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DESCIFRAMIENTO
Severo Ochoa
Marshall W. Nirenberg
Sydney Brenner
Francis Crick
Sydney Brenner
Los ARN-t suelen presentar bases nitrogenadas poco frecuentes como son la pseudouridina
(), metilguanosina (mG), dimetilguanosina (m2G), metilinosina (mI) y dihidrouridina (DHU,
UH2).
El que realiza el reconocimiento del codn correspondiente del ARN-m es el anticodn del
ARN-t y no el aminocido. Mediante un experimento se demostr que era posible transformar el
cisteinil-ARN-t mediante tratamiento con hidruro de nquel en alanil-ARN-t. Este tratamiento
convierte la cistena en alanina. De esta manera se consigui un ARN-t especfico de cisteina
que en lugar de llevar unida cisteina llevaba unida alanina. Cuando se empleo este ARN-t
hbrido para sintetizar protenas se pudo comprobar que en el lugar en el que deba aparecer
cisteina en la secuencia del polipptido apareca alanina. Por tanto, el que llevaba a cabo el
reconocimiento del codn del ARN-m era el anticodn del ARN-t y no el aminocido.
La degeneracin de l cdigo se explica teniendo en cuenta dos motivos:
Algunos aminocidos pueden ser transportados por distintas especies moleculares (tipos)
de ARN transferentes (ARN-t) que contienen distintos anticodones.
Algunas especies moleculares de ARN-t pueden incorporar su aminocido especfico en
respuesta a varios codones, de manera que poseen un anticodn que es capaz de
emparejarse con varios codones diferentes. Este emparejamiento permisivo se denomina
Flexibilidad de la 3 base del anticodn o tambaleo.
Flexibilidad de la 3 base del anticodn, tambaleo: La tercera base del anticodn, la que ocupa
la posicin 5' no est especialmente confinada de forma que en algunos casos puede
emparejarse con distintas bases del codn. En la siguiente grfica se observa que cuando en la
posicin 5' del anticodn hay una G, esta guanina puede emparejarse con un uracilo (U) de la
posicin 3' del codn o con una citosina (C).
ARN-t
ARN-tSer1
ARN-tSer2
ARN-tSer3
Anticodn
AGG + tambaleo
AGU + tambaleo
UGG + tambaleo
UNO
AAA
SON
DOS
Severo Ochoa
Marshall W. Nirenberg
La mayora de los trabajos realizados por estos tres grupos de investigacin consistieron en
sintetizar ARN mensajeros (ARN-m) para utilizarlos posteriormente como mensajeros artificiales
en un sistema acelular de traduccin "in vitro". Estos sistemas acelulares de traduccin "in vitro"
procedan de la bacteria E. coli y contenan todo lo necesario para llevar a cabo la traduccin:
ribosomas, todos los ARN transferentes, aminocidos, enzimas, etc. Sin embargo, a estos
sistemas acelulares se les quitaban los ARN mensajeros de E. coli y se les aada un ARN
sintetizado artificialmente. En estos sistemas acelulares se sintetizaba un polipptido.
Posteriormente, se comparaba la secuencia del ARN -m sinttico utilizado en el experimento
con la secuencia de aminocidos del polipptido producido.
La puesta a punto de estas tcnicas requera poder sintetizar ARN-m de forma enzimtica
(grupo de Ochoa) o de forma qumica (grupo de Khorana) y conseguir un sistema acelular
estable para sintetizar protenas (grupo de Nirenberg).
En esencia, los grupos de investigacin anteriormente mencionados realizaron los siguientes
tipos de esperimentos:
Utilizacin de homopolmeros.
Uso de copolmeros.
Empleo de polmeros de secuencia conocida.
Tcnica de incorporacin de ARN transferente.
UTILIZACIN DE HOMOPOLMEROS
Un homopolmero es un ARN sinttico que solamente contiene un tipo de ribonucletido. Por
ejemplo, el ARN sinttico UUUUUUUUUUUUU.......
Gruberg-Manago y Ochoa (1955) aislaron a partir de timo de ternera un ezima denominada
Polirribonucletido fosforilasa que tena la capacidad de sintetizar ARN a partir de
ribonuclesidos difosfato y sin necesidad de molde. Este enzima iba tomando al azar los
ribonuclkeosidos del medio para originar un ARN.
Matthei y Nirenberg (1961) consiguieron sintetizar polipptidos "in vitro" aadiendo un ARN
sinttico de secuencia conocida a un sistema acelular estable de traduccin. Usando la
Polirribonucletido fosforilasa sintetizaron poli-uridlico (poli-U: UUUUUUUUUUUUUU...).
Cuando emplearon este ARN sinttico en su sistema acelular de traduccin daba lugar a la
formacin de un polipptido que solamente contena el aminocido fenilalanina (Polifenilalanina: phe-phe-phe-phe-..). Por tanto, el triplete UUU codificaba para fenilalanina (phe).
Tambin comprobaron que el ARN snttico Poli C (Poli-citidlico: CCCCCCCCCC....) daba
lugar a un polipptido que contena solamente prolina (Poli-prolina: pro-pro-pro-pro-pro-...), por
tanto, el codn CCC significaba prolina (pro).
Poco tiempo despus, Ochoa sintetiz Poli-adenlico (Poli-A: AAAAAAAAA....) y observ que el
polipptido que apareca solamente tena el aminocido lisina (Poli-lisina: lys-lys-lys-lys-....). Por
consiguiente el triplete AAA codificaba para el aminocido lisina (lys). Tambin corrobor que el
Poli-C daba lugar a Poli-prolina. El ARN Poli-guanlico no produca protena alguna,
probablemente debido a que adquira una estructura terciara helicoidal que impeda su
traduccin a protena.
Triplete
CCC
UUU
AAA
Aminocido
prolina
fenilalanina
lisina
USO DE COPOLMEROS
El siguiente paso fue la utilizacin de copolmeros, es decir, de ARN sintticos que contenan
ms de un ms de un ribonucletido distinto. Para ello emplearon la Polirribonucletido
fosforilasa y pusieron en el medio dos ribonuclesidos distintos. Por ejemplo, U y G, de manera
que haba 5 veces ms U que G en el medio (5U:1G). Debido a que el enzima toma los
ribonuclesidos difosfato del medio al azar, la probabilidad de que tome un U del medio es 5/6,
mientras< que la probabilidad de que tome una G es 1/6. El ARN sinttico formado presentaba
una secuencia al azar de uracilos y guaninas y aparecan en l ocho tripletes diferentes con las
siguientes probabilidades:
Triplete 5 3
UUU
UUG
UGU
GUU
UGG
GUG
Probabilidad
5/6 x 5/6 x 5/6 = 125/216
5/6 x 5/6 x 1/6 = 25/216
5/6 x 1/6 x 5/6 = 25/216
1/6 x 5/6 x 5/6 = 25/216
5/6 x 1/6 x 1/6 = 5/216
1/6 x 5/6 x 1/6 = 5/216
Valor relativo
100
20
20
20
4
4
GGU
GGG
4
0,08
Cuando se analiz el polipptido que se sintetizaba con este mensajero sinttico, se observ
que contena fenilalanina (phe), cisteina (cys), valina (val), glicina (gly) y triptfano (trp).
Tomando como valor 100 el de el aminocido ms frecuente, cys y val presentaban un valor de
20 mientras que trp y gly mostraban un valor de 4 a 5. Se confirmaba que UUU significaba
fenilalanina y se deduca que 2U y 1G (UUG, UGU y GUU) codificaban para cistena y valina.
Tambin se deduca que 1U y 2G (UGG, GUG y GGU) codificaban para triptfano y glicina. Sin
emabrgo, no era posible asignar un triplete concreto para cistena y valina, o para triptfano y
glicina. Parece raro, que en estos experimentos no detectaran el aminocido leucina (leu) que
esta codificado por el triplete UUG, tampoco dedujeron que el aminocido valina estaba
codificado por 1U y 2 G (GUG). Uno e los problemas, de estos experimentos radica en asignar
el valor 100 al aminocido ms frecuente y comparar las proporciones de aminocidos
obtenidas de esta manera con las de los distintos tripletes del mensajero, ya que el aminocido
ms frecuente puede estar codificado por ms de un triplete. Oto inconveniente es que los
mensajeros sintticos producidos no presenten la frecuencia de codones esperada por azar.
Este tipo de experimentos fueron realizados por los grupos de Nirenberg y de Ochoa y no
rindieron grandes resultados.
EMPLEO DE POLMEROS DE SECUENCIA CONOCIDA
La siguiente forma de abordar el desciframiento de la clave gentica fue utilizar ARN
mensajeros sintticos de secuencia conocida obtenidos por mtodos de sntesis qumica o
enzimtica. Estos mtodos fueron empleados por Khorana y col. (1965).
Utilizando el Poli-UCde 116 residuos de longitud, ARN mensajero sinttico en el que se repite
muchas veces seguidas el dinucletido UC (UCUCUCUCUCUCUC...) obtuvieron un polipptido
que contena los residuos de serina y leucina en secuencia alternada (ser-leu-ser-leu-ser-leuser-leu-....). El Poli-UC contiene dos tripletes diferentes, UCU y CUC, por consiguiente uno de
ellos codifica serina y el otro leucina, pero no se puede determinar cul a cul.
Tambin se emplearon los mensarejos sintticos Poli-AC, Poli-AG y Poli-UG que codificacban
para los siguientes aminocidos:
ARN sinttico
Poli- AC (ACACACAC..)
Poli-AG (AGAGAGAG..)
Poli-UG (UGUGUGUG..)
Poli-UC (UCUCUCUC..)
Codones
ACA y CAC
AGA y GAG
UGU y GUG
UCU y CUC
Polipptido sintetizado
thr-his-thr-his-thr-his
arg-glu-glu-arg-glu-arg
cys-val-cys-val-cys-valser-leu-ser-leu-ser-leu-
Aminociods
treonina e histidina
arginina y glutmico
cistena y valina
serina y leucina
Polipptido sintetizado
Poli-lys, Poli-arg, Poly-glu
Poli- lys: lys-lys-lys-lys-..
Poli-arg: arg-arg-arg arg-..
Poli-glu: glu-glu-glu-glu-..
Aminocidos
lys, arg y glu
lisina
arginina
glutmico
codn lleva informacin para el mismo aminocido en diferentes especies. Hoy da existen
muchos experimentos que demuestran la universalidad del cdigo nuclear, algunos de estos
experimentos son:
Utilizacin de ARN mensajeros en diferentes sistemas acelulares. Por ejemplo ARN
mensajero y ribosomas de reticulocitos de conejo con ARN transferentes de E. coli. En
este sistema se sintetiza un polipptido igual o muy semejante a la hemoglobina de
conejo.
Las tcnicas de ingeniera gentica que permiten introducir ADN de un organismo en otro
de manera que el organismo receptor sintetiza las protenas del organismo donante del
ADN. Por ejemplo, la sntesis de protenas humanas en la bacteria E. coli.
El desciframiento del cdigo gentico dio como resultado la siguiente asignacin de
aminocidos a los 64 tripletes.
P
R
I
M
E
R
A
B
A
S
E
U
UUU Phe
UUC Phe
UUA Leu
UUG Leu
CUU Leu
CUC Leu
CUA Leu
CUG Leu
AUU Ile
AUC Ile
AUA Ile
AUG Met
GUU Val
GUC Val
GUA Val
SEGUNDA BASE
C
A
UCU Ser UAU Tyr
UCC Ser UAC Tyr
UCA Ser UAA FIN
UCG Ser UAG FIN
CCU Pro CUA His
CCC Pro CAC His
CCA Pro CAA Gln
CCG Pro CAG Gln
ACU Thr AAU Asn
ACC Thr AAC Asn
ACA Thr AAA Lys
ACG Thr AAG Lys
GCU Ala GAU Asp
GCC Ala GAC Asp
GCA Ala GAA Glu
G
UGU Cys
UGC Cys
UGA FIN
UGG Trp
CGU Arg
CGC Arg
CGA Arg
CGG Arg
AGU Ser
AGC Ser
AGA Arg
AGG Arg
GGU Gly
GGC Gy
GGA Gly
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
G
U
C
A
T
E
R
C
E
R
A
B
A
S
Gly
El cdigo gentico nos indica que aminocido corresponde a cada triplete o codn del ARN
mensajero.
El triplete de iniciacin suele ser AUG que codifica para Formil-metionina. Tambin
pueden actuar como tripletes de iniciacin GUG (Val) y UGG (Leu) aunque con menor
eficacia.
Existen tres tripletes sin sentido o codones de terminacin (FIN) que no codifican para
ningn aminocido: UAA (ocre), UAG (ambar) y UGA (palo).
La mayora de los aminocidos estn determinados por ms de un triplete, excepto la
metionina (AUG) y el triptfano (UGG) que son los nicos que poseen un solo triplete.
Cuando un aminocido est codificado por varios tripletes suele variar la tercera base, por
ejemplo, la glicina es GGX, la alanina es GCX, la valina es GUX, la treonina es ACX. Sin
embargo, hay varias excepciones en las que tambin puede variar la primera base, por
ejemplo, la arginina es AGPu y CGX, la leucina es CUX y UUPu y la serina es UCX y
AGPi.
El cdigo gentico mitocondrial es la nica excepcin a la universalidad del cdigo, de manera
que en algunos organismos los aminocidos determinados por el mismo triplete o codn son
diferentes en el ncleo y en la mitocondria.
Excepciones a la Universalidad del Cdigo
Organismo
Codn
Todos
Levadura
Drosophila
Humao, bovino
Humano, bovino
Ratn
UGA
CUX
AGA
AGA, AGC
AUA
AUU, AUC, AUA
Significado en
Cdigo Nuclear
FIN
Leu
Arg
Arg
Ile
Ile
Significado en
Cdigo Mitocondrial
Trp
Thr
Ser
FIN
Met (iniciacin)
Met (iniciacin)