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Sommaire :
-Objectif .. 4
Mthode par filtration sur membrane :
a-Principe 4
b- Mode opratoire 4-5
c-Milieux utiliss 5
d-Rsultats..5
e-Comparaison avec les normes .6
f-conclusion ..6
II- Analyse dune eau contamine (eaux uses) 6
Objectif .6
Prparation des chantillons ..6
Mthode par ensemencement en milieu liquide ou du nombre le plus probable
(NPP)
a- Principe 6
b-Mode opratoire : 6-7
c-Dnombrement des germes tmoignant dune pollution FCALE ..7
Recherche des coliformes fcaux et coliformes totaux :

Recherche et dnombrement des streptocoques fcaux ou Enterococcus

Recherche de spores de Clostridium Sulfito-Rducteur

d-Prsentation des Milieux 8
e-Rsultats 9-10
f-Dtermination de la source de pollution des eaux 10

Introduction :

Lobjectif de lanalyse bactriologique dune eau nest

pas deffectuer un inventaire de toutes les espces
prsentes, mais de rechercher soit celle qui sont
susceptibles dtre pathognes, soit celles qui sont
indicatrices de contamination fcales.
Lobjectif gnral est danalyser une eau use et
dterminer sa source de pollution.

II - Analyse dune eau use :

Objectif : Dterminer la source la pollution fcale
Avant densemencer les milieux, on effectue des dilutions en
cascades de la solution 10-1 la solution 10-9.

Prparation des chantillons :

Mthode par ensemencement en milieu liquide ou du nombre le

plus probable (NPP)
Elle est utilise le plus souvent dans le cas des eaux troubles.
a- Principe :
Le principe de la mthode NPP consiste ensemencer de dilutions dchantillon dans des
tubes de milieu de culture liquide.
Les dilutions sont donc incorpores dans une premire srie de tubes de milieu non
vritablement slectif : cest le test prsomptif (croissance ou non). Ce premier test est
qualitatif et permet de conclure seulement la prsence ou labsence de
microorganismes dans la prise dessai.
On ensemence une deuxime srie de tubes de milieu plus slectif en repiquant les tubes
ayant donn un rsultat positif dans la premire srie : cest le test confirmatif.
A partir de ces rsultats, on estime la quantit de microorganismes aprs dtermination du
NPP.
b-Mode opratoire :

On ensemence des dilutions successives de leau analyser (par exemple 1, 0.1, 0.01)
raison de 3 5 tubes de milieu de culture liquide par dilution

On notera le nombre de tubes inoculs prsentant une culture visible indiquant

la prsence dau moins dun micro-organisme.

Il doit tre tenu compte que si labsence de culture correspond labsence de

micro-organisme, plus dun micro-organisme peut tre responsable dune culture
positive.

Les tables, en fonction du nombre caractristique (nombre de puits positifs pour

chaque dilution) indiquent la valeur statistiquement la plus probable et son
intervalle de confiance).
C-DNOMBREMENT DES GERMES TMOIGNANT DUNE POLLUTION

FCALE:

Les germes tmoignant dune pollution fcale:

Les coliformes totaux et fcaux

Les streptocoques fcaux ou Entrocoques
Les spores de clostridium sulfitorducteurs

Recherche des coliformes fcaux et coliformes totaux :

Les coliformes totaux : correspondent des bacilles Gram ngatif, non sporul,
oxydase ngatif, arobie et anarobie facultatifs, capables de se multiplier en prsence
de sels biliaires et de fermenter le lactose avec production de dacide et de gaz en 48h
une temprature de 35- 37C.
Les coliformes fcaux ou thermotolrants : prsentent les mmes proprits mais qui
ils se dveloppent 44C dont lorigine fcale est plus nette.
Escherichia coli : correspond des coliformes thermotolrants qui produisent de
lindole partir du tryptophane 44C. Cet indicateur est le plus spcifique dune
contamination fcale.

Recherche et dnombrement des streptocoques fcaux ou Enterococcus

Definition : bactries Gram positif, sphriques ou ovodes, formant des
chainettes, non sporules, catalase ngative, possdant lantigne D, cultivant
en anarobiose 44C, et pH 9.6, et capables dhydrolyser lesculine en
prsence de bile.
Ils se rpartissent en deux genres streptococcus et enterococcus.
Recherche de spores de Clostridium Sulfito-Rducteur

Spores de clostridium sulfitorducteurs : Ces germes sont prsents dans lintestin de

lhomme, des animaux, et dans le sol. Ce sont des bactries qui sporulent . Les spores
sont des formes de rsistances qui peuvent vivre trs longtemps. Do les clostridium
sulfitorducteurs sont des indicateurs de la pollution fcale.

Milieu

Milieu

utilis

de
Rothe

Bouillo

BCP : pour
la recherche
des
coliformes

Bouillon BLBVB :

Milieu viande foie :

Milieu Lit

Milieu de

recherche des

(Test

dnombrement

Clostridium sulfito-

confirma

des coliformes

rducteurs

streptoco

( apparition du

fcaux.

trouble )

d-Prsentation des Milieux :

Streptocoques fcaux :
Filtration sur membrane

Test Prsomptif

Test Confirmatif

Milieu Slanetz au TTC

Incubation pendant 24h 37C
Colonies rouges ou roses
Prsence de Streptocoques fcaux

Ensemencement en milieu liquide

Milieu de Rothe
Incubation 37C pendant 24 48h
Rsultat positif
Trouble microbien

A partir du tube positif

Ensemencement en milieu de Listky
Incubation 37C pendant 24h 48h

Rsultat positif
violet

Trouble microbien ou dp

e-Rsultats : Milieu de Rothe (Streptocoques fcaux)

Dilution

10

Groupement des
rsultats
Nombre

10-1

10-2

10-3

10-5

10-4

+++

+++

+++

+++

+++

---

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330

Daprs la table de Mac Grady n=20
Alors : Nombre de bactries = 2.10^6UFT/100ml

Dilution

10

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

Groupement

++

+++

+++

+++

+++

+++

---

des rsultats
Nombre

Milieu BCP : (Coliformes)

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330
Daprs la table de Mac Grady n=20
Alors : Nombre de bactries = 2.10^7UFT/100ml
8

Coliformes fcaux et totaux :

Filtration sur membrane

Milieu Tergitol au TTC

Incubation pendant 24h :
Test Prsomptif

Ensemencement en milieu liq

Bouillon Lactos + Cloche de Dirham

Incubation 24 48h 37C
Tubes positifs
Prsence de gaz da
cloche

44C
37C
C.F
C.T
( colonies jaunes
Avec halo jaune )

A partir du tube positif

-Un ose dans un tube contenant le B
-Un ose dans un tube contenant leau
Incubation 44C pendant 24h 48

Test Confirmatif

Rsultat positif Rsultat ngatif

Prsence de gaz Absence de gaz
Coliformes(oui) Pas de coliformes

Eau peptone

Rsultat positif
9

Rsultat ngatif

Anneau rouge Pas danneau rouge

Existence dE .coli
Absence

Clostridium Sulfito-rducteur :
Prparer un chantillon de 5 10 ml dans un tube essai, port 80C
pendant 10min et laisser refroidir
Ensemencer sur une glose viande foie
Incuber 16 48h 37C
Dnombrer toutes les colonies entoures par une aurole noire
Rsultats :
Pour le milieu Viande foie (Clostridium sulfito rducteurs), on a obtenu
seulement le rsultat de tube de dilution 10^-4, ce rsultats est positif, car on
obtient une aurole noire, par contre les autres tubes de dilution 10^-1, 10^-2 et
10^-3, on nobtient pas les rsultats parce que on ne peut respecter le temps
dincubation, on a dpass 48 h.

Les rsultats de tests confirmatifs :

Milieu de litsky :
Dilution

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

Groupemen

+++

+++

+++

+++

- --

t des
rsultats
Nombre

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330

Daprs la table de Mac Grady n=20
10

Alors : Nombre de bactries =2.10^6UFT/100ml

Milieu BLBV :
Dilution

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

Groupemen

+++

+++

+++

+++

- --

t des
rsultats
Nombre

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330

Daprs la table de Mac Grady n=20
Alors : Nombre de bactries =2.10^7UFT/100ml

Milieu Eau peptone :

Dilution

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

Groupemen

+++

+++

+++

+++

- --

t des
rsultats
Nombre

A partir de ces rsultats, On choisit le nombre caractristique 330

Daprs la table de Mac Grady n=20
Alors : Nombre de bactries =2.10^7UFT/100ml

f- Conclusion :
Calcul le rapport CF/SF :
R=2.10^7 /2.10^6=10

R 4

Alors lorigine de pollution fcale est source exclusivement humaine.

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