Trabalho n 1

Determinao de Constantes Cinticas na

Actividade da Invertase de Clulas de
Saccharomyces bayanus

Laboratrios de Engenharia Biolgica I

2014-2015

Objectivo
Este trabalho tem por objectivo a determinao dos parmetros cinticos da
hidrlise da sacarose pela enzima invertase de clulas de Saccharomyces
bayanus.

invertase
SACAROSE

GLUCOSE + FRUTOSE
+ H2O

Pretende-se determinar os parmetros cinticos desta reaco

temperatura de 45C.

Introduo
As enzimas so biocatalisadores de natureza proteica que participam
nas reaces qumicas que ocorrem nos seres vivos. So muito especficos e
capazes de alterar o seu estado de actividade (regulveis).
Aproveitados desde a antiguidade, as enzimas, uma vez conhecidos a
sua natureza e mecanismos de aco, tm sido progressivamente utilizadas
nas indstrias alimentar, txtil e farmacutica.
A cintica de reaces catalisadas por enzimas pode ser descrita pela
equao de Michaelis-Menten, que corresponde equao :

o vmx.So

Km So

em que o a velocidade inicial da reaco, So a concentrao inicial de

substrato e mx e Km as constantes cinticas (Figura 1), sendo mx
proporcional `a concentrao total de enzima.

vo
vmx

vmx
2

Km

So

Figura 1. Representao grfica da equao de Michaelis-Menten

Os valores de mx e Km podem ser determinados atravs da medio

das velocidades iniciais da reaco a diferentes concentraes iniciais de
substrato. Geralmente, recorre-se representao grfica de LineweaverBurk, baseada num rearranjo da equao de Michaelis-Menten:

Km 1
1
.
mx S o mx

Esta equao representa uma recta e as constantes cinticas retiram-se dos

valores do declive e da ordenada na origem (Figura 2).

1/vo

1/vmx
-1/Km

1/S o

Figura 2 - Representao grfica de Lineweaver-Burk

para determinao de parmetros cinticos.

Parte Experimental

A reaco ser conduzida a 45C. As solues de substrato (sacarose) so

preparadas em tampo acetato 20 mM pH 4,5, contendo 1% (p/v) de cloreto
de clcio. Sero previamente preparadas todas as solues necessrias.
Concentrao de sacarose a usar:
10, 15, 25, 35, 45, 55, 70, 100 g/L

1. Suspenso de clulas
Preparar uma suspenso a 1% (p/v) da levedura S. bayanus em gua destilada.

2. Ensaios
2.1. Para cada concentrao de substrato, medir 25 ml de soluo de sacarose
(contendo 1% (p/v) de cloreto de clcio) para o reactor, e termostatiz-la a
45C (cerca de 5 minutos), com agitao. Executar os ensaios por ordem
crescente de concentrao.
2.2 Retirar uma amostra de 0,5 ml, correspondente ao tempo zero.
2.3 Adicionar 0,5 ml de suspenso de clulas marcando simultaneamente o
incio da contagem do tempo.
2.4 Retirar amostras de 0,5 ml de 1 em 1 minuto at se completarem 9 minutos
de reaco.

3. Determinao de acares redutores

Determinar a concentrao de acares redutores (glucose+frutose) nas
amostras pelo mtodo do DNS (apndice I).

Tratamento de Resultados
1. Determinar as velocidades iniciais de reaco, para cada concentrao
inicial de sacarose.
2. Calcular as constantes cinticas, atravs da representao grfica de
Lineweaver-Burk e por ajuste directo equao de Michaelis-Menten.

Referncias
Taipa, M.A., Gama, F.M. (2003) Estrutura e Funo de Enzimas. Em
Engenharia Enzimtica, Gama, M., Aires-Barros, M.R., Cabral, J.M.S.
(Eds), Lidel-Edies Tcnicas, Cap. 2, pp. 13-67.
Laidler, K.J. e Bunting, P.S. (1973) The Chemical Kinetics of Enzyme
Action, 2nd Ed., Clarendon Press, Oxford, UK
Shuler, M.L. e Kargi, F. (1992) Bioprocess Engineering - Basic Concepts,
Prentice hall Inc, USA

APNDICE I

Determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS

Este mtodo baseia-se na formao de um complexo acastanhado, por

reduo do cido 3,5-dinitrossaliclico (DNS) a 3-amino-5-nitrossaliclico,
que pode ser doseado colorimetricamente.

Mtodo

Medir 0,5 ml do reagente de DNS para um tubo de ensaio.

Adicionar-lhe 0,5 ml da amostra a analisar. Cobrir o tubo com uma tampa
metlica e coloc-lo durante 5 minutos num banho de gua a 100C. Arrefecer
o tubo com gua fria e adicionar-lhe 5 ml de gua destilada, agitando de
seguida num vrtex. Ler a densidade ptica desta soluo a 540 nm, contra a
amostra do tempo zero que sofreu o mesmo tratamento.

Curva de calibrao

A curva de calibrao obtida com solues-padro de glucose, com

concentraes at 1 g/l, que sofrem o mesmo tratamento das amostras.