de una mayor poblacin bovina
(para el 2004 la poblacin mundial de ganado vacuno era de 1.339 millones de cabezas con un
incremento esperado anual del 2.8% (1)) para una poblacin humana creciente. La reproduccin es un
vehculo para el mejoramiento gentico, representado en las ltimas dcadas principalmente por
programas de seleccin e importacin de gentica superior desde pases desarrollados hacia los
denominados pases en desarrollo. Los sistemas tradicionales de mejoramiento gentico, aunque
exitosos en todo el mundo, se han visto limitados en su progreso por aspectos biolgicos propios de la
especie bovina, principalmente respecto a su capacidad reproductiva dentro de su vida til dentro de los
hatos. La biotecnologa ha surgido en las ultimas dcadas como una alternativa a esta limitacin, ya que
permite al ser humano hacer un mejor aprovechamiento de los recursos biolgicos involucrados en sus
actividades vitales y productivas, lo cual para la produccin pecuaria representada por la especie bovina
ha permitido mltiples avances tanto en la bsqueda de la optimizacin de los aspectos productivos
tradicionales, tales como la produccin de leche de mejor calidad y en mayor volumen, y la produccin
ms eficiente de carne y pieles, como en lo referente a nuevas alternativas como la investigacin
biomdica, el uso de animales como biofbricas de protenas humanas a travs de la tecnologa del
ADN recombinante y la transgnesis, as como en la elaboracin de modelos para el estudio, control y
teraputica de enfermedades humanas y de inters veterinario. Las biotecnologas reproductivas bien
aplicadas son adems un complemento a los estudios del valor gentico de los animales; ya que han
permitido reducir los intervalos generacionales al facilitar la propagacin de la gentica de animales lite
para las caractersticas productivas de inters, al permitir la obtencin de un mayor nmero de cras a
partir de un individuo.
La ganadera e industria lechera en Colombia requieren alcanzar niveles productivos que les permitan
competir con los mercados internacionales, en un ambiente de globalizacin econmica mundial
mencionado por autores como (2, 3), y que est enmarcado por la generacin reciente de tratados
12
comerciales con implicaciones en la economa latinoamericana (4). Sin embargo, en nuestro pas, el
pobre aprovechamiento del potencial gentico de animales de alta produccin con condiciones de
adaptacin, viabilidad y productividad que los hacen notablemente aptos a nuestros ambientes y
condiciones productivas, va en contrava de dicho fin, principalmente a razn de la falta de
implementacin y diseminacin de procesos biotecnolgicos, que aplicados a la produccin animal
brindan esta posibilidad, como sucede en pases de ganadera altamente desarrollada. En el mundo
muchas biotecnologas han sido introducidas en la reproduccin bovina, entre las que se pueden
destacar: la inseminacin artificial, la regulacin hormonal, la fertilizacin in vitro y la transferencia de
embriones, que han sido fundamentales al proveer a los ganaderos de herramientas que mejoran
ostensiblemente sus parmetros de productividad (5). Sin embargo en Colombia, an una de las
primeras biotecnologas reproductivas desarrolladas como es la inseminacin artificial bovina, no
alcanza un buen nivel de cobertura de los servicios realizados a la poblacin de hembras bovinas, y lo
mismo ocurre con la obtencin de cras a travs de la transferencia de embriones. Algunas instituciones
pblicas y privadas han realizado importantes avances en la implementacin de biotecnologas
reproductivas a los procesos investigativos y productivos que involucran bovinos en Colombia, aplicando
tecnologas como la inseminacin artificial, la transferencia de embriones, y ms recientemente la
aspiracin folicular guiada por ultrasonido, la produccin in vitro de embriones, la criopreservacin de
embriones, y el sexaje de embriones (7-12). Sin embargo son an necesarios grandes esfuerzos
financieros y logsticos para poner al pas en la vanguardia mundial de aplicacin de biotecnologas
reproductivas para el sector ganadero.
13
CAPTULO I
LA INSEMINACIN ARTIFICIAL BOVINA
1.1 INTRODUCCIN
El tema de inseminacin artificial en bovinos es abordado en este texto, con el fin de estudiar no solo
aspectos tcnicos y metodolgicos de la misma, que ya son bien conocidos y estudiados por
investigadores y profesionales del sector pecuario, sino que se pretende analizar la influencia que esta
biotecnologa ha tenido desde su introduccin a nuestro pas Colombia, en aspectos fundamentales
para la explotacin bovina como son la eficiencia reproductiva, el mejoramiento gentico, la
transferencia de tecnologa al campo, y la capacitacin del productor, todo finalmente reflejado en la
productividad y la rentabilidad de las explotaciones ganaderas.
En Colombia en las explotaciones de ganadera lechera, de explotacin crnica y de doble propsito, la
inseminacin artificial es una herramienta que an no cuenta con la difusin que seria pertinente de
acuerdo a los beneficios que puede aportar a la productividad de una explotacin. Los reportes
referentes al trabajo en las diferentes regiones respecto a esta biotecnologa son escasos, y
dependiendo de la regin geogrfica y tipo de explotacin, la inseminacin artificial se distribuye de
manera poco homogenea, siendo ms comn el trabajo de inseminacin en regiones y explotaciones
donde la ganadera es destinada a la produccin intensiva y semintensiva, con la existencia de un sector
comercial de la IA ms estructurado, y una mayor disponibilidad de profesionales y campesinos
capacitados en las labores de la IA.
La inseminacion artificial puede definirse como la biotecnologa para la aplicacin de semen en el tracto
genital de una hembra en el momento efectivo para la fecundacin. Respecto al origen de la
inseminacin artificial (IA), existen historias indocumentadas de la obtencin por los Arabes de esperma
a partir de yeguas servidas pertenecientes a grupos rivales, y el uso del esperma para inseminar sus
14
propias yeguas. Leeuwenhoek (1678) y su asistente Hamm, fueron las primeras personas en observar
espermatozoides (13).
La primera IA la hizo en 1780 el fisilogo italiano Lazaro Spallanzani en una perra, la cual pari tres
cachorros 62 das despus. Pasaron otros 100 aos antes de que Heape (1897) y otros investigadores
en muchos pases, reportaran que la IA fue utilizada en conejos, perros y caballos. Un crecimiento
fenomenal de la IA en bovinos lecheros, ocurri en los aos 40 en los Estados Unidos, cuyos
procedimientos desarrollados fueron establecidos mundialmente. Desde entonces, la IA ha sido utilizada
como el principal vehculo para dispersar rpidamente genes de valor, dentro de la poblacin para
mejorar la calidad gentica de los hatos. El constante nivel de progreso gentico en el ganado lechero
en pases desarrollados, ha estado determinado adems de la seleccin, por el avance en la tecnologa
de la IA y su rpida aceptacin para establecer genes de inters productivo en las poblaciones lecheras
(13, 14, 15).
Otros hechos histricos importantes para la IA, fueron desarrollados en Rusia, Japn, Dinamarca y
Francia, entre otros pases. En Rusia en 1907, Ivanow, estudi la IA en perros, zorros, conejos y pollos.
Veterinarios daneses (1936), realizaron un programa con 1,070 vacas alcanzando un 59% de tasa de
concepcin y establecieron el mtodo recto-vaginal de fijacin del crvix, y Sorensen en 1940, realiz la
invencin de las pajillas para empacar semen. En Japn, Nishikawa (1912-1962), realiz inseminacin
en vacas, ovejas, cabras, cerdos y pollos. En Rusia, Milovanov (1964), dise e hizo prcticas las
vaginas artificiales para recoleccin de semen. Cassou (1964), produjo las pajillas comerciales utilizadas
mundialmente, con un mtodo de sellado de pajillas plsticas y una pistola para inseminacin.
Originalmente se usaron solo las pajillas para 0.5ml de semen, pero las pajillas para 0.25ml de semen
se hicieron populares al requerir menos espacio para el almacenamiento (13).
Es inegable la relevancia de la inseminacin artificial en el mejoramiento de los parmetros
reproductivos y productivos de la ganadera mundial. El uso extendido de la inseminacin artificial ha
permitido a la industria lechera mundial, adquirir avances espectaculares en el merito gentico del
ganado lechero para la produccin de leche (16). La IA ha mostrado que su uso ha sido de un enorme
15
beneficio econmico sobre el mejoramiento en la produccin de leche, como mecanismo de dispersar

genes, en el control de venreas y otras enfermedades, y en la reduccin de genes letales (17, 18).
El componente mejoramiento gentico es entonces uno de factores sobre los cuales se reconoce con
ms vehemencia el papel beneficioso de la IA. En los pases con una alta produccin de leche, est
bien generalizada la idea de que la IA es una metodologa simple, exitosa y econmica para introducir
genes de inters en las poblaciones (19). La IA ha tenido un gran impacto benfico en la ganadera
lechera porque conduce a un incremento en la intensidad de seleccin porque solo un pequeo nmero
de toros es requerido para generar progenie, y en la ocurrencia de seleccin porque los toros son
identificados por merito gentico basado en registros del desempeo de sus hijas y otros parientes (16).
Este ultimo prrafo nos conduce a pensar en la relacin directa que debe existir entre el manejo de las
fuentes de informacin de registros productivos y reproductivos para la elaboracin de programas de
seleccin y mejoramiento gentico, que finalmente debern conducir las labores de inseminacin, al
menos respecto a la escogencia del material gentico a utilizar para cada servicio, el cual debe ser
acorde con los fines productivos y reproductivos de la explotacin, y a las proyecciones respecto al
comportamiento del hato, incluso en otros factores tales como la sanidad, la nutricin, el manejo, la
adaptacin, y el mercado o comercializacin de animales y productos.
En Colombia, un problema generalizado del uso de la IA, esta en que la escogencia del semen para la
IA, la cual se realiza en muchos casos sin criterios slidos fundados en estudios de mejoramiento
gentico, sin estudios del impacto productivo y rentable, e incluso sin la evaluacin de las condiciones
del ambiente productivo en que los animales deben desarrollarse. La importacin de semen al pas es
comn, por lo cual aunque el semen este respaldado por estudios de su valor gentico, es importante
considerar que el ambiente productivo en el cual dicho semen fue evaluado suele ser bastante distante
al ambiente productivo local, principalmente en factores nutricionales, climticos, de manejo, alojamiento
(pastoreo, confinamiento), y de tipo de explotacin (intensidad), por lo cual en la mayora de los casos
no es posible extrapolar al pas los resultados de dichas pruebas genticas forneas.
La importacin es uno de los medios para el mejoramiento gentico por lo cual no se pretende
desconocer su valor, adems es innegable que gran parte del avance gentico en la ganadera
colombiana corresponde a dicho origen a travs del semen para IA. Sin embargo los estudios genticos
16
propios son sin duda ms adecuados para lograr un avance gentico rentable de acuerdo a nuestras
condiciones productivas, y es adems importante reconocer algunos problemas que son asociados con
la importacin indiscriminada de material gentico, tales como el desbalance nutricional comn a la
mayor intensividad de las explotaciones, la perdida de eficiencia reproductiva asociada con los
incrementos en la produccin lechera, los problemas sanitarios y de adaptabilidad de algunas razas
importadas, y los problemas conformacionales que afectan el desempeo de los animales, donde
pueden servirnos como ejemplo los problemas de adaptacin a nuestra geografia y el aumento en la
lechera de partos distocicos por cras de gran tamao, posiblemente con origen en los sistemas de
seleccin por tamao desarrollados en pases como Mxico, EEUU y Canad.
Un programa de mejoramiento gentico involucra la estimacin final de valores de cra para cada una de
las principales caractersticas productivas heredables por machos y hembras en lechera y ganadera de
carne. Por la facilidad de diseminacin de material gentico a travs de IA, la estimacin de valores de
cra para toros de acuerdo a la produccin de sus hijas y dems relaciones de parentesco adquiere gran
importancia. Por esta razn, la evaluacin gentica de toros en pases de ganadera desarrollada se
realiza a un mbito nacional, de manera que el programa de mejoramiento repercute en todas sus
explotaciones y se acomoda a su ambiente productivo. Un ejemplo de este caso son las evaluaciones
genticas elaboradas por la Asociacin Holstein de Mxico, las cuales son desarrolladas para
caractersticas de productividad lechera, componentes de la leche, y conformacin corporal, donde no
solo se limitan a la calificacin de caractersticas de tipo, sino que se evala su correlacin con la
produccin, y se calculan valores de cra para cada caracterstica de manera que es factible predecir los
logros genticos mediante los programas de seleccin elaborados.
Con lo aqu expuesto se quiere entonces dar a entender que la IA por si sola no es necesariamente un
vehculo de mejoramiento gentico, pues en el caso de ser mal utilizada puede causar incluso un
retroceso en los logros alcanzados con el mejoramiento, e incluso puede llevar a la perdida acelerada
de caractersticas beneficioasas en animales adaptados a determinadas condiciones de vida. Por estas
razones, los programas de IA as sean aplicados solo al nivel de explotaciones individuales, deben ser
soportados con estudios de impacto gentico, que pueden ser alaborados de manera sencilla, siempre y
cuando se cuente con la informacin en registros, la cual es ms confiable mientras mayor volumen de
informacin se genere.
17
El desarrollo de la IA ha permitido avances que han sido extrapolados o han fundado el desarrollo de
otras biotecnologas, de manera que, aunque en Colombia estemos an lejos de lograr una amplia
cobertura de hatos ganaderos que implementan IA, debe continuarse con la bsqueda del
establecimiento de biotecnologas alternas o asociadas, pues segn Foote (13), la aceptacin mundial
de la tecnologa de IA, proporciona el mpetu para el desarrollo de otras tecnologas como la
criopreservacin y el sexaje de espermatozoides, la regulacin del ciclo estral, y la recoleccin, cultivo,
congelacin, y transferencia de embriones, adems de la clonacin. Adems la combinacin de la IA
con nuevas tecnologas, puede dispersar genes deseables de una forma ms eficiente (19).
Se ha comenzado a trabajar en la IA con espermatozoides sexados, y en la criopreservacin del semen
se ha sugerido desarrollar estrategias alternativas como la vitrificacin para el almacenamiento por
largos periodos de los espermatozoides bovinos, disminuyendo los daos celulares (20, 21).
Las principales ventajas que posee la IA para tener una gran aceptacin dentro de los productores son:
el bajo costo del semen, el bajo costo de la aplicacin de est y el xito que garantiza el proceso (19).
Tambin esta demostrado el menor costo del servicio, menores riesgos asociados con la monta natural,
una mayor ganancia gentica, y tasas de preez que pueden ser mejores respecto a la monta natural
(22, 23).
El costo del semen debe ser analizado como un factor que no necesariamente es directamente
proporcional al progreso gentico que proporciona, pues existe la visin errnea que el semen de mayor
costo brinda mayores beneficios en tal sentido, lo que solo puede ser cierto si la cotizacin de las pajillas
es correspondiente a un ranqueamiento de animales para determinadas caractersticas respecto a
valores de cra o habilidades predichas de transmisin. Un programa de IA debe ser bien estructurado
para que se refleje en beneficios econmicos por los costos disminuidos de los servicios, para lo cual
aspectos como la tcnica, el costo-beneficio del semen utilizado, y el numero de servicios o pajillas
utilizadas por concepcin, determinaran la viabilidad econmica del mismo o su ventaja econmica
sobre un sistema de servicios por monta natural. De igual forma el xito del proceso no solo recae sobre
la tcnica en s, sino que estar precedido por las labores de planeacin de los servicios y la deteccin
efectiva de calores como factores determinantes.
18
Hasta el 50% del aumento en la produccin ganadera en pases como Canad y el Reino Unido es
atribuible al mejoramiento gentico solo a travs del uso de la IA, y el resto es atribuido al mejoramiento
de factores ambientales como la salud, el sitio de pastoreo, la nutricin y la administracin (24, 25). Lo
que nos da una idea del potencial que tiene la IA para fomentar el desarrollo productivo de la ganadera
colombiana, siempre y cuando se establezcan esfuerzos a una escala significativa, en lo posible del
mbito pblico y privado.
1.4 LA DETECCIN DEL CELO PARA LA INSEMINACIN ARTIFICIAL
El xito en campo de la IA, depende de la deteccin adecuada del estro y de la habilidad en la
inseminacin. El principio clsico para la IA es el sistema A.M.-P.M. y P.M.-A.M, establecido por
Trimberger (1948), el cual establece que para mejor fertilidad, las vacas que sean vistas en estro en la
maana, deben ser inseminadas durante la tarde del mismo da, y las vacas vistas en estro en la tarde,
deben ser inseminadas despus del amanecer del siguiente da. Todo esto basado en la observacin, la
palpacin de los ovarios y los datos sobre servicios (13).
La principal causa de fallas en los programas de inseminacin artificial es la pobre deteccin de calores,
causante de bajas tasas de concepcin y por ende de los largos intervalos entre partos, al no permitir
obtener la preez antes de los 85 das posparto, para adquirir un ternero cada 12 meses (26). Una
deteccin de celos poco eficiente disminuye la produccin lechera total a lo largo de la vida productiva
del animal y el nmero de terneros nacidos por vaca, y aumenta el nmero de das abiertos y la tasa de
reemplazo por problemas reproductivos (27).
En nuestro medio la deteccin poco efectiva de los celos suele ser la causante de la baja eficiencia en
los programas de IA, pues la deteccin del calor se realiza casi de manera generalizada, solo mediante
la observacin visual de signos, lo que en muchos casos no se realiza ni con la frecuencia, ni en los
horarios ms adecuados. Adems el nivel de capacitacin de los operarios suele ser escaso y solo se
identifica un rango de signos reducido. De manera afortunada el signo denominado reflejo de
permanencia ha sido adoptado como determinante del momento adecuado para realizar la IA en
muchas ganaderas, mediante el metodo AM-PM principalmente para ganado lechero, y 6 a 12 horas
despes del mismo para ganado cebuino. Los costos de la mano de obra y la dificultad de realizar
19
seguimientos de animales en grandes poblaciones o sistemas de produccin extensivos, son otros

determinantes de las fallas de la deteccin del celo en nuestro medio.
La observacin visual de signos es la metodologa tradicionalmente aceptada para la determinacin del
momento del estro en los bovinos. Dicha observacion debe ser realizada minimo 30 minutos en la
maana y 30 minutos en la tarde cada dia (28). Algunos signos comunes del estro bovino son: La
aparicin de moco acuoso cristalino en la vulva 2-3d antes del estro, la aparicin de moco pegajoso
cristalino en el periestro, la presencia de tumefaccin vulvar, los animales se tornan nerviosos, inquietos,
en alerta, con la cabeza en alto, incrementan el acicalamiento, se mantienen en pie, realizan mayor
desplazamiento, se separan del grupo, recorren las cercas, reducen levemente la rumia, el consumo y la
produccin de leche, la vaca en estro muge ms de lo normal, intenta saltar a otras vacas, y se deja
saltar quedndose quieta en el momento de mayor receptividad sexual (reflejo de permanencia), y
finalmente no se deja saltar y aparece una secrecin sanguinolenta 2 a 3 das despus del estro. Todos
los celos no se expresan con igual claridad; su intensidad se suele medir subjetivamente en funcin de
lo "excitable" que se muestre la vaca, o en funcin de cuntas veces monta y se deja montar, o solicita
la monta (29).
Otro problema asociado con la observacin visual de signos de estro son los comportamientos
individualizados de los animales, o la baja intensidad de signos determinada por el factor endocrino, lo
cual dificulta las labores de deteccin y tiende a producir un aumento en el periodo de das abiertos
(dias entre el parto y el servicio efectivo) en el hato.
Existen mtodos o ayudas para la deteccin del estro, los cuales pueden clasificarse como: mtodos
detectores de pasividad a la monta, mtodos basados en la medicin de la actividad fsica, mtodos
detectores de cambios no visuales, y mtodos basados en el control del ciclo estral. Algunos de estos
mtodos han sido probados en Colombia o podran ser adoptados dependiendo de su practicidad y
factibilidad econmica.
Los mtodos detectores de pasividad a la monta se basan en el nico indicador especfico de celo el
reflejo de pasividad de monta o de permanencia, estos mtodos pueden ser:
20
1. Detectores de la presin de monta, los cuales se colocan en la base de la cola de la hembra, e

indican la ocurrencia de la monta a travs de: a). Cambio de color de un dispositivo; b) El cambio de
color del dispositivo y la emisin de luz, o c) La emisin de seal de radiofrecuencia hacia una
computadora (ver Figura 1). La eficiencia de estos mtodos es del 66 al 98% (28, 30). Dentro de estos
mtodos, poseen una mayor factibilidad de aplicacin en nuestro medio por facilidad y economa, los
dispositivos de cambio de color como los conocidos Kamar, que consisten en espumas con tinta
recargables, la cual es liberada por la presin de la monta.
Figura 1. Dispositivos detectores de presin de monta.
Fuente: Marcantonio (1998).
2. Pintura en la base de la cola, la cual consta en pintar una franja de 20-30 cm de largo por 5 cm de
ancho en la base de la cola de la vaca, la cual pierde gradualmente la pintura, evidenciando de esta
manera la pasividad a la monta mediante una escala de perdida de pintura. La eficiencia del mtodo es
del 81 al 95% (30). Se conoce de algunos ensayos en el pas con esta metodologa, sin embargo no se
ha establecido como un mtodo sistemtico de deteccin de calores, posiblemente por la dificultad de
evaluacin al solo permitir un criterio subjetivo de las montas recibidas por la vaca.
3. Animales detectores, como toros preparados quirrgicamente por vasectoma o desviacin del pene y
hembras o novillos androgenizados o estrogenizados. Estos animales pueden utilizar un bozal marcador
("Chin ball") que tiene en su parte inferior un recipiente con tinta, de manera que al apoyar el bozal
sobre la hembra receptiva, pinta una franja sobre su lomo (28) -ver Figura 2-. La eficiencia del mtodo
es del 78 al 96% (30). Los animales detectores, principalmente toros preparados quirrgicamente con
desviacin o retraccin del pene y vasectoma, son empleados como el mtodo auxiliar de deteccin
ms comn en Colombia. Esta prctica sin duda es beneficiosa para incrementar la eficiencia de la
deteccin, sin embargo existen algunos problemas asociados como son los costos de la cra y
21
mantenimiento de estos animales, adems de los riesgos asociados a su manejo, tanto para operarios y
otros animales, como para las instalaciones.
Figura 2. Bozal marcador.
Fuente: www.sinnamonshowsupply.com
Los mtodos basados en la medicin de la actividad fsica, usan el principio del aumento en la actividad
fsica durante el estro, pueden ser podmetros que miden y registran automticamente la cantidad de
pasos, o collares que miden y registran los movimientos del cuello (ver Figura 3). La eficiencia de estos
sistemas es del 60 al 100% (30).
Los mtodos detectores de cambios "no visuales" pueden ser: 1. Cambios a nivel crvico-vaginal, dentro
de los cuales encontramos la medicin del contenido de materia seca del moco vulvar, la prueba de
cristalizacin, y la medicin de la resistencia elctrica vaginal. Estos mtodos suelen basarse en
cambios que ocurren gradualmente durante el periestro, y su eficiencia es del orden del 50 al 80%; 2.
Cambios en las temperaturas vaginal y de la leche, basados en que la hembra en celo aumenta su
temperatura vaginal en 0,3 a 1,1 C, en tanto que la temperatura de la leche sufre un incremento entre
0,2 a 0,4 C. Su eficiencia es alrededor del 50 al 55%; y 3. Medicin de la progesterona plasmtica, la
cual est basada en que durante el celo los niveles de progesterona son bsales (<1ng/ml), sin embargo
estos niveles se mantienen bsales durante 5-6 das del ciclo y no slo durante el celo (30). Ha sido
considerado el uso de una nariz electrica compuesta por sensores de conduccin polimericos utiles
para cuantificar el olor perivulvar y su coincidencia con las etapas del ciclo estral segn la resistencia
electrica (31). A parte de algunos trabajos de investigacin, estos mtodos son poco utilizados de
manera prctica en el pas, posiblemente por la logstica requerida, por los costos, o simplemente por el
desconocimiento de los mismos. Sera importante entonces, realizar programas de difusin y
22
capacitacin al productor sobre las alternativas para la deteccin del celo, de manera que el aumento en
su eficiencia, entre a favorecer el desempeo de los programas de IA.
Figura 3. Podmetros y collares para la deteccin de estro.

Fuente: Marcantonio (1998).
1.5 INSEMINACIN ARTIFICIAL A TIEMPO FIJO Y SINCRONIZACION HORMONAL

Mtodos basados en el control del ciclo estral efectuados mediante el uso de hormonas simplifican o
eliminan en caso de inseminacin artificial a tiempo fijo (IATF) el problema de la deteccin del celo. La
IATF permite hacer inseminacin artificial de un amplio nmero de animales sin necesidad de detectar
los celos. Consiste en la manipulacin del ciclo estral mediante un tratamiento hormonal para reproducir
las condiciones fisiolgicas que permitan realizar la IA en un periodo de tiempo establecido. La IATF
permite el establecimiento de temporadas de servicios y partos, y favorece el mejoramiento gentico al
usar semen de reproductores sobresalientes y razas especializadas en produccin de carne o leche.
El costo de los hormonales y el manejo adecuado de los mismos son factores determinantes del xito de
la IATF, por lo cual deben realizarse anlisis econmicos y tcnicos, previos al uso de este tipo de
protocolos, que en muchos casos pueden por falta de previsin, constituirse en desencadenantes de
problemas reproductivos y de rentabilidad. No se quiere con esto fomentar ni mucho menos el concepto
popular errneo de Lo mejor de las hormonas es no utilizarlas, pero si se quiere hacer nfasis en la
importancia de su utilizacin bajo un conocimiento estricto de sus efectos y consecuencias.
La efectividad de los mtodos de IATF demuestra que sta puede ser una alternativa importante a
masificar en los programas de IA del pais, siempre y cuando se conozca la relacin costo-beneficio de
su desarrollo y aplicacin.
23
La sincronizacin hormonal del estro permite llevar las vacas al estro en un tiempo predeterminado,
favoreciendo la eficiencia en la deteccin del mismo. Al igual que puede sincronizarse solo la ovulacin,
como otra alternativa para mejorar las tasas de gestacin (26). Un grupo de hormonas son utilizadas
para los fines mencionados y otros que se mencionaran en los captulos siguientes, algunas de uso
extendido en nuestro pas, e incluso de uso rutinario, en ocasiones por personas no capacitadas en
labores medico veterinarias, lo que lastimosamente ha conducido a diversidad de efectos perjudiciales,
como seria el caso del desencadenamiento de abortos, alteraciones en el ciclo estral, alteraciones en el
desarrollo de la gestacin, e incluso efectos en la salud animal y humana consumidora de productos
pecuarios.
Existen mltiples programas para la sincronizacin del estro y modificaciones posibles, como una
inyeccin simple o doble de prostaglandina o el uso de otras hormonas como la GnRH (26, 32), el uso
de progestagenos (33) inyectables o liberados por diversos implantes subcutneos o intravaginales, o el
uso de FSH, LH, PMSG, hCG y estrgenos (34).
Las prostaglandinas buscan la lisis del cuerpo lteo y la disminucin de la progesterona circulante, son
tiles para llevar grupos de vacas al calor. Los animales pueden estar ciclando y la deteccin del calor
puede ser eficiente por programas con prostaglandinas. De manera que si el animal esta entre los das 6
y 16 de su ciclo, generalmente entrar en calor 36 a 72 horas despus de la inyeccin de la droga. En
un programa semanal, una vaca observada en calor es inseminada 8 a 12 horas despus, mientras las
vacas no vistas en calor son reinyectadas (ver Figura 4). En nuestro medio las prostaglandinas son
empleadas con gran frecuencia por su facilidad de uso y relativo bajo costo respecto a otros
hormonales, sin embargo es importante considerar que el uso de prostaglandinas requiere la presencia
de un cuerpo lteo funcional en el ovario para que el animal responda, por lo que la gran mayora de
fallas en los resultados de su uso, estn asociados a una deficiente determinacin del cuerpo lteo, que
incluso en ocasiones no se realiza. La ecografa ovrica transrectal es una excelente alternativa para
dicho fin.
24
Figura 4. Sincronizacin del estro con una prostaglandina.

Adaptado de Graves y McKeee (2003).
Actualmente est en uso la combinacin de estrgenos y progestgenos para sincronizar el estro

bovino, mediante la aplicacin de un implante plstico en la oreja de la vaca, el cual contiene 6 mg de
norgestomet (un progestgeno sinttico) y una solucin inyectable que contiene 3 mg de norgestomet y
5 mg de valerato de estradiol. El implante y la inyeccin se aplican el mismo da y el implante se retira 9
das ms tarde. Una vez retirado el implante, igual que cuando el cuerpo lteo est en regresin, baja el
nivel de progesterona en la sangre y se libera la hormona LH, permitiendo el crecimiento final, la
maduracin folicular, el estro y la ovulacin. Las vacas inician el estro entre 24 a 36 horas despus de
retirado el implante. El norgestomet implantado inhibe las hormonas gonadotrpicas, el norgestomet
inyectado inhibe el desarrollo folicular rpidamente, y el valerato de estradiol inhibe la formacin de un
cuerpo lteo o causa su regresin en animales que han ovulado recientemente (34). Implantes
intravaginales liberadores de progesterona como el DIB , son empleados en protocolos similares.
Otros programas de sincronizacin del estro y la ovulacin han sido desarrollados por investigadores en
los ltimos aos, la difusin de estos mtodos en Colombia es an deficiente, por lo cual es importante
que sean estudiados, evaluados y considerados por los mdicos veterinarios en sus actividades de
campo, principalmente por los resultados satisfactorios que se reportan en otras latitudes. A
continuacin se describen algunos de los programas ms notables en este sentido.
El programa Ovsyinch introducido en 1995 por Pursley et al. (35), fue el primer programa de
sincronizacin del estro para ganado lechero con un componente efectivo para la inseminacin a tiempo
fijo (IATF). Consiste en una inyeccin de GnRH seguida en 6 o 7 das por una inyeccin de
prostaglandina (PGF2), 48 horas despus se proporciona una segunda dosis de GnRH (ver Figura 5),
25
que logra la sincrona de la ovulacin con un tiempo de inseminacin que puede realizarse a las 0 a 24
horas. Las ms altas tasas de preez pueden obtenerse, inseminando las vacas a las 16 horas despus
de la segunda inyeccin de GnRH. Ovsynch es un mtodo efectivo para sincronizar la ovulacin, y no
necesariamente el estro. Puede inducir el estro en vacas anestricas, y hasta un 85% de las vacas
pueden ser servidas por IATF. La gran ventaja de Ovsynch es el no tener que detectar las vacas en celo
por un periodo de seis das. Otros programas de sincronizacin son: Co-Synch, cuando las vacas son
inseminadas al mismo tiempo en que reciben la segunda inyeccin de GnRH; Select Synch, que
consiste en una inyeccin de GnRH, seguida por una inyeccin de PGF a los 7 das, para servir las
vacas al ser observadas en calor; Pre-Synch, consiste en 2 inyecciones de PGF, administradas a un
intervalo de 14 das, con la segunda inyeccin administrada 12 a 14 horas antes de un programa
Ovsynch, logrando alcanzar tasas de preez de 43 a 48% comparado con 29 a 38% de Ovsynch (36,
37).
Figura 5. Programa Ovsynch para sincronizacin de estro.
Fuente: Olson (2002).
Existen programas para la sincronizacin adecuada del estro en novillas. Eazi-Breed CIDR, consiste en
la insercin de un dispositivo liberador de progesterona (CIDR) en la vagina de la novilla por 7 das, el
CIDR es removido y las novillas son tratadas con una dosis de PGF (Lutalyse), las novillas finalmente
son observadas para el estro. Melengestrol (MGA) y PGF, se utilizan en otro programa para
sincronizacin. MGA es suministrado en el alimento a una tasa de 0.5mg por cabeza por 14 das para
suprimir el estro. Una vez retirado el MGA del alimento, las novillas entran en un calor sincronizado, y 19
das despus de retirar el MGA se inyecta PGF, y el estro es observado por 5 das (37).
26
1.6 EVALUACIN DEL SEMEN PARA INSEMINACIN ARTIFICIAL

Uno de los factores fundamentales en el xito de la IA es la calidad del semen utilizado. En centrales de
recoleccin y procesamiento de semen, ste debe ser evaluado no solo para garantizar una cierta
capacidad fecundante, sino tambin su calidad en el aspecto sanitario. No es frecuente en Colombia la
evaluacin del semen en las explotaciones ganaderas donde es utilizado, de manera que suele
desconocerse su estado al momento de la inseminacin, adems el manejo del semen durante su
transporte, manipulacin y almacenamiento puede constituirse en un factor causante de fallas en su
calidad y en los resultados de la IA, ya sea por perdidas de nitrgeno o demoras en la recarga de los
termos, por manipulacin incorrecta de las pajillas en aspectos tcnicos como tiempos de exposicin a
determinadas temperaturas, o por inadecuadas prcticas sanitarias. Por dichos motivos, es
recomendable un estricto seguimiento de la calidad seminal y de los procedimientos de conservacin y
manipulacin del mismo. La evaluacin del semen puede realizarse en las explotaciones contando con
un equipamiento mnimo para la determinacin por microscpica de la calidad del mismo, en aspectos
como la movilidad masal e individual, la morfologa y la concentracin, adems de parmetros de su
apariencia macroscopica como consistencia, olor y color, evaluados en una muestra de cada lote de
pajillas almacenado.
La prueba ms ampliamente usada para evaluar la calidad espermtica, desde las etapas iniciales de la
IA, hasta el tiempo presente, ha sido la evaluacin de la proporcin de espermatozoides normales con
movimiento progresivo. Para garantizar la fertilidad del semen congelado los eyaculados
criopreservados han sido evaluados tradicionalmente para su movilidad espermatica. Esta evaluacion es
principalmente de tipo subjetivo y es realizada por observacion visual en un microscopio optico con
contraste de fase, por lo cual depende de la habilidad y experiencia del operador (38). Para el
mejoramiento de la cuantificacin de la movilidad espermtica han contribuido los microscopios de
campo oscuro, los microscopios de contraste de interferencia diferencial, las tinciones mltiples, la
citometra de flujo, y el anlisis de esperma asistido por computador (CASA). Con el semen congelado,
la evaluacin de la sobrevivencia posdescongelacin se hace importante. La capacidad de evaluar el
estado acrosomal de los espermatozoides fue desarrollada en 1968 por Saacke y Marshall (13, 15).
Aunque algunos de estos procedimientos son costosos o no estn disponibles al productor en nuestro
27
medio, es factible realizar algunas evaluaciones peridicas al semen mediante los servicios de
laboratorios especializados en pruebas de este tipo.
La evaluacion de la morfologia espermatica es un componente principal del espermiograma, e indica la
presencia de patologias testiculares o epididimarias. Este puede proveer informacion sobre la habilidad
fecundante del espermatozoide (38).
El volumen eyaculado y la concentracin espermtica son otros dos componentes crticos de evaluacin
del semen, porque determinan el nmero de espermatozoides obtenidos. Mtodos pticos rpidos para
medir
la concentracin
espermtica, han reemplazado
los
tediosos
procedimientos
de
hematocritometra. El test hiposmotico, la penetracin en gel y la integridad del ADN, han sido
correlacionados con la fertilidad. La fertilizacin competitiva es una va eficiente de ranquear la fertilidad
de machos usando pruebas de fertilizacin in vitro o pruebas de inseminacin con animales. Para la IA
comercial, un mtodo no costoso de estimar la fertilidad, basado en vacas que no retornan al estro por
inseminacin, fue desarrollado por Thompson y Salisbury (1947), como un componente esencial de los
programas de IA, pues hace posible comparar la fertilidad de toros, los inseminadores, los
procedimientos de procesamiento de semen, y el desempeo del hato bajo condiciones practicas de
campo (13, 15, 39). Otros nuevos mtodos para la evaluacin de la calidad seminal son: la evaluacin
del estado de la cromatina de espermatizoide segn el grado de desnaturalizacin del ADN usando
citometra de flujo, la evaluacin de la habilidad del espermatozoide para unirse a la zona pelcida del
oocito, la evaluacin de la capacitacin espermatica y la reaccin acrosmica (38).
El estudio del xito de los programas de IA, mediante el analisis de los registros de servicios, toros, e
inseminadores, debe ser siempre considerado en las ganaderas, pues permite asociar de manera
estadstica, los resultados de los programas de IA con los factores tcnicos o relacionados con la
calidad del semen.
1.7 TCNICA DE INSEMINACIN ARTIFICIAL
La tcnica recto-vaginal es la ms comnmente utilizada para inseminar vacas, es siempre
recomendable que se use la mano izquierda en el recto para manipular el tracto reproductor, y la mano
derecha para manipular la pistola de inseminacin. Usando siempre un guante lubricado es necesario
28
sacar el estircol del recto, tambin es importante limpiar la vulva con una toalla de papel, para quitar el
exceso de estircol. Se deben abrir los labios de la vulva, lo que permitir insertar la pistola de
inseminacin varias pulgadas, antes de tocar las paredes de la vagina. La pistola debe insertarse en un
ngulo ascendente de 30 grados, para as evitar penetrar a la uretra y a la vejiga. Una vez que la punta
de la pistola haya entrado unas 6 a 8 pulgada en la vagina, se levanta la parte trasera de la pistola hasta
una posicin casi horizontal. La punta de la pistola puede tocarse fcilmente con la mano izquierda a
travs de las paredes de la vagina. La pistola se avanza hasta hacer llegar la punta de la misma hasta el
fondo de la vagina y la parte externa del crvix o frnix (40, 41, 42).
Imagen 1. Inseminacin artificial en bovinos.
Izq: IA por el mtodo recto-vaginal; Der: vagina artificial; pajilla para semen de 0.5 ml, y cortapajillas.
Una vez que la pistola esta en contacto con la parte externa del crvix, se usa la palma y los dedos para
guiar la punta de la pistola hacia la entrada del mismo. Luego es necesario hacer movimientos rotativos
hasta sentir que la pistola avanz cada anillo del crvix. Cuando se haya pasado todos los anillos del
crvix, se puede sentir la punta de la pistola en el cuerpo uterino. Es necesario verificar la ubicacin de
la punta de la pistola, para luego empujar el mbolo de la pistola, para que el semen se deposite en el
cuerpo uterino. Despus de haber depositado el semen correctamente, se retira lentamente la pistola
del tracto reproductor y se retira la mano enguantada del recto (40, 41, 42).
29
Figura 6. Trabajo de inseminacion artificial.

Fuente: DeJarnette y Nebel (2006).
Izq: Contacto de la punta de la pistola para inseminacin con el fondo de la vagina y el frnix; Der: deposito del semen en el
cuerpo uterino.
Respecto a la tcnica en s, no sobra mencionar que mientras ms preciso y sistemtico sea el trabajo
de IA, ms factible ser lograr una fecundacin efectiva. El hecho de omitir pasos claves en el proceso
puede conducir al fracaso del mismo. Y all es donde cobra gran importancia una capacitacin adecuada
de los operarios encargados en las explotaciones del trabajo de IA. Siempre debe existir un seguimiento
y asesora veterinaria en los programas de IA, pues aunque los operarios conozcan y adquieran
destrezas manuales para la tcnica, es el profesional quien debe conocer la fisiologa reproductiva
bovina y resolver la problemtica asociada a este tipo de biotecnologa.
La inseminacin artificial es una biotecnologa reproductiva que aplicada a la produccin ganadera
aporta beneficios prcticos, sanitarios, productivos y rentables. La tcnica de IA por si misma ha ido
evolucionando desde su desarrollo hasta niveles de eficiencia comparables con la monta natural, ms
sin embargo en muchos casos se ha desconocido que la IA es solo una herramienta para lograr el inicio
de la gestacin, y que no deben atribursele condiciones absolutas como el mejoramiento gentico y el
mejoramiento de la sanidad, pues ante un mal uso de la misma estas condiciones pueden revertirse. La
comercializacin del semen en Colombia an presenta grandes restricciones, pues aunque en centros
urbanos y grandes municipios es muy factible la consecucin de semen, medios para su
almacenamiento y material para la IA, en zonas apartadas es dificultoso el acceso a stos. Un ejemplo,
est en la recarga de nitrgeno para termos de almacenamiento, que en muchas latitudes del pas es
compleja, lo que desestimula la diseminacin de la tcnica.
30
Es importante reconocer la labor de los profesionales del sector pecuario en el desarrollo de la IA en

Colombia. Labor que en lo posible no debe restringirse solo a explotaciones que cuentan con mayor
disponibilidad de recursos, sino que deben fomentarse las labores de extensin al pequeo productor
tanto con la capacitacin, como con la facilitacin de asesora y recursos tecnolgicos, para promover
un desarrollo sostenible y ms generalizado, que pueda tener reflejo en un mbito productivo nacional.
Las asociaciones ganaderas de Colombia fomentan en muchos casos el uso de la inseminacion
artificial. Es pertinente que en el pais dicho fomento est sustentado por pruebas de valor gentico, de
manera que la informacin recopilada por las asociaciones no se limite a la elaboracin de promedios y
otros reportes prcticos, sino que se le permita al ganadero acceder a informacin de pruebas geneticas
elaboradas en nuestras condiciones productivas. Avances en este sentido son reportados por la Union
Nacional de Asociaciones Ganaderas Colombianas, y su Sistema Oficial Nacional de Pruebas de
Progenie (43).
En Colombia ser necesaria la bsqueda de la implementacin de la IA en la gran mayora de las
explotaciones ganaderas, as como el aprovechamiento de los avances para el mejoramiento de la
tcnica, con el fin de promover el avance productivo y rentable de la ganadera nacional.
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33
CAPTULO II
ESTIMULACIN HORMONAL Y SUPEROVULACIN EN
BOVINOS
2.1 INTRODUCCIN
Antes de ejercer las labores del uso de hormonas naturales o sintticas para interferir en la fisiologa
reproductiva normal de un animal, es necesario conocer detalladamente la fisiologa reproductiva y
principalmente la endocrinologa de la reproduccin. El uso biotecnolgico de las hormonas ha sido
siempre motivo de discusin, ya sea por las creencias populares en cuanto a lo mal sano de los
productos derivados de animales tratados con hormonas, o en un contexto ms tcnico respecto a los
beneficios reales de modificar el desempeo reproductivo de los animales. Sin embargo son innegables
los beneficios que al desarrollo de algunas biotecnologas en reproduccin bovina, han sido aportados
por el estudio y aplicacin de protocolos de estimulacin hormonal.
En la biotecnologa bovina de transferencia de embriones el objetivo de los tratamientos de
superovulacin en la vaca, es obtener un mximo nmero de embriones transferibles, con una alta
probabilidad de producir preeces, mientras para la puncin folicular guiada por ultrasonido, la
superovulacin permite la obtencin de una poblacin mayor de folculos ovulatorios que pueden ser
aspirados, para la obtencin de oocitos para la produccin in vitro de embriones (1).
En Colombia la estimulacin hormonal para dichos fines es an una tecnologa reciente, aplicada por un
nmero todava limitado de explotaciones ganaderas, lo cual puede an repercutir poco en la eficiencia
reproductiva del hato nacional. Los altos costos y la necesidad de una alta capacitacin para estas
tecnologas, son limitantes posiblemente superables por los beneficios rentables que proporcionan
cuando son bien aplicadas. Algunos procedimientos seguirn siendo exclusivos a algunos laboratorios y
empresas, sin embargo en el campo son imprescindibles las labores asociadas a su desarrollo, o al
menos en un futuro cercano las explotaciones ganaderas nacionales debern beneficiarse en mayor
escala de estos logros biotecnolgicos.
34

La superovulacin busca permitir el aprovechamiento ms eficiente del recurso gentico de las hembras
bovinas, que se ve limitado por la escasa produccin de cras que de manera natural pueden obtenerse
de stas en su vida til, de manera que se optimicen los fines de eficiencia productiva y rentable.
No solamente con el conocimiento de los efectos fisiolgicos de las hormonas puede predecirse la
respuesta superovulatoria ovrica en una hembra bovina. La preparacin particular elegida de
gonadotropinas, la relacion proporcional LH:FSH, la dosis total, la duracin, el tiempo del tratamiento, el
mtodo de administracin y el tratamiento adjunto apuntado a controlar el crecimiento folicular y la
ovulacin, son factores propios de la tcnica de gran relevancia para el xito de la superovulacin (2, 3,
4). Otros factores conocidos por ser cruciales en la determinacin de la efectividad de los tratamientos
de superovulacin son, la gentica de la donadora, el ambiente en el que sta es mantenida, y el efecto
del toro. Se reporta igualmente un incremento de la atencin de los efectos nutricionales en la funcin
ovrica, la respuesta a la ovulacin y la calidad de los embriones. Otros factores importantes son la
edad e historia reproductiva del animal, la estacin, y el efecto de tratamientos de superovulacin
repetidos. De manera que es requerimiento evaluar otro grupo de factores que suelen mirarse de
manera aislada cuando en una explotacin ganadera se implementan este tipo de protocolos. Cabe
resaltar el caso de la nutricin que puede ser la causa principal de perdida de fertilidad en las hembras
bovinas (5), y que es manejada de manera muy emprica, an en muchas explotaciones tcnificas, lo
que sin duda puede afectar el desarrollo de sta y otras biotecnologas reproductivas.
El aspecto mejoramiento gentico no debe adjudicarse a priori a las biotecnologas asociadas con la
estimulacin hormonal, pues en ausencia de sistemas de determinacin del valor gentico de un animal,
por simples estimativos no probados no es posible asumir un avance en rasgos productivos,
reproductivos o conformacionales. Se hace nfasis en esta situacin porque es comn en nuestro medio
que se hable de mejoramiento gentico de manera ligera y sin evaluaciones que lo soporten.
Para la transferencia de embriones, un amplio rango de respuestas a la superovulacin ha sido
detallado. La variabilidad en dicha respuesta superovulatoria contina siendo uno de los ms frustrantes
problemas con la transferencia de embriones. El nmero de ovulaciones vara entre 0 y 40, y un 30% de
las vacas superovulados no responden al tratamiento o producen muy pocos embriones de mala calidad
35
(6). En promedio el 24% de las recuperaciones de embriones no producen embriones viables, y el 64%
producen menos embriones que el promedio de embriones transferibles, siendo la mayor fuente de
variabilidad en la superovulacin en bovinos, el estado de los folculos ovricos en el momento de inicio
del tratamiento con gonadotropinas. Para dar respuesta a dicho problema se sugiere iniciar los
tratamientos de superovulacin en el momento de la emergencia de una onda folicular, de manera que
la respuesta superovulatoria sea mejorada. La superovulacin puede ser inducida con igual eficacia
cuando los tratamientos son iniciados durante la primera o segunda onda folicular (1), de manera que
durante la aplicacin de la estimulacin hormonal y superovulacin sera pertinente realizar
evaluaciones secuenciales del comportamiento de las estructuras ovricas mediante palpacin o
ecografa, de forma que se reduzca la variabilidad asociada al proceso. Otras alternativas para el
mejoramiento de la respuesta superovulatoria incluyen el uso de anticuerpos contra la inhibina y el uso
de somatotropina bovina (6).
2.3 ASPECTOS TCNICOS DE LA ESTIMULACIN HORMONAL
Tres diferentes tipos de gonadotropinas han sido utilizadas para inducir la superovulacin en la vaca:
gonadotropinas (FHS, LH) de extractos de pituitarias porcina y de otros animales domsticos,
gonadotropina corionica equina (eCG) tambin llamada gonadotropina de suero de yegua preada
(PMSG), y gonadotropina menopausal humana (hMG) (1, 4, 6). El rgimen usual con hormona folculo
estimulante (FSH), es un tratamiento dos veces diarias por 4 o 5 das, con una dosis total de 400mg de
extracto purificado de pituitaria porcina (Folltropin - V) o 50mg de extracto de pituitaria crudo (FSH-P),
para 48 a 72 horas de iniciado el tratamiento, se realiza una inyeccin de prostaglandina (PGF2) para
inducir la luteolisis. El estro ocurre entre 36 a 48 horas, con ovulacin 24 a 36 horas despus. La eCG
es una glicoprotena compleja con actividades de FSH y LH (hormona luteinizante), normalmente es
inyectada una vez, seguida por una inyeccin de PGF2, 48 horas despus. La dosis recomendada esta
entre 1500 a 3000 UI (1, 4).
36
Imagen 2. Ovario bovino multifolicular por tratamiento para superovulacin, imagen

laparoscopica. Fuente: www.uclm.es/profesorado/produccionanimal/TE.pdf
Son mltiples los protocolos que pueden emplearse para la superovulacin ovrica, y cada da se
investigan nuevas combinaciones en los factores descritos como propios de la tcnica. De manera que
ser siempre importante establecer los sistemas de estimulacin hormonal que se acomoden de mejor
manera a las condiciones de los animales, el ambiente, y los recursos de una empresa ganadera.
Otro esquema para la superovulacin involucra la inyeccin de 5 mg de 17 estradiol, despus de la
insercin de un implante de progesterona, seguido por la administracin de FSH, comenzando 4 das
despus del tratamiento con estradiol. Una PGF2 es inyectada 48 horas despus de iniciado el
tratamiento con FSH, y el implante es removido 12 horas despus del tratamiento con PGF2. Una
dosis de 1 mg de benzoato de estradiol puede ser tan eficaz como el 17 estradiol. Datos sugieren
que se logra gran sincrona de la emergencia de ondas foliculares con este tratamiento (1). Este tipo de
esquemas busca adems de sincronizar la emergencia de una onda folicular, fomentar el desarrollo de
mltiples folculos ovricos.
Surez et al. (7) realizaron un trabajo cuyo objetivo fue comparar la respuesta superovulatoria, y la
cantidad y calidad de embriones recuperados en vacas Holstein en la Sabana de Bogot, mediante la
aplicacin de buserelina (un anlogo de GnRH) en el da 6 del ciclo estral, antes de iniciar el esquema
de superovulacin. Se emplearon veinte bovinos hembra de la raza Holstein a los cuales se les aplic
FSH para inducir superovulacin, en los das 11, 12 13 y 14 del ciclo estral, con una dosis total de 20 cc,
y PGF2 con la ltima dosis de FSH, 3cc. A diez de ellas (grupo tratamiento) se les aplic Buserelina en
el da 6 del ciclo estral, antes de iniciar el tratamiento superovulatorio. Los resultados obtenidos
muestran que hubo diferencia significativa entre el grupo tratamiento y el grupo control respecto a la
respuesta superovulatoria (p< 0,05). No se encontr diferencia significativa en el nmero de embriones
37
recuperados entre ambos grupos (p> 0,05). La aplicacin de un anlogo de GnRH, reprograma y
sincroniza el desarrollo folicular, y esto aplicado a vacas superovuladas, tanto como a las receptoras,
garantizara un mejor ambiente para los embriones, con lo cual se incrementara la supervivencia de los
mismos.
Otros trabajos de investigacin en superovulacin bovina en Colombia son: Superovulacin en la
hembra bovina con hormona folculo estimulante y dimetil sulfoxido va intravaginal (Vargas, E. U.Nal,
Bogota, 1993) y Superovulacin en bovinos (Rodrguez, A. Universidad Tecnolgica de los Llanos
orientales, 1993) (8).
Para el caso de la produccin in vitro de embriones previa aspiracin folicular de los oocitos, se sugiere
que en los tratamientos de superestimulacin, la poblacin de folculos es sometida a un crecimiento
acelerado mediante administracin exgena de FSH, con lo cual se altera el ambiente folicular idneo
en donde normalmente los oocitos alcanzaran un estado de competencia para el desarrollo (9). Las
tasas de desarrollo embrionario a partir de oocitos obtenidos de vacas estimuladas con FSH, no han
sido las mejores (15-40%), pues aunque dicho estmulo aumenta el tamao folicular y disminuye la
atresia, estas condiciones no son suficientes para conferir la competencia para el desarrollo de los
oocitos (10). Lo cual demuestra que la respuesta en el desarrollo folicular producto de la estimulacin
hormonal, no garantiza la capacidad de los oocitos para desarrollarse, y menos en condiciones
sintticas como en el caso de la produccin in vitro de embriones. Siendo importante considerar
entonces que la maduracin del oocito no es directamente proporcional a la maduracin folicular.
Investigaciones demuestran que preparaciones de FSH con LH afectan la respuesta superovulatoria
(ver Tabla 1), y que el mximo nivel aceptable de LH parece estar entre 15 y 20% (1). Otros datos
sugieren que la LH no es necesaria en las preparaciones superovulatorias, y que la calidad de
embriones obtenidos puede ser superior con FSH pura. Incluso se sugiere que la administracin de LH
en cualquier dosis, puede ser detrimental para la calidad embrionaria.
38
Tabla 1. Respuesta superovulatoria de vacas Bos taurus, superestimuladas con FSH y

cantidades variables de LH. Adaptado de Mapletoft et al. (2002).
Medias con letra diferente son estadsticamente diferentes. CL: cuerpos luteos; Fert: oocitos fertilizados; Trans:
embriones transferibles.
Se ha demostrado que un periodo de privacin de FSH por un perodo de 1 2 das (coasting

period), que va desde el final de la estimulacin hormonal y la coleccin de los ovarios, as como el
intervalo de tiempo entre la coleccin de los ovarios y la aspiracin folicular para la produccin de
embriones in vitro, afectan significativamente el potencial desarrollo de los complejos cmulus-oocitos
(10, 11), los folculos entran en fase de pseudodominacia o atresa temprana y proveen a los CCOs, un
ambiente folicular en el cual la competencia para el desarrollo es mayor, como ya ha sido previamente
demostrado (12, 13, 14). Una vez el estado de desarrollo folicular hubiese sido alcanzado, con el
mantenimiento de la estimulacin tnica del folculo dominante con LH exgena, podra tener la ventaja
dual de promover la maduracin terminal del folculo pre-ovulatorio y simultneamente detener el
desarrollo de mltiples oocitos menos maduros, que de otra manera ocurrira en respuesta al
tratamiento con FSH (15).
Actualmente, es de amplia aceptacin que la onda pre-ovulatoria de LH provee la seal para la
maduracin final del oocito lo cual comprende la progresin meitica hasta MII, la adquisicin de la
capacidad para la fertilizacin y la futura competencia embrionaria para el desarrollo (16, 17)). De igual
manera, se sabe que la respuesta folicular a la superestimulacin es ptima cuando el tratamiento con
gonadotropinas es iniciado durante la emergencia de una nueva onda folicular. Para este momento los
folculos son relativamente pequeos requiriendo por lo tanto de un tiempo adicional para completar la
maduracin antes de la exposicin al pico de LH (18).
La produccin de oocitos de calidad superior se correlaciona con la ocurrencia de la onda endgena de
LH; por lo tanto, en un proceso superovulatorio una onda de LH inducida precisa y adecuadamente (36
39
a 40 horas despus de la administracin de prostaglandinas) es indispensable para obtener una

maduracin folicular completa y posiblemente una elevada competencia oocitaria necesaria para el
desarrollo (19).
Se postula que la elevada concentracin de estradiol correlacionada con la pulsatilidad de la LH, es
necesaria para facilitar la adquisicin de la competencia por parte de los CCOs (20, 21). En animales
tratados con prostaglandinas, el pico preovulatorio de LH ocurre ms prematuramente en vacas
superestimuladas que en las no superestimuladas (22).
Resultados mostrados por Blondin et al (9), son bastante revolucionarios ya que nunca antes se haba
presentado unas tasas tan altas en la produccin in vitro de embriones a partir oocitos obtenidos por
puncin folicular (tasas de clvaje in vitro cercanas al 100% y tasas de desarrollo embrionario in vitro de
hasta 80.4 9.4%), Esto mediante la estimulacin hormonal de vacas, con FSH, con una posterior
supresin temporal de la FSH desde el final de la estimulacin y el momento de la puncin (48 horas),
con la aplicacin final exogena de LH.
En Colombia se reportan escasos trabajos de investigacin en superovulacin bovina, y la mayora de
reportes encontrados corresponden a trabajos de campo en los cuales no se realizan evaluaciones
estadsticas de la verdadera efectividad de los protocolos empleados, sto principalmente en la
bsqueda de una comercializacin indiscriminada que conduce a muchos productores y profesionales,
al uso indiscriminado y sin criterios slidos de productos hormonales. De igual forma son escasas las
empresas que a nivel comercial, en Colombia, reportan los procedimientos de superovulacin para sus
actividades de aspiracin folicular guiada por ultrasonido y produccin in vitro de embriones para
transferencia, de manera que la cobertura para el acceso a estas biotecnologas en la mayora de
empresas ganaderas del pas es limitada y ms an cuando se consideran los altos costos de estos
procedimientos.
Con el desarrollo de este captulo no se ha pretendido realizar un cubrimiento de todos los aspectos
tcnicos relacionados con esta biotecnologa, pero al menos se busca con la revisin de literatura y la
formulacin de opiniones, brindar una base para su estudio y poner en consideracin algunas
40
concepciones que pueden permitir a los tcnicos hacer un anlisis ms concienzudo antes de su
aplicacin en condiciones da campo.
Los avances tcnicos, farmacuticos y metodolgicos generados en Colombia y el mundo, relacionados
con la estimulacin hormonal para la reproduccin bovina, aplicados a biotecnologas como la
produccin de embriones in vivo e in vitro y la inseminacin artificial, sin duda alguna confieren a stas,
estndares de eficiencia y calidad necesarios para su desarrollo, en la bsqueda de mejores resultados
y mayores beneficios econmicos para la ganadera.
2.5 REFERENCIAS BIBLOOGRFICAS

1. Mapletoft R, Bennett K, Adams G. Recent advances in the superovulation in cattle. Reprod Nut Dev
2002;42:601611.
2. Gordon I. Developments in embryo in vitro production IVP technology. CAB International, 2003.
3. Guilbault L, Lussier J, Grasso F. Matton P, Rouillier P. Follicular Dinamics and superovulation in cattle.
Can Vet J 1991;32:91-93.
4. Kanitz W, Becker F, Schneider F, Kanitz E, Leiding C, Nohner H, Phland R. Superovulation in cattle:
practical aspects of gonadotropin treatment and insemination. Reprod. Nutr. Dev. 2002;42:587599.
5. Correa H. Relacin produccin-reproduccin en hatos de alto potencial gentico y propuestas
nutricionales para mejorarla, Documento sin publicar. Universidad Nacional de Colombia, Medelln,
2000.
6. Jimnez C. Superovulacin: estrategias, factores asociados y prediccin de la respuesta superovulatoria
en Bovinos. Documento de revision, Universidad Nacional de Colombia.
7. Surez D, Gaviria M, Gmez C. La buserelina en programas de superovulacin para transferencia de
embriones. Rev Col Cienc Pec 2001;14(2).
8. Universidad Nacional de Colombia Bogota, Catalogo electrnico biblioteca, 2006; [fecha de acceso:
mayo 15 de 2006] URL: http://www.catalogo.unal.edu.co
9. Blondin P, Bousquet D, Twagiramungu H, Barnes F, Sirard M. Manipulation of follicular developmental to
produce developmentally competent bovine oocytes. Biol Reprod 2002;66:38-43.
10. Blondin P, Guilbault P, Sirard M. The time interval between FSH-P adiminstration and slaugher can
influence the developmental competence of beef heifer oocytes. Theriogenology 1997 a;48:803-813.
11. Blondin P, Guilbault P, Coenen l, Sirard M. In vitro production of bovine embryos; developmental
competence is acquired before maturation. Theriogenology 1997b; 47:1061-1075.
12. Hagemann l, Beaumont S, Berg M, Donnison M, Ledgard A, et al. Development during single IVP of
bovine oocytes from dissected follicles: Interactive effects of estrous cycle stage follicle size and atresia.
Mol Rev Dep 1999;53:451-458.
13. De Witt A, Wurth Y, Kruip T. Effect of ovarian phase and follicle quality on morphology and
developmental capacity of the bovine cumulus-oocyte complex. J Anim Sci 2000;78:1277-1283.
14. Hendriksen P, Vos P, Steenweg W, Bevers M, Dieleman S. Bovine follicular development and its effect
on the in vitro competence of oocytes. Theriogenology 2000;53:11-20.
15. Hillier S. Current concepts of the roles of follicle stimulating hormone and luteinizing hormone in
folliculogenesis. Human Reproduction 1994;9188-191.
16. Docchio M, Jillella D, Lindsey B. Factors that influence follicle recruitment growth and ovulation during
ovarian superstimulation in heifers: Opportunities to increase ovulation rate and embryo recovery by
delaying the exposure of follicles to LH. Theriogenology 1999;51:9-35.
41
17. Driancourt M. Regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals, Implications for manipulation of
reproduction. Theriogenology 2001;55:1211-1239.
18. Price C, Carrire P, Gosselin N, Kohram H, Guilbault l. Effects of superovulation on endogenous LH
secretion in cattle and consequences for embryo production. Theriogenology 19995;1:37-46.
19. Bordigon V, Morin N, Durocher J, Bousquet D, Smith l. GnRH improves the recovery rate and the in vitro
developmental competence of oocytes obtained by transvaginal follicular aspiration from superstimulated
heifers. Theriogenology 1997;48:291-298.
20. Filicori M. The role of luteinizing hormone in folliculogenesis and ovulation induction. Fertility and
Esterility 1999;71:405-14.
21. Lvy D, Navarro J, Schattman G, Davis O, Rosenwaks Z. The role of the LH in ovarian stimulation,
exogenous LH; lets design the future. Human Reproduction 2000;15:2258-2265.
22. Madill S, Rieger D, Johnson W, Walton J, Coy D, et al. Effects of an LHrh antagonist on the time of
occurrence and amplitude of the preovulatory LH surge progesterone and estradiol secretion and
ovulation in superovulated Holstein heifers. Theriogenology 1994;4:1951-1960.
42
CAPTULO III
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS
3.1 INTRODUCCIN
La transferencia embriones se define como el proceso por el cual un embrin es recolectado (lavado)
desde una hembra (donante o donadora) y transferido a otra hembra (la receptora) para completar el
periodo de gestacin (1).
Desde hace cerca de 40 aos se viene desarrollando la transferencia de embriones (TE), tcnica
conducente a mejorar las caractersticas deseables de un hato ganadero, ya que a travs del aumento
del nmero de embriones y terneros, el potencial gentico de la hembra puede emplearse con ms
eficiencia, lo cual facilita la implementacin de programas de mejoramiento gentico (2, 3).
Para la ganadera colombiana esta biotecnologa puede constituirse en una fuente fundamental de
aprovechamiento de la gentica de nuestras hembras bovinas, en las cuales se encuentren
caractersticas como adaptacin, rusticidad, productividad en caractersticas deseables, y reproduccin
eficiente, de manera que desde nuestros propios recursos genticos se aproveche la posibilidad de
mejorar el hato nacional, en lo posible con una estimacin adecuada del valor gentico con el que se
cuenta, y de forma fundamental segn los fines productivos y comrciales que se busquen, para cubrir
las demandas internas y el comportamiento de los mercados internacionales.
En 1890 el Ingls Walter Heape, transfiri exitosamente dos embriones de cuatro clulas de conejos
angora (4). La primera transferencia de un embrin bovino fue reportada en 1949 por Umbaugh. En
1951 se report la primera TE exitosa en vacas, con el nacimiento de un ternero, resultado de la
transferencia quirrgica de un embrin de cinco das (5, 6).
El uso comercial de la TE en vacas, comenz en Norteamrica al inicio de los aos 70 (7), y desde
entonces con la TE se ha podido multiplicar al mximo la capacidad gentica de la hembra (3), de
manera que esta tecnologa ha logrado reproducirse y emplearse con ms eficiencia, lo cual ha
43
facilitado la implementacin de programas de mejoramiento gentico dadas sus innegables ventajas en

cuanto a la intensidad de seleccin y el recambio generacional (2).
En la actualidad, la tecnologa de transferencia de embriones es usada en muchos pases alrededor del
mundo, con un estimado de 530.000 embriones transferidos anualmente. Con promedios de
recuperacin de embriones por sesin, con calidad de transferibles de 5.9, segn Thibier en 2001 (8).
En el 2000, el 93% de transferencias, fueron de embriones producidos in vivo, y solo un 7% para
embriones producidos in vitro (9).
Tabla 2. Datos de actividad de transferencia de embriones en el mundo en el 2000 (Thibier 2001).
Adaptada de Gordon (2003).
En Sur Amrica la transferencia de embriones comercial esta expandindose, considerndose en un

22% de la TE alrededor del mundo en 2002 (10).
El principal uso de la TE en bovinos ha sido el ampliar las tasas reproductivas de hembras valiosas. Por
las bajas tasas reproductivas y los largos intervalos generacionales, la TE es especialmente til en esta
especie. Un bovino puede ser valioso por muchas razones, incluyendo escasez, valor gentico
productivo probado, o por poseer caractersticas nicas como la resistencia a enfermedades. La TE es
usada entonces para satisfacer simultneamente tanto objetivos genticos como financieros. Es posible
incrementar hasta 10 veces o ms las tasas reproductivas de las vacas en un ao, y hasta en cinco
veces durante su tiempo de vida, con las tcnicas actuales de TE (6).
44
Este panorama demuestra que aunque la TE no alcanza los niveles de diseminacin de gentica
superior que pueden lograrse con los machos mediante la inseminacin artificial, si es significativo el
progreso gentico que aporta, de manera que en lo posible se debe buscar su posicionamiento en los
procedimientos que aplicados en las granjas colombianas, permitan no solo la reproduccin efectiva
sino el avance productivo.
De manera general otros propsitos de la TE son: facilitar la importacin y exportacin de material
gentico, permitir el probar toros genticamente para caractersticas deseables o indeseables, producir
nacimientos gemelares, permitir el almacenamiento a largo plazo de material gentico por congelacin
de embriones, facilitar el control de enfermedades no transmisible por TE, y favorecer el rpido cambio
gentico con una poblacin pequea (1). La transferencia de embriones es ahora usada comnmente
para producir toros para inseminacin artificial a partir de vacas y toros altamente probados
genticamente (10).
Como puede derivarse del prrafo anterior, los objetivos de avance gentico son una condicin
intrnseca a la transferencia de un embrin, de manera que, tal como el semen debe estar acompaado
de informacin que demuestre y garantice hasta cierta medida su aporte al progreso gentico, los
embriones deben cumplir la misma condicin. Esto debe permitir a un profesional hacer proyecciones de
la conveniencia de utilizar determinados embriones en una ganadera donde se constituirn en parte de
una base gentica, pues no es conveniente fijar solo la atencin en la tcnica, olvidando el impacto de la
gentica introducida. Es importante esta consideracin ya que cuando se introducen embriones hacia
una ganadera, ya sean de origen nacional o internacional, o producidos en el mismo hato, es
fundamental ser concientes que la gentica introducida debe ser acorde con los parmetros y
programas de mejoramiento, con el establecimiento o formacin de razas, y con los objetivos de
heterosis, consanguinidad y seleccin que se posean.
La disminucin del riesgo de comprometer la sanidad de los hatos nacionales, hace de la TE el mtodo
de seleccin para la importacin de pie de cra, ya que pocos organismos infecciosos son diseminados
por los procedimientos de TE, adems tales procedimientos no resultan en un aumento de las tasas de
incidencia de abortos o anormalidades (6). Respecto al control de enfermedades de transmisin sexual
en el ganado, no est de ms aclarar que con la transferencia de embriones se obvia el contacto directo
entre reproductores y por lo tanto se evita el contagio por esta va, ms sin embargo los mismos
45
embriones pueden ser fuente de algunas enfermedades infectocontagiosas o segn su componente

gentico, favorecer el desarrollo de desordenes congnitos en las cras resultantes. Por tal motivo es
importante el control por entidades gubernamentales de los factores sanitarios asociados a los
embriones u otro material gentico en importacin. Tambin es posible lavar, tratar y examinar
fsicamente los embriones individuales, para lograr proteccin adicional (6).
En 1987, Smith introdujo el concepto de ovulacin mltiple y transferencia de embriones (MOET),
mostrando como un programa MOET bien diseado, puede incrementar la intensidad de seleccin y
reducir los intervalos generacionales, resultando en mejoramiento en las ganancias genticas. El
establecimiento de hatos ncleo y una descendencia de novillas objetivo de MOET juvenil, puede
resultar en ganancias genticas que se aproximen al doble de aquellas logradas con programas de
prueba de progenie tradicionales (8, 9, 10). Lo que nos da la idea que en la necesidad inmediata en el
pas de programas estructurados de mejoramiento gentico, los ncleos MOET pueden constituirse en
alternativas ms viables, que las pruebas de progenie tradicionales por su alta inversin y logstica de
mbito nacional.
La evaluacin gentica por mejoramiento gentico tradicional y por gentica cuantitativa no es la nica
va para la introduccin de caractersticas deseables a travs de embriones.
Las tecnologas
dependientes de la TE tienen el potencial de incrementar la eficiencia de la seleccin asistida por

marcadores y permitir la incorporacin de transgenes en el ganado (9). De manera que aunque en el
pas no se haya avanzado en las tecnologas recientes de ingeniera gentica en embriones bovinos, es
fundamental considerar su aplicacin.
Por medio de la superovulacin y la transferencia de embriones, es posible obtener progenie desde
vacas valiosas genticamente que sean infrtiles por trauma, enfermedad, o por edad, aunque las tasas
de xito son solo cercanas a un tercio de las adquiridas con vacas saludables y frtiles. Las vacas y
novillas con causas genticas de subfertilidad no deben ser propagadas por estos medios (6).
Los problemas de eficiencia reproductiva en la ganadera colombiana, tal vez difcilmente puedan ser
superados mediante la TE, ms an considerando la alta variabilidad de la tcnica, dada por el alto
costo de la produccin de embriones y los problemas asociados con la misma, que conducen a una
46
pobre congelabilidad de los embriones, fetos y terneros anormales, y proporciones de sexo alterados
(11).
La TE puede ser una alternativa econmica a la inseminacin artificial, pues los embriones que son
producidos por superovulacin pero no son transferidos a vacas elite, son una fuente potencial de
embriones econmicos. La ms posible fuente de embriones economicos para los programas de TE a
larga escala en hatos comerciales, pueden ser aquellos producidos desde ovarios de matadero por
produccin in vitro (9).
La inversin de recursos econmicos y tcnicos, y la superacion de las dificultades propias del proceso,
solo pueden ser alcanzados si los embriones producidos garantizan de algn modo el progreso gentico
de las ganaderas, para el desarrollo conjunto de la base gentica nacional. Una combinacin de la TE,
usando vacas altamente probadas, inseminadas con semen de toros altamente probados, y una
industria amplia de inseminacin artificial, pueden aparecer como el uso ms factible de la TE en un
futuro cercano (10).
3.4 ASPECTOS TCNICOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES
La tcnica de transferencia de embriones consta a grandes rasgos de los pasos de sincronizacin del
estro de hembras donantes y receptoras de embriones, superovulacin de hembras donantes,
inseminacin artificial de hembras donantes, recoleccin de embriones desde la hembra donante, y
transferencia de embriones de hembras receptoras. El dominio de la tcnica de transferencia de
embriones requiere de un alto nivel de capacitacin, que incluye el manejo hormonal adecuado, la
destreza para la palpacin para identificacin de las estructuras del tracto reproductivo bovino,
inseminacin, y los procedimientos de lavado y recoleccin de embriones, adems de la manipulacin
de embriones y los procedimientos requeridos para la determinacin de su calidad, el almacenamiento y
la transferencia final.
47
Figura 7. Mtodo de ovulacin mltiple y transferencia de embriones (MOET).

Fuente: Alvarado (2005).
La TE es una tecnologa basada en la estimulacin de vacas donadoras seleccionadas, para producir un

gran nmero de embriones, despus de la induccin de la ovulacin mltiple (superovulacin), por
tratamiento con gonadotropinas (8). Estos procedimientos son una tecnologa ampliamente difundida en
la industria ganadera mundial y que an se consideran una prctica eficiente para multiplicar la gentica
de hembras valiosas (12, 13). Pero a pesar de extensa investigacin por muchos aos, la
superovulacin continua siendo una de las partes dbiles de la tecnologa de TE (8, 14), pues no
obstante, bajo condiciones estndares de manejo, la cantidad de embriones transferibles es altamente
variable en un mismo animal y entre animales (12, 13). Las tcnicas de superovulacin abordadas
durante el captulo II, ilustran el trabajo en este sentido que puede desarrollarse sobre la vaca donadora
de embriones para transferencia.
Los mtodos tradicionales de sincronizacin del estro desarrollados durante los ltimos 60 aos, han
involucrado el control de la duracin del ciclo estral bovino por administracin de un progestageno y/o la
regresin del cuerpo lteo con drogas luteolticas (15). En los procesos de TE, la sincronizacin se
define como el proceso de igualar el ciclo estral de una donadora y una receptora por la administracin
de una hormona para estimular el inicio del estro o calor (1). Los protocolos de sincronizacin hormonal
se describen con detalle en el captulo I.
48
Tratamientos de sincronizacin desarrollados ms recientemente, combinan los mtodos tradicionales

de controlar la longitud del ciclo con la manipulacin del desarrollo folicular en orden de programar o
seleccionar el folculo ovulatorio. Estos tratamientos pueden controlar la ovulacin con suficiente
repetibilidad y precisin para asegurar la sincrona de los ciclos estrales de receptoras en TE, sin la
necesidad de deteccin visual del estro (15). Esta condicin puede ser beneficiosa para su aplicacin en
los protocolos de sincronizacin para TE desarrollados en Colombia, ya que ante la ausencia en muchas
ganaderas de esquemas de deteccin del estro ms elaborados que la deteccin visual de signos, con
el uso de dichos protocolos puede verse favorecida la eficiencia del proceso de TE.
Una limitacin con los esquemas MOET es la frecuencia a la cual un animal puede ser sometido a
superovulacin (aproximadamente cada 30 das), de manera que la produccin anual de embriones no
es usualmente mayor que 60 embriones transferibles (9).
En promedio, los embriones producidos por vaca superovalada no supera los seis, y aproximadamente
el 20% de las vacas donadoras no responden al tratamiento (7). Esto ha desviado la mirada hacia la
potencialidad de la produccin in vitro de embriones (16). Sin embargo para nuestro medio cabe analizar
las condiciones que pueden ser requeridas para uno u otro mtodo de produccin de embriones.
Considerando la logstica es obvio que segn la localizacin geogrfica, las instalaciones con que se
cuenta en la mayora de ganaderas colombianas, el acceso a algunos materiales y medios necesarios,
y los costos asociados, la produccin de embriones por TE es mucho ms factible a nivel de granja,
pues no son requieridos equipos tan especializados, ni condiciones tan estrictas de manejo como para
la produccin in vitro. Por otro lado el grado de inversin requerido para la TE es mucho menor y se
ajusta ms a la capacidad de inversin de nuestras explotaciones ganaderas, adems el grado de
especializacin tcnica puede considerarse como menor para la TE, y en la actualidad son posiblemente
ms los profesionales que dominan este proceso en Colombia, respecto al procedimiento in vitro.
Despus del tratamiento de superovulacin, la donadora debe ser observada estrechamente para los
signos de estro. Las vacas superovuladas en algunas ocasiones no muestran comportamiento de estro
tan claramente como vacas no tratadas. La vaca donadora debe ser inseminada 12 y 24 horas despus
de que sea observada en estro. Algunas personas recomiendan 2 dosis de semen por inseminacin,
particularmente en la segunda inseminacin (6).
49
Existen 2 criterios amplios para seleccionar las vacas donantes para programas de transferencia de
embriones: Uno, la superioridad gentica, y dos, la posibilidad de produccin de un gran nmero de
embriones utilizables. En Colombia es escasa una real determinacin del valor gentico y por lo mismo
es difcil estimar cuando un proceso de TE conduce a una real mejora de los parmetros productivos
esperados.
Es imprescindible el uso de vacas saludables y ciclando, sin problemas al parto como retenciones de
placenta. Las donantes deben al menos tener dos meses posparto, pues producen ms embriones que
las vacas con partos muy cercanos. Las vacas jvenes pueden producir ligeramente ms embriones
utilizables que las novillas. Se considera adecuado un rango de edad de entre 3 a 8 aos. La lactancia
no desfavorece la superovulacin. No deben usarse vacas extremadamente gordas por ser donantes de
embriones pobres, pues no responden bien a la superovulacin y sus tractos reproductivos son difciles
de manipular. Los animales enfermos no producen muchos, ni buenos embriones (6). Las donantes
adems no deben poseer malformaciones anatmicas reproductivas, ni historial de enfermedades
congnitas.
Es as como deben instaurarse programas de evaluacin sanitaria y evaluacin de la condicin
nutricional de los animales dentro de una ganadera que pretenda buenos resultados en un programa de
TE. Una formacin y evaluacin del historial clnico y de la clnica reciente de una vaca utilizada para TE
debe ser requerimiento. De igual forma los programas nutricionales que conduzcan al logro de una
buena condicin corporal de las vacas donadoras, que adems debera ser evaluada con regularidad,
deben estar establecidos para fines productivos y reproductivos con antelacin a la instalacin de
programas de TE. Se realiza esta salvedad a razn de que comnmente en Colombia los programas de
TE suelen realizarse como una inversin aparte de lo mencionado, de manera que en ocasiones no
existen condiciones previas apropiadas para el logro de una buena respuesta de los animales, lo cual
conduce sin duda a pobres resultados.
Caractersticas importantes para la seleccin de las hembras receptoras de embriones son la eleccin
de hembras frtiles, con caractersticas de buenas madres, con historial de buena facilidad de partos,
no es necesario que tengan un elevado valor gentico, es imprescindible que posean buena salud
(libres enfermedades de declaracin obligatoria), con una buena condicin corporal (cercana a 3.5 de 5),
las razas mestizas son adecuadas, la edad debe ser menor de 10 aos, y las hembras deben ser
50
animales dciles y manejables. Adems, las hembras deben estar ciclando y deben poseer un medio
sencillo de identificacin. A una hembra receptora pueden otorgrsele dos y hasta tres oportunidades
para quedar preada, de manera que despus de tres fallas en quedar gestante, despus de la
transferencia de embriones de buena a excelente calidad, y sin evidencia de problemas tcnicos, la
receptora debe ser descartada. De tal forma que el anlisis para la evaluacin de la pertinencia del uso
y permanencia de una vaca como receptora en un programa de TE, debe considerar de manera objetiva
el desempeo del animal respecto a lo que a su fisiologa reproductiva corresponde, pues de otro modo
otras fallas tcnicas no analizadas a profundidad conducirn al descarte de animales aptos.
Los primeros programas de transferencia comercial de embriones realizaban recoleccin quirrgica de
los embriones, mediante exposicin quirrgica medio-ventral del tero y los ovarios, con la donadora
bajo anestesia general (10). En la actualidad, la recoleccin de los embriones se realiza va transcervical
no quirrgica, 6 a 8 das despus de iniciado el estro, por presentarse en este tiempo las mejores tasas
de recoleccin, porque an el embrin no se ha expandido, y por ser el tiempo optimo para la
criopreservacin o biseccin del mismo. El primer paso en la recoleccin, es la palpacin de ovarios va
rectal, o el uso de ultrasonografa para estimar el nmero de cuerpos lteos para calcular de manera
aproximada el nmero de embriones que pueden recogerse. Es recomendado el uso de anestesia
epidural en la base de la cola para facilitar el manejo del animal. El xito de la anestesia puede ser
monitoreado por la presencia de flacidez en la cola de la vaca. La vulva debe ser lavada, desinfectada y
secada, antes de la recoleccin de los embriones. La recoleccin se realiza con manipulacin rectal, e
insercin de un catter tipo Foley calibre 18 a 24, que puede ser de dos vas (aire y fluido) o tres vas
(dos vas pequeas de fluido y una va de aire), con o sin baln inflable para facilitar el lavado (6, 17).
Un estilete metlico insertado en el interior del catter permite su insercin a travs del crvix. El lavado
puede realizarse desde el cuerpo uterino body flush al inflar el baln justo al pasar el crvix, o puede
realizarse al nivel de los cuernos del tero horn flush, al inflar el baln en la bifurcacin de los cuernos
uterinos. Tambin puede utilizarse una tcnica que combine ambas localizaciones. El lavado al nivel de
los cuernos uterinos requiere menor volumen de solucin de lavado, tiene menor riesgo de ocluir alguno
de los cuernos, y suele presentar mayores tasas de recoleccin de embriones. Sin embargo requiere la
recolocacin del catter, lo que alarga el tiempo del proceso (6, 17). La experiencia y destreza de cada
tcnico en el proceso determinar el modo ms efectivo y cmodo para desarrollar el lavado de los
embriones.
51
Imagen 3. Catter Foley de 2 vas, con y sin baln inflable.

Fuente: Seidel y Moore (1991).
Figura 8. Localizacin del cateter Foley con baln inflable en un cuerno uterino.
Fuente: Seidel y Moore (1991).
El lavado de los embriones se realiza con tampn fosfato con suero fetal bovino (SFB) o albumina srica
bovina (BSA) a 37C. El tero puede ser llenado y vaciado con un sistema de flujo continuo o por flujo
en alcuotas, por ejemplo con insercin y recoleccin de 50 ml de fluido con una jeringa, lavando por 2 a
3 veces. El sistema de flujo continuo se realiza colocando 2 litros de medio en una bolsa para infusin
intravenosa aproximadamente un metro por encima de la vaca. La bolsa con la solucin y un tubo de va
de salida, se acoplan a un conector en Y en el catter Foley. El tero se llena con la solucin hasta
alcanzar una distensin similar a 45 das de gestacin, se realizan va rectal un masaje sobre los
cuernos uterinos, y la expansin del tero para liberar los embriones de los pliegues endometriales (6,
17).
52
El fluido del tero es usualmente recolectado en cilindros graduados de 2 litros, donde el fluido se deja
sedimentar por 25 a 30 minutos, o es recolectado en filtros de malla de 75, donde para recuperar los
embriones, el filtro es lavado rpidamente por varias ocasiones, utilizando una jeringa de 30cm3 y una
aguja calibre 22. Este mtodo es ms rpido, pero presenta el inconveniente del taponamiento del filtro
con moco uterino. La bsqueda de los embriones se realiza en cajas de petri, en un estereoscopio a
aumentos entre 10 a 14X (ver imagen 4). Los embriones recuperados son lavados, evaluados,
preparados y empacados para su transferencia inmediata o para la criopreservacin. Para el empaque,
las pajillas de 0.25ml son llenadas cerca de un tercio de fluido (Ej: PBS), luego con una columna de aire
de 5mm, luego con otra columna de fluido de un tercio de la longitud de la pajilla conteniendo el
embrin, luego con otra columna de aire, y finalmente con ms fluido hasta llenar la pajilla (6, 17). La
criopreservacin de embriones es estudiada con detalle en el captulo VI.
Figura 9. Recoleccin de embriones.
Fuente: www.uclm.es/profesorado/produccionanimal/TE.pdf
La transferencia de embriones involucra un proceso de seleccin y solo aquellos embriones que han
adquirido desarrollo a los estados de mrula o blastocisto son transferidos (9). Los embriones son
rutinariamente transferidos a un cuerno uterino. Pueden ser utilizados tanto mtodos quirrgicos como
no quirrgicos para la TE. La transferencia quirrgica puede realizarse mediante una incisin al nivel de
la lnea abdominal media en la vaca, bajo anestesia general, o mediante una incisin a nivel del flanco,
que se realiza bajo un bloqueo anestsico paravertebral (6).
53
Imagen 4. Bsqueda y localizacin de embriones mediante un estereoscopio.

Fuente: www.uclm.es/profesorado/produccionanimal/TE.pdf
Tanto en mtodos quirrgicos como no quirrgicos, es necesario determinar previamente la localizacin

del cuerpo lteo en uno de los ovarios de la hembra receptora, para transferir el embrin en el cuerno
uterino ipsilateral a ste. Para la transferencia quirrgica el embrin se lleva al tercio craneal del cuerno,
mediante una incisin puntual con una aguja despuntada, para luego insertar una pipeta de vidrio con
0.1ml de medio mas el embrin, el cual es finalmente expelido en el interior del cuerno uterino. Para la
transferencia no quirrgica, es recomendable la anestesia epidural. La herramienta estandar en este
caso en una pistola de inseminacin Cassou con pajillas de 0.25 ml. La pistola es llevada a travs del
crvix de la vaca llegando finalmente al cuerno uterino, donde el embrin es liberado (6, 18).
Figura 10. Empacado de un embrin para transferencia en una pajilla de 0.25 ml.
3.5 ACTUALIDAD DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN COLOMBIA

A nivel investigativo en Colombia se reportan algunos trabajos de investigacin relacionados con la TE,
principalmente realizados por Universidades pblicas, mientras son pocos los trabajos de investigacin
54
relacionados con este tema, reportados por universidades privadas, as como por la empresa privada. A
continuacin se citan algunos trabajos realizados en Colombia relacionados con este tema.
Ariza et al. (19), del Grupo de Investigaciones en Ciencias Animales, Universidad Cooperativa de
Colombia, Bucaramanga, realizaron el anlisis de datos obtenidos sobre las tasas de preez, en los
aos 1999-2001, para evaluar el mejor cruce como receptora en un programa de transferencia de
embriones, donde se usan principalmente animales F1 como Limbrah, Simbrah, Brabon, Brangus y
Girolando. Se cont con una poblacin de 1166 receptoras transferidas, para las cuales 577
transferencias se realizaron con embriones en fresco, y 589 con embriones congelados en glicerol o
etilenglicol. Las mejores receptoras para el programa de TE, correspondieron a los cruces Brabon y
Girolando con 39,58% y 39,56% de tasas de preez respectivamente.
Borrero et al. (20), de la Universidad de Antioquia, realizaron una investigacin en el norte del
Departamento de Antioquia, para la evaluacin pre y post descongelacin y de las tasas de preez
despus de la transferencia de embriones de ganado Holstein congelados en etilenglicol. Los autores
reportaron como resultados, la perdida de calidad embrionaria a la descongelacin, evidenciada en las
tasas de preez (34% para calidad 1; 10% para calidad 2; 0% para calidad 3).
La Universidad Nacional de Colombia (21) reporta trabajos de investigacin en transferencia de
embriones como: Evaluacin de un programa de transferencia de embriones en ganado Brahman
(Olivera, 2000); Evaluacin de algunos factores de importancia zootcnica en un programa de
transferencia de embriones (Rodrguez, 1992); Evaluacin de la influencia de algunos factores que
afectan la viabilidad de embriones bovinos en un programa de transferencia de embriones (Fuentes,
2000).
Se mencionan a continuacin dos de las ms destacadas empresas involucradas en la transferencia de
embriones bovinos en el mbito comercial, y sus resultados en Colombia:
A partir de Febrero de 1998, la empresa colombiana CGR reporta al 2006, 1.820 procedimientos de
colecta de embriones, con 14.513 estructuras recuperadas, 7.461 embriones transferibles, 5.530
embriones congelados transferidos con un porcentaje de preez del 45%, y 2.304 embriones
transferidos en fresco con un porcentaje de preez de 55% (22).
55
La empresa colombiana Ctelca, dedicada a las biotecnologas reproductivas en bovinos, reporta contar
para la TE con ms de 300 vacas donadoras seleccionadas, para ms de 680 colectas de embriones
realizadas en hembras bovinas de las razas Gyr, Guzera, Brahman, Bon, Hartn y Holstein, con un
promedio de 5 embriones viables por colecta, y ms de 1600 nacimientos, por transferencia de ms de
3500 embriones frescos y ms de 686 embriones congelados, hasta el 2003 (23).
La realidad de la transferencia de embriones en el pas demuestra que an son demasiados los
esfuerzos que deben realizarse para que alcance una cobertura que haga significativo su aporte al
progreso productivo de la ganadera nacional. Los esfuerzos, exceptuando algunas instituciones, son
aislados, carecen de proyecciones de impacto y generalmente son poco constantes.
La planeacin es necesaria para salvaguardar los recursos econmicos que se invierten en este tipo de
biotecnologa, en la bsqueda de lograr resultados viables respecto a su rentabilidad. Por tal motivo se
hace nfasis en que es necesario, antes de comenzar a implementar un programa de transferencia de
embriones, que las condiciones logsticas estn dadas, donde la preexistencia de un programa de
inseminacin artificial es demasiado beneficiosa porque abona el camino para establecer la TE. Adems
es prerrequisito el buen funcionamiento de los esquemas de sanidad, nutricin, alimentacin y manejo,
pues de lo contrario introducir este tipo de tecnologas puede complicar el panorama, antes de favorecer
la eficiencia productiva y reproductiva.
La investigacin en TE en Colombia es escasa segn lo revisado, se realizan muchos trabajos que
hacen reportes someros de resultados, y es difcil establecer la validez estadstica de algunos reportes.
Cabe destacar el esfuerzo de algunas instituciones por realizar investigaciones en este sentido,
principalmente al nivel de universidades pblicas, sin embargo es necesaria la extrapolacin y aplicacin
de los hallazgos logrados, a la prctica de campo de la TE.
Los costos del servicio de TE, dificultan el acceso para la mayora de ganaderas, de manera que en lo
posible sera beneficioso para el mercado el establecimiento de nuevas empresas y de mayor cobertura,
para que con una mayor competencia y una masificacin del proceso puedan ofrecerse alternativas ms
56
econmicas. Las capacitaciones en TE son casi exclusivas de las empresas privadas que comercializan
la tcnica, y los costos de las mismas dificultan el acceso a muchos profesionales, por lo cual sera
pertinente una mayor participacin de entidades pblicas para la bsqueda de lograr dimensiones
suficientes de diseminacin de la TE por las ganaderas del pas.
Se requiere evaluar como el crecimiento de la aplicacin de la TE en los procesos reproductivos, esta
cobrando impacto, inicialmente al nivel de las granjas y posteriormente a mayor escala, pues solo
estimando el progreso gentico y la rentabilidad como verdaderos aportes, ser factible pensar en el
direccionamiento correcto de este procedimiento. Adems sto es necesario para estimar, evaluar y
dirigir las proporciones de la TE colombiana en un mbito internacional.
La transferencia de embriones bovinos en Colombia, an se encuentra en sus estadios iniciales de
difusin a las zonas dedicadas a la ganadera. Por consiguiente, son necesarios esfuerzos
gubernamentales y privados de asistencia tecnica e inversin econmica en las regiones, que impulsen
la difusin de esta biotecnologa que puede representar una fuente fundamental de desarrollo productivo
para el sector agropecuario colombiano.
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23. Ctelca (central de transferencia de embriones tecnologa de semen y ncleo de mejoramiento gentico
las camelias) [fecha de acceso Julio 16 de 2006] URL: www.ctelca.com
58
CAPTULO IV
PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS
4.1 INTRODUCCIN
A pesar de que cada ovario posee cientos de miles de oocitos al momento del nacimiento de una
hembra, la mayora se pierden por atresia en un proceso que comienza despus del nacimiento. Esta
tremenda perdida de material gentico puede ser reducida por la recuperacin de oocitos desde los
ovarios y el uso de la tcnica de produccin in vitro de embriones PIVE- (1).
La PIVE es una tcnica que bien manejada puede conducir a un aprovechamiento mucho ms
significativo del material gentico de una hembra de alto merito. Los rasgos deseables en los animales
pueden ser potenciados con la escogencia adecuada del origen de los oocitos y el semen para el
proceso, tal como en un esquema de seleccin y apareamientos dirigidos para mejoramiento gentico.
Adems mediante procedimientos de ingeniera gentica, es factible realizar manipulaciones sobre
gametos y embriones conducentes a establecer rasgos deseables en una poblacin animal.
La PIVE, en los ltimos aos se ha constituido en una de las biotecnologas ms promisorias aplicadas
a la reproduccin animal y ms especficamente a la reproduccin bovina, representando gracias al
mejoramiento productivo y reproductivo de los hatos, un incremento significativo en los niveles de
rentabilidad de las industrias ganaderas de algunos pases en que dicha biotecnologa se ha venido
aplicando en forma comercial (2). A la actualidad la PIVE es un procedimiento bien establecido y
razonablemente eficiente. En todo el mundo aproximadamente el 15% de embriones bovinos son
producidos por tecnologa in vitro (1).
Para Colombia el hecho de establecer una biotecnologa con la magnitud e importancia mundial de la
PIVE en sus procedimientos de mejora gentica y reproductiva, puede ser vital para la competitividad
futura del sector. La PIVE no slo puede ser beneficiosa para el pas en stos sentidos, sino que puede
y debe representar, como en otros pases, una base para el desarrollo de actividades investigativas y
comerciales, y para el desarrollo de otras biotecnologas asociadas.
59

A partir del primer cultivo de un embrin mamfero por Brachet (1912), del primer reporte de fertilizacin
in vitro exitosa por Pincus et al., (1930) realizada con gametos de conejo, del primer reporte de
fertilizacin in vitro de un oocito bovino madurado artificialmente por Iritani y Niwa en Japn en 1977, y
del primer nacimiento de un ternero por fertilizacin in vitro por Brackett et al., (1982), la transformacin
de la tcnica de produccin de embriones bovinos en el laboratorio aplicada solo para investigacin
bsica, a una tecnologa de aplicacin industrial, constituye el hito tecnolgico ms importante y de
mayor impacto potencial en la ganadera, desde la aparicin de la inseminacin artificial (2, 3).
La PIVE ha demostrado ser una tecnologa reproductiva con una relacin positiva costo-beneficio en
compaas como Holland Genetics (Holanda), Genus (Inglaterra), CIZ (Italia), UNCEIA (Francia), DELTA
(Canad), y EMTRAM (USA) (Vivanco, 2002). Al ao 2000, casi 42.000 embriones producidos por PIVE
fueron transferidos, mientras al ao 2002 ms de 80.000 embriones de este origen fueron transferidos
en todo el mundo, lo cual es cercano al doble de lo logrado en 2001, y es el resultado casi en su
totalidad del incremento en esta actividad en Brasil (1, 3). En los aos recientes, los blastocistos bovinos
de PIVE se han convertido en una herramienta rutinaria de investigacin en muchos laboratorios. En las
granjas la PIVE esta siendo usada para obtener embriones desde donadoras infrtiles y puede a
menudo ser considerada como la opcin final para obtener terneros desde vacas genticamente elite
(3).
Las comparaciones entre los resultados de los programas de PIVE y de produccin de embriones in
vivo, han llevado a la conclusin que la PIVE puede producir cerca de 3.4 veces ms embriones, y 3.2
veces ms preeces en un periodo de 60 das, asumiendo solo una superovulacin por vaca donadora
(1).
La PIVE es una tcnica bastante atractiva ya que ha posibilitado la disminucin de los costos en la
produccin de embriones para transferir, el diagnostico embrionario, la clonacin de clulas
embrionarias y somticas, la produccin de animales clonados y genticamente modificados por
ingeniera como la produccin de vacas transgnicas, e Igualmente ha posibilitado profundizar mucho
60
ms sobre los mecanismos de fertilizacin y embriognesis (4, 5). La fertilizacin in vitro ha sido usada
tambin para producir miles de embriones necesarios para otras lneas de investigacin cientfica, como
la produccin de clulas madre embrionarias, mientras la fertilizacin por inyeccin espermtica
intracitoplasmtica (ICSI) ha sido muy importante en la reproduccin asistida humana, siendo posible su
uso en bovinos an con semen congelado y descongelado, aunque todava sin una amplia aplicacin (1,
5).
Como se describi antes, la produccin in vitro de embriones mamferos tiene una amplia variedad de
aplicaciones, y muchos avances desarrollados a partir de sta para la reproduccin asistida humana, se
han trasladado a la reproduccin bovina. Es necesario considerar cuales de estos avances o
tecnologas desarrolladas pueden hacer aportes ms inmediatos a la ganadera colombiana. La
transgnesis y clonacin an estn lejos de pasar de la investigacin a la difusin a las granjas, incluso
en pases con mayores desarrollos en este sentido. La baja tasa de xito de estos procedimientos y sus
altos costos, reducen las posibilidades incluso investigativas en este sentido, sin embargo seria
importante fundar las etapas iniciales de su desarrollo en Colombia. El trabajo con clulas madre e ICSI,
al momento tiene fines de aplicacin principalmente para la medicina humana. Difcilmente tendra
sentido invertir en la reproduccin en bovinos por ICSI en Colombia cuando es una tcnica utilizada para
casos de infertilidad grave, y no es deseable para un sistema productivo propagar este tipo de gentica.
De igual forma el trabajo con clulas madre para sistemas de produccin y medicina bovina
seguramente tendr grandes expectativas en el futuro, despus de establecer muchos logros primero en
la medicina humana.
En el campo de la genetica molecular, muchos son los aportes ahora posibles a partir de la PIVE. los
avances tecnolgicos en tcnicas de diagnostico gentico preimplantacin por reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) o hibridacin por fluorescencia in situ (FISH) permiten que marcadores genticos
sean identificados, haciendo posible seleccionar embriones para transferencia, basndose en la
determinacin de la herencia de allos especficos. Muchos marcadores han sido identificados en
ganado lechero, incluyendo marcadores para caractersticas de la produccin de leche y resistencia a la
mastitis. La integracin de transgnes puede ser incorporada en embriones por microinyeccin, y por
fertilizacin in vitro usando semen transgnico preparado por insercin mediada por enzimas de
restriccin (6). Algunos avances en los sentidos aqu referidos, introducidos en la ganadera colombiana
permitiran aumentar los mrgenes de rentabilidad de las explotaciones. Un ejemplo estara en la
61
introduccin de genes de resistencia a enfermedades que como la mastitis, causan inmensas prdidas
econmicas al sector lechero nacional.
4.4 ASPECTOS TCNICOS DE LA PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES Y OTRAS
CONSIDERACIONES
Son muchas las variantes que han sido desarrolladas para una biotecnologa como la PIVE, y an hoy
diariamente se investigan nuevas alternativas en cada una de sus etapas para alcanzar una mxima
eficiencia en la produccin de embriones. El hecho de buscar el desarrollo de un embrin en sus etapas
iniciales, en medios artificiales respecto a su desarrollo normal en el ambiente proporcionado por el
tracto reproductivo de la hembra, hace que se produzcan alteraciones en el desarrollo embrionario, y por
tal motivo sea necesario el mejoramiento constante de las condiciones de desarrollo. Este captulo
pretende brindar una visin general del trabajo en PIVE, considerando que existen otras alternativas no
expuestas.
La preparacin de medios y soluciones stock para la PIVE, requiere componentes de alta calidad, una
tcnica estril, un pesaje cuidadoso de sus componentes, lo que demanda una balanza analtica con
capacidad de al menos 10g, el uso de agua destilada pasada a travs de un sistema Mili-Q, para una
resistencia mayor a 18 megahms-cm, y la filtracin de los medios preparados antes de su uso o
almacenamiento, con filtros recomendados de 0.22 m. El uso de una cabina de flujo laminar es
indispensable para evitar contaminacin alguna en la mayora de procesos. El uso de materiales
desechables es conveniente en trminos de eliminar la contaminacin. Medidas para evitar la
contaminacin de los medios de cultivo para oocitos y embriones incluyen la cobertura de boca y nariz, y
el lavado y esterilizacin de las manos en los operarios. Desinfectantes como alcohol al 70% pueden ser
aplicados sobre las superficies de trabajo. No se debe comprometer el xito de la PIVE por el uso de
medios y reactivos vencidos. Los medios deben mantenerse en un ambiente de almacenamiento
apropiado segn sus requerimientos (7).
Como se deduce del prrafo anterior la PIVE es una tcnica que requiere un cuidado minucioso de cada
detalle, pues las posibilidades de contaminacin o de fallas en brindar el ambiente propicio para los
oocitos y embriones son las principales causales de ineficiencia en el proceso. Es imprescindible
entonces considerar que si se pretende instaurar esta biotecnologa dentro de los procedimientos
62
reproductivos para una explotacin, no puede escatimarse ni en recursos, ni en esfuerzos de

capacitacin, logstica y bioseguridad, ms an cuando el solo hecho de la estandarizacin de la tcnica
en un laboratorio, implica un proceso sistemtico de ajuste de detalles.
El material gentico para la PIVE esta dado por el semen bovino seleccionado y altamente probado en
lo posible para los rasgos genticos deseados, y por los oocitos bovinos que pueden originarse de
vacas vivas idealmente con un alto valor gentico probado, mediante la aspiracin de folculos por
laparoscopia o va transvaginal, y a partir de vacas sacrificadas en lo posible con el conocimiento de su
valor gentico, por recoleccin de oocitos una vez colectados los ovarios.
Los ovarios colectados en mataderos son una fuente disponible de gran nmero de oocitos (6), varios
programas, algunos de los ms notables en Italia (8), Japn (9) y Australia (2) se han especializado en
la PIVE a partir de ovarios de vacas despus de su sacrificio. Los procedimientos de PIVE son ms
simples de desarrollar cuando se usan oocitos recogidos desde ovarios de matadero, porque la
produccin de embriones puede hacerse en cantidad (6). En Colombia muy posiblemente por razones
econmicas, sea ms factible la adopcin de este tipo de procesos, pues aunque pueda desconocerse
en gran medida la gentica aportada por las vacas sacrificadas, an seria factible en muchas
ganaderas aportar al progreso gentico por el empleo de semen altamente probado, de manera que al
producir embriones ms econmicos sea ms posible la diseminacin de los mismos a mayor nmero
productores.
La recoleccin de ovarios en matadero se realiza removiendo los ovarios del tracto reproductivo de la
vaca inmediatamente o mximo 10 minutos despus de retirado de la canal. Los ovarios son puestos en
un contenedor con solucin salina fisiolgica (0.9% NaCl) con 100 m/ml de estreptomicina y 100 IU/ml
de penicilina, dentro de un termo, a una temperatura cercana a 37C. Una cuidadosa observacin de la
temperatura de la solucin salina es importante para mantener la viabilidad de los ovarios. Pueden
emplearse dos contenedores utilizando uno de ellos para el lavado de los ovarios y el segundo para su
almacenamiento. Los ovarios deben transportarse inmediatamente al laboratorio. Es recomendable que
los oocitos sean recolectados desde los ovarios dentro de un periodo de 6 horas de recolectados los
ovarios, despus de este tiempo su potencial de desarrollo se ve altamente comprometido (7, 10).
63
Existen varias tcnicas de recoleccin de oocitos: diseccin de folculos, cortado de ovarios, aspiracin
de oocitos, combinacin de aspiracin de oocitos y cortado de ovarios (11). Desde ovarios de matadero,
el mtodo de aspiracin es comnmente empleado por la conveniencia asociada con su aplicacin (7).
La principal fuente de oocitos son ovarios provenientes de las plantas de faenado, donde el material es
muy heterogneo ya que los oocitos son obtenidos a partir de folculos de diferentes tamaos (12).
Para la recoleccin de oocitos por aspiracin de folculos es necesario lavar los ovarios con solucin
salina fisiolgica estril para remover contaminantes. Cada ovario es secado suavemente con papel
toalla estril, y los oocitos son recuperados desde folculos de 2 a 8 mm. La aspiracin de oocitos es
realizada con una jeringa para 5 a 10 ml unida a una aguja 18, para evitar el dao de las clulas del
cmulus que lo rodean. El contenido de la jeringa es liberado lentamente en un tubo para centrfuga
estril puesto en un bao de agua. Se permite la sedimentacin de los oocitos en el tubo al menos por 5
minutos (7).
La seleccin de oocitos debe realizarse en una cabina de flujo, y sobre una plancha termica a 38C. Se
preparan 2 cajas de petri cuadriculndolas al reverso, se vierte preferiblemente Hepes Talp como medio
de lavado en el interior de las cajas (13). El precipitado con los oocitos es tomado del fondo del tubo con
una pipeta Pasteur estril y puesto en las cajas de petri estriles para la bsqueda de los complejos
cmulus-oocito (CCOs). En lo posible este procedimiento debe realizarse en un ambiente estril con una
temperatura en el cuarto de 25C. Los CCOs son recolectados con una pipeta de vidrio y transferidos en
cajas con medio de lavado fresco precalentado. El Hepes o medio fosfato buferado es indicado como
medio de lavado y almacenamiento fuera de incubadora para oocitos y embriones, pues no requiere una
fase gaseosa controlada de dixido de carbono para mantener un pH relativamente constante (7). La
recoleccin debe realizarse lo ms rpido posible para prevenir los efectos adversos del enfriamiento.
Solo CCOs con al menos un par de capas compactas de clulas del cmulus y un citoplasma granulado
uniformemente y sin espacios claros, deben ser usados en los siguientes pasos (10).
Los CCOs se clasifican de acuerdo con la cantidad y calidad de capas de clulas del cmulus y la
apariencia de su ooplasma segn los parmetros establecidos por Lindner y Wright en 1983. De estas
categoras en general se considera que solamente los oocitos tipo 1 y 2 poseen un elevado potencial
para desarrollarse en embriones por FIV (14)
64
Tabla 3. Categoras de complejos cumulus - oocito (CCOs) para procedimientos de PIVE.

Fuente: Lindner y Wright (1983).
Tipo
1
=Excelente
2
=Bueno
No. Clulas cmulus

Capas mltiples, compactas de clulas
(cuatro o ms)
Capas mltiples de clulas de cmulus
(entre una y tres)
Denudados
Citoplasma
Homogneo y transparente
Homogneo con zonas
perifricas oscuras
Irregular con zonas oscuras
Clulas expandidas
Irregular con zonas oscuras
=Regular
4
=Malo
Bsicamente, la produccin in vitro de embriones comprende tres pasos que son: 1) la maduracin in
vitro de los oocitos (MIV) obtenidos de ovarios por medio de aspiracin o puncin folicular, 2) la
fertilizacin in vitro (FIV) de los oocitos madurados, y 3) el cultivo in vitro de los embriones (15) -ver
Figura 12-. Cada uno de los pasos mencionados es un punto vital para el xito del proceso. Sin
embargo la parte ms critica del mismo o al menos en lo que se refleja de los resultados, est dada
desde la fertilizacin hasta el desarrollo final, principalmente en la etapa de cultivo pues es all donde se
da el mayor porcentaje de prdidas. Sin embargo como se expondr ms adelante, al parecer el origen
de los oocitos mismos y su grado de maduracin nuclear y citoplasmtica al iniciar el proceso son
determinantes para el xito del mismo.
La PIVE difiere de su contraparte de produccin in vivo respecto a los embriones producidos, en muchos
aspectos importantes como: Los embriones de PIVE muestran un citoplasma oscuro, menor densidad,
blastmeras hinchadas, menor tasa de crecimiento, ms alta sensibilidad termal, y una reducida
densidad de uniones gap (15), adems de la presencia de una excesiva cantidad de material lipdico en
dichas clulas, con la presencia de suero en el medio de cultivo como posible responsable de la
acumulacin de lpidos por un incremento en la toma de los mismos desde el medio, y/o por un trastorno
en el metabolismo mitocondrial (15-18).
65
Figura 11. Procedimiento de PIVE.
los blastocistos producidos in vitro poseen desviaciones en las densidades y volmenes de las
organelas asociadas con el metabolismo celular, as como desviaciones asociadas con una
diferenciacin embrionaria alterada, las cuales varan con el tipo de condiciones de cultivo usadas en la
PIVE (19).
Segn lo anterior es indispensable evaluar la conveniencia de implementacin de la PIVE respecto a la
transferencia de embriones tradicional, donde el desarrollo embrionario in vivo favorece las
caractersticas de calidad de los embriones, sus tasas de xito implantatorio y un menor porcentaje de
malformaciones congnitas y alteraciones del desarrollo, entrando a jugar en este caso, principios de
tipo tico y de proteccin animal.
66
El medio usado para la MIV de oocitos vara entre laboratorios. Estos medios pueden clasificarse en
simples y complejos. Los medios simples son usualmente sistemas buferados con bicarbonato,
contienen sales fisiolgicas bsicas con piruvato, lactato y glucosa. El medio es generalmente
suplementado con suero o albmina, y con cantidades traza de antibiticos como penicilina,
estreptomicina, anfotericina y gentamicina. Los medios complejos contienen adicionalmente
aminocidos, vitaminas, purinas y otras sustancias, principalmente a los niveles en que son encontradas
en el suero. El medio ms ampliamente usado para MIV en ganado y bfalos es el medio de cultivo de
tejidos 199 (TCM 199) con sales Earles, glutamina y 25mM de Hepes, suplementado con 10 a 20% de
suero inactivado por calor (suero de ternero fetal, suero de ternero, o suero de vaca en estro). Otros
medios usados son Hams F-10, MEM, IVMD 101, RPMI, y fluido oviductal bovino sinttico (SOF), entre
otros. Algunas hormonas son suplementadas, incluyendo FSH, LH, estradiol y prolactina. La accin
directa de estas hormonas en la MIV y el desarrollo temprano de embriones no esta totalmente
establecida, pero su adicin al medio de cultivo mejora el desarrollo de embriones preimplantatorios (7).
Segn Watson et al. (20), la suplementacin del medio de maduracin para oocitos con factor de
crecimiento epidermal (EGF), resulta en un incremento en el desarrollo de blastocistos dependiente de
su concentracin, mientras la suplementacin con aminocidos, ha sido asociada con el mejoramiento
de las frecuencias de desarrollo, incrementando el nmero de blastocistos, y elevando los niveles de
RNAm materno. Estos autores encontraron un nmero comparable de blastocistos obtenidos con
maduracin de oocitos con medio de fluido oviductal sinttico suplementado con aminocidos (cSOFaa)
y con TCM-199 ms suero de ternero recin nacido.
La preparacin de cajas (petri de 30mm) de medio de maduracin se realiza con microgotas de 50l de
medio, cubiertas con aproximadamente 3 ml de aceite mineral (ver imagen 5), colocando 10 oocitos por
gota (13). El uso de microgotas bajo aceite mineral para la MIV, tiene como ventajas que previene o
reduce la evaporacin del agua, protege contra la contaminacin, atena las fluctuaciones de gases y
temperatura, y facilita la evaluacin durante el cultivo. Hay una diferencia significativa en produccin de
blastocistos a favor de la MIV por un periodo de 24 horas. Otras consideraciones son que los oocitos y
embriones no deben ser expuestos a periodos prolongados de luz, la temperatura benfica para el
desarrollo est entre 38 y 39C, al igual que el mejor ambiente gaseoso es 5% CO2, 5% O2 y 90% N2
(7).
67
Watson et al. (20), encontraron que el desarrollo de blastocistos se reduce despus de la MIV de oocitos
bajo una atmsfera de cultivo de 5% CO 2, 7% O2, y 88% N2, comparado con una atmsfera de 5% CO 2
en aire.
Imagen 5. Microgotas para PIVE bajo aceite mineral.
Despus de realizar un proceso de MIV de oocitos bovinos, aproximadamente el 90% de los oocitos
inmaduros llegan a metafase y expulsan el primer cuerpo polar (21-25). En este paso es importante
constatar en una muestra a travez de tinciones de material gentico como Hoechst y DAPI, que
efectivamente se logra la maduracin hasta la metafase de la segunda meiosis, pues solo esto posibilita
que los oocitos sean fertilizados y logren la maduracin final y el desarrollo embrionario.
Los eventos previos a la ovulacin determinan el destino final de los oocitos, pero los eventos que
ocurren entre los estados de una clula y el blastocsto, determinan la calidad del embrin (22). Un
ejemplo de esto es que los oocitos bovinos con idnticas condiciones de cultivo a excepcin de la
ocurrencia de un pulso de hormona luteinizante (LH) durante la MIV, difieren en su habilidad de alcanzar
el estado de blastocsto, lo que muestra que la MIV puede permitir futuros adelantos (3).
Los esfuerzos para mejorar la maduracin de oocitos incluyen: el desarrollo de protocolos que permiten
que el oocito sufra un periodo de arresto antes de la maduracin, el desarrollo de recoleccin por AFGU
en receptoras superovuladas antes y 24 horas despus de la oleada de hormona luteinizante, y la
68
modificacin del medio de maduracin por inclusin de factor de crecimiento epidermal, antioxidantes, y
acido 9-cis retinoico (6).
Para el caso de la PIVE adems del valor gentico del semen, la calidad del mismo debe ser evaluada
peridicamente. Los factores que influencian el xito de la produccin in vitro de embriones, varian
desde el toro usado para la FIV, a las tcnicas en el laboratorio, y segn este autor evaluaciones
convencionales de la calidad espermtica, pueden ser realizados por pruebas como la induccin de la
reaccin acrosomica, pruebas de unin a la zona pelcida y FIV (3).
El proceso de FIV implica la preparacin de un gradiente percoll, PHE (mezcla de hipotaurina,
penicilamina y epinefrina), heparina, medio de fertilizacin y la preparacin del semen (26). La
preparacin del semen para la FIV usualmente involucra procedimientos para separar los
espermatozoides del plasma seminal, diluyentes y/o crioprotectores. Tambin pueden mejorar el
porcentaje de espermatozoides motiles y/o normales usados para FIV. Las tcnicas usadas para estos
propsitos incluyen swim-up, gradiente percoll y glass wool. El procedimiento percoll es ms rpido y
produce hasta 6 veces una mayor recoleccin de espermatozoides motiles que el mtodo swim-up (27),
percoll es superior en la seleccin de espermatozoides con morfologa normal, por lo que puede
incrementar las tasas de fertilizacin (28).
Imagen 6. Semen + gradiente percoll para la seleccin de espermatozoides.
La capacitacin de los espermatozoides involucra una serie compleja de reacciones bioqumicas y

fisiolgicas para la remocin o alteracin gradual de la cubierta protectora de la superficie espermtica,
permitiendo la exposicin de sitios receptores que permiten la interaccin con los receptores del oocito.
Los procedimientos de capacitacin in vitro de espermatozoides son realizados por lavados y exposicin
69
en el medio a sustancias como albmina srica bovina, que participa en la remocin de colesterol y zinc
para desestabilizar la membrana espermtica y potenciar la capacitacin y la reaccin acrosmica;
heparina, que es un glucosaminoglicano que se une a protenas de unin, jugando un papel en la
fertilizacin en la superficie del espermatozoide. Otras sustancias utilizadas en el medio de fertilizacin
para favorecer la capacitacin espermtica son cafena, ionofros de calcio y PHE (7).
El medio de fertilizacin puede ser preparado mediante un medio stock compuesto por una combinacin
de sales ms lactato, con suplementacin por albmina srica bovina libre de cidos grasos (BSA-FAF),
piruvato y antibiticos (26). En ganado y bfalos la FIV de oocitos madurados in vitro, es usualmente
comenzada despus de 22 a 24 horas de MIV porque el pico de oocitos en etapa de metafase II se da
en este periodo. Para facilitar la penetracin espermtica en la FIV, los oocitos pueden ser parcialmente
denudados de clulas del cmulus (7). Como procedimiento para la FIV se preparan cajas de petri con
gotas de 44l de medio de fertilizacin, cubiertas con aproximadamente 3 ml de aceite mineral para
luego de un periodo de preincubacin de las gotas de mnimo de 2 horas, pasar 10 oocitos a cada gota,
previamente retirados del medio de maduracin y lavados en Hepes. Luego se adiciona 2l de
heparina, PHE y semen previamente preparados, para completar gotas de medio para FIV de 50l. Los
oocitos debern permanecer en incubacin durante 18 horas para lograr la FIV. El cocultivo de oocitos y
semen para FIV debe hacerse en un ambiente de 5% CO 2, 38.9C de temperatura, y humedad maxima
por 18 horas (13).
Los cigotos bovinos madurados y fertilizados in vitro, fueron inicialmente cultivados con clulas del
cmulus, clulas epiteliales oviductales, clulas de la granulosa, clulas del amnios, y clulas de hgado
de rata bfalo en TCM199 suplementado con suero bovino, produciendo embriones con citoplasma
oscuro y baja densidad. El medio CR1aa fue luego desarrollado para el cultivo in vitro y segn varios
estudios, CR1aa es superior a TCM199 para el desarrollo potencial a blastocistos, con o sin cocultivo
con clulas de la granulosa (29).
El fluido oviductal sinttico (SOF) ha sido utilizado para la PIVE y principalmente para el CIV (26).
Gandhi et al. (30), utilizaron medios de cultivo a partir de SOF con albmina srica bovina (BSA) o
suero de ternero bovino (BCS) como medios nicos para MIV, FIV y CIV, concluyendo que un medio
simple puede ser usado satisfactoriamente durante la maduracin, fertilizacin y desarrollo embrionario
preimplantacin.
70
Como puede deducirse cada laboratorio aborda cada paso de la PIVE segn las posibilidades, reportes
y resultados propios de manera que sera pretencioso pensar en un sistema PIVE ideal. Sin embargo es
importante que los tcnicos e investigadores de los sistemas PIVE en Colombia, busquen implementar
desarrollos propios y forneos en la bsqueda de optimizar el proceso.
El CIV se realiza preparando el medio de desarrollo (Ej. CR1 AA, SOFaa) con gotas de 50 l bajo aceite
mineral en cajas de petri de 30mm, a las cuales son transferidos 10 presuntos cigotos por gota, una vez
retirados del medio para FIV y lavados en Hepes. El cultivo de embriones es realizado en una
incubadora con aire humidificado, con 5% CO 2 a 38C. La observacin de la tasa de clivaje es realizada
aproxiamadamente 32 horas despus del inicio del CIV, mientras la observacin del desarrollo de
embriones preimplantatorios es hecha a los 7 a 10 das de CIV (7, 13).
Aproximadamente el 80% de los oocitos quedan fertilizados y clivan hasta el estado de dos clulas
despus de MIV, FIV, y de stos solo llegan el 40% de los embriones al estado de blastocisto despus
de CIV (21-25), lo cual para la ineficiencia del proceso, se suma a las bajas tasas de xito en la
obtencin de gestaciones a trmino por la transferencia de embriones (31, 32).
La ineficiencia del proceso es el factor ms limitante para la masificacin de la PIVE en pases en vas
de desarrollo como Colombia, pues se requieren altas inversiones que debern solventarse en muchos
casos en un corto plazo. Esto claro est, dependiendo de la magnitud del proceso en cuanto a cantidad
de embriones producidos por semana, que como se menciono antes, puede ser ms grande cuando se
trabaja con oocitos provenientes de matadero por el alto volumen recolectado de estas clulas, y
tambin dependiendo de las tasas de xito implantatorio logradas. Los embriones producto de
esquemas de aspiracin folicular guiada por ultrasonido y PIVE, aunque pueden tener garanta de una
mejor gentica por lo sabido del origen de los oocitos, tambin es cierto que los costos ms elevados de
este procedimiento, los hacen menos accequibles para muchos productores.
71
Imagen 7. Desarrollo embrionario desde el complejo cmulus-oocito hasta el clivaje.

Fuentes: www.theses.ulaval.ca; www.utm.edu; www.teagasc.ie
De izquierda a derecha: Complejo cmulus-oocito; oocito fertilizado con expulsin del primer cuerpo polar y presencia de
pronucleos; embrin en estado de 2 clulas (clivaje).
Imagen 8. Desarrollo embrionario temprano.

Fuente: www.utm.edu
Izq: embrin temprano; Der: embrin en estado de blastocisto.
Como se menciono antes, el ambiente en el cual el embrin se desarrolla entre el estado de cigoto y
blastocsto determina la calidad del mismo, por tal razn el desarrollo de un sistema de cultivo de
embriones definido es importante para la industria de la transferencia de embriones, pues a pesar de
utilizar una variedad de sistemas para la produccin in vitro de embriones, se ha carecido de una
adecuada definicin que asegure el control de calidad y la repetibilidad esperada (15, 33).
Las condiciones de cultivo durante los diferentes pasos en la PIVE, pueden afectar las tasas de
desarrollo, pero el relativo bajo nivel de eficiencia manifestado en el 60% de oocitos inmaduros que no
logran llegar hasta el estado de blastocisto, se debe bsicamente a la calidad intrnseca del oocito (22).
Es necesario optimizar los sistemas de cultivo in vitro en orden de que las tasas de produccin y calidad
de blastocistos sean comparables a el cultivo in vivo (15).
72
Para eliminar la excesiva variabilidad, sistemas de cultivo simplificados han sido empleados, teniendo en
cuenta la influencia en el desarrollo embrionario in vitro, de aminocidos, sustratos energticos, citrato y
vitaminas (33). Es importante que en Colombia se busque mediante procedimientos investigativos
establecer protocolos ms definidos de PIVE para mejorar el proceso y eliminar en alguna medida la
dependencia de sistemas desarrollados en otros pases. Esto sin duda, requerir una participacin ms
significativa de entidades pblicas, pues es desde all que los logros podran extrapolarse con mayor
facilidad al productor.
Entre los desarrollos prometedores para mejorar las condiciones del cultivo de embriones se han
suplementado los medios de cultivo con IGF-I, vitamina E y hialuronato, se han reducido las
concentraciones de oxigeno y glucosa, e inhibido la fosforilacin oxidativa (6).
Mientras el nico parmetro que puede fiablemente medir la eficiencia de un sistema in vitro, es la
habilidad de producir fetos viables desde un cultivo de embriones, por razones prcticas y econmicas,
la medida ms comnmente usada de eficiencia, es la proporcin de oocitos inmaduros, desarrollados a
la etapa de blastocisto (34).
La competencia de un oocito ha sido definida como la capacidad que ste posee para desarrollarse
hasta el estado de mrula o blastocisto despus de la MIV, la FIV y el CIV (35-37). Muchos estudios han
demostrado claramente que la calidad del oocito es el factor ms crucial que afecta la tasa de
blastocistos (34).
Se han examinado diferentes caractersticas foliculares y oocitarias para evidenciar los factores
asociados con la adquisicin de la competencia para el desarrollo, entre ellas: el tamao folicular, la
atresia folicular, la morfologa de los oocitos (38-40), el dimetro de los oocitos (41), y la salud folicular
(38, 40), donde la atresia folicular no es necesariamente detrimental para los oocitos y por el contrario,
en sus estados iniciales favorece el logro de la competencia oocitaria (42); el perfil hormonal (43) y el
estado del ovario tambin han sido mencionados (40, 44). La competencia de los oocitos se incrementa
por aproximadamente 4 horas pos-mortem para el caso de su obtencin desde ovarios provenientes de
plantas de sacrificio (6).
73
Una alta competencia para el desarrollo de los oocitos obtenidos y unos mtodos adecuados de cultivo
in vitro son requeridos para hacer un mximo aprovechamiento del potencial gentico de la hembra
bovina (45). Aunque en las publicaciones de los ltimos diez aos, se sealan muchos factores que
pueden mejorar la competencia del oocito como factores de crecimiento, gonadotropinas, suero
especifico y condiciones de incubacin entre otros, y se muestran algunos efectos positivos sobre la
tasa de embriones y su calidad, es el origen folicular el que muestra ser vital para conferir al oocito un
ambiente necesario para tener un total desarrollo competente (24, 37).
Un problema preocupante para la PIVE, es el nacimiento ocasional de terneros con un serio sobrepeso,
posiblemente por ciertas condiciones de cultivo, que podran permitir la expresin de algunos genes que
son normalmente inhibidos. A pesar de la baja incidencia del sndrome del ternero grande y que
algunos laboratorios no lo reportan, es necesario encontrar una explicacin adecuada a este fenmeno,
de manera que las condiciones de cultivo sean ajustadas para eliminar o restringir en gran medida esta
ocurrencia (3). Otros problemas asociados a la postransferencia de embriones de PIVE, son incremento
en tasas de aborto, aberrante expresin gentica muscular, incremento en la mortalidad neonatal, y
proporcin de sexo sesgada hacia los machos (6).
Los terneros resultantes de la PIVE poseen una mayor ingestin de alimento, una mayor tasa de
crecimiento y una mejora en su eficiencia alimentaria en el primer mes de vida en comparacin con
terneros producto de la inseminacin artificial. Sin embargo, esto no es reflejado por cambios
hematolgicos, metablicos, y endocrinos consistentes (46).
4.5 ACTUALIDAD DE LA PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES EN COLOMBIA
A pesar del esfuerzo de algunas instituciones pblicas, y un poco mas de empresas privadas, la
actividad investigativa e incluso comercial de la PIVE en Colombia es reducida en comparacin con
pases de la regin como Brasil. Las inversiones en estos sentidos debern ser an muy grandes si se
quiere que la participacin de la PIVE en los procesos genticos y reproductivos del pas, tenga
relevancia productiva.
A continuacin se citan algunos de los trabajos de investigacin relacionados con la PIVE desarrollados
en Colombia, por algunas de las principales instituciones que efectan PIVE:
74
Urrego et al. (47), de La Universidad Nacional de Colombia sede Medelln y La Universidad de

Antioquia, realizaron un trabajo para la simplificacin del mtodo de seleccin de los espermatozoides
en la fertilizacin de oocitos durante la produccin in vitro de embriones bovinos, mediante un mtodo
en el cual se obvia el paso de la centrifugacin y por ende sus daos en la membrana plasmtica y en el
ADN de los espermatozoides. Esto con la finalidad de ahorrar tiempo y recursos en la FIV, adems de
aumentar las tasas de fertilizacin y desarrollo embrionario.
Novoa et al. (48), en una investigacin del Programa de Recursos Genticos y Biotecnologa Animal, de
La Universidad de Cundinamarca, Tibaitata-Corpoica, evaluaron el efecto de la utilizacin de medios
sintticos o definidos sobre la base de SOF, en la maduracin y fecundacin de oocitos bovinos in vitro,
con el propsito de sustituir los productos biolgicos en los medios. Los resultados del estudio
demostraron que los oocitos bovinos pueden ser madurados en condiciones completamente definidas,
sin perder su capacidad de desarrollo, debido a que no se encontraron diferencias significativas
(P>0.05) entre los tratamientos con medios sintticos y el control con biolgicos como suero fetal bovino
(SBF) y base de TCM-199. Las tasas de clivaje estuvieron entre el 50 y el 64%. Segn los autores, la
MIV y CIV en ausencia de sustancias biolgicas, son un paso importante en el desarrollo de un sistema
de PIVE completamente definido, que ser de gran valor tanto para los investigadores como para los
programas de crianza.
Lpez et al. (49), del grupo de Investigacin en Ciencias Animales, Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia, Universidad Cooperativa de Colombia, evaluaron el efecto de la MIV de oocitos bovinos,
empleando como suplementacin proteica, albmina srica bovina (BSA al 0.6%), suero de vaca en
estro (SVE al 10%) y suero fetal bovino (SFB al 10%), a fin de establecer el porcentaje de produccin de
mrulas / blastocistos a las 168 horas post-fertilizacin, con cultivo en medio de desarrollo CR1-AA.
Como resultados se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de mrulas y blastocitos
obtenidos, siendo mayor para BSA, seguida de SVE y SFB.
Salgado et al. (50), de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Crdoba,
realizaron un estudio cuyo objetivo fue evaluar el efecto de diferentes concentraciones de heparina y de
semen en el medio de fertilizacin sobre el porcentaje de oocitos bovinos fertilizados in vitro. Los
autores reportan como resultados que la concentracin de heparina tuvo efecto significativo (p<0.05) en
75
el porcentaje de oocitos fertilizados, encontrndose los mejores resultados en la concentracin de 10

g/ml, con una tasa de penetracin del 67%. Y que la concentracin espermtica afecta la fertilizacin,
encontrndose la mayor proporcin de oocitos con fertilizacin normal (74%) al utilizar una
concentracin de 2x106 espermatozoides/ml, aunque sin diferencia estadstica respecto a la
concentracin de 1x106 (p>0.05). Segn los autores los resultados indican que la tasa de fertilizacin
guarda relacin directa con la dosis de heparina y la concentracin espermtica.
La Universidad Nacional de Colombia (51), reporta los siguientes trabajos de investigacin en PIVE:
Obtencin de embriones bovinos por tcnicas in vitro (Ramrez, H. 1998); y Efecto de la temperatura
sobre la penetracin espermtica y fertilizacin in vitro en toros de las razas Romosinuano, Holstein y
Brahman en oocitos bovinos de matadero (Medina, 1998).
En Colombia en el mbito comercial CRG es una de las principales empresas en prestar el servicio de
PIVE a partir de oocitos recolectados por AFGU. Segn esta empresa, en promedio por cada sesin de
aspiracin, obtienen 20 oocitos, los cuales van a generar despus del manejo hormonal adecuado de
las receptoras, el uso de ecografa ovrica, y la transferencia de los embriones, cerca de 4 preeces,
permitiendo una alta multiplicacin gentica de los animales involucrados en el proceso de FIV (52).
La empresa colombiana Ctelca, reporta entre 2003 y 2005, la obtencin por aspiracin folicular guiada
por ultrasonido (AFGU) de 24.162 oocitos, para maduracin in vitro, con 4.217 embriones transferidos
producidos por PIVE, para 1.476 preeces confirmadas (53).
La empresa Brasilera Vitrogen con una sede en Zipaquir, Colombia, se encarga de la PIVE, dentro de
sus principales servicios en biotecnologa reproductiva bovina, y reporta que sus tasas de produccin de
embriones del 40 al 50% a partir de oocitos colectados, estn por encima del promedio internacional (54), lo cual
ilustra el desarrollo tcnico de esta biotecnologa en el pais.
Dentro de las tecnologas de produccin de embriones, la produccin in vitro posee la ventaja de la gran cantidad
de embriones que pueden producirse en un periodo corto de tiempo. A pesar de las dificultades del proceso, un
programa de PIVE puede representar avances muy significativos en la eficiencia reproductiva de una ganadera.
76
En el mbito internacional, pases con gran desarrollo en esta biotecnologa, como Italia, Francia, Canada,
Inglaterra y Holanda, han demostrado los beneficios productivos y rentables que son factibles con su
implementacin, producto de los incrementos en la eficiencia reproductva de las explotaciones. Grandes
laboratorios en estos pases prestan servicios de difusin comercial de esta tcnica, y grandes empresas
ganaderas adoptan la PIVE para el logro del progreso deseado. En Colombia la difusin de los beneficios de la
tcnica al sector productivo ganadero es escasa, y no se reportan estimativos concretos de su actividad a parte de
los realizados en la parte comercial de algunas empresas. Sin embargo, an el pais est a tiempo de estar en la
vanguardia, al menos en la regin, en la aplicacin de esta biotecnologa, ya que existen los recursos cientficos y
acadmicos para lograrlo, siendo necesaria una capacitacin ms incluyente, e inversiones econmicas que
aunque grandes, son justificables por la magnitud de progreso que la PIVE puede aportar al campo.
Otro factor a analizar en el papel de la PIVE en Colombia, esta dado por la manera como es abordada por las
universidades pblicas. La labor investigativa llevada desde la ciencia bsica hasta la estandarizacin de
protocolos es valiosa, pero se lograrian mayores beneficios si se asume el papel de su difusin comercial, lo cual
puede generar recursos para magnificar las labores investigativas y de aplicacin, y puede generar mayores
beneficios al crecimiento ganadero del pas.
El manejo de embriones criopreservados tanto de origen nacional o internacional, permite su almacenamiento,
transporte y transferencia a animales en todas las regiones del pas. El trabajo en protocolos de sincronizacin
hormonal debe ser exitoso y brindar niveles altos de eficiencia, al igual que debe existir un buen dominio de la
tcnica de transferencia para lograr buenas tasas de gestaciones a trmino por esta metodologa. La ventaja de la
transferencia de embriones criopreservados adquiridos en centrales de produccin in vitro, est en que es menor
el requerimiento de recursos tcnicos en las granjas respecto a los programas de transferencia tradicional con la
transferencia de embriones frescos, por lo cual es factible que este tipo de trabajo permita en Colombia una mayor
difusin de la gentica aportada por embriones producidos por PIVE.
Los avances alcanzados al momento en Colombia en la PIVE, aunque valiosos, son insuficientes para que esta
tcnica se haga asequible a gran parte de los productores ganaderos del pas, por lo cual son necesarios
esfuerzos a todos los mbitos, para el logro del posicionamiento de esta biotecnologa en el pas, de manera que
sea factible alcanzar los niveles de aportes en la productividad que sta genera a la ganadera de otras latitudes
del mundo.
77

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80
CAPTULO V
ASPIRACIN FOLICULAR DE OOCITOS BOVINOS GUIADA
POR ULTRASONIDO
5.1 INTRODUCCIN
El vinculo entre el ultrasonido y la poco invasiva recoleccin de oocitos transvaginal guiada por este
medio, es denominada por algunos investigadores como recogida de vulos o ovum pick up (OPU), y
por otros como recoleccin transvaginal (1), o mediante las siglas en espaol para aspiracin folicular
guiada por ultrasonido (AFGU).
La AFGU es una tcnica que aporta oocitos para los procedimientos de produccin in vitro de
embriones. El conocimiento del origen directo de los oocitos a partir de animales probados como
genticamente superiores, es lo que justifica su aplicacin teniendo en cuenta lo dispendioso de la PIVE
y de los costos agrupados de ambas tcnicas, reflejados en el precio final de los embriones,
considerando adems otros costos asociados como los procedimientos de criopreservacin,
almacenamiento y transferencia.
Los programas de TE con sus procesos de superovulacin producen unos resultados muy variables
reflejados en el irregular nmero de embriones recuperados (2), por lo cual tratando de superar parte de
estos inconvenientes, se desarroll la AFGU.
La obtencin de oocitos bovinos mediante AFGU, fue reportada por primera vez en 1988 por Pieterse et
al. (3) y ha demostrado ser una tcnica reproducible y exitosa como parte de la produccin de
embriones y terneros a partir de donadoras con ciclo estral normal, donadoras problema, prepberes o
con dificultad para el apareamiento. La obtencin de oocitos mediante AFGU seguida por la produccin
in vitro de embriones (PIVE), ha sido considerada como una tcnica alternativa promisoria frente a la
superovulacin y la transferencia de embriones (4), y se constituye en la base para el desarrollo de
nuevas tecnologas como la clonacin, el sexaje de embriones y la produccin de animales transgnicos
81
(5). Cuando la AFGU es combinada con la PIVE es posible producir por encima de 50 terneros por
vaca donadora por ao (6).
La AFGU es una tcnica implementada en Colombia por laboratorios dedicados a la PIVE comercial. En
el pas esta tecnologa es solo recientemente aplicada y tiene sus bases en los estudios que han sido
desarrollados en ultrasonografa de las estructuras del tracto reproductivo de la hembra bovina,
principalmente para el seguimiento de la fisiologa ovrica y de la gestacin. Su importancia radica en la
cantidad significativa de recuperacin de oocitos que puede realizarse desde un animal en un periodo
de tiempo. De manera que es posible la propagacin de rasgos genticos deseables por su combinacin
con la tecnologa de produccin de embriones in vitro.
La conjugacin de la PIVE con la AFGU, provee un nuevo desarrollo invaluable en la cra de ganado y la
industria de transferencia de embriones (1). El origen y calidad de los oocitos se convierte en un factor
importante cuando se busca que estos sean altamente competentes para la PIVE. Por lo cual con la
iniciacin de los programas de fertilizacin in vitro (FIV), surgi la necesidad de obtener oocitos de
buena calidad para los procesos de transferencia.
La AFGU permite a partir de animales vivos incrementar potencialmente el nmero terneros producidos
por vaca donadora por ao (5) obviando los problemas derivados de la produccin de embriones a partir
de oocitos que tradicionalmente han sido obtenidos de ovarios de vacas sacrificadas, lo cual presenta
las desventajas del desconocimiento del estado hormonal y sanitario de los animales, y la falta de
repetibilidad de la tcnica en los mismos individuos (1). Sin embargo la proporcin de oocitos que se
desarrollan en blastocistos despus de maduracin, fertilizacin y cultivo in vitro, es muchas veces
mayor mediante oocitos provenientes de ovarios de matadero que desde oocitos recuperados por AFGU
(7). Es importante en este sentido considerar el estado de madurez nuclear y citoplasmtica de los
oocitos al momento de su recoleccin desde los folculos, adems de las agresiones fsicas a las cuales
pueden ser sometidos por las presiones de succin, los sistemas de agujas y la manipulacin hasta el
inicio del in vitro, que pueden comprometer su competencia para el desarrollo.
82
La extraccin transvaginal de oocitos tiene como ventajas que permite extracciones repetidas (1 o 2
veces por semana), sin siquiera afectar la regularidad del ciclo estral de la hembra (8), permite el
aprovechamiento de folculos no ovulatorios que bajo condiciones fisiolgicas se tornaran en folculos
atrsicos (9), no requiere un tratamiento hormonal preliminar, no interfiere con la fisiologa normal del
animal donador, ni con el crecimiento folicular que por el contrario es estimulado (10), permite la
disminucin del intervalo generacional (5) e incluso puede ejercer un efecto teraputico en animales con
problemas de fertilidad al remover estructuras qusticas (10). Igualmente, se ha reportado que la
extraccin transvaginal de oocitos es menos traumtica para los animales y menos invasiva que otros
sistemas como la laparoscopia (11, 12), pues la AFGU es la nica tcnica para la recoleccin de oocitos
que por un mtodo no invasivo, puede ser usada en animales donadores vivos (13)..
Durante un estudio de comparacin entre las tcnicas de extraccin transvaginal de oocitos y la
extraccin de oocitos va laparoscopia, los autores concluyeron que la recuperacin transvaginal es
menos traumtica y riesgosa para las vacas y presenta mayores facilidades de aplicacin, siendo
considerada como un mtodo ms efectivo para la recoleccin de complejos cmulus-oocito inmaduros
de buena calidad, mientras la recuperacin por laparoscopia permite un ms exacto posicionamiento de
la aguja de aspiracin dentro del folculo con menos trauma para los ovarios, y brinda mayor informacin
sobre la vascularizacin, luteinizacin y el contenido del folculo antes de la aspiracin (11). A pesar de
sto la recoleccin por aspiracin folicular laparoscopica incluye riesgos propios de la tcnica quirrgica
como las posibilidades de complicaciones, infeccin, y la necesidad de anestesia y un periodo de
recuperacin, lo que hace ms complejo su manejo, adems de los altos costos del equipo, el alto nivel
de capacitacin requerido para su manejo y la poca accesibilidad en muchas regiones del pas al
mismo.
Comercialmente, la aspiracin de oocitos para la produccin in vitro de embriones le puede permitir a los
productores generar un elevado nmero de embriones de sus mejores vacas an cuando sus animales
sean viejos o presenten patologas del tracto reproductivo que influyan sobre su fertilidad (5). Inclusive
es posible obtener oocitos a partir de vacas durante los primeros meses de preez, y desde vacas
durante el periodo posparto temprano (1).
Estas caractersticas hacen de la AFGU un mtodo complementario promisorio para los procesos de
produccin de embriones en Colombia. Puede permitir a los ganaderos del pas aumentar en gran
83
medida la eficiencia reproductiva de sus mejores animales, y puede potenciar el progreso gentico con
la reduccin de los intervalos generacionales y el logro de altos niveles de ganancia gentica mediante
su difusin conjunta con la PIVE.
5.3 ASPECTOS TCNICOS DE LA ASPIRACIN FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONIDO
La AFGU es una tecnologa compleja, que requiere altos niveles de destreza para su desarrollo y
perfeccionamiento. El dominio y reconocimiento de las imgenes ultrasonograficas para el desarrollo de
la AFGU, es un requerimiento fundamental que incrementa la necesidad de una alta capacitacin para
los tcnicos que operan este procedimiento. Adems la manipulacin va rectal principalmente de los
ovarios, la manipulacin de la instrumentacin para la localizacin y puncin de folculos, y la aspiracin
y recuperacin de oocitos desde el aspirado, son procedimientos que deben ser precisos y minuciosos
para el xito de la recoleccin y la viabilidad de estas clulas.
La tcnica de extraccin transvaginal de oocitos mediante AFGU, se realiza con un equipo de
ultrasonografa como gua para la puncin. Las vacas donadoras son contenidas en un brete, se vaca
su recto, se limpia y desinfecta la regin perineal, y se utiliza anestesia epidural baja (Lidocaina 2%)
para producir analgesia, relajacin del recto y la vagina, y para prevenir las contracciones abdominales,
facilitando la manipulacin de los ovarios. El dispositivo para la extraccin de los oocitos es introducido
en la vagina, este consiste en una sonda para ultrasonografa de arreglo anular multiangular (5 / 7.5
MHz), que posee un sistema de puncin con una aguja de 18 G con punta ecognica, conectado a una
bomba peristltica de vaco a presin de 75-100 mmHg para la succin del liquido folicular (5, 14). Estas
especificaciones son segn investigaciones las ms apropiadas para el xito de este procedimiento, sin
embargo existen variantes a las mismas, y los equipos de ultrasonografa, puncin y succin pueden
variar en sus especificaciones de manejo segn la marca y propiedades.
Para la aspiracin folicular, se realiza manipulacin rectal de los ovarios y se colocan los mismos contra
el transductor del ecografo, se visualizan los folculos y una vez localizados son puestos en posicin (ver
imagenes 9 y 10). La aguja es insertada en el folculo a travs de la puncin de la corteza ovrica para
recoger el producto del aspirado en tubos cnicos con medio TL-Hepes o PBS con Heparina. Los
complejos cumulus-oocito (CCOs) son recolectados desde el aspirado con la ayuda de un
estereoscopio, y posteriormente son incorporados a un programa de PIVE (5, 14).
84
Imagen 9. Aspiracion folicular guiada por ultrasonido (AFGU).

Fuente: LTR laboratorio (2006).
El ultrasonido ha sido utilizado como una herramienta en biotecnologa para la aspiracin de oocitos en
bovinos por va transvaginal (5). La ecografa o ultrasonido es una tcnica que emplea ondas de sonido
de alta frecuencia para producir imgenes de los tejidos blandos y rganos internos, sobre la base de la
recepcin de ecos que se producen por la reflexin de los ultrasonidos a nivel de los distintos tejidos
(15).
Imagen 10. Ubicacin y equipo para AFGU.
Izquierda: diagrama de la aspiracin transvaginal guiada por ultrasonido, fuente Ramrez y Jimnez (2003). Derecha:
ubicacin para la AFGU; Abajo: ecgrafo Piemedical 240 Parus Vet con sonda transvaginal para AFGU.
85
Son requerimientos especiales de la tcnica de AFGU, una adecuada localizacin de los ovarios sobre
la sonda transvaginal para una adecuada observacin de las estructuras, una exacta diferenciacin de
las estructuras foliculares y determinacin de su tamao para la evaluacin de su posibilidad de ser
aspiradas, una habilidad manual adecuada para el posicionamiento de la aguja dentro de los folculos
sin profundizar con la puncin en la mdula ovrica, por la aspiracin de sangre y el dolor e
incomodidad causados en la vaca, y una destreza adecuada para realizar la liberacin del vaci para
una aspiracin rpida del liquido folicular. De manera que se facilita la adquisicin de las destrezas para
su desarrollo cuando los tcnicos cuentan con habilidades previas en ultrasonografa y palpacin.
Las mayores tasas de recuperacin de oocitos se obtienen con agujas gruesas (18G) independiente del
vaco de aspiracin (17). El uso de agujas de mayor dimetro y los incrementos en la presin de vaco
superiores a 70 a 80 mmHg, aumentan el nmero de oocitos recuperados, pero a la vez disminuyen el
nmero de oocitos viables, posiblemente por la prdida de las clulas del cmulus que rodean al oocito
(16, 17).
En otros trabajos, Vandenheede et al. (18), alcanzaron un nmero de 122 oocitos recolectados para una
tasa de recoleccin de oocitos del 42%, durante la aplicacin de la extraccin transvaginal de oocitos en
bovinos para el estudio de un sistema de orientacin de agujas, en 27 vacas durante 17 sesiones de
recoleccin de oocitos, con 291 folculos aspirados en total. Estos investigadores por produccin in vitro
obtuvieron un porcentaje de divisin en embriones del 69% (3 das despus de la inseminacin) y un
porcentaje de blastocstos tempranos del 28%.
Los folculos ms grandes son tcnicamente ms fciles de aspirar que los folculos ms pequeos
aunque ellos no necesariamente producen un oocito, sto puede ser en parte debido a la consistencia
de su fluido folicular (13). Los CCOs colectados durante la fase de crecimiento o en el periodo de
dominancia del desarrollo folicular, poseen un nivel de competencia reducido (19, 20).
La AFGU se puede realizar durante todos los estados del ciclo estral, es fcil su utilizacin a nivel de
campo y adems se puede efectuar una o dos veces a la semana durante perodos de 3 a 6 meses (5).
La aspiracin dos veces por semana permite una recoleccin mxima de oocitos de adecuada calidad
para la produccin de embriones, mientras que con la recoleccin realizada una vez por semana, se
obtiene un bajo nmero y menor calidad de oocitos (21). Estas caractersticas potencian en una medida
86
importante las posibilidades de reproduccin de una hembra bovina, y para una central que aplique esta
biotecnologa contar con un flujo significativo de oocitos para el proceso, requiere un nmero reducido
de animales, determinado tambin por la rotacin de gentica deseada y los objetivos de heterosis y de
reduccin de la consanguinidad.
Se ha demostrado que el nmero total de oocitos recuperados mediante AFGU y el total de embriones
subsecuentemente producidos in vitro, es directamente proporcional al nmero de sesiones de
aspiracin, de manera que incrementando de 1 a 2 veces la frecuencia de aspiraciones se dobla la
cantidad de oocitos colectados sin afectar la actividad estral subsiguiente o la respuesta a los
tratamientos de superovulacin (22).
De acuerdo con Galli et al. (21), un promedio de 8 a 10 oocitos son recolectados por sesin de
extraccin transvaginal, con un promedio de produccin de 2 embriones transferibles. Estos autores
reportan datos sin publicar en los cuales fueron recuperados en promedio 9.9 oocitos por sesin,
durante 261 sesiones de extraccin transvaginal en 59 donadoras. El porcentaje de oocitos que se
dividieron fue del 64.4%, los embriones transferibles en promedio fueron de 2.5 y los aptos para
congelacin de 2. Hasler (23), reporta una vaca de 8 aos de edad, con produccin de 176 embriones
transferibles, en un periodo de 3 aos, mediante un programa de AFGU-PIVE con una aspiracin por
semana.
Segn Merton et al. (2003) citados por Hansen y Block (7), se estima que aproximadamente 50
embriones congelables pueden ser producidos por vaca por ao usando superovulacin, comparado
con 150 embriones por ao mediante PIVE-AFGU. Se clcula que en promedio por AFGU acoplada a
PIVE, se pueden obtener aproximadamente 30 terneros/vaca/ao (24) o 0.96 a 1.38 embriones por
semana (25).
En estudios de Bousquet et al. (2) utilizando la PIVE acoplada con AFGU, se obtuvieron 4.145 oocitos,
provenientes de 92 vacas, durante 437 sesiones de recoleccin, alcanzando un promedio de 9.5 (5.6)
oocitos recolectados por sesin, de los cuales se logr que un 78.6% se dividieran despus de la
fertilizacin, y se alcanz una produccin promedio de 4.7 (3.7) embriones viables o sea el 49.7%,
mientras que Santl et al. (11), obtuvieron una tasa de divisin para oocitos recuperados por va
87
transvaginal del 58.1%, una proporcin del 38.7% de los oocitos extrados fueron considerados de alta
calidad, y se obtuvo una tasa de desarrollo hasta el estado de mrula/blastocisto del 27.1%.
La AFGU tiene adems como ventaja, permitir el uso de semen de diferentes toros para fertilizar los
oocitos recuperados a partir de donadoras individuales, lo que en otros trminos significa la posibilidad
realizar mltiples cruces entre una vaca y varios machos de manera simultnea (21).
Aunque, s bien es cierto que la extraccin transvaginal de oocitos es una tcnica que representa
muchas ventajas, tambin se ha reportado que despus de la inseminacin de vacas que tienen un ciclo
estral normal, aproximadamente el 85% de los oocitos ovulados alcanzan el desarrollo embrionario (26),
lo cual contrasta con los resultados obtenidos mediante la prctica de extraccin transvaginal de oocitos
acoplada a la PIVE, en donde menos del 35 al 40% de los oocitos alcanzan el desarrollo embrionario.
Existen fuertes indicios que sealan que estas diferencias en la produccin de embriones estn ms
relacionadas con la fuente de los oocitos que con las diferentes circunstancias entre la fertilizacin in
vivo e in vitro y el subsecuente desarrollo embrionario, ya que se ha sealado que las condiciones in
vitro para el cultivo de embriones no son las responsables del decrecimiento en la competencia de los
oocitos (9).
La dificultad en muchos casos para lograr tasas de desarrollo embrionario in vitro comparables a las
logradas en un ambiente in vivo, est dada por la gran cantidad de cambios en las tcnicas in vitro, de
las condiciones en las que un embrin se desarrolla dentro del proceso natural. Aunque muchos
sistemas in vitro buscan asemejar al mximo las condiciones a las que se someten a oocitos,
espermatozoides y embriones en el tracto reproductivo de la hembra, la influencia de mltiples factores
propios de la tcnica favorece cambios en el comportamiento de estas clulas en su fisiologa
reproductiva, e incluso cambios epigenticos que modifican sus caractersticas de desarrollo
embrionario, fetal, neonatal y productivo (7, 27).
Dentro de las desventajas que ofrece la tcnica de recuperacin transvaginal de oocitos, se encuentra el
relativo elevado costo del equipo y la necesidad de personal capacitado para la puncin. Adems se ha
reportado con la aspiracin transvaginal un leve endurecimiento de los ovarios debido a incrementos en
el nmero de fibras de colgeno en la tnica albugnea, el cual no produce ningn dao irreparable a
nivel ovrico (28).
88
El costo de un equipo de ultrasonografa para AFGU puede fcilmente solventarse con la

comercializacin de los embriones producidos por PIVE. Como opcin para el profesional de las reas
pecuarias en Colombia, el dominio de la ultrasonografa para sta y otras tecnologas de diagnostico
reproductivo, puede ser una eleccin rentable por lo cual es una inversin justificable.
En la actualidad por el gran aporte al desarrollo de la PIVE que hace la aspiracin folicular, sta se ha
convertido rpidamente en una parte importante del proceso de produccin de embriones in vitro para
transferencia (8, 29), lo cual la hace tanto en el mbito internacional como para la biotecnologa
reproductiva en Colombia, la opcin ms adecuada para el complemento de la produccin de
embriones.
5.4 ESTIMULACIN HORMONAL PREVIA A LA ASPIRACIN FOLICULAR
La estimulacin hormonal en bovinos previa a la aspiracin folicular, tiene como objetivo lograr primero
una mayor disponibilidad de folculos ovricos para la aspiracin, y en segundo lugar favorecer la
maduracin oocitaria de manera que se potencie su capacidad de desarrollo embrionario en la PIVE.
Cuando las hembras bovinas son tratadas hormonalmente de una manera adecuada, ms del 95% de
oocitos clivan y ms de un 75% de los oocitos inmaduros obtenidos mediante AFGU se desarrollan in
vitro hasta el estado de blastocisto, lo que se traduce en un avance significativamente importante en la
produccin in vitro de embriones (2, 30, 31).
El tratamiento de vacas con FSH aumenta el nmero de folculos asequibles para la aspiracin,
comparados con las vacas no estimuladas, tal como lo han reportado mltiples estudios sobre la
estimulacin con esta hormona (25, 32-34) o PMSG (28).
Estudios hechos por Pieterse et al. (3), muestran una alta tasa de oocitos recuperados para vacas
estimuladas con PMSG. Sin embargo los mismos autores reportan en estudios posteriores que la
estimulacin con PMSG, resulta en una disminucin en la tasa de oocitos recuperados (28).
89
Algunos resultados muestran que ni el tratamiento con FSH, ni la duplicacin en la frecuencia de

aspiraciones por semana, resultan en un incremento significativo en la cantidad de oocitos producidos
por semana por AFGU (22, 35-37).
Los folculos grandes, tales como aquellos estimulados por gonadotropinas exgenas, pueden ser ms
maduros y contener en el aspirado ms capas de clulas de la teca y la granulosa, y un fluido folicular
viscoso (13). Consecuentemente, una presin negativa constante de 70 a 80 mmHg, puede no ser
suficientemente alta para aspirar el fluido viscoso de los folculos ms grandes, estimulados con FSH
(38).
En un estudio de AFGU en vacas, se hall que los efectos individuales explicaron hasta el 48,3% en la
variacin del nmero de oocitos recobrados (39). Lo cual explica en ocasiones el hallazgo de resultados
contradictorios en las respuestas para la estimulacin hormonal. Muy posiblemente adems de
influencias individuales, factores relacionados con el ambiente productivo y los protocolos mismos de
estimulacin afectan dichas respuestas. Tal situacin es indicativa de la necesidad de evaluar en las
condiciones propias de campo del pas, los protocolos de estimulacin hormonal para establecer los de
mejor comportamiento y eficiencia, considerando adems elementos prcticos y econmicos.
5.5 ACTUALIDAD
DE
LA ASPIRACIN
FOLICULAR GUIADA
POR ULTRASONIDO EN
COLOMBIA
A escala comercial en Colombia la AFGU es una tcnica aplicada por algunos laboratorios que la
incluyen en sus procesos de PIVE, y la difusin de la tcnica an esta muy lejos de tener la magnitud
que debera, considerando un mbito internacional. Sin embargo es de destacar su introduccin dentro
de la biotecnologa reproductiva del pas, y los esfuerzos por lograr altos niveles de eficiencia.
La empresa colombiana Ctelca reporta desde 1995 al 2003, 1.424 aspiraciones realizadas, para 24.162
oocitos para maduracin in vitro, reporta el primer rcord en produccin de embriones por sesin de
aspiracin en la raza Brahman, con 77 oocitos en una aspiracin y 40 embriones transferidos despus
de la PIVE. Y adems reporta el logro del primer nacimiento en Colombia de terneros por la tcnica de
aspiracin folicular y fertilizacin in vitro en el 2000 (40).
90
La empresa Brasilera Vitrogen, cuenta con la AFGU dentro de sus principales servicios, para la cual
reportan desde 1998 al 2003, la aspiracin de 250 donadoras por promedio en una semana, con una
produccin media postransferencia de 1500 preeces/mes (41).
En el campo investigativo es difcil encontrar reportes de trabajos realizados implementando la AFGU. Sin lugar a
dudas seria pertinente incrementar la actividad investigativa y comercial en este sentido en la bsqueda de lograr
el perfeccionamiento de la tcnica y unos mayores niveles de xito que permitan de manera pronta el acceso a
esta tecnologa por muchas ganaderas colombianas.
Para la produccin de embriones en Colombia deben ser establecidos objetivos claros respecto a los
logros que se desea sean alcanzados en cuanto al avance gentico y el desarrollo productivo de la
ganadera. Cada explotacin puede generar sus propios objetivos, y el valor gentico de su pie de cra
debe ser considerado cuando se realiza la introduccin de gentica mediante semen o embriones, pues
solo sto posibilita determinar si es factible el logro de avances para los rasgos productivos deseados.
La AFGU es una tecnologa que solo se hace justificable por la inversin tcnica y econmica que
requiere, cuando se recuperan oocitos que por su valor gentico, y al trasladarlos a un proceso de PIVE,
garantizan un avance en el valor gentico de los animales para una ganadera.
La AFGU es una biotecnologa valiosa como recurso cientfico, y el alcance del dominio de la misma,
representa una importante contribucin al desarrollo formativo de un profesional en las reas pecuarias.
La capacitacin en esta tecnologa es dispendiosa y prolongada cuando no se posee experiencia en
palpacin y ecografa, sin embargo el hecho de invertir en este proceso, por parte de instituciones
pblicas y entes privados, es valioso para mejorar la disponibilidad de la AFGU para los procesos de
PIVE desarrollados en todas las regiones del pas.
Las condiciones actuales de un comercio en globalizacin y los recientes acuerdos comerciales donde
participa nuestro pas, pueden favorecer el ingreso de recursos tecnolgicos a precios ms moderados,
lo que en un futuro cercano puede facilitar la difusin de biotecnologas como la AFGU.
91
La expansin de la recuperacin transvaginal de oocitos acoplada a la PIVE, dentro de los procesos

biotecnolgicos relacionados con la reproduccin del ganado en Colombia, puede ser lograda mediante
la promocion gubernamental de la integracion de entidades de carcter publico, al ambito comercial de
dichos procesos, y mediante la estimulacion de la inversion en los mismos, por empresas nacionales y
extrangeras con posibilidades de establecimiento en el pais, lo cual puede representar el hecho de
acercar a la nacin a la vanguardia en la biotecnologa reproductiva bovina, logrando repercutir en la
competitividad del sector pecuario colombiano, y realizando un aporte a nuestro avance investigativo y
cientfico.
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94
CAPTULO VI
CRIOPRESERVACIN DE GAMETOS Y EMBRIONES
BOVINOS
6.1 INTRODUCCIN
La criopreservacin es el proceso de almacenar materiales biolgicos a bajas temperaturas durante
largos periodos de tiempo (1). Lograr criopreservar eficientemente semen, embriones y oocitos, significa
ampliar las herramientas que la biotecnologa reproductiva tiene al servicio de la reproduccin asistida,
la ingeniera gentica, la preservacin de germoplasma y la industria o la investigacin (2-5), pues tanto
el semen, como los oocitos y embriones bovinos, son ampliamente conocidos por su importancia en los
procesos de mejoramiento gentico y reproduccin, representando un alto potencial para el crecimiento
del sector pecuario (6).
Este panorama es ampliamente aplicable al desarrollo biotecnolgico colombiano, pues solo
considerando el caso de la poblacin bovina productora de leche y carne, el hecho de poder conservar,
almacenar, transportar y diseminar por las ganaderas un recurso gentico valioso, facilita el crecimiento
productivo de los hatos. Ya es muy bien sabido como el semen bovino criopreservado ha permitido a la
tcnica de inseminacin artificial llegar a muchos hatos an en regiones aisladas del pas. Tambin se
conoce como en los ltimos aos aunque sin estimativos precisos en el mbito nacional, la transferencia
de embriones bovinos criopreservados ha cobrado un espacio en la reproduccin bovina, aunque la
transferencia de embriones frescos contine siendo la tcnica prodominante. La criopreservacin de
oocitos bovinos es en Colombia todava un proceso principalmente restringido al campo investigativo en
ciencia bsica, pero puede tomar una connotacin y magnitud importante en el orden comercial por el
alto nmero de estas clulas que pueden conservarse para procesos posteriores de PIVE, y ms
cuando se desea multiplicar la gentica de animales altamente valiosos.
En el orden del desarrollo cientfico en Colombia, la criopreservacin de embriones y oocitos puede
representar el desarrollo de otras biotecnologas de vanguardia mundial. Segn varios autores la
habilidad de criopreservar oocitos y embriones bovinos efectivamente, permite aumentar la aplicacin de
95
procedimientos de ingeniera gentica, incrementar la disponibilidad de material para investigacin,

mejorar la gentica, las tecnologas y las biotecnologas reproductivas, as como las aplicaciones
comerciales, al igual que los experimentos de clonacin y transgnesis los cuales necesitan gran
cantidad de oocitos, que si pueden ser almacenados congelados seria muy interesante desde el punto
de vista logstico (4, 5, 7, 8), pues los oocitos poseen un periodo de vida corto, de manera que cuando
no son fertilizados se degeneran rpidamente (9).
6.2 CRIOPRESERVACIN DE SEMEN BOVINO
La estandarizacin en la criopreservacin de semen, hizo que la inseminacin artificial fuese ms
accesible a los productores, lo que permiti que en los aos 60 la industria lechera mejorara su valor de
cra por el reemplazo del stock gentico a travs de la IA (10).
La criopreservacin de semen ha mejorado significativamente el potencial reproductivo de los animales
machos (11), y su xito potencia las ventajas de la inseminacin artificial sobre la monta natural. El
almacenamiento a largos trminos de semen facilita su transporte, permite la cuarentena del semen y
favorece el uso extendido de germoplasma superior, an despus de la muerte del toro (12). Sin
embargo las tcnicas actualmente usadas para la congelacin, comnmente resultan en una reduccin
de la calidad del semen (11), lo cual hace ms pertinente crear conciencia en los ganaderos de la
evaluacin peridica del semen, pues es perjudicial para la eficiencia reproductiva de los hatos asumir
una buena calidad del semen, lo que generalmente conduce a un juzgamiento herrado de la fertilidad de
las vacas o del desarrollo de la tcnica de inseminacin.
El uso de semen criopreservado es una parte fundamental de la inseminacin artificial en bovinos en el
mundo, y Colombia no es la excepcin a esta realidad. Afortunadamente los espermatozoides bovinos
poseen la caracterstica de una mayor resistencia a los procesos de criopreservacin a diferencia del
esperma de otras especies domesticas (12), lo cual ha facilitado de manera dramtica la difusin de la
IA.
Los protocolos de criopreservacin desarrollados en otros pases han sido implementados en las
centrales procesadoras de semen del pas con el xito esperado. La conservacin del semen por largos
periodos gracias a esta tecnologa se realiza en el pas de una manera econmica, lo que permite a
96
muchos ganaderos aplicadores de la IA dar continuidad a sus programas de inseminacin, una vez se
realiza la inversin inicial del instrumental para la tcnica y principalmente del termo para conservacin
de pajillas. Sin embargo, son muchos los casos en que los programas de IA no son constantes por los
pobres resultados producto de deficiencias en su manejo tcnico, lo que conyeva a conservar o retomar
el sistema de monta natural. En este sentido una prctica comn en el pas es realizar a cada vaca un
nmero limitado de servicios por IA (2 o 3), realizando montas naturales posteriores al no lograr el
establecimiento de la gestacin.
6.2.1 Aspectos tcnicos de la criopreservacin de semen bovino
Inicialmente el problema ms importante a resolver en la IA, fue el desarrollo de un mtodo para
almacenar semen por largos periodos, para su transporte y su uso en el campo (13). La tcnica de
criopreservacin de semen bovino fue desarrollada y mejorada hace varias dcadas, sin embargo, a
pesar de los adelantos en el desarrollo de nuevos protocolos, en la prctica son pocos los cambios en
muchos de los aspectos tcnicos establecidos para la mayora de plantas de procesamiento de semen.
El principal desarrollo en criopreservacin de semen bovino fue dado en Estados Unidos por Phillips y
Lardy (1940), con el desarrollo de un diluyente para semen de yema de huevo-fosfato. Salisbury et al,
en 1941, mejoraron el medio con la adicin de citrato como buffer. El glicerol fue adicionado
posteriormente como crioprotector para la criopreservacin de semen de toro (13, 14). En la industria de
la inseminacin artificial, la mayora de los diluyentes para la congelacin de espermatozoides bovinos,
contienen yema de huevo, leche o componentes derivados de esas sustancias, utilies para proteger los
espermatozoides del choque trmico y/o el dao de la congelacin y descongelacin (15).
La criopreservacin en presencia de glicerol es considerada como un tratamiento moderado para el
choque trmico, donde una subpoblacin de espermatozoides sobrevive y mantiene su capacidad
fertilizante, a pesar de una reduccin en el porcentaje de clulas motiles y viables. La efectividad del
glicerol como crioprotector es atribuida parcialmente a su habilidad de prevenir las transiciones durante
el enfriamiento, por el incremento en la permeabilidad al agua y la fluidez de la membrana plasmtica
del espermatozoide (12).
97
Un diluyente formado por yema de huevo y glicerol con Tris como buffer provee una excelente
proteccin para el semen en la congelacin y descongelacin, y en la actualidad es uno de los ms
populares mundialmente para la criopreservacin de semen bovino y de muchas otras especies (13, 14).
Respecto a la dilucin del semen es importante considerar que no solo se desarrolla con los fines
descritos para la criopreservacin, sino que permite un mximo aprovechamiento del eyaculado en
cuanto a la concentracin de espermatozoides y el nmero de dosis de semen o pajillas generadas para
el comercio.
Salisbury y coinvestigadores publicaron textos con el concepto de que solo unos pocos millones de
espermatozoides son requeridos por inseminacin. Posteriormente se desarrollo la dilucin del semen,
con una reduccin del nmero de espermatozoides por inseminacin de ms de 100x10 6 a 4x106 (13,
14).
El control de algunas enfermedades venreas en la IA, se ha logrado por la adicin a los diluyentes de
la mezcla de antibiticos, penicilina, estreptomicina y polimicina B. Recientemente Silveira et al. (16),
evaluaron la eficiencia del 2-bromo-5-(2-bromo-2-nitrovinyl)-furano como sustituto de los antibiticos
comnmente utilizados en la preservacin del semen bovino, concluyendo que dicho compuesto a
concentraciones de 10g/ml posee una eficacia antimicrobiana semejante a stos.
Sin embargo, con la adicin de antibiticos los problemas de contaminacin son resueltos solo en parte,
pues enfermedades transmitidas por diferentes agentes podran diseminarse por su sobrevivencia en el
semen, pues la presencia de antibiticos no garantiza totalmente el control de la contaminacin. De
manera que el productor no debe asumir la inocuidad del semen y menos cuando se presenten
problemas reproductivos infecciosos sin la presencia de monta natural, siendo igualmente importante
considerar que una contaminacin del tracto reproductivo de las vacas puede darse por condiciones
higinicas deficientes en el desarrollo de la manipulacin para inseminacin. En el campo es factible
evaluar el semen para descartar contaminacin mediante un examen de las caractersticas
macroscpicas del mismo (olor, color, viscosidad), y mediante observacin por microscopia de la
presencia o no de agentes infecciosos como bacterias, hongos o protozoos.
La evaluacin y control de la calidad sanitaria del semen antes de su criopreservacin y despus de su
descongelacin, posee relevancia tcnica al nivel de los centros de procesamiento y empacado de
98
semen, donde se debe garantizar la inocuidad del mismo para diversos patgenos causantes de
enfermedades como brucelosis, leptospirosis, tricomoniasis, diarrea viral bovina, y rinotraqueitis
infecciosa bovna.
El uso actual de ingredientes de origen animal en los diluyentes para la criopreservacin del semen,
presenta el riesgo de la contaminacin microbiana y ha impulsado la investigacin de alternativas. Hoy
en da esta disponible una nueva generacin de diluyentes libres de productos animales, algunos
basados en soya, para la congelacin de semen bovino en protocolos de uno y dos pasos -Biociphos
plus y Bioxcell, IMV Technologies- (15).
Uno de los cambios ms importantes en el almacenamiento de semen se dio en los aos 50 con el
cambio de la congelacin en dixido de carbono slido a 79C, por la congelacin en nitrgeno liquido
a 196C, por la sobrevivencia virtualmente infinita de los espermatozoides, sin cambios biolgicos
significativos. Sin embargo se ha demostrado que el semen congelado es menos frtil que el semen
fresco (13, 14), y se requieren 8 veces ms semen bovino congelado para lograr tasas equivalentes de
fertilizacin in vivo, a las alcanzadas con semen fresco (17).
Para muchos mamferos la criopreservacin de semen no es una realidad por el alto nmero de
espermatozoides que son aparentemente infrtiles despus de la congelacin y la descongelacin. Es
generalmente aceptado que los procedimientos de criopreservacin afectan el transporte y la
sobrevivencia de los espermatozoides en el tracto reproductivo femenino. La membrana plasmtica del
espermatozoide es el primer sitio afectado por la exposicin a las bajas temperaturas. La
descongelacin afecta diferencialmente la membrana plasmtica sobre la pieza principal, la pieza media
y la cabeza, donde el dao es inevitable, afecta la habilidad del espermatozoide de interactuar con las
clulas del tracto genital femenino, y causa tremendas alteraciones en su volumen de agua celular, lo
cual confiere un estrs mecnico considerable, predisponiendo a defectos morfolgicos y perdida o
anormalidad en los cromosomas. La destruccin de la permeabilidad selectiva al calcio, incrementa sus
niveles intracelulares reduciendo la motilidad y permite la necrosis. La criopreservacin disminuye las
defensas antioxidantes del semen, por lo que se ha propuesto la inclusin en los diluyentes de tocoferol y ascorbato, por su efecto protector de la actividad metablica y la viabilidad celular del semen
bovino criopreservado (12).
99
El xito de la congelacin del semen y el desarrollo de contenedores eficientes de nitrgeno liquido,

proveen la base en la que se construye la industria actual de la criopreservacin (13, 14). La
criopreservacin del semen es una industria establecida mundialmente, particularmente en la ganadera
lechera (12).
Las facilidades para el transporte de pajillas con semen bovino, dadas por el proceso de
criopreservacin, han permitido que Colombia se beneficie de la importacin de semen de un amplio
rango de caractersticas de calidad, valor gentico y precio. Esto sin duda ha contribuido al
mejoramiento de la base gentica ganadera nacional para muchos rasgos, pero lastimosamente
tambin ha favorecido una comercializacin indiscriminada de semen, sin conocimiento de causa, de los
verdaderos aportes a nuestra ganadera, y de los perjuicios posibles por el cruzamiento indiscriminado,
el cambio gentico no planeado, y la perdida de caractersticas de los ganados criollos como
germoplasma autctono.
6.3 CRIOPRESERVACIN DE OOCITOS Y EMBRIONES BOVINOS
La criopreservacin es un proceso complejo que debe considerar el logro del almacenamiento de
clulas por un periodo indefinido, y garantizar en una proporcin adecuada la viabilidad y sobrevivencia
de stas, para los procesos vitales posdescongelacin, dados en el caso de los oocitos por el desarrollo
a embriones comnmente in vitro o incluso in vivo, y en el caso de los embriones para el desarrollo de
gestaciones postransferencia.
La congelacin de embriones mamferos fue demostrada como posible en 1972 por David Whittingham
y colegas en Londres, al reportar el nacimiento de ratones vivos despus de la transferencia de
embriones congelados y luego descongelados (18). El desarrollo de mtodos efectivos de congelacin
de embriones, ha hecho de la transferencia de embriones una tecnologa mucho ms eficiente, la cual
no depende en gran medida de la disponibilidad inmediata de vacas receptoras. La congelacin de
embriones bovinos es ahora comn, y las tasas de preez son solo ligeramente menores a las
obtenidas con embriones frescos (19).
Oocitos de muchas especies han sido cripreservados exitosamente, y mediante mtodos de
criopreservacin aplicados a oocitos maduros e inmaduros han sido reportados nacimientos en especies
100
como ratones, conejos, bovinos y humanos, al transferir blastocistos derivados de oocitos congelados o
vitrificados (7, 9, 20).
Muchos aspectos han sido estudiados en la bsqueda de superar las limitantes de la criopreservacin,
dadas por los daos causados a las clulas por las bajas temperaturas y la congelacin. En el mundo
las tasas de desarrollo de blastocistos, a partir de oocitos criopreservados siguen siendo bajas con tasas
maximas del 25% alcanzadas por Vajta et al (20), lo cual limita su aplicacin en pases como el nuestro.
La madurez, el tamao y la calidad de los oocitos son caractersticas particularmente importantes que
afectan el resultado de su criopreservacin. La criopreservacin de especimenes biolgicos causa
cambios complejos en su estructura y composicin celular, y para el caso de los oocitos, un nmero de
parmetros de su fisiologa normal han sido destacados como blancos potenciales para el dao que
puede resultar por varios mtodos de criopreservacin. Los cambios en algunos de esos parmetros
pueden contribuir a la perdida del desarrollo de competencia de los oocitos almacenados (21).
Los embriones bovinos producidos in vitro, son mucho ms sensibles a la congelacin y
criopreservacin que los embriones producidos en vacas vivas. Esto es un factor limitante serio para el
desarrollo del comercio internacional de los embriones de PIVE (18). Adems no hay que olvidar que
para el caso del in vitro adicional a la criopreservacin, las alteraciones celulares sumadas de ambos
procesos pueden facilitar la disminucin en la viabilidad embrionaria para transferencia
Los oocitos son difciles de cropreservar por su gran tamao, por su escasa rea de superficie en
proporcin a su volumen, por su alto contenido de agua y por su baja conductividad hidrulica (9, 22).
Estas caractersticas celulares han dificultado un xito tan rotundo en la criopreservacin de oocitos y
embriones, como el logrado con la criopreservacin de semen bovino, lo cual ha obligado al desarrollo
de mltiples investigaciones en muchos pases del mundo, para lo cual sera pertinente una mayor
participacin de la investigacin colombiana.
A pesar de dos dcadas de investigacin intensiva, el xito en congelacin de oocitos de animales y
humanos ha sido muy limitado, y hasta la actualidad la capacidad de desarrollo de los oocitos que se
han congelado, medida como el nmero de embriones viables por oocito congelado, se mantiene baja
comparada con la obtenida a partir de oocitos frescos. Esto debido a la alta sensibilidad de los oocitos y
101
embriones tempranos cuando son expuestos a hipotermia (5, 8, 21, 22, 23), pues el dao causado por la
congelacin es el principal obstculo para el xito de la preservacin de oocitos de mamferos (24), ya
que los oocitos son muy vulnerables a los procedimientos de criopreservacin (25), lo que se refleja en
bajas tasas de sobrevivencia, fertilizacin y desarrollo (23).
6.3.1 Aspectos tcnicos de la criopreservacin de oocitos y embriones
Durante el procedimiento de laboratorio de la criopreservacin en sus diferentes mtodos, se requiere
destreza y precisin en el manejo de los tiempos de exposicin a crioprotectores, en la operacin de
equipos, en la preparacin de medios y reactivos, y en la manipulacin del material biolgico. El
conocimiento y dominio de los procesos de produccin in vitro de embriones facilitan el aprendizaje de la
criopreservacin para los profesionales que se dediquen a realizar este procedimiento, el cual sin duda
alguna debe incrementarse en Colombia, ya sea para criopreservar embriones producidos in vivo para
transferencia tradicional o producidos por tcnicas in vitro.
La criopreservacin tanto de oocitos como de embriones involucra cinco pasos crticos: 1) Exposicin de
las clulas a los crioprotectores; 2) Congelacin de especimenes a temperaturas por debajo de los 0C;
3) Almacenamiento a la temperatura de transicin de cristal del agua por debajo de -130C; 4)
Calentamiento y descongelacin; y 5) Dilucin y remocin de crioprotectores antes de la incubacin
(22).
Los oocitos pueden ser criopreservados como oocitos desnudos individuales o como oocitos rodeados
por clulas del cmulus. La seleccin del mtodo a utilizar depende de la etapa de maduracin nuclear
del oocito antes de la criopreservacin, por ejemplo los oocitos en metafase II, son comnmente
denudados antes de congelar, mientras es ms apropiado congelar los oocitos en vescula germinal
dentro de sus clulas del cmulus para una maduracin in vitro optima despus de descongelados (21).
El principio bsico de la proteccin durante la criopreservacin es reemplazar el agua del citoplasma por
algn crioprotector (26). Las clulas de mamferos pueden ser congeladas exitosamente con la adicin
al medio de cultivo de sustancias crioprotectoras, en concentraciones optimas de 1 a 1.5 M. Los
crioprotectores poseen un bajo peso molecular que permite su paso por la membrana celular, son
totalmente solubles en agua, y se definen como drogas de accin inespecfica que permiten a las
102
clulas sobrevivir a la congelacin del agua, a travs de diferentes mecanismos, sin actuar sobre
receptores, enzimas o genes. Especficamente disminuyen la temperatura a la cual se forman los
ncleos de hielo en la congelacin, favoreciendo la formacin de agua superfra sin que se inicie la
formacin de cristales de hielo. Los crioprotectores adems causan deshidratacin celular previniendo la
formacin intracelular de cristales de hielo (8, 9, 21-22). En clulas no protegidas, se forma hielo
intracelular al ser enfriadas a bajas temperaturas bajo 0 C, el hielo sufre un crecimiento incontrolado y
forma grandes cristales que atentan contra la integridad de la clula (26).
Segn su capacidad de atravesar la membrana plasmtica los crioprotectores pueden ser clasificados
en permeables o impermeables. Los crioprotectores permeables por su bajo peso molecular, son
capaces de atravesar la membrana plasmtica de forma activa o pasiva, entre estos se encuentran
alcoholes (glicerol, etilenglicol, propilenglicol o sorbitol), aminas (acetamida, betana, formamida,
glutamina, lisina o taurina), siendo el etilenglicol el ms utilizado en vitrificacin por su baja toxicidad y
rpida difusin por la membrana plasmtica. Los crioprotectores no permeables no atraviesan la
membrana plasmtica por su alto peso molecular y su compleja estructura, elevan la presin osmtica
disminuyendo la cantidad requerida de crioprotector permeable y su toxicidad, favoreciendo la
deshidratacin de la clula. Dentro de este grupo se encuentran azucares (glucosa, fructosa, sacarosa,
treolosa, lactosa o sucrosa 0.1-0.5 M), macromolculas (albmina), o polmeros sintticos (ficoll,
dextrano, polivinilpirrolidona, polivinilalcohol o polietilenglicol) (3, 4, 8, 21, 22, 27).
Desde la introduccin del glicerol como agente crioprotector, y el subsecuente descubrimiento y uso
como crioprotector del dimetilsulfxido (Me 2SO o DMSO), muchas clulas y tejidos han sido congelados.
El etilenglicol (EG) por su masa molecular (62.07 uma) tiene mayor capacidad de atravesar la
membrana celular, adems presenta baja toxicidad para embriones mrinos y combinado con el DMSO
arroja excelentes resultados (26).
Fuku et al. (28), expusieron oocitos bovinos en vescula germinal o madurados in vitro, a soluciones
concentradas de crioprotectores (2 M DMSO, 1 M acetamide, 3 M propanediol) por 1.5 o 5 minutos,
encontrando que los oocitos en vescula germinal tuvieron reducidas tasas de clivaje y formacin de
blastocistos, adems de un incremento en el porcentaje de alteraciones en sus organelas. Mientras los
oocitos madurados expuestos por 5 minutos, tuvieron una reducida tasa de fertilizacin, y los oocitos
expuestos por 1.5 minutos, no mostraron diferencias respecto al control. Observaciones por las cuales
103
los autores concluyen que los oocitos en vescula germinal son ms sensibles a los crioprotectores que
los oocitos madurados in vitro.
Es posible cropreservar oocitos y embriones de algunas especies de mamferos mediante los
protocolos de congelacin lenta, congelacin rpida y vitrificacin (8). En la tcnica de congelacin lenta
los principales objetivos son equilibrar las clulas con los crioprotectores y minimizar la formacin de
grandes cristales de hielo (25), la congelacin lenta busca mantener el balance entre la velocidad de
enfriamiento (0.2-0.3C/min), la velocidad de deshidratacin, y la velocidad de formacin de ncleos de
hielo, de manera que se produzca la penetracin de un crioprotector en la clula, producindose un
equilibrio osmtico y disminuyendo la formacin de cristales de hielo (8, 21, 29).
El mtodo de produccin in vitro de embriones influencia la morfologa de los blastocistos resultantes, lo
cual afecta su habilidad de resistir la criopreservacin, lo cual fue demostrado en un estudio de Fair et
al. (30), donde adems se observ que el equilibrio de los embriones en 10% de glicerol en PBS ms
10% de suero de ternero recin nacido, causa cambios morfolgicos en blastocistos antes de la
criopreservacin.
El enfriamiento lento reduce la posibilidad de que se formen cristales intracelulares de hielo a razn de
que el hielo que se forma en el espacio extracelular extrae (absorbe) el agua intracelular
(deshidratacin), hasta dejar tan poca agua libre dentro de la clula que solamente pequeos cristales
de hielo, no lesivos, pueden formarse (26).
Despus de la exposicin a los crioprotectores, los protocolos de congelacin lenta usualmente usan
congeladores programables automticos, mediante los cuales la temperatura es descendida lentamente
(0.5 a 2C/min), y se inicia el crecimiento de cristales de hielo (seeded) en la solucin, lo que en las
pajillas se da a -7C. La congelacin continua a 0.3 a 0.5C/min hasta aproximadamente 40C, luego a
10C/min hasta 150C, y finalmente la pajilla es transferida a nitrgeno liquido a 196C para
almacenamiento (21, 26).
La iniciacin de la cristalizacin puede ser inducida tocando la pared de la pajilla (si es lo
suficientemente delgada) con unas pinzas u otro pequeo objeto (placa, esptula, navaja, etc.) enfriado
a la temperatura del nitrgeno lquido. Este proceso de enfriamiento localizado se conoce como seeding,
104
el cual se realiza cuando la temperatura de enfriamiento se encuentra entre 6 y 9 C, interrumpiendo

de paso el superenfriamiento. La nucleacin del glicerol puede ser inducida por seeding (26).
Figura 12. Montaje de embriones u oocitos en pajillas antes de la congelacin lenta.
Adaptado de Guignot (2005).
La congelacin rpida y ultrarrpida requieren la presencia de una alta concentracin de crioprotectores

(5 a 7 M), por lo cual para reducir la toxicidad de las soluciones crioprotectoras, se realiza
suplementacin con azucares y macromolculas. Los azucares adems eliminan rpidamente el agua
de las clulas y favorecen el ingreso de los crioprotectores, permitiendo sumergirlas directamente en
nitrgeno liquido a -196C (congelacin ultrarrpida o vitrificacin) o en vapores de nitrgeno por
congelacin rpida (29, 31-33). Para la vitrificacin de oocitos, autores reportan que las tasas de
supervivencia para bovinos (26) y humanos (21) son cercanas al 70% (ver Tabla 4).
La vitrificacin corresponde a una tcnica de congelacin ultrarrpida basada en el contacto directo
entre la solucin de vitrificacin que contiene agentes crioprotectores, y oocitos o embriones
(exposiciones cortas a altas concentraciones de crioprotectores de aproximadamente 4-6 mol/L) con el
nitrgeno liquido, producindose una solidificacin para formar un estado vtreo o similar a cristal, sin
ninguna formacin de cristales de hielo durante el enfriamiento a tasas muy rpidas (tasa de
congelacin >2000C/min, hasta 11000 a 14000C/min) y permaneciendo en este estado durante todo el
proceso de cambio de temperatura (8, 9, 21, 25, 31, 32).
105
Tabla 4. Tasas de sobrevivencia despus de la criopreservacin de oocitos.

Adaptado de Picton (2002).
REFERENCIA
Porcu et al. 1997
Tucker et al. 1998
Polak de Fred et al. 1998
Young et al. 1998
Tucker et al. 1998
Porku et al. 2000
Kulesshova et al. 1999
Yoon et al. 2000
Fabbri et al. 2001
TIPO DE CPAS
PR
PR
PR
PR
PR
PR
EG + S
EG + S
PR + S
MTODO
Lenta
Lenta
Lenta
Lenta
Lenta
Lenta
Vitri
Vitri
Lenta
% SOBREVIVENCIA
33
24
30
89
23
54
65
63
54
CPAS: Crioprotectores, PR: 1,2 Propanediol, EG: Etilenglicol, S: Sucrosa, Vitri: vitrificacin.
La velocidad de congelacin es uno de los principales determinantes de la supervivencia celular durante

la criopreservacin. La congelacin muy lenta puede causar la muerte celular por su exposicin a
soluciones concentradas, mientras la congelacin muy rpida puede causar muerte celular por
formacin de cristales de hielo (22). El enfriamiento debe ser por 25 a 90 segundos (26).
Mtodos de congelacin usando tasas bajas de congelacin controlada, han sido los ms comnmente
usados para congelar oocitos (ver Tabla 5). Sin embargo mediante la criopreservacin de oocitos
bovinos por los procedimientos de congelacin lenta convencional, el desarrollo de blastocistos desde
oocitos congelados y descongelados, ha sido baja, usualmente menor al 8% de todos los oocitos
cripreservados, tal como lo demuestran reportes del 8% de Mogas et al. (35), 5% de Otoi et al. (4), y
3% de Lim et al. (36), con un desarrollo de embriones de 2 clulas usualmente menor al 13% de los
oocitos bovinos fertilizados in vitro (22).
Estudios sugieren que el mtodo de vitrificacin podra ser superior al procedimiento de congelacin
lenta convencional para criopreservacin de oocitos madurados in vitro de bovinos, humanos y otras
especies animales (34, 37).
La vitrificacin especialmente usando tasas muy altas de enfriamiento en oocitos suspendidos en
volmenes extremadamente pequeos, de varios aditivos crioprotectores, es vista como el mtodo ms
apropiado (7). Nuevos mtodos de vitrificacin pueden maximizar la tasa de congelacin, manteniendo
la viabilidad de las clulas, previniendo el estrs mecnico, facilitando la manipulacin durante la
criopreservacin y la recoleccin (38). Sin embargo los protocolos de vitrificacin pueden causar un
106
choque osmtico severo y puede comprometer la sobrevivencia celular post-descongelacin y su

potencial de desarrollo (21).
Tabla 5. Resultados de congelacin de oocitos de animales domsticos.
Fuente: Molina et al. (2004).
REFERENCIA
Kubota et al. 1998
Lim et al 1999
Asada y Fukui 1990
Nakagata et al.
2000
ESPECIE
Vacuno
Vacuno
Vacuno
Ratn
PROTOCOLO
SV
Lenta
47-84%
Lenta
62-86%
Lenta
Rpida
77-91%
SM
58-60%
33-54%
16-23%
71-83%
BL
NV
4%
31-43%
SV: Supervivencia. SM: Segmentacin. BL: Blastocisto in vitro. NV: nacidos vivos
Los ndices de supervivencia de oocitos vitrificados en vescula germinal (pequeos, material gentico
en diplotene de profase I dentro de un ncleo, no poseen un huso) son todava muy bajos en el vacuno,
lo que podra ser debido al dao de las membranas plasmticas o la comunicacin intracelular entre el
oocito y las clulas del cmulus, perjudicando as su posterior maduracin. Existen trabajos para la
congelacin de estadios intermedios de desarrollo, como vescula germinal rota, o entre metafase I y II
(7, 8, 22).
Martins et al. (39), al criopreservar por vitrificacin oocitos bovinos inmaduros, encontraron que la
combinacin de un tiempo de equilibrio de 5 minutos, una solucin de equilibrio con 20% de etilenglicol,
y una solucin de vitrificacin con 40% de etilenglicol y 1 M de sucrosa, produce en la maduracin in
vitro, las ms altas tasas poscongelacin de oocitos en metafase II (44.5%), siendo sin embargo menor,
a la tasa para oocitos madurados control no vitrificados (74.6%).
Segn Souza et al. (40), los protocolos utilizados para la vitrificacin (usando etilenglicol asociado con
trealosa y polivinilpirrolidona), no son recomendados para la criopreservacin de oocitos bovinos
inmaduros, al alcanzar bajas tasas de maduracin, fertilizacin y clivaje, y no lograr mrulas o
blastocistos a partir de dichos oocitos cripreservados.
Martino et al. (32), reportan que 10 a 15% de oocitos bovinos maduros cripreservados por congelacin
ultrarrpida en la presencia de etilenglicol son viables para desarrollarse a blastocistos. Tasas mximas
de blastocistos del 25% a partir de oocitos madurados in vitro, vitrificados en metafase de la meiosis II,
fueron reportadas por Vajta et al. (20). Estos trabajos indican que la congelacin ultrarrpida o
107
vitrificacin puede ser una tcnica ms prctica que el procedimiento de congelacin lenta convencional.
Adems otra gran ventaja de esta tcnica es que no requiere equipos de congelacin costosos o
sofisticados, y puede realizarse de manera sencilla (7, 8).
Para la vitrificacin el tamao de la muestra debe ser lo ms pequea posible para aumentar la
velocidad de congelacin. Para dicho fin se han descrito diversos soportes fsicos para la vitrificacin
como open pulled straw, closed pulled straw, flexipet-denuding pipette, microgotas, gradillas de cobre de
microscopia electrnica, sistema hemistraw, nylon mesh, y cryoloops. Mientras para disminuir el choque
osmtico y la toxicidad se han utilizado crioprotectores menos txicos, combinacin de crioprotectores, o
crioprotectores por etapas (8, 20, 29, 33, 41).
Figura 13. Montaje de embriones u oocitos en pajillas antes de la vitrificacin en pajilla de 0,25ml.
El uso de la tcnica Open Pulled Straw (Pajilla abierta y estirada), ha permitido aumentar la velocidad
de los cambios de temperatura, lo cual ofrece ciertas ventajas para la congelacin, como son la
disminucin de las concentraciones de los crioprotectores utilizados, con los consecuentes menores
efectos osmticos y txicos, adems del paso ms rpido por la zona de temperatura peligrosa, lo que
produce menores daos por enfriamiento (42).
La tcnica OPS de vitrificacin permite las velocidades de enfriamiento ms rpidas, del orden de
20.000 C/min, lo cual es posible gracias al reducido volumen vitrificado (2l), que permite que los
embriones u oocitos sean introducidos a la pajilla por capilaridad. Son utilizadas pajillas clsicas de 0.25
ml, las cuales son estiradas (43) -ver Figura 15-. Posteriormente las pajillas se sumergen en etanol al
70% por una noche y luego se dejan secar. El sistema OPS acelera el tiempo de congelacin y
descongelacin hasta 10 veces sobre pajillas convencionales (26). La vitrificacin por OPS es un
mtodo rpido y efectivo para cropreservar embriones bovinos (20, 44).
108
El crioloop usado como un recipiente en la vitrificacin, es un delgado bucle (loop) de nylon usado para
sostener una pelcula de crioprotector que contiene los oocitos, y luego es directamente inmerso en
nitrgeno lquido (25) -ver Figura 16-.
Figura 14. Open pulled straw (OPS), pajilla de 0,25 ml.
a. Gota de 2 l de crioprotector con los embriones u oocitos. b. Montaje de la gota por capilaridad en la pajilla y su paso
directo al nitrgeno liquido.
Figura 15. Criopreservacin en crioloop.

A. Las clulas son colocadas en una pelcula de crioprotector formada en el anillo del crioloop. B. El anillo es puesto
directamente en nitrgeno lquido y almacenado en un criotubo.
109
Imagen 11. Oocitos bovinos puesto en un crioloop de nylon.

Fuente: Luster (2004).
Los protocolos de desvitrificacin deben tratar de disminuir la probabilidad de recristalizacin mediante

una adecuada transferencia trmica. El mtodo de desvitrificacin ms comn para oocitos es un
mtodo rpido y directo (8, 22). Durante la descongelacin el rpido influjo de agua a la clula, como el
ablandamiento del entorno extracelular, pueden causar un choque osmtico, cuya sensibilidad por la
clula es dependiente de la permeabilidad de la clula a el agua y los solutos, y que puede ser reducido
por el uso de un buffer osmtico, no toxico e impermeable como la sucrosa. La tasa de calentamiento
ptima depende de los crioprotectores y su concentracin, al igual que la tasa de congelacin utilizada
(21).
Para descongelar una muestra vitrificada, se sumerge el soporte de vitrificacin en un medio a
temperatura fisiolgica (37C), obteniendo velocidades de calentamiento entre 3000 a 8000 C/minuto,
dependiendo del soporte utilizado (8). Los oocitos son puestos en una solucin para calentamiento entre
20C a 37C, para posteriormente rehidratarlos y remover los crioprotectores utilizados (22).
Los embriones en pajillas pueden ser descongelados en un bao mara, al igual que el semen, y su
contenido ser depositado directamente dentro del tero de una vaca receptora, como ocurre en la IA. No
es necesario el uso de un microscopio o de procedimientos complejos de dilucin, y los crioprotectores
dejan el embrin en el tero sin sufrir de estrs osmtico (19).
Una posible desventaja de algunos mtodos de vitrificacin, puede ser el contacto directo de los oocitos
o embriones con el nitrgeno lquido contaminado con virus u otros microorganismos. Se ha sugerido
110
que dicha contaminacin puede ser prevenida adoptando precauciones apropiadas de esterilidad, y
congelando pajillas OPS en nitrgeno lquido filtrado (18).
Como factores preocupantes en la criopreservacin de oocitos, diferentes parmetros han sido tomados
en cuenta: caractersticas celulares, permeabilidad a los crioprotectores, y toxicidad, temperatura y
tiempo de exposicin a los crioprotectores. Otros factores posiblemente influencian la supervivencia de
oocitos de mamferos despus de la criopreservacin, entre ellos est la sensibilidad de las estructuras
celulares al enfriamiento y congelacin, el contenido de lpidos, y la etapa meitica del oocito, siendo
mayor el dao por criopreservacin en oocitos en vescula germinal, ms sin embargo los oocitos en
meiosis II son vulnerables a la crioinjuria, porque su huso meitico en el cual estn alineados los
cromosomas es altamente sensible a la temperatura (5, 21).
Estudios sugieren que alta concentracin y variable distribucin de lpidos intracelulares pueden inducir
la nucleacin intracelular, conocida como el primer evento en la formacin de cristales de hielo (32), y
son asociados con la alta sensibilidad a la criopreservacin. La presencia de suero en el medio de
cultivo ha sido referido como responsable de una excesiva acumulacin de lpidos por un incremento en
la toma de lpidos desde el medio y/o por un trastorno en el metabolismo mitocondrial (45-47). La
tolerancia a la congelacin del huso mittico y otras organelas de oocitos bovinos madurados in vitro,
puede ser mejorada por la polarizacin de gotas lipdicas citoplasmticas por centrifugacin antes de la
criopreservacin (4).
Muchos reportes han sugerido que la criopreservacin afecta la membrana (ruptura o fusin), el
citoesqueleto (disolucin de microtbulos y dao de la actina), las protenas y enzimas (deshidratacin y
perdida de la funcin), la organizacin de los grnulos corticales, causa alteraciones y fracturas en las
organelas intracelulares y la zona pelcida, entre otras alteraciones generales como apoptsis,
toxicidad, produccin de radicales libres, falla en el clivaje, activacin partenogentica y afeccin del
metabolismo y del balance del calcio. Tales daos son provocados por la formacin de cristales de hielo,
los choques osmticos, el efecto toxico de los crioprotectores, la concentracin de electrolitos
intracelulares y el enfriamiento. Tambin han sido observadas anormalidades cromosomles despus
de la criopreservacin de oocitos de humano y ratn (3, 5, 7, 22, 48, 49). La disrupcin del huso
meitico y los cromosomas podra conducir a anormalidades genticas en la progenie (9, 23).
111
Kathryn et al. (50), encontraron que la congelacin puede incrementar la ocurrencia de anormalidades
citolgicas. En su estudio menos del 31% de los oocitos congelados y descongelados posean un
arreglo cromosmico normal (vs. un 90% del control). Solo 7 a 14% de estos oocitos tuvieron husos
normales (vs. 59 a 71% del control). La distribucin normal de filamentos de actna fue menor al 30%
(vs. 62 a 89% del control). Segn los autores, estos resultados indican que los pasos del procedimiento
de congelacin tradicional, causan alteraciones irreversibles en mltiples componentes citolgicos de los
oocitos bovinos.
La obtencin de oocitos a partir de ovarios provenientes de plantas de faenado, se relaciona con la
tolerancia a la congelacin, al aspirar oocitos de folculos de diferentes tamaos, al igual que la
obtencin de oocitos de diversos tamaos, factores relacionados con la criotolerancia (7).
El ambiente de cultivo embrionario posfertilizacin, tiene una influencia significativa en la calidad de los
blastocistos bovinos resultantes, medido en trminos de su criotolerancia despus de la vitrificacin (51).
Massip (7) sugiere como factores para mejorar la criopreservacin de oocitos: 1) La criopreservacin
solo de oocitos competentes, en lo posible ovulados; 2) cropreservar oocitos provenientes de grandes
folculos, al contener oocitos por su mayor dimetro, ms competentes; 3) cultivar oocitos durante
arresto meiotico inducido por sustancias como butirolactona y roscovitina, para mejorar su desarrollo de
competencia post-fertilizacin; 4) Remover parcialmente las clulas del cmulus, varias horas despus
de iniciada la maduracin in vitro, facilitando el ingreso de los crioprotectores, pero manteniendo el papel
de soporte de estas capas celulares en la maduracin final, fertilizacin y desarrollo; 5) Penetracin
rpida de crioprotectores para minimizar el choque osmtico y asegurar la proteccin de la clula; 6)
Centrifugacin previa de los oocitos a cropreservar, para eliminar las gotas lipdicas en parte
responsables de la criosensibilidad; y 7) Incrementar las tasas de congelacin durante la zona de
temperatura ms peligrosa (entre 15C y 15C).
Las estrategias de criopreservacin de oocitos an requieren el desarrollo de gran trabajo para mejorar
las tasas de sobrevivencia y el potencial de desarrollo de los oocitos congelados y descongelados (21).
Son muchos los aspectos a considerar cuando se utiliza la criopreservacin para conservar materiales
biolgicos como oocitos y embriones. En la actualidad est en auge la investigacin en este sentido, en
112
la bsqueda de resolver los problemas de eficiencia del proceso, siendo muchos los logros alcanzados
durante los ultimos aos. La criopreservacin ms que la aplicacin de un protocolo especifico requiere
la sincronia de muchos procesos, donde son claves aquellos que influyen y determinan las
caractersticas y la calidad de las clulas a criopreservar, de manera que el xito en estos
procedimientos difcilmente se alcanza de manera inmediata, y requiere en los laboratorios donde se
instaure su aplicacin, un proceso de estandarizacion y ajuste muy detallado. Lo cual se enfatiza pues
en Colombia, a parte de algunas empresas, los reportes en esta disciplina suelen ser de orden aislado.
6.3.2 Actualidad de la criopreservacin de oocitos y embriones en Colombia
En Colombia son escasos los reportes de trabajos en el campo de la criopreservacin de oocitos y
embriones bovinos. Serrano et al. (52), del Grupo Biognesis de la Universidad de Antioquia,
compararon los mtodos de criopreservacin en embriones bovinos, de congelacin lenta y vitrificacin,
respecto a su efecto en la calidad (morfologa y nuclearidad) de los embriones producidos in vitro.
Reportando como resultados, que no existi diferencia entre las tcnicas de criopreservacin (p>0.05)
en ninguna de las fases, y que ms que el mtodo de criopreservacin, las alteraciones celulares
observadas en los embriones estudiados, podran deberse a caractersticas propias de los embriones
producidos in vitro.
Borrero et al. (53), realizaron una investigacin en Antioquia, para la evaluacin pre y
posdescongelacin, y de las tasas de preez despus de la transferencia de embriones de ganado
Holstein congelados en etilenglicol. Los autores reportaron como resultados, la perdida de calidad
embrionaria a la descongelacin, evidenciada en las tasas de preez (34% para calidad 1; 10% para
calidad 2; 0% para calidad 3).
En el mbito comercial en Colombia, empresas como Ctelca, Vitrogen y CGR, reportan la transferencia
de embriones criopreservados, despus de produccin in vivo o in vitro de los mismos. La difusin de
los embriones criopreservados en Colombia es exclusiva a pocas explotaciones principalmente por los
costos y por la poca difusin de la transferencia de embriones en nuestro pais.
113

La criopreservacin de semen bovino es una empresa establecida en Colombia, sin embargo su nivel de
difusin al igual que el de la tcnica misma de IA, es apenas para una proporcin menor de las
empresas ganaderas del pas. La criopreservacin de embriones y oocitos en Colombia estn sujetos a
los avances mundiales en este sentido, que tal como se expone en este captulo son dificultosos por la
naturaleza misma de estas clulas, aunque se han logrado avances valiosos gracias al alto nivel de
investigacin mundial.
Conocidas las dificultades de los esquemas transferencia de embriones tradicional, la transferencia de
embriones criopreservados para un pas como Colombia, puede ser una alternativa viable desde el
punto de vista econmico y prctico, siempre y cuando se d el crecimiento en escala de esta
biotecnologa, y teniendo en cuenta que la transferencia de embriones criopreservados no difiere mucho
en su tcnica respecto a la transferencia de embriones frescos, y de la misma inseminacin artificial. Lo
importante es garantizar mediante un protocolo de sincronizacin del ciclo estral, la factibilidad de
implantacin del embrin transferido. Este proceso obvia la necesidad de trabajo con grupos de
animales con sincronizaciones paralelas como se da en la transferencia de embriones tradicional, y
reduce en gran medida la manipulacin de animales en condiciones de campo cuando lo embriones
provienen de produccin in vitro. Esto facilita en gran medida el desarrollo del proceso, por lo que para
las posibilidades de masificacin de la transferencia en Colombia, podra ser una alternativa ms
adecuada.
Sin duda la razn ms importante para criopreservar material biolgico como oocitos y embriones
bovinos, est en la conservacin de un material gentico valioso que puede diseminarse para el logro de
avances productivos en las industrias ganaderas. La gentica criopreservada en lo posible debe ser
reconocida por su valor, gracias a estudios de orden gentico, cuestin que en nuestro pas difcilmente
se da. Tambin es importante considerar la criopreservacin de material gentico de animales criollos,
que para el caso de razas de ganado, representa un valor incalculable por sus caractersticas adquiridas
durante cientos de aos de adaptacin, algunas de las cuales podrn ser introducidas a las razas
comerciales y altamente productoras actuales, ya sea mediante cruzamientos o procedimientos de
ingeniera gentica molecular.
114
Aunque los costos de la criopreservacin pueden incrementar el precio final de los embriones ofrecidos
a los ganaderos, las ventajas tcnicas que ofrece el uso de embriones criopreservados tales como las
facilidadades para su transporte, almacenamiento y transferencia, justifican la inversin, mas an en
zonas de poca accesibilidad, donde realizar montajes completos para transferencia tradicional puede ser
an ms complejo.
El crecimiento del comercio internacional de embriones congelados puede ser otro factor que impulse su
volumen de transferencia en Colombia. Los tratados de libre comercio (TLC) suscritos entre pases de la
regin, sin duda sern un aspecto que promueva el comercio de material biolgico a costos ms
asequibles para los ganaderos. Donde para el caso del TLC entre Colombia y Estados Unidos, los
acuerdos realizados, favorecen la transferencia y adopcin de los progresos de las ciencias y la
biotecnologa (54), para lo cual, Colombia incluso podra pasar de ser un importador de gentica bovina
a un exportador a los mercados internacionales, ya que el pas cuenta con ms de 10 centros
especializados para la produccin de pajillas y el manejo de embriones (55).
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117
CAPTULO VII:
SEXAJE DE ESPERMATOZOIDES Y EMBRIONES BOVINOS
7.1 INTRODUCCIN
Como es conocido, muchos de los sistemas productivos ganaderos en el mundo son especializados en
la produccin de leche o carne. Para estas ganaderas el sexo de las cras resultantes de sus
programas de reproduccin es un factor fundamental de orden productivo y econmico, pues sus
esquemas productivos se basan principalmente en la explotacin de uno de los dos sexos, por lo cual
un porcentaje elevado de cras del sexo contrario al deseado, representa perdidas de magnitud
significativa. En Colombia este esquema se cumple en mayor medida para las explotaciones de lechera
semintensiva e intensiva donde la obtencin de cras hembras es la prioridad por su valor en la
produccin de leche, mientras un macho a no ser que sea destinado a la reproduccin, representa un
ingreso mnimo para la explotacin que no justifica las inversiones econmicas y de tiempo que
constituye una vaca durante su etapa de gestacin. En la ganadera crnica colombiana aunque la
mayora de explotaciones prctican la ceba de ambos sexos, es conocida la preferencia por los machos
por sus mayores ganancias de peso y rendimientos en canal gracias a una actividad anablica ms
intensa. Adems cebas especializadas engordan solo ganado macho aprovechando en mayor medida
tales caractersticas. Por estas razones la seleccin del sexo es un factor que puede inflluir
positivamente en la rentabilidad de una ganadera y que instaurado en un futuro como un procedimiento
generalizado para el semen y los embriones transferidos a las vacas tanto en Colombia como en el
mundo, permitira grandes avances productivos y rentables. Canterelli y Vera (1), aseguran que la
seleccin del sexo tiene un valor econmico significativo en la produccin de leche y de carne, en los
cuales la productividad de los sistemas, son favorecidos por la progenie de uno de los dos sexos.
Los avances en la biotecnologa son centrales para el mejoramiento de la eficiencia en la reproduccin y
produccin ganadera general. Un ejemplo actual que ilustra la importancia del desarrollo de la
biotecnologa, son los procedimientos que permiten a los productores ganaderos determinar el sexo de
la progenie para animales importantes en la agricultura (2).
118
A partir de la dcada de los aos 80, el perfeccionamiento y la difusin de las tcnicas de IA y TE en los
programas de mejoramiento animal, como una demanda de produccin de los sistemas ms eficientes,
condujeron al desarrollo de tcnicas de seleccin del sexo, mediante el sexado de espermatozoides y
embriones preimplantatorios de las especies de inters zootcnico (1).
El sexaje se hace particularmente valioso con los sistemas de lneas maternales y lneas terminales que
han surgido recientemente en la produccin animal. La ineficiencia siempre ha sido un dilema con
caractersticas limitadas por el sexo como la produccin de leche, la produccin de madres para la
siguiente generacin, y la obtencin de machos productores de carne con crecimiento ms eficiente. De
manera que la seleccin del sexo tiene un gran potencial para el incremento en la eficiencia,
favoreciendo los mercados asociados con la agricultura animal (3), y provee una ventaja econmica por
medio de la ganancia gentica y la optimizacin del manejo de la granja (4).
La importancia del sexaje ha sido probada en algunos paises del mundo. En Nueva Zelanda, Australia,
Holanda, Canad, Francia, El Reino Unido, Japn y los EE.UU se viene aplicando ya esta nueva
tecnologa reproductiva, la cual combinada con la produccin in vitro de embriones, en el caso de Nueva
Zelanda, genera un incremento del 16% en la ganancia gentica anual (5).
Colombia no debe ser ajena a la introduccin y difusin de estas biotecnologas pues permiten aportes
en ganancia gentica incluso mayores que otras biotecnologas reproductivas. El hecho de influir en la
proporcin natural de sexos, al nivel de producciones ganaderas aumenta en gran medida el nmero y
reduce los costos de vacas destinadas como reemplazos, y permite la reduccin del intervalo
generacional al favorecer una mayor proporcin de recambio gentico, por la mayor disponibilidad de
cras hembras que generen novillas para la realizacin de reemplazos con mayor prontitud. En otras
palabras mediante la reduccin del promedio de vida til de las hembras reproductoras en los hatos.
7.2 SEXAJE DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS
Uno de los ms dramticos avances tcnicos en los aos recientes, es el sexaje del semen por
cuantificacin de DNA usando instrumentacin de citometra de flujo, desarrollada por Gledhill en 1985,
y mejorada por Johnson y Seidel en 1989 (6, 7). La tecnologa actual de sexaje de espermatozoides, fue
119
desarrollada al final de los aos 1980, con orgenes de desarrollo para el uso de esta tecnologa en
clasificadores de clulas de alta velocidad producidos en los aos 1970 (2)..
Los procedimientos usados inicialmente separaban los espermatozoides X y Y de manera efectiva, pero
mataban las clulas espermticas, haciendo el procedimiento imprctico. Un mejoramiento importante a
este procedimiento, realizado por Johnson y colaboradores en 1989, fue lograr que el sistema
funcionara sin matar o causar dao severo a los espermatozoides (8)..
7.2.1 Aspectos tcnicos del sexaje de espermatozoides
La tecnologa de sexaje de espermatozoides Beltsville es actualmente el nico medio efectivo para
alterar la proporcin de sexo de la descendencia en la ganadera. Est permite producir progenie con un
sexo predeterminado en bovinos, porcinos, ovejas y animales de laboratorio. El mtodo es basado en la
separacin por citometra de flujo de espermatozoides que llevan cromosomas X y Y, segn su
diferencia en el contenido de ADN (que puede ser entre un 3 a 7 %). El proceso involucra el tratamiento
de los espermatozoides con un fluorocromo de unin al ADN denominado Hoechst 33342, de manera
que la citometra de flujo los clasifique en poblaciones separadas X y Y, a una velocidad de 5 a 6
millones de espermatozoides por hora (2, 9).
La esencia del citmetro de flujo es que las clulas son teidas con una sonda fluorescente, y luego son
forzados a pasar a travs de un canal de vidrio en una suspensin liquida. Cuando las clulas pasan a
travs del punto focal de un haz lser, la luz lser causa que la sonda fluorescente emita la luz
fluorescente de un cierto color (10).
La parte del sistema que separa las clulas funciona como sigue: Cuando la corriente de fluido sale del
citmetro de flujo, sta es fraccionada en pequeas gotas por un vibrador, formando alrededor de
70,000 a 80,000 gotas por segundo. Aproximadamente un tercio de las gotas contienen un
espermatozoide y alrededor de dos tercios estn vacas; unas cuantas gotas contienen dos
espermatozoides (8).
La fluorescencia de cada espermatozoide teido, es recolectada con un tubo fotomultiplicador, y la
informacin cuantitativa es transmitida a un sistema computarizado, el cual asigna una categora a cada
120
espermatozoide de acuerdo con su intensidad de fluorescencia (11). El espermatozoide X al ser de

mayor tamao, emite una mayor cantidad de luz fluorescente, la cantidad de emisin de luz para cada
espermatozoide es medida, y a cada espermatozoide se le asigna una carga (12). Si la computadora
detecta una gota conteniendo un espermatozoide X, una carga elctrica positiva se agrega a la gota; si
la gota contiene un espermatozoide Y se agregar una carga negativa, y si la gota no contiene
espermatozoides, dos espermatozoides, un espermatozoide daado o un espermatozoide que no se
puede sexar, no se le agrega carga elctrica alguna (8).
Conforme las gotas caen al salir de la boquilla del citmetro de flujo (a una velocidad de
aproximadamente 90 Km/hora), pasan a travs de un campo magntico que es positivo en un lado y
negativo en el otro. En virtud de que los polos opuestos se atraen, las gotas con carga positiva
(conteniendo un espermatozoide X) se mueven en direccin del lado negativo del campo; aquellas con
carga negativa se movern hacia el lado positivo del campo, y las que llegan sin carga continuarn su
camino sin desviarse (8). El plato deflector separa la corriente en tres fracciones en tres tubos de
ensayo: los espermatozoides cargados positivamente o X, los cargados negativamente o Y, y los no
cargados o no identificados que pasan a la parte central como desperdicio (12) -ver Figuras 14 y 15.
En la prctica, cerca de un 20% de los espermatozoides terminan colectados en la fraccin X, 20% en la
fraccin Y, y 60% son espermatozoides daados o que no pudieron ser sexados por alguna razn u otra
(8).
Figura 16. Estructura de un citmetro de flujo.
Fuente: SCSA Diagnostics (2006).
121
El clasificador de espermatozoides de velocidad convencional (Epics V y 753; Beckman-Coulter), posee

un sistema de presin de 844 g/cm3, con una tasa de clasificacin de 8000 espermatozoides / segundo,
mientras el clasificador de alta velocidad (HiSS de Peters et al., 1985) es caracterizado por presiones de
hasta 200 psi, y clasifica hasta 20.000 espermatozoides / segundo (2).
El ADN del espermatozoide es excesivamente compacto y su cabeza en el caso de animales de granja,
es en forma de remo. Lo cual junto con el hecho de poseer motilidad y una cola larga, hacen los
espermatozoides una de los tipos celulares ms difciles de distribuir con xito, lo que solo hace posible
distinguir la pequea diferencia en la cantidad de ADN entre espermatozoides con cromosomas X o Y,
mediante el paso del haz lser a lo largo del lado plano de la cabeza. Para superar tal inconveniente los
citmetros de flujo modificados poseen fotodetectores situados a diferentes ngulos (4).
Figura 17. Proceso de clasificacin y separacin de espermatozoides por citometra de flujo
segn su contenido de ADN. Adaptado de XY Inc. (2006).
1. Una pieza elctrica de cristal es ondulada

aproximadamente 90.000 veces / segundo, la cual
rompe el flujo en gotas en un punto particular el
tiempo.
2. Un espermatozoide que lleva X o Y es comparado
segn el criterio de seleccin presente.
3. Despues de un tiempo de espera la barra de
insercin se carga.
4. Una carga es aplicada al tiempo que las celulas
alcanzan la ltima gota fijada.
5. Las gotas cargadas son desviadas al tiempo que
pasan continuamente entre los platos cargados.
6. Las partculas que no reunen los criterios pasan
directamente al desperdicio.
122
Mejoras en la tecnologa Beltsville, desarrolladas en los ltimos aos involucran el desarrollo de una
nueva boquilla de flujo de una orientacin ms efectiva para la cabeza de espermatozoide al haz del
lser, el desarrollo de un clasificador comercial de alta velocidad (MoFlo; Cytomation, Inc.), y el
desarrollo de una nueva orientacin de boquilla que puede ser encajada a clasificadores celulares
convencionales y de alta velocidad, lo que permiti el incremento en la tasa de clasificacin desde 0.35
millones de espermatozoides / hora hasta 6 millones de espermatozoides / hora (2).
Las posibilidades tcnicas de aplicacin del semen sexado son diversas y pueden favorecer en gran
medida el desarrollo y resultado de otras biotecnologas en Colombia, que pueden involucrar semen
para la determinacin del sexo. Segn Johnson et al. (2), los espermatozoides resultantes pueden ser
usados para la inseminacin quirrgica intratubal, intrauterina o intrauterina profunda, en algunos casos
para la inseminacin artificial regular, para la fertilizacin in vitro para producir embriones sexados para
transferencia, y para la inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides en oocitos. Proporciones
repetibles de 85 a 95% de espermatozoides de un sexo o el otro, pueden ser obtenidas para la mayora
de las especies.
La eficiencia del proceso al menos en capacidad de sexado es un aspecto que puede estimular su uso
en las empresas ganaderas colombianas. Por los costos del sexaje, las dosis empleadas de semen
deben ser de una concentracin reducida por lo cual sera pertinente para el uso de esta tecnologa en
el pas, instaurar procesos de inseminacin intrauterina profunda que dentro de un rango de
posibilidades es la opcin ms viable y pueden posibilitar un mayor xito en las tasas de concepcin, de
manera que se haga justificable la inversin. Eso s, teniendo en cuenta que este procedimiento podra
instaurarse, al menos mientras se reducen sus costos, en animales de alto valor gentico y comercial.
La posibilidad de colocar una pequea cantidad de espermatozoides en un sitio muy cercano al sitio
donde ocurre la fertilizacin en la vaca, fue probada por Seidel y colaboradores en 1996, en un
experimento para verificar el concepto que una dosis de semen pequea puede ser usada para la
inseminacin, si los gametos son puestos de manera ptima en el tracto reproductivo de la hembra. Se
utiliz solo 1 a 5x105 espermatozoides / dosis, de manera profunda en el cuerno uterino de novillas,
logrando tasas de preez razonables. Seidel y colaboradores en 1997, con un procedimiento similar,
utilizando 1 a 2x105 espermatozoides / dosis, obtuvieron 17 terneros de los cuales 14 fueron del sexo
123
predicho. Y en 1998, alcanzaron tasas de preez del 80%, y un 80% de tasa de obtencin del sexo
esperado (11).
El semen sexado puede ser criopreservado, pues a pesar de que los procedimientos de sexaje resultan
en ligeramente bajas motilidades posdescongelacin, y baja integridad acrosomal comparando con un
semen control, este dao es menor comparado con el causado por la criopreservacin rutinaria. La
criopreservacin del semen sexado permite una mayor flexibilidad en la distribucin de este producto
para la inseminacin (11).
La validacin por laboratorio es esencial en el desarrollo de un mtodo efectivo para separar
espermatozoides X y Y para preselecccionar semen (9). En la actualidad existen muchos
procedimientos crebles para verificar las proporciones de sexo obtenidas por citometra de flujo, tales
como el re-anlisis por citometra de flujo, la hibridacin por fluorescencia in situ (FISH) y el uso de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en espermatozoides individuales. El sexaje de embriones
despus de FIV tambin puede ser utilizada (3, 4). Sin embargo es comnmente aceptado que la
observacin del sexo fenotpico de la progenie, es la prueba definitiva de la efectividad de un mtodo
particular de sexaje de semen (9).
La tecnologa Beltsville para sexaje de semen, es tambin satisfactoria para la validacin en laboratorio
del proceso de sexaje por reanalisis de clasificacin de los espermatozoides X o Y, segn su contenido
de ADN (ver Figura 19 a y b). El proceso consiste en el uso de una alcuota de semen clasificado y la
obtencin por sonicacin del ncleo espermtico. La uniformidad de la tincin nuclear es reestablecida
por la adicin de ms Hoechst 33342. El anlisis de la alcuota produce un histograma que se ajusta a
un curva gausiana doble (ver Figura 19 c y d) que permite determinar la proporcin de poblaciones X y Y
(9).
Puesto que la tincin Hoechst 33342 puede ser mutagnica y puede tener efectos citotxicos,
particularmente a altas dosis, la atencin se ha fijado en los posibles efectos nocivos de dicho colorante
en la fertilidad, en el desarrollo embrionario, y en la normalidad de la progenie. Sin embargo se han
reportado tasas de clivaje embrionario cercanas al 80% con el uso de semen sexado, lo cual es muy
similar a los resultados cuando se utiliza semen no sexado. Reportes respecto la tasa de desarrollo de
embriones bovinos, muestran un retraso en el desarrollo de al menos 12 horas con el uso de semen
124
sexado, y tasas de obtencin de blastocistos de solo 17%, respecto al 35% del control. No se reportan
evidencias de anormalidades morfolgicas, ni fallas reproductivas al menos hasta la segunda
generacin (4).
Figura 18. Clasificador de semen de alta velocidad y re-anlisis del contenido de ADN.
Fuente: Johnson et al. (1999).
a. Anlisis por citometra de flujo del contenido de ADN por deteccin de fluorescencia por detectores de 0 y 90;
b. Ventana de clasificacin de espermatozoides; c. y d. Re-anlisis del contenido de ADN para validacin de
resultados de ambas fracciones colectadas.
125
Han sido descritos nuevos acercamientos al sexaje de espermatozoides los cuales son bastante
deseados en la bsqueda de un procesamiento de lotes de semen sexado de manera menos costosa.
Algunos de estos sistemas son basados en la inmunologa. El sexaje inmunolgico convencional para
espermatozoides, se basa en la utilizacin de una protena de superficie (3). El aislamiento de una
protena desde la superficie de espermatozoides que llevan cromosomas X o Y, especifica para uno u
otro, busca su utilizacin como un marcador, de manera que un anticuerpo pueda ser desarrollado para
unirse a poblaciones de espermatozoides con X o Y. Sin embargo no ha sido posible dentro de ms de
1000 protenas aisladas en la superficie espermtica, encontrar alguna especifica que permita el sexaje
(2)
Otro sistema que tambin puede ofrecer un medio potencial de separacin de espermatozoides es la
distincin de espermatozoides con cromosomas X o Y sobre la base de una diferencia en el volumen
espermtico. Sin embargo la eficacia de este nuevo sistema an es poco clara, al no ser todava
probada en la prctica (3).
7.2.2 Importancia y consideraciones generales
El semen sexado presenta ventajas tales como una casi totalmente garantizada incidencia (90% de
semen sexado garantizado) del sexo deseado en los terneros, una manera ms econmica de criar
terneras propias en lugar de comprar reemplazos, reducir los costos de pruebas de progenie para toros
(ms progenie en menos tiempo y menos semen usado), alta calidad por seleccin de toros y novillas,
mayor aprovechamiento si se contrata por servicios o montas, incremento en la tasa de reemplazo
voluntaria, incremento en la bioseguridad, y como un mtodo menos costoso para la expansin del hato.
Sin embargo el semen sexado presenta desventajas tales como que el proceso no es perfecto, es
considerablemente ms costoso, es prolongado el tiempo consumido en el proceso (10 pajillas por
hora), movilidad baja (cerca de la mitad respecto al semen no sexado), y tasas de concepcin bajas
(12).
El equipo de citometra de flujo funciona razonablemente bien, aunque es algo complicado y costoso,
sobre $ 300,000 dlares por equipo sexador, el cual es tambin costoso de instalar y mantener.
Adicionalmente, se necesita personal entrenado para su operacin, lo que resulta en costos de
126
entrenamiento. Debido a estos grandes costos fijos, la mayora de los aparatos sexadores de semen
son operados en turnos de 14 a 16 horas por da (8).
Tubman et al. (13), reporta que el proceso de sexaje causa alteraciones en los espermatozoides de
varias maneras. La motilidad, viabilidad, e integridad de la membrana se ven comprometidas por las
altas tasas de dilucin cuando las molculas protectoras son removidas. El estrs fsico durante la
clasificacin y la manipulacin del semen conduce a dao de la membrana, incluyendo reaccin
acrosmica prematura, Hoechst 33342 puede causar dao cromosomal, y las altas presiones dentro del
sistema se han asociado con descensos en la fertilidad.
En un estudio reciente, Tubman et al. (13) compararon los terneros producidos a partir de semen
sexado por citometra de flujo y semen no sexado, para duracin de la gestacin, peso al nacimiento,
facilidad de parto, vigor del ternero, peso al destete, tasa de aborto, y tasa de mortalidad neonatal y
durante el destete. No se encontraron diferencias estadsticamente significativas (P<0.10) para ninguna
respuesta. Observaron un crecimiento y desarrollo prenatal y postnatal normal en terneros producidos a
partir de semen sexado, sin reportes de anormalidades anatmicas. Por lo cual concluyen que la
citometra de flujo puede ser usada de manera segura para preseleccionar el sexo de los terneros, con
una tasa de xito en la obtencin del sexo esperado cercana al 90%.
El mtodo de sexado de semen que actualmente se usa, tiene una limitante importante: los
espermatozoides son sexados de uno en uno, serialmente, en lugar de que pudieran sexarse mltiples
espermatozoides simultneamente (en paralelo). Otra limitante es que el proceso de sexado funciona
mejor con semen fresco, de modo que las maquinas separadoras deben ser ubicadas cerca de donde
estn los toros y el semen debe ser congelado inmediatamente despus del proceso de sexado (8).
Las tasas de concepcin con semen sexado pueden ser menores a las obtenidas con el semen regular,
especialmente con IA de vacas, ms que en novillas. La diferencia puede ser del 10 al 15% por debajo
para el semen sexado respecto al semen control en los mismos rebaos. Las tasas de prees son
profundamente afectadas por el nmero de animales, su estado fisiolgico, su nutricin, y por factores
asociados con el manejo del hato (14).
Las desventajas de la tcnica de sexaje de embriones la hacen todava distante de su aplicacin a gran
escala en la ganadera colombiana. Avances recientes en la eficiencia de la tcnica y algunos mtodos
127
alternos a la tecnologa Beltsville, podra hacer del sexaje una realidad para la implementacin de este
material gentico seleccionado en ms hatos en el mbito mundial.
El tiempo necesario para clasificar los billones de espermatozoides de un eyaculado, limita las extensas
aplicaciones comerciales de la tcnica, sin embargo las maquinarias para sexaje estn mejorando
rpidamente (6, 7). El primer ternero nacido a partir de semen sexado, fue derivado de embriones de
ganado lechero, resultado de produccin in vitro, desarrollada en 1993 por Cran et al (15).
Tabla 6. Resumen de campo realizado por XY Inc, usando semen sexado en novillas Holstein en
Colorado (EEUU). Fuente: XY Inc. por Weigel (2006).
La combinacin de las tecnologas de embriones y recuperacin de oocitos por aspiracin transvaginal

con el uso de semen sexado pueden ser una opcin propicia para difundir mejoramiento gentico a gran
escala en un pas como Colombia, dadas todas las ventajas descritas de cada uno de estos
procedimientos en trminos de posibilidades de ganancia gentica.
Para la industria de la transferencia de embriones bovinos, el semen sexado puede ser atractivo para la
fertilizacin in vitro, donde puede cumplir un papel en los servicios de vacas donadoras despus de
tratamientos de superovulacin convencionales (7). El uso de semen sexado en los procedimientos de
produccin de embriones puede ser una va ms efectiva en costos para inclinar la proporcin de sexo
en el ganado, que mtodos basados en la biopsia de embriones, particularmente para embriones de
costo econmico, tal como puede ser usual en hatos comerciales (16).
Wilson et al. (17), encontraron resultados que sugieren que la produccin in vitro embriones de bajo
costo usando vacas de descarte como donadoras, en conjuncin con esperma sexado, pueden ser
herramientas efectivas en los programas de mejoramiento del ganado lechero, pero solo si las tasas de
concepcin pueden ser mejoradas. Tambin sera pertinente para evaluar lo adecuado de un proceso
128
de este tipo, valorar el aporte en progreso gentico que puede significar a la poblacin ganadera de un
pas, una regin o un tipo de explotacin especfica.
El proceso de comercializacin del semen sexado avanza en forma constante pero lenta. Existen 3
razones principales para esta lenta comercializacin: altos costos, la complejidad de la tecnologa a
implementar y menores tasas de preez en comparacin con semen convencional. No obstante lo
anterior, es posible comprar semen sexado bovino congelado en varios pases. El uso exitoso del
semen sexado requiere un manejo excelente del ganado, manejo cuidadoso del semen y el uso de
inseminadores experimentados. El semen sexado ser usado cada vez ms conforme los costos se
vayan reduciendo (8).
7.3 SEXAJE DE EMBRIONES BOVINOS
El sexaje de los embriones producidos en los procesos de transferencia tradicional o de produccin in
vitro del pas, puede significar un valor agregado que de manera importante puede aportar ms ingresos
a los profesionales involucrados, puede aportar al avance gentico de los hatos, y puede significar
ganancias econmicas de corto plazo a los productores. Sin embargo seria errneo fomentar el uso de
esta tecnologa, si no se realizan estudios de impacto, con proyecciones precisas de su efecto en los
parmetros productivos en las explotaciones. Pues las repercusiones de su uso, no solo a nivel de
granja, sino tambin en la economa del sector ganadero, pueden ser perjudiciales si se implementa
correspondiendo exclusivamente a modas comerciales promovidas gracias a la novedad de los
procesos y los avances tecnolgicos, como sucede con otras biotecnologas en el pas.
La seleccin del sexo para producir machos y hembras puede mejorar la tasa de seleccin gentica en
los programas de seleccin, por reduccin del nmero de preeces requeridas para lograr potenciales
madres y sementales (16).
Algunos mtodos han sido usados para sexar embriones. Como todos estos mtodos poseen
limitaciones, su aplicacin comercial ha sido restringida, aunque comercialmente puede utilizarse en el
futuro. El proceso de sexaje es innatamente ineficiente por la alta prdida de embriones y el alto costo
de la obtencin de los mismos, que slo es justificable para vacas donadoras particularmente valiosas
(18).
129
7.3.1 Aspectos tcnicos del sexaje de embriones

Al momento el medio ms efectivo de preseleccionar el sexo embrionario es la utilizacin de semen
sexado con poblaciones de espermatozoides con cromosoma X o Y, previo a su uso para inseminacin
artificial o FIV, antes de la transferencia embrionaria (4). Sin embargo existen otras metodologas para
este procedimiento. A continuaciones se describen los mtodos ms comunes para el sexaje de
embriones (18):
Cariotipificacin: Una biopsia de un embrin es obtenida y cultivada con sustancias como la colchisina
que detienen la divisin celular, en bsqueda de detenerla durante la metafase de la mitosis. Las clulas
son lizadas osmticamente y la preparacin es fijada y teida para la observacin por microscopia de
los cromosomas. Este mtodo es dispendioso en el uso del tiempo y poco eficiente en embriones de
ms de 10 das.
Anticuerpos antgeno-especficos para macho: este mtodo requiere anticuerpos de superficie
celular especficos de molculas de tejidos masculinos. Los embriones son incubados por 30 a 60
minutos con los anticuerpos, y luego incubados por 30 a 60 minutos adicionales, con un anticuerpo con
un colorante fluorescente para el primer anticuerpo. Los embriones son luego evaluados con un
microscopio de fluorescencia, considerando embriones para macho a aquellos que evidencian la
fluorescencia. Este mtodo es costoso, de precisin limitada (80%) y subjetivo en la evaluacin de la
fluorescencia, sin embargo es considerado desarrollable como procedimiento de rutina.
Sondas ADN especificas para el cromosoma Y: partes de ADN (sondas) pueden ser hechas
marcadas radioactivamente o enzimticamente para unirse especficamente a ADN en el cromosoma Y.
Se realiza una biopsia a los embriones, el ADN es extrado y la sonda es incubada con el ADN
embrionario. Si el cromosoma Y est presente, la sonda se une al ADN embrionario. Este mtodo
permite sexar un gran nmero de embriones al tiempo y es altamente confiable, aunque es costoso y
complejo. Una variacin de este procedimiento permite la observacin directa del ADN utilizando
reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).
130
Con el advenimiento del anlisis de PCR, y la derivacin de sondas especficas para ADN para
cromosomas sexuales, se ha hecho relativamente sencillo remover unas pocas clulas de un embrin
para la determinacin del sexo de una variedad de especies (4).
En ste ltimo mtodo, la identificacin del sexo de los embriones se lleva cabo comercialmente por
medio de PCR para determinar secuencias especficas de ADN, presentes slo en el cromosoma Y. La
eficiencia de la determinacin del sexo por medio del PCR es actualmente superior al 90% con tasas de
preez entre 58 y 71%, similares a las obtenidas con los embriones frescos no sexados (19). El sexaje
por PCR es una tecnologa existente en el pas que utilizada de manera generalizada podra disminuir
de manera importante en sus costos hacindola ms accesible a los ganaderos.
El costo de la tecnologa de sexaje es alto, incluye tanto la biopsia y la determinacin del sexo, como
tambin el costo del embrin con el sexo no buscado. Por otra parte la biopsia para el sexado es una
tcnica invasiva que lesiona la zona pelcida, requiere un alto nivel de habilidad del operador, impide
por razones sanitarias el comercio internacional y produce una reduccin en la viabilidad del embrin
(19, 20).
Figura 19. Biopsia embrionaria para la determinacin del sexo por medio de PCR.
Fuente: http://www.news.cornell.edu/chronicle/04/2.5.04/biopsy.jpg
Las tasas de preez obtenidas con embriones sexados congelados / descongelados son aun bajas
(37% a 66%), lo que limita su uso comercial (19). Durante 2002, casi 3.800 embriones sexados fueron
transferidos en Canad, un tercio de ellos despus de congelacin y descongelacin (20).
131
7.3.2 Actualidad del sexaje de embriones en Colombia

En Colombia se reportan pocas investigaciones en este sentido, el mtodo aplicado en la mayora de los
casos ha sido el sexaje por PCR, y se conoce de datos sin publicar de trabajos que combinan este
procedimiento con la tcnica de ELISA.
Rodrguez (21), de la Universidad Nacional de Colombia, sede Medelln, y el SENA Antioquia, realizaron
la amplificacin por PCR de secuencias genticas (genes ZFX/ZFY y SRY) asociadas al sexo molecular
en especies de mamferos domsticos que incluan Bos (Sub-especies indicus y taurus) y Bubalus
Bubalis, teniendo como objetivo determinar el sexo molecular en clulas somticas a partir de muestras
de sangre perifrica. Los resultados obtenidos mostraron la amplificacin del gen SRY en las especies
evaluadas, lo cual se constituy en un valioso aporte para el proceso de sexaje preimplantatorio, para
trabajos posteriores.
Lpez y Vsquez (22), de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia- sede de
Medelln, y la Facultad de Medicina del Instituto de Ciencias de la Salud CES, realizaron la
estandarizacin de la tcnica que permite la determinacin del sexo de embriones bovinos
preimplantatorios mediante la PCR, con el fin de permitir la utilizacin eficiente de los vientres, e
impulsar el desarrollo del rea de la reproduccin animal en nuestro medio. La imagen 12 ilustra los
resultados de dicho experimento:
Imagen 12. Determinacin del sexo de embriones bovinos.
Fuente: Lpez y Vsquez (2004).
Electroforesis en gel de agarosa al 2%. Se presenta el amplificado de 344bp correspondiente al gen de la -Cn en
todos los individuos analizados (carriles 2-9, 11 y 12), los carriles 2, 3, 5 y 8 muestran una banda de 151pb
correspondiente al gen sry exclusivo de los machos la cual fue obtenida por amplificacin por PCR con los
132
cebadores SRY1BF/SRY2R. Carril 10 control sin DNA, carriles 11 y 12 control positivo macho y hembra. Carril 1
marcador de peso molecular 50pb.
A escala comercial, la empresa colombiana Ctelca, reporta el logro del primer nacimiento en Colombia
de terneros sexados por la tcnica de PCR en 1998 (23). No se encontraron reportes de otros trabajos
en este sentido lo que hace pensar que la tecnologa de sexaje de embriones no llega en Colombia an
ni a las etapas preliminares para su aplicacin al nivel de explotaciones ganaderas.
En Colombia el desarrollo de estas biotecnologas, en mayor medida en el caso de embriones, se ha
dado principalmente en el mbito experimental, y no se encuentran reportes sobre actividad de difusin
comercial de semen y embriones sexados. Las alternativas de sexaje de embriones pueden difundirse
con mayor facilidad en el pas pues se basan en tcnicas moleculares establecidas en muchos
laboratorios de biologa molecular. Mientras tanto, el escaso desarrollo del sexaje de espermatozoides,
esta dado muy posiblemente por los altos costos que esta tecnologa genera, y por su escasa
comercializacin en el pas.
Los acercamientos y avances citados en el sexaje de embriones, tanto para la parte investigativa como
comercial, son un paso importante en la bsqueda de establecer esta biotecnologa en los
procedimientos de produccin de embriones por entidades colombianas. Sin embargo mientras no se
realicen inversiones econmicas en el pas en la formacin cientfica del recurso humano, asi como en
la transferencia o adaptacin de recursos tecnolgicos, tanto para el sexaje de embriones como de
espermatozoides, difcilmente se lograr un avance cercano al alcanzado en otros pases. Adems
dichas Inversiones sean de origen nacional gubernamental en los institutos o universidades estatales
relacionadas con la biotecnologa animal, o de origen privado por empresas nacionales y extranjeras
interesadas en invertir en la biotecnologa animal colombiana, pueden facilitar el desarrollo comercial de
estas biotecnologas, favoreciendo finalmente los intereses del productor y el crecimiento del sector
ganadero colombiano.
En algunos pases con un gran desarrollo de su sector pecuario, el uso de semen y embriones sexados
avanza lentamente. De manera que es el momento para que en nuestro pas nos asociemos en mayor
133
medida al avance de estas tecnologas, buscando estar incluidos en la vanguardia mundial de dichos
procesos.
La importacin de semen y embriones sexados puede ser una alternativa ms actual para Colombia por
los volmenes y costos de produccin que se reducen cada vez ms en pases donde estos procesos
se aplican. El impacto de la introduccin de estas tecnologas puede ser de grandes proporciones por
las caractersticas de nuestros sistemas productivos, que en muchos de los casos son altamente
dependientes del desempeo de uno de los dos gneros de animales, por lo cual las posibilidades de
rentabilidad son casi inmediatas, al menos en el comercio de vacas reemplazos, y un poco menos
inmediatas en los volmenes de leche o carne producidos segn las condiciones de productividad y
comercio.
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135
ANLISIS GENERAL
El uso apropiado de las biotecnologas reproductivas en el sector ganadero mundial, brinda la
posibilidad al productor de lograr un aprovechamiento mximo de la capacidad reproductiva de sus
mejores animales, lo cual es reflejado en el mejoramiento de sus parmetros productivos. Permite el
crecimiento del sector pecuario de un pas, pues acrecienta los beneficios econmicos generales
por la participacin en los mercados internos y externos, generando mayor capacidad de
competencia en un ambiente de globalizacin de la economa.
En Colombia, biotecnologas reproductivas como la inseminacin artificial y la transferencia de
embriones han contado con algo ms de difusin dentro de los procesos reproductivos bovinos. No
obstante, la base para dicha aplicacin en la mayora de explotaciones son consideraciones
producto de apreciaciones fenotpicas, y no el resultado de pruebas de valor gentico. Esta
situacin, dada por razones de mercado, puede ser altamente beneficiosa para un productor al
lograr el mximo nivel reproductivo de animales de exposicin, o lo que en nuestro mbito se
denomina ganado puro, el cual puede alcanzar altos valores comerciales. Sin embargo, un
impacto productivo no valorado para la comercializacion masiva de este tipo de animales, puede ser
perjudicial en la bsqueda de un progreso gentico nacional que conduzca a un progreso rentable
ms uniforme.
No sobra mencionar que las evaluaciones genticas en el pas an estn en un nivel de cobertura
mnima, considerando solo los rasgos productivos tradicionales. De manera que la introduccin
biotecnolgica de gentica no se realiza en la mayora de los casos, con proyecciones de impacto,
ni estudios de su compatibilidad, ni de su pertinencia de aplicacin segn los objetivos productivos,
lo cual hace que incluso una biotecnologa como la inseminacin artificial pueda ser mal aplicada,
aunque en el medio muchos profesionales asuman su xito por el buen desarrollo de la tcnica. Con
la transferencia de embriones en la actualidad ocurre un fenmeno similar, y las condiciones de
comercio dominan a los que deberan ser los verdaderos objetivos de su uso, como lo son el
mejoramiento gentico de los rasgos productivos del ganado, la optimizacin de los procesos
reproductivos, y el avance de la eficiencia reproductiva del mismo. Por estos motivos, con la futura
aplicacin de biotecnologas de vanguardia, deber ser requisito fundamental promover por parte de
136
los profesionales, un verdadero aporte conciente a la productividad, rentabilidad y crecimiento de la

ganadera colombiana, a travs de la concientizacin a los productores del impacto y los alcances
reales de la implementacin de dichos procedimientos dentro de sus explotaciones, y mediante el
juzgamiento tico de la pertinencia de su aplicacin segn las condiciones productivas de los hatos.
Respecto a la parte tcnica y al xito puntual de las biotecnologas reproductivas actualmente
aplicadas en Colombia, es importante reconocer que se ha logrado en muchas explotaciones,
mediante productores, profesionales y empresas relacionadas con su utilizacin en bovinos,
establecer un aumento de las tasas reproductivas de los animales, y que son importantes los casos
de aplicacin exitosa de biotecnologas como inseminacin artificial, transferencia de embriones,
produccin in vitro de embriones y aspiracin folicular guiada por ultrasonido. Y aunque el acceso a
stas, por muchas ganaderas del pas sea an muy limitado, cierto nivel de progreso gentico para
rasgos productivos, ha sido establecido en el pie de cra, principalmente por la importacin de
gentica extranjera.
Los costos y el nivel tcnico necesarios para el desarrollo de la mayora de biotecnologas
reproductivas en Colombia, han limitado su aplicacin, y las han vuelto casi exclusivas de
ganaderas con buena capacidad de inversin. A parte de la inseminacin artificial, otras
biotecnologas son desconocidas en la mayora de ganaderas del pas, lo que hace que sus
ventajas y aportes a la produccin pecuaria no alcancen un impacto de cobertura nacional, por lo
cual se hace necesario el desarrollo de polticas que beneficien su participacin y cobertura, como la
incentivacin de los factores de mercado internos, o de fomento a la inversin extranjera a travs de
ventajas arancelarias, como en la intensificacin de las labores de capacitacin y extensin, en la
bsqueda de la aplicacin masiva de tecnologas que como stas, poseen grandes posibilidades de
contribuciones al sector pecuario colombiano.
Los tratados comerciales entre Colombia y otros pases que incluyen el crecimiento del comercio de
productos de origen animal como carne y leche, y el comercio en biotecnologa y recursos
biolgicos, sern fundamentales en el desarrollo venidero de la ganadera colombiana y la
aplicacin de las biotecnologas reproductivas en sus procesos productivos, obviamente
dependientes del comportamiento econmico del sector. Dentro de estos tratados se incluye: El
Tratado de libre comercio (TLC) entre Colombia, Mxico y Venezuela G3; El acuerdo de tratado de
137
comercial de alcance parcial suscrito entre la Repblica de Colombia y la Repblica de El Salvador;

los acuerdos de la comunidad andina de naciones (CAN), EL Mercosur, El TLC entre los pases
andinos y El Mercosur, y Los TLC suscritos entre Estados Unidos y pases como Colombia, Chile,
pases de Centroamrica, Republica Dominicana y Panam. Dentro de los cuales, para el caso
especfico del TLC entre Colombia y Estados Unidos, un captulo esencial es la constitucin de un
fondo para la modernizacin y reconversin tecnolgica de la agricultura, a fin de financiar la
transferencia y adopcin de los ms avanzados progresos de las ciencias y la biotecnologa.
Segn el texto final del tratado de libre comercio, recientemente firmado entre nuestro pas y los
Estados Unidos, el resultado de la negociacin promueve el crecimiento de las exportaciones al
mercado de los EEUU, de productos pecuarios como crnicos, con acceso preferencial al cupo de
30.000 toneladas disponibles del contingente de la OMC, y 5.000 toneladas sin arancel, una vez
agotado dicho contingente. Y lcteos, donde se lograron contingentes de exportacin totales de
9.000 toneladas repartidas en leche liquida, mantequilla, helados, quesos y otros lcteos, y libre
acceso a yogures. Segn dicho texto final, el TLC brinda a la produccin agropecuaria del pas
condiciones para modernizar sus procesos productivos, y establece mecanismos de proteccin
como aranceles base, salvaguardas especiales automticas, amplios plazos de desgravacin,
cuotas de importacin, y plazos para productos sensibles, entre otras ventajas para enfrentar las
condiciones de competencia. Todo esto permitira proyectar un crecimiento econmico de la
ganadera nacional, y la necesidad de optimizacin de sus procesos productivos, donde sin duda el
desarrollo biotecnolgico debe ser fundamental por sus aportes en este sentido. El TLC adems
contempla ventajas para el acceso a tecnologa en el sector agropecuario, lo que podra posibilitar
un mayor acceso de los ganaderos a sistemas biotecnolgicos de vanguardia, por la reduccin en el
costo en los equipos y los procedimientos mismos.
Todo este panorama comercial permitira pensar efectivamente en ventajas para el desarrollo
ganadero del pas, que con su crecimiento podra jalonar el desarrollo biotecnolgico, como una
opcin importante en el logro de altos niveles de eficiencia y rentabilidad. Sin embargo son muchos
los detractores de este tipo de acuerdos comerciales, que predicen adems un descalabro en la
economa del sector agropecuario colombiano, y perjuicios en todos sus sentidos incluyendo el rea
biotecnolgica. Lo cual puede ser exagerado en la medida que la tendencia mundial de apertura de
las economas hacia los mercados internacionales, prcticamente obliga a la bsqueda de mltiples
138
asociaciones comerciales que permitan la libre competencia en un mbito ms globalizado, y que al

final se traduce en beneficios econmicos para la mayora de productores y consumidores de cada
sector productivo, siendo adems un motor para la promocin local del mejoramiento de los
cnones de eficiencia en los procesos productivos. Ya ser entonces hora de conocer el impacto
real que acuerdos comerciales y principalmente que el TLC, tendr en el desarrollo de las
biotecnologas reproductivas aplicadas en bovinos.
Respecto al papel de las universidades colombianas en el impulso en la ganadera del uso de las
biotecnologas reproductivas, es fundamental primero considerar que aunque se realizan en la
actualidad esfuerzos en el campo de la investigacin para la caracterizacin biolgica bsica, y la
estandarizacin y mejoramiento de los procedimientos tcnicos, a este nivel siguen siendo muy
reducidos los progresos tanto en nmero de investigaciones, como en aportes tangibles, siendo un
requerimiento fundamental la incentivacin de la labor investigativa mediante la destinacin de
mayor cantidad de recursos econmicos. En segundo lugar es importante considerar que en los
aspectos de difusin comercial y extensin de estas tecnologas desde las universidades hasta el
sector ganadero, son mnimos los avances en la actualidad. Motivo por el cual, es necesaria una
mayor vinculacin de estas instituciones a labores comerciales de la biotecnologa reproductiva,
pues no solo logran un beneficio econmico propio, sino que adems promueven el impulso para la
diseminacin de tecnologas con aportes valiosos. En el mbito de la extensin al campo y la
capacitacin de profesionales, se requiere una mayor voluntad de accin por las universidades, que
en muchos casos cuentan con el recurso tcnico y humano para cumplir dichas labores.
El papel del profesional de las reas pecuarias en este campo, tambin vale la pena que sea
revisado, pues es en l, que recae la responsabilidad de realizar un fomento con criterios ticos de
estas tecnologas, obedeciendo ms al conocimiento de un impacto favorable para el conjunto de la
ganadera nacional, que a factores de mercado o beneficios econmicos personales. Y para sto, es
importante el cubrimiento de falencias en la formacin profesional, pues son evidentes las
deficiencias que existen en la formacin en mejoramiento gentico en muchos profesionales,
considerando que se trata de un conocimiento imprescindible si se tiene en cuenta su participacin
en los procedimientos reproductivos en los hatos.
139
Por razones ticas y legales es trascendente para los profesionales y productores no desconocer,
aplicar y promover en las labores prcticas e investigativas en biotecnologas reproductivas, las
disposiciones legales colombianas, enmarcadas en leyes como: El estatuto nacional de proteccin
de los animales, Ley 84 de 1989, la cual adems de otras disposiciones, en su captulo VI, artculos
23 a 26, reglamenta el uso de animales vivos en experimentos e investigacin; La Ley 165 de 1994,
por medio de la cual se aprueba el "convenio sobre la diversidad biolgica", hecho en Ro de
Janeiro el 5 de junio de 1992, que sobre todo busca la proteccin de la diversidad biolgica del pas,
la cual sin duda puede afectarse por actividades biotecnolgicas indiscriminadas; La ley 740 de
2002 que ratific el protocolo de Cartagena sobre seguridad en la biotecnologa del convenio sobre
diversidad biolgica, y que tiene como objetivo contribuir a garantizar un nivel adecuado de
proteccin en la esfera de la transferencia, manipulacin y utilizacin seguras de los organismos
vivos modificados resultantes de la biotecnologa que puedan tener efectos adversos sobre la
diversidad biolgica. Y entre otras leyes, la Ley 208 de 1995, por medio de la cual se aprueba el
"Estatuto del Centro Internacional y Biotecnologa", que busca el uso adecuado de la ingeniera
gentica y la biotecnologa, en beneficio del hombre, y que influencia de manera directa el papel
actual de las biotecnologas reproductivas en la ganadera, y la posibilidad de implementacin de
procedimientos biotecnolgicos de vanguardia asociados a estas.
Con el desarrollo de este texto se ha pretendido poner a disponibilidad de los productores,
estudiantes y profesionales del sector pecuario un material bibliogrfico que adems de revisar los
principios generales y el estado del arte de las biotecnologas reproductivas que en Colombia tienen
mayores perspectivas de aplicacin y aporte al desarrollo de la productividad, tambin se ha
realizado un anlisis de los factores que a consideracin del autor influencian el desempeo tcnico
y el papel de estas biotecnologas en la ganadera y economa colombiana.
Con la intensa investigacin mundial desarrollada y la vanguardia de algunos de los temas de
biotecnologa de la reproduccin bovina abordados, resulta difcil cubrir todos los aspectos
relacionados con ellos. Sin embargo, se considera que el aporte de ste texto como material
bibliogrfico puede ser importante por la recopilacin de informacin, la elaboracin y bsqueda de
coherencia en la temtica, la traduccin y revisin de artculos cientficos, el estudio de los avances
biotecnolgicos recientes, y ms an por el anlisis y discusin del papel histrico, la situacin
actual y las perspectivas futuras de aplicacin de dichas biotecnologas en nuestro pas.
140

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BIOTECNOLOGAS REPRODUCTIVAS APLICABLES A LA

GRUPO DE INVESTIGACIN EN BIOTECNOLOGA ANIMAL -GIBAPOLITECNICO COLOMBIANO JAIME ISAZA CADAVID

A mis tres amores: Gloria, Jimena y Sarah

CAPTULO I: LA INSEMINACIN ARTIFICIAL BOVINA

1.2 REFERENCIAS HISTRICAS

1.3 IMPORTANCIA Y CONSIDERACIONES GENERALES

1.4 LA DETECCIN DEL CELO PARA LA INSEMINACIN ARTIFICIAL

1.5 INSEMINACIN ARTIFICIAL A TIEMPO FIJO Y SINCRONIZACIN HORMONAL

1.6 EVALUACIN DEL SEMEN PARA INSEMINACIN ARTIFICIAL

1.7 TCNICA DE INSEMINACIN ARTIFICIAL

1.8 ANLISIS Y DISCUSIN

1.9 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO II: ESTIMULACIN HORMONAL Y SUPEROVULACIN EN BOVINOS

2.2 IMPORTANCIA Y CONSIDERACIONES GENERALES

2.3 ASPECTOS TCNICOS DE LA ESTIMULACIN HORMONAL

2.4 ANLISIS Y DISCUSIN

2.5 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO III: TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS

3.2 REFERENCIAS HISTRICAS

3.3 IMPORTANCIA Y CONSIDERACIONES GENERALES

3.4 ASPECTOS TCNICOS DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

3.5 ACTUALIDAD DE LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN COLOMBIA

3.6 ANLISIS Y DISCUSIN

3.7 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO IV. PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS

4.2 REFERENCIAS HISTRICAS

4.3 IMPORTANCIA Y CONSIDERACIONES GENERALES

4.4 ASPECTOS TCNICOS DE LA PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES

4.5 ACTUALIDAD DE LA PRODUCCIN IN VITRO DE EMBRIONES EN COLOMBIA 70

4.7 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO V: ASPIRACIN FOLICULAR DE OOCITOS BOVINOS GUIADA POR ULTRASONIDO

5.2 IMPORTANCIA Y CONSIDERACIONES GENERALES

5.3 ASPECTOS TCNICOS DE LA ASPIRACIN FOLICULAR GUIADA POR

5.5 ACTUALIDAD DE LA ASPIRACIN FOLICULAR GUIADA POR ULTRASONIDO

5.6 ANLISIS Y DISCUSIN

5.7 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO VI: CRIOPRESERVACIN DE GAMETOS Y EMBRIONES BOVINOS

6.2 CRIOPRESERVACIN DE SEMEN BOVINO

6.2.1 Aspectos tcnicos de la criopreservacin de semen bovino

6.3.1 Aspectos tcnicos de la criopreservacin de oocitos y embriones

6.4 ANLISIS Y DISCUSIN

6.5 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CAPTULO VII: SEXAJE DE ESPERMATOZOIDES Y EMBRIONES BOVINOS

7.2 SEXAJE DE ESPERMATOZOIDES BOVINOS

7.2.1 Aspectos tcnicos del sexaje de espermatozoides bovinos

7.2.2 Importancia y consideraciones generales

7.3 SEXAJE DE EMBRIONES BOVINOS

7.3.1 Aspectos tcnicos del sexaje de embriones bovinos

7.3.2 Actualidad del sexaje de embriones bovinos en Colombia

7.4 ANLISIS Y DISCUSIN

7.5 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Dispositivos detectores de presin de monta.

Podmetros y collares para la deteccin de estro.

Sincronizacin del estro con una prostaglandina.

Programa Ovsynch para sincronizacin de estro.

Trabajo de inseminacion artificial.

Mtodo de ovulacin mltiple y transferencia de embriones (MOET).

Localizacin del catter Foley con baln inflable en un cuerno uterino.

Inseminacin artificial en bovinos.

Ovario bovino multifolicular por tratamiento para superovulacin, imagen

Catter Foley de 2 vas, con y sin baln inflable.

Bsqueda y localizacin de embriones mediante un estereoscopio.

Microgotas para PIVE bajo aceite mineral.