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Beddar Kahina
Department of Agricultural Sciences; University of Mouloud Mammeri;Tizi ouzou; Algeria
Djamel Djenane
Department of Microbiology and Biochemistry; University of Mouloud Mammeri;Tizi ouzou; Algeria
ABSRACT
The aim of this work is to study the chemical composition and antifungal activity of essential
oils isolated from leaves of Myrtus communis and Pistacia lentiscus growing in North Algeria
against two postharvest pathogenic fungi of strawberry fruit: Aspergillus niger and
Penicillium sp. The chemical compositions of the essential oils were analyzed using a Gas
Chromatography/Mass Spectrometry (GC-MS) technique. The essential oils of Myrtus
communis are characterized by the presence of 1;8-Cineole (46.98 ); Cis-Geraniol (25.18
) as principal chemical components. The essential oils of Pistacia lentiscus are formed
mainly by Myrcene (15.18 ) and 1;8-Cineole (15.02 ).
The in vitro antimicrobial activity of Pistacia lentiscus and Myrtus communis essential oils
against Aspergillus niger and Penicillium sp were evaluated using standart agar-disk diffusion
assay. The results obtained, followed by measurements of Minimal Inhibitory Concentrations
(MICs); showed promising inhibitory effect against both pathogens tested. Oil of Myrtus
communis was most active (= 59.5 mm; = 46 mm) against Penicillium sp and Aspergillus
niger respectively with the lowest MIC value for both pathogens (125 l/ml).
Pistacia lentiscus essential oil was tested in strawberry fruit; experimentally inoculated with
Aspergillus niger and Penicillium sp separately at a concentration of 107 spores/ml. Results
demonstrated that Pistacia lentiscus essential oil exerted an antifungal effect against
pathogens tested. This effect was evident from 24 hours of incubation; showing significant
differences with untreated samples. The data suggest a possibility that essential oils could be
used as natural preservatives for improving shelf life of strawberry fruit.
Keywords: Essential oils; Aspergillus niger; Penicillium sp; Antifungal activity; Strawberry
dvelopper des
riches en
application in vivo sur un fruit trs sensible aux altrations dorigine fongique qui est la
fraise.
2. Matriel et Mthodes
2.1 Les huiles essentielles
Les huiles essentielles utilises dans cette tude sont des huiles essentielles 100 pures et
naturelles du pistachier (Pistacia lentiscus) et du myrte (Myrtus communis) (Florame-St Rmy
de Provence- France). Ces huiles essentielles ont t obtenues partir dun matriel
biologique (certifi par Ecocert SAS F33600). Les flacons renfermant ces huiles sont opaques
et bien ferms. Ils sont conservs labri de la lumire et de loxygne une temprature de
rfrigration de 4C. Lidentification des constituants a t ralise par analyse
chromatographique selon la mthode dcrite par Djenane et al., (2011).
2.2 Les souches fongiques
Les souches utilises dans cette tude appartiennent deux genres de moisissures:
Aspergillus (Aspergillus niger) et Penicillium (Penicillium sp). Ces souches proviennent du
laboratoire de mycologie de luniversit Abderrahmane Mira de Bejaia. Les souches ont t
reues dans des tubes glose incline puis conserves une temprature de 4C.
2.3 Test in vitro de lactivit antifongique
Les spores des jeunes cultures (cultures de 3 jours) de chaque souche sont rcupres par
un lavage des boites de Ptri, avec un volume de 5 ml de leau physiologique strile, partir
de cette suspension, qui est considre comme suspension mre, on prpare les diffrentes
dilutions dans des tubes essai contenant 9 ml deau physiologique strile.
Aprs une bonne agitation de chaque tube, pour avoir une rpartition homogne des spores
dans leau physiologique, on procde un comptage des spores laide dune cellule de
Mallassez et le microscope lectronique et une valuation de la densit optique (DO) de la
suspension fongique laide dun spectrophotomtre une longueur donde de 630 nm dans
le but de standardiser la suspension de spores 107 spores/ml. On estime quune DO de 0,04
correspond une concentration de 107 spores/ml.
Laromatogramme est une technique qualitative permettant de dterminer la sensibilit
des microorganismes vis--vis dune substance rpute antimicrobienne, dans notre cas cest
doxyttracycline
(lensemencement est fait par ltalement de 100 l de cette suspension dans chaque boite),
puis on les incube 30 C pendant 15 20 minutes.
Des disques de papier Wattman de 6 mm de diamtre sont striliss puis dposs sur la
glose sche inocule au pralable avec les suspensions fongiques, en suite ces disques sont
chargs des volumes croissants de chaque huile (20, 30, 40 et 60 l) laide dune
micropipette.
Les boites de Ptri sont places au rfrigrateur, couvercles renverses, 4C pendant 2
heures, avant de les incuber 30C pendant 3 jours.
Aprs lincubation, la lecture se fait par la mesure des diamtres des zones dinhibitions,
laide dune rgle (rsultats exprims en mm). Chaque diamtre est reprsent par la moyenne
de deux mesures.
2.4 Application des huiles essentielles sur la fraise
Le test est ralis sur des fraises trs sensibles aux altrations fongiques. Avant de tester
leffet dhuile essentielle, on a dabord test la sensibilit des fraises aux souches fongiques
tudies (Penicilium sp et Aspergillus niger) avec la mme mthode que celle de la
prparation des chantillons tmoins dans ce test in vivo.
Le protocole utilis est celui dcrit par Alilou et al (2009) sur les fruits de clmentine.
Apres lavage avec leau javellise dilue 10 et rinage (trois fois) avec de leau
distille strilise, les fruits bien goutts sont inoculs par inondation avec des souches
fongiques de 107 spores/ml, prpares de mme faon que le test in vitro et toujours partir
des jeunes cultures ges de trois jours, cela est fait par trempage des fruits dans un bcher
strilis contenant la suspension fongique, ensuite laisser sgoutter.
Chaque fruit inocul de suspension fongique a t dpos dans une boite de Ptri, puis
inond dhuile essentielle du pistachier (brute et dilu dans lthanol 50) laide
dune pipette Pasteur (environ 1ml de lextrait sur chaque fruit).
Des tmoins sont aussi prpars et inoculs par chaque souche fongique mais sans addition
dhuile essentielle. Chaque chantillon a t ralis en duplicata.
3. Rsultats et Discussion
3.1 Composition chimique
Les analyses chromatographiques des huiles essentielles ont permis didentifier 57 composs
qui reprsentent environ 98 .69 pour Pistacia lentiscus, contre 17 composes (95.98) pour
Myrtus communis. Lhuile essentielle de Myrtus communis est compose principalement de
1;8-Cineole (46.98 ) et Cis-Geraniol (25.18 ) accompagns dautres constituants a des
teneurs relativements faibles. Lhuile essentielle de Pistacia lentiscus est compose
principalement de Myrcene (15.18 ) et 1;8-Cineole (15.02 ) (Djenane et al., 2001).
Les rsultats du test de sensibilit dAspergillus niger lhuile essentielle du pistachier par la
mthode daromatogramme sont reprsents dans la figure 1.
20l
30l
40l
60l
Figure 1: Photos montrant les zones dinhibition provoques par lhuile essentielle du
pistachier diffrentes concentrations sur lAspergillus niger
Les rsultats du test de sensibilit de Penicillium sp lhuile essentielle du pistachier par la
mthode daromatogramme sont reprsents dans la figure 2.
20l
40l
30l
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Figure 2: Photos montrant les zones dinhibition provoques par lhuile essentielle du
pistachier diffrentes concentrations sur le Penicillium sp.
Les diamtres des zones dinhibition (mesurs en mm) obtenus par la moyenne de trois
rptitions sont reprsents dans le tableau 1, cette mesure nous a permis de classer les
souches fongiques selon leur degr de sensibilit chaque volume dhuile essentielle teste.
Tableau 1: Halos dinhibition (en mm) provoqus par lhuile essentielle du pistachier
Souche fongique
V1=20 l
V2=30 l
V3=40 l
V4=60 l
Aspergillus niger
16,5(++)
24,83(+++)
26(+++)
40,83(+++)
Penicillium sp
18,16(++)
25(+++)
29,66(+++) 42,16(+++)
-pinne et -pinne sont bien connus comme produits chimiques ayant des potentiels
antimicrobiens. Cependant, lactivit antifongique dhuile essentielle de Pistacia lentiscus est
due -pinne qui se prsente en quantit apprciable dans cette huile. Un autre compos le
linalol possde aussi une large gamme d'activit antibactrienne et antifongique (Imelouane
et al., 2009).
20l
30l
40l
60l
Figure 3: Photos montrant les zones dinhibition provoques par lhuile essentielle
du myrte diffrentes concentrations sur lAspergillus niger
20l
40l
30l
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Figure 4: Photos montrant les zones dinhibition provoques par lhuile essentielle
du myrte diffrentes concentrations sur Penicillium sp.
Le tableau 2 renseigne sur les diamtres des zones dinhibition provoques par lhuile
essentielle du myrte (aussi mesurs en mm et obtenus par la moyenne de trois rptitions), les
souches fongiques sont aussi classes selon leur degr de sensibilit chaque volume dhuile
essentielle teste.
Tableau 2: Halos dinhibition (en mm) provoqus par lhuile essentielle du myrte
Souche fongique
V1=20 l
V2=30 l
Aspergillus niger
14,25 (+)
Penicillium sp
32,16 (+++)
46 (+++)
V3=40 l
V4=60 l
78 (+++)
(+): sensible
(+++): Extrmement sensible
Les deux souches sont extrmement sensibles tous les volumes tests dhuile essentielle
du myrte sauf lAspergillus niger qui a montr une sensibilit moyenne au volume 20 l.
Lactivit antifongique
majoritaires: cinol (ther), -pinne et limonne (monoterpnes) mais aussi ses constituants
minoritaires: Myrtnol, Linalol, Graniol (alcools terpniques) et lEugnol (phnol).
Les monoterpnes tels que l -pinne et le limonne sont parmi les composants
major qui contribuent une forte activit antimicrobienne du Myrtus communis (Rasooli et
al., 2002).
Selon Randrianarivelo (2008), les constituants minoritaires sont galement connus pour
leur activit antimicrobienne. Les alcools, les aldhydes et les esters peuvent contribuer
l'effet antimicrobien global des huiles essentielles (Derwich et al., 2010).
Donc les deux huiles sont riches en monotrpenes qui sont trs connus pour leurs activits
antimicrobiennes. Selon Derwich et al (2010), lactivit antimicrobienne des monoterpnes
est explique par la prsence des groupes d'hydroxyles phnoliques capables de former des
liaisons hydrognes avec les emplacements actifs des enzymes de la cellule cible.
Pour les deux huiles testes, plus on augmente le volume, plus les diamtres des zones
dinhibition augmentent, ceci peut tre du la prsence de plus de composs actifs avec
laccroissement du volume dhuile essentielle.
Daprs Mohammedi et al (2005), lhuile essentielle de Ciste a t teste contre sept
moisissures: Rhizopus, Mucor, Alternaria, Fusarium, Pnicillium, Trichoderma et
Aspergillus. Lhuile sest montre trs active sur toutes les souches. Cependant cette activit
dpend de la concentration de lhuile et de la moisissure. Lhuile essentielle a manifest un
bon pouvoir antifongique. Les moisissures ont montr une sensibilit accrue laugmentation
du volume de lhuile dans leur milieu de culture o le diamtre de la colonie se rduit
chaque fois quon augmente la dose de lhuile jusqu une inhibition totale o aucune
croissance nest observe. Selon Degryse et al (2008), le degr dactivit antimicrobienne est
proportionnel la concentration en huile essentielle.
3.4 Concentration minimale inhibitrice (CMI) des huiles testes
Tableau 3: valeurs de la CMI des huiles testes (en l/ml)
Souche fongique
Aspergillus niger
125
125
Penicillium sp
250
125
Le pouvoir inhibiteur des huiles essentielles vis--vis dune souche microbienne est class
en: excellent pouvoir inhibiteur pour des CMI < 50 l/ml, pouvoir inhibiteur intressant pour
des CMI entre 50 l/ml et 250 l/ml, faible pouvoir inhibiteur pour des CMI entre 250 l/ml
et 500 l/ml et pouvoir inhibiteur mdiocre ou nul pour des CMI > 500 l/ml (Koba et al.,
2004). On peut dduire que les deux huiles essentielles ont un pouvoir inhibiteur intressant
sur les deux souches fongiques.
3.5 Activit antifongique sur la fraise
Les rsultats du test sur la fraise montrent que, dans la fraise inocule, lhuile essentielle du
pistachier a exerc un effet inhibiteur trs important vis--vis des deux souches (Aspergillus
niger et Penicillium sp) et cette activit a t maintenue mme pour le deuxime jour. Donc
cette huile est trs efficace pour la protection des fraises contre le moisissement aprs rcolte.
Cette efficacit peut tre due la nature de fruit qui est pauvre en lment gnant lactivit
des huiles essentielle comme les protines et les lipides dune part, et la prsence des
quantits limites en oxygne dautre part.
4. Conclusion
est un
consommateur. Des recherches portes sur lefficacit des diffrents extraits obtenus de la plante sur
certains agents daltration fongique ont montr le grand intrt des huiles essentielles dans la
conservation des aliments. Les rsultats de notre tude, nous a permis de prdire que les substances
naturelles telles que les huiles essentielles peuvent tre une source non ngligeable dantifongiques
utilisables mme dans la conservation des fraises.
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