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Biotecnologia
MDULO II
Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para
este Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao do
mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autores
descritos nas Referncias Bibliografias.
MDULO II
3.
envolvidas
com
este
processo,
tecnologia
do
DNA
recombinante.
O aprofundamento em conhecimentos de gentica abriu a imaginao
dos pesquisadores e esta cincia se tornou uma das ferramentas mais
importantes para o desenvolvimento de tcnicas biotecnolgicas. Aliado a isto,
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Vetor
DNA alvo
Digesto enzimtica
Digesto enzimtica
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plasmdeo
DNA
cromossmico
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Stio de restrio
EcoRI
G A-A-T-T-C
Tipo de extremidade
Extenso 5 fosfato
C-T-T-A-A G
BamHI
G G-A-T-C-C
Extenso 5 fosfato
C-C-T-A-G G
PstI
C-T-G-C-A G
Extenso 3 fosfato
G A-C-G-T-C
PvuII
C-A-G C-T-G
Extremidade cega
G-T-C G-A-C
HpaI
G-T-T A-A-C
Extremidade cega
C-A-A T-T-G
HaeIII
G-G C-C
Extremidade cega
C-C G-G
NotI
G C-G-G-C-C-
Extenso 5 fosfato
G-C
C-G-C-C-G-GCG
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Digesto
BamHI
Digesto
EcoRI
Digesto
EcoRI + BamHI
950
850
600
600
500
400
300
250
300
100
100
EcoRI
500
100
EcoRI
300
400
100
BamHI
850
300
250
600
950
600
BamHI
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CCGGGATCCTAAG
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
GGCCCTAGGATTC
Digesto com
enzima de
restrio
CCGG
GGCCCTAG
Digesto com
enzima de
restrio
GATCCTAAG
CCGGGA
TCCTAAG
GATTC
GGCCCT
AGGATTC
Extremidades coesivas
Extremidades cegas
Figura 29: Extremidades cegas e coesivas geradas aps a digesto com enzimas de
restrio.
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CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
Digesto com
enzima de
restrio
OH
CCGG
GATCCTAAG
GGCCCTAG
GATTC
P
OH
Anelamento
OH P
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
P OH
Ligao
Ligase T4
CCGGGATCCTAAG
GGCCCTAGGATTC
ao final das fitas de DNA que estejam mantidas juntas pela complementaridade
de bases ou mesmo quando as extremidades cegas estejam em contato ao se
ligarem enzima. A enzima responsvel por este processo a DNA ligase e
em procedimentos biotecnolgicos frequentemente se utiliza a isolada do
bacterifago T4.
Conhecendo as tcnicas e os procedimentos genricos para a
tecnologia
do
DNA
recombinante,
os
prximos
tpicos
trataro
de
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ento
analisados
caracterizados.
Teoricamente,
este
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Stio de
restrio
a
Stio de
restrio
b
Stio de
restrio
c
Digesto parcial
b
a+b
d
d
a+b+c
a
b+c+d
a+b
a
a
Figura
c+d
d
b+c
b
c+d
31:
Digesto
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de RNA, como RNAr e RNAt. Isto possvel, pois somente o RNAm possui a
cauda de poliA em sua estrutura. Para a sua purificao, o material derivado da
extrao de RNA passado por uma coluna seletiva, na qual esto ligadas
pequenas cadeias curtas de resduos de timina de aproximadamente 15
nucleotdeos. Ento, o RNAm se liga coluna devido ao pareamento de bases
entra a cauda poliA e os resduos de timina.
Por outro lado, os RNAt e os RNAr passam com o fluxo e no so
retidos na coluna, pois no h um pareamento de bases que permita a ligao.
Finalmente, o RNAm eludo da coluna aps um tratamento com um tampo
capaz de interromper as pontes de hidrognio formadas entre adenina e timina,
liberando a molcula de RNAm.
Antes que as molculas de RNAm possam ser clonadas em um
determinado vetor, elas precisam ser convertidas em uma molcula de DNA
dupla fita. O sucesso deste experimento depende da ao sucessiva de duas
enzimas diferentes: a transcriptase reversa e do fragmento de Klenow da
DNAP
I.
Inicialmente,
so
adicionadas
pequenas
molculas
de
polimerizada
pela
transcriptase
reversa,
baseando-se
na
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poro 5, onde a fita de DNA se dobra sobre si mesma. Esta sequncia pode
ento ser utilizada como um primer para a polimerizao da fita dupla de
DNA.
A segunda fita de DNA sintetizada aps a adio do fragmento de
Klenow. Esta enzima adiciona nucleotdeos complementares aos especificados
pela fita simples sintetizada pela transcriptase reversa, concluindo ento a
cadeia dupla de DNA. Para isto, o fragmento utiliza como iniciador a volta
formada pela dobra na poro 5do cDNA.
Para finalizar o processo de gerao de uma fita dupla de DNA a partir
de RNAm, a amostra tratada com a enzima RNase H que tem por finalidade
degradar molculas de RNAm molde. Finalmente, a volta de DNA formado na
extremidade 5 do cDNA desfeita pela ao da nuclease S1, que tem como
princpio geral degradar extenses de DNA fita simples. Ao final de todo o
procedimento, tem-se uma amostra que apresenta uma mistura composta de
cDNA de dupla fita correspondente aos RNAm que sejam os mais
representativos na amostra inicial. Este material ser clonado em um vetor
apropriado. Um esquema geral do procedimento envolvido na gerao de
cDNA est descrito na Fig. 32.
RNAm
Oligo (dT)
Transcriptase reversa e
polimerizao de cDNA
RNAm
cDNA
RNase H
Degrada fita de RNA
cDNA
Fragmento de
Klenow
Nuclease S1
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Aparelho de PFGE
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S n te se d e fita s in d iv id u a is
P
2
P
3
OH
OH
5
OH
OH
6
OH
OH
A n e la m e n to
OH
OH
OH
OH
OH
OH
L ig a o
P
OH
OH
Estes
buracos
constitudos
por
fita
simples
so
ento
ligase.
Sntese de oligonucleotdeos
P
2
OH
OH
OH
OH
Anelamento
OH
OH
OH
OH
Ligao
P
OH
OH
Um
par
de
oligonucleotdeos
sintticos,
denominados
de
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gerando fitas mais longas. No segundo ciclo, isto tambm acontece; porm, h
a amplificao de fragmentos mais curtos, que tm a sequncia de um iniciador
na extremidade de uma fita e o outro, na outra extremidade da fita
complementar. Em ciclos subsequentes, os fragmentos de amplificao mais
curtos vo se acumulando e, ao final de 30 ciclos, elas predominaro.
Iniciador 1
Iniciador 2
DNA fita
dupla
desnaturao
Anelamento
Extenso
Primeiro
ciclo
Segundo
ciclo
Terceiro
ciclo
cegas, este fato nem sempre verdadeiro. H diferentes tipos de Taq DNA
polimerases especializadas em distintas funes e nem todas possuem a
caracterstica de acrescentar adeninas extremidade 3 das fitas de DNA.
A clonagem de insertos gerados por PCR facilitada quando tanto o
vetor como os insertos so digeridos com a mesma enzima de restrio, pois
este procedimento gera extremidades coesivas que ainda permitem a
clonagem direcional. Contudo, alguns insertos no possuem a sequncia a ser
reconhecida pela enzima desejada e a digesto com a enzima de interesse
ocorre de maneira que a sequncia codificadora seja clonada fora da fase de
leitura. Este um ponto crtico para procedimentos que tm por objetivo a
expresso de protenas. Para facilitar estes procedimentos, fragmentos de DNA
adaptadores, contendo os fragmentos de restrio desejados, podem ser
adicionados sequncia dos insertos.
3.1.5.3.1 Adaptadores
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II-
conter
diferentes
sequncias
que
permitam
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3.2.1 Plasmdeos
Plasmdeos
extracromossomal,
so
que
molculas
apresentam
de
a
DNA
dupla
capacidade
de
fita
circular
autorreplicao.
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serem
molculas
autorreplicativas,
os
plasmdeos
so
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da
tetraciclina.
Isto
tem
implicaes
na
seleo
dos
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de
fragmentos
maiores
deve
levar
em
considerao
as
3.2.2 Bacterifagos
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Figura 41: Empacotamento do DNA no capsdeo do fago lamba durante o ciclo ltico.
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BamHI
BamHI
BamHI
Digesto BamHI
BamHI
cos
I/E
R
cos
Digesto BamHI
Seleo fragmento
de 20kb
I/E
T4 ligase
cos
R
cos
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3.2.3 Cosmdeos
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ScaI
BamHI
Cos
DNA
Tet R
Cos
Digesto BamHI
ScaI
Cos
BamHI
BamHI
Ligao T4 ligase
Cos
Cos
50kb
Formao de Partculas
de fagos
Infeco
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se
circularize
como
um
plasmdeo.
Finalmente,
os
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cromossomo
BAC
pilus
Clula F+
Clula F-
Estabilizao no pareamento
entre as clulas
Replicao e transferncia de
uma das fitas
Finalizao da transferncia
com a separao das clulas
Clula F+
Clula F+
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clonagem. Os YAC so molculas de DNA fita dupla linear que podem conter
insertos de at um megabase (1.000 Kb). Assim, podem-se isolar clones que
apresentem
sequncias
sobrepostas
de
insertos
que
contenham
Digesto com
BamHI e EcoRI
DNA de interesse
Ligao
Seleo
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elementos
genticos
que
permitem
expresso
de
protenas
de
um
determinado
gene
de
interesse
se
devem
ao
em
uma
clula
hospedeira.
Este
processo
foi
inicialmente
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transformao
por
choque
trmico
um
dos
mtodos
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mtodo
da
eletroporao
consiste
em
sujeitar
as
clulas
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Fragmentos de DNA
amplificados com
nucleotdeos
marcados
eletroforese
Mtodo manual
Mtodo automtico
Migrao
do DNA
Figura 49:
Sequenciamento de DNA.
Laser
Detector
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