Revisin de Mtodos Espectroscpicos

y elaboracin de curva estndar de protena

Hernndez Pando Daniel Alejandro; Lagar Quinto Frida; Lpez Eric; Casas Mara Fernanda.
Bioqumica Experimental. Grupo: 3 Fecha: 16 de febrero de 2016
Resumen
Se realiz una curva estndar empleando el
mtodo de Lowry para la cuantificacin de
Albmina Srica Bovina (BSA), utilizando una
longitud de onda de 750nm. Para ello se
prepararon ocho soluciones con diferentes
concentraciones de BSA y se aadieron los
reactivos A y B del mtodo de Lowry.
Posteriormente se registraron los valores de
absorbancia y se procedi a graficarlos.
As mismo, se midi la absorbancia de dos
muestras problema. Estos valores se
interpolaron en la curva estndar, con el fin de
conocer su concentracin de BSA.
Palabras clave: Mtodo de Lowry, BSA,
concentracin, espectrofotometra
Introduccin
La albmina es una protena presente en la
sangre, que es producida en el hgado. Su
cuantificacin puede resultar til para algunos
aspectos relacionados con la salud. En este
trabajo se utilizar Albmina Srica Bovina
(BSA, por sus siglas en ingls) para la
determinacin de la cantidad de dicha protena
en dos muestras problemas.
Existen diversas metodologas para determinar
la presencia de protenas en una solucin. El
mtodo de Lowry
(1951) es un mtodo
colorimtrico de valoracin cuantitativa de las
protenas. A la muestra se aade un reactivo
que forma un complejo coloreado con las
protenas, siendo la intensidad de color
proporcional a la concentracin de protenas,
segn la ley de Lambert-Beer A= .l.c.
Este mtodo consta de dos etapas: 1) Los
iones Cu2+, en medio alcalino de la solucin
cabonato-tartrato-cobre (reactivo A) se unen a
las protenas formando complejos con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos.
Estos complejos Cu2+-protena tienen un color
azul
claro.
Adems,
provocan
el
desdoblamiento de la estructura tridimensional
de la protena, exponindose los residuos
fenlicos de tirosina que van a participar en la

segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se

mantiene en solucin alcalina en forma de su
complejo con tartrato. 2) La reduccin, tambin
en medio bsico, del reactivo de FolinCiocalteau (reactivo B), por los grupos fenlicos
de los residuos de tirosina y el triptofano,
presentes en la mayora de las protenas,
actuando el cobre como catalizador. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau
es el cido fosfomolibdotngstico, de color
amarillo, que al ser reducido por los grupos
fenlicos da lugar a un complejo de color azul
intenso. (1,2)
Dado que el mtodo a emplear es un mtodo
que mide la absorbancia de una sustancia
colorida, se utiliza un espectrofotmetro como
instrumento de medicin. De acuerdo con la ley
de Lambert-Beer, las mediciones realizadas
guardan una correlacion con la concentracin
de las soluciones, por lo que se debe realizar
una cuerva estndar. Una curva estndar, que
es una grfica de referencia construida a partir
de concentraciones conocidas de una
sustancia que se utiliza para determinar la
cantidad de esta sustancia presente en una
muestra incgnita (3).
Conociendo las bases de este mtodo,
buscaremos comprobar la relacin proporcional
que existe entre las concentraciones y la
absorbancia para posteriormente poder usar
esa curva como referencia a una absorbancia
pero sin conocer la concentracin. Teniendo las
mismas condiciones y como nica variable
controlable la concentracin de protena
sabremos la concentracin de una muestra
problema.
Materiales y mtodos.
Primeramente se uso BSA
a una
concentracin de 1mg/ml para tener 8 tubos a
distintas concentraciones, siendo el tubo 1 con
concentracin 0 de BSA y se fueron aadiendo
5 L ms a cada tubo de manera ascendente,
siendo el tubo 8 con 35L de BSA. El volumen
de agua inicial fue de 450 L y se fue

disminuyendo en 5L por tubo para asi tener el

mismo volumen en todos los tubos.
Posteriormente se aadi reactivo A de Lowry
(500L) y se mezclo para despus aadir
250L de reactivo B. Se incub por 30 minutos
y se procedi a leer en el espectrofotmetro
usando el tubo 1 como blanco y a una longitud
de onda de 750nm.
Para finalizar se midi la muestra problema a
dos volmenes distintos (25 y 50 L) para
despus analizar los datos.
Resultados
Los
resultados
obtenidos
de
manera
experimental al graficar la concentracin de
BSA contra la absorbancia registrada con el
espectrofotmetro a 750nm se muestran en la
grfica siguiente (Fig.1). En ella podemos
observar con claridad que no se sigue una
relacin lineal entre la concentracin y la
absorbancia. Incluso es posible ver algunos
puntos que quedan fuera de la tendencia de la
grfica.

Absorbancia

0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0

0.8
0.7
0.6
0.5
Absorbancia 0.4
0.3
0.2
0.1
0

10 15 20 25 30 35

Concentracin (mg/mL)

Fig. 2. Relacin entre la concentracin de BSA y la

absorbancia con reactivo A distinto. Los puntos que salan
de la tendencia en la Fig.1 se graficaron por separado, ya que
fueron obtenidas bajo condiciones experimentales distintas. Se
observa que entre estos puntos se guarda una buena
correlacin y muestran una tendencia homognea y constante.
La regresin lineal aplicada a la grfica se muestra en la figura.

Por otra parte, se graficaron las soluciones con

los reactivos iniciales (Fig.3) para observar su
tendencia y poder discriminar entre las dos
curvas obtenidas.

10 15 20 25 30 35

Concentracion (mg/mL)

Fig. 1. Relacin entre la concentracin de BSA y la

absorbancia. La grfica muestra todos los puntos obtenidos
experimentalmente en conjunto. Las concentraciones de 10 y
35 mg/mL quedan fuera de la grfica, lejos de los dems
valores obtenidos.

Sin embargo, se detect una variacin en los

reactivos que podra haber causado las
fluctuaciones obtenidas en la grfica original.
Dado que las soluciones con 10 y 35 mg/ml
BSA fueron aquellas en las que vari el reactivo
se procedi a graficar estas absorbancias en
una curva independiente de las otras seis
soluciones de BSA (Fig.2).

f(x) = 0.02x
R = 1

Las absorbancias obtenidas en las muestras

problema se muestran a continuacin (Fig.5).
Para la muestra A la absorbancia fue de 0.22,
mientras que para la muestra B fue de 0.43.
Para obtener la concentracin de BSA
contenida en dichas muestras se interpol en la
grfica de la Fig.2 a partir de la grfica obtenida
mediante la regresin lineal ajustada a cero.
Fig. 3. Relacin entre la concentracin de BSA y la
absorbancia con reactivo A original.
Las soluciones
tratadas con los reactivos originales se graficaron tambin.
Observamos una buena correlacin entre los valores
obtenidos y una tendencia no tan homognea y constante. El
punto correspondiente a la solucin de 20 mg/mL se sale

0.8

0.14
0.12

0.7

f(x) = 0x
R = 1

0.1

0.6

0.08

0.5

Absorbancia 0.06

Absorbancia 0.4
0.3

0.04

0.2

0.02
0

10

15

20

25

30

Concentracin (mg/mL)

f(x) = 0.02x
R = 1

0.43

0.22

Fig. 5. Interpolacin de las muestras problema. Las

0.1
muestras problema
A y B, cuyas absorbancias fueron de 0.22 y
0.43 respectivamente,
se interpolaron en la grfica cuya curva
0
est descrita 0por 5 la10 ecuacin
y= 300.0208
Las
15 20 25
35 40x.
concentraciones obtenidas mediante este tratamiento fueron
Concentracin
10.57692308 y 20.67307692
mg/mL. (mg/mL)

En las grficas de las figuras 3 y 4 podemos

observar
un
comportamiento
bastante
aceptable y constante. Pero como referencia se
muestra una grfica terica, obtenida a partir
de los datos proporcionados por la profesora
(Fig. 4).
Discusin
0.8

En base a los datos obtenidos de manera

experimental se realiz la primera grfica que
0.6
se observa en la figura 1. En ella se aprecia
0.5
bastante inconsistencia en la tendencia de los
Absorbancia 0.4
datos. Esto fue debido al uso de reactivos A
0.3
preparados en distintos momentos y bajo
0.2
distintas condiciones, los cuales muy
0.1
seguramente
se
encontraban
a
una
0
concentracin distinta. Recordemos pues que
0 5 10 15 20 25 30 35 40
el reactivo A es la Solucin de carbonatoConcentracin (g/L)
tartrato-cobre, la cual le da la coloracin inicial
a la solucin con BSA debido a los complejos
el in Cu2+ forma con las protenas. Si el
Fig. 4. Relacin entre la concentracin de BSAque
y la
0.7

f(x) = 0.02x
R = 0.99

absorbancia con datos tericos. La grfica muestra la

tendencia de los valores tericos proporcionados por la
profesora. Se observa una tendencia similar a la que hay en las
grficas experimentales.

reactivo estuviera menos concentrado, habra

menos iones Cu disponibles y se vera una
coloracin an ms tenue de lo habitual y aun
agregando el reactivo B no se alcanzara a
observar
la
intensidad
de
azul
correspondiente. En la grfica de la figura 3
observamos este comportamiento, ya que las
absorbancias registradas van entre 0 a 0.14, es
decir, son valores muy pequeos. Las muestras
problema A y B arrojaron valores de
absorbancia superiores a este rango, por lo que
no pueden ser interpoladas en la grfica 3.

se tuvo que repetir. Mientras tanto, el reactivo A

se termin y no fue suficiente para la ltima
solucin. Es por ello que las soluciones con 10
y 35 mg/mL fueron preparadas con el segundo
reactivo A y fueron utilizadas para realizar la
curva patrn dentro de la cual si es posible
interpolar las absorbancias de las muestras A y
B. Si se comparan las grficas de las figuras 2
y 4, se observa que ambas tienen un intervalo
de absorbancias similares, por lo que la curva
realizada con datos tericos respalda la curva
utilizada para calcular las concentraciones de
las muestras problema.

Mientras que la grfica de la figura 2 muestra

mayor congruencia con las lecturas de
Bibliografa
absorbancia de las muestras problema. Esta
grfica fue elaborada a partir de datos que se 1. O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y
R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275
obtuvieron con una segunda versin del
reactivo A. Las absorbancias registradas para
(1951)
esta grafica fueron superiores a las de la 2. Snchez, S. Material de apoyo para los
grfica 3, e incluso se poda notar visualmente
alumnos de Bioqumica Experimental.
que la intensidad del color azul las soluciones
(2013) Facultad de Qumica, UNAM.
preparadas con este reactivo era superior con
Pags.10 y11
respecto a las soluciones preparadas con el 3.Curva de calibracin de protenas totales.
reactivo original. En el caso particular del
Recuperado
de
equipo, por errores de pipeteado, el tubo cuya
http://trabajosmedicos.blogspot.mx/2011/
concentracin deba ser de 10 mg/mL tena un
08/curva-de-calibracion-de-proteinas.html
volumen distinto a todos los dems, por lo que

Consultado el: 14 de febrero de 2016