APUNTES DE CROMATOGRAFA

PROF. ZULEMA MALDONADO R.

CROMATOGRAFA PLANA
Los mtodos de cromatografa plana incluyen la cromatografa en capa fina, TLC, cromatografa en papel,
PC, y la electrocromatografa, EC.
En todos se emplea una capa horizontal y delgada de un material que es a la vez soporte, o que se coloca
sobre una superficie de vidrio, plstico o metlica.
La fase mvil se mueve a travs de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o
con un potencial elctrico.
La cromatografa plana en algunas ocasiones se denomina cromatografa bidimensional, lo que no es
estrictamente correcto puesto que la fase estacionaria tiene un grosor definido.
En general, la cromatografa plana se basa en la tcnica de la capa fina, que es rpida, tiene una mejor
resolucin y es ms sensible que la cromatografa en papel.

Cromatografa en capa fina

Los tipos de fases mviles y estacionarias as como las aplicaciones de cromatografa en capa fina son
muy similares a las de la cromatografa de lquidos .
Una importante aplicacin de la cromatografa en capa fina, es la de servir como gua para el desarrollo de
las condiciones ptimas para realizar separaciones por cromatografa de lquidos en columna.
Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo costo de los ensayos en capa fina.
Estos ensayos, segn cromatografistas, deberan preceder siempre al uso de la columna.
La cromatografa en capa fina se ha convertido en una importante herramienta en la industria de las
drogas para los controles de la pureza del producto.
Se utiliza en laboratorios clnicos, en estudios bioqumicos y biolgicos y en laboratorios industriales.
Separaciones en capa fina
Las separaciones en capa fina tpicas se hacen en placas horizontales de vidrio o plstico que se recubren
con una capa delgada y adherente de partculas finamente divididas, la que constituye la fase
estacionaria.

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Placas de capa fina

Los tamaos comunes de placa en centmetros son 5 x 20, 10 x 20 y 20 x 20.
Las placas comerciales son de dos tipos: convencional y de alta resolucin.
La convencional tiene una capa delgada de 200 a 250 m con partculas de 20 m o ms. Presenta unos
2000 platos tericos en 12 cm, con un tiempo de desarrollo de 25 min.
La de alta resolucin tienen pelculas ms delgadas, 100 m, y un dimetro de partcula de 5 m o
menos. Ellas permiten mejores separaciones y en menos tiempo. Presenta 4000 platos tericos en 3 cm y
con 10 min de desarrollo. Tienen menor capacidad de carga.

Aplicacin de la muestra
Es el aspecto ms crtico de esta cromatografa, especialmente en medidas cuantitativas.
Se aplica una disolucin del 0,01 al 0,1 % de la muestra como una mancha a 1 o 2 cm del extremo de la
placa.
La mancha debera tener un dimetro mnimo, 5 mm, para una aplicacin cualitativa y menor para anlisis
cuantitativo.
Para disoluciones diluidas se realizan 3 o 4 aplicaciones superpuestas secando la zona entre las
aplicaciones.
La aplicacin se hace por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra.
Desarrollo de la placa
Es un proceso anlogo a la elucin en la cromatografa de lquidos, en el cual la muestra es transportada
por la fase mvil a travs de la fase estacionaria.
Una vez depositada la muestra, marcada su posicin y evaporado el disolvente, se coloca la placa en un
recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente con el que se efectuar el desarrollo,
cuidando que ste no se ponga en contacto directo con la muestra.
Despus que el disolvente ha recorrido las partes de la longitud de la placa se retira sta del recipiente
y se seca.

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Localizacin de los analitos en la placa

Existen varios procedimientos, denominados visualizacin o revelado, para localizar los componentes de la
muestra en la placa.
Comnmente se utilizan dos mtodos con la mayora de mezclas de sustancias orgnicas:
1. Colocar la placa en una cmara de yodo.
2. Nebulizar sobre la placa una disolucin de H2SO4.
Se utllizan tambin otros reactivos especficos para localizar los componentes separados.
Adems, se utiliza para la deteccin de componentes, agregar un material fluorescente a la fase estacionaria
y una vez realizado el desarrollo de la placa, sta se examina bajo luz UV.
Se observa que los componentes de la muestra eliminan la fluorescencia del material.

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Caractersticas generales de la cromatografa en capa fina

Los parmetros y ecuaciones desarrolladas para cromatografa en columna, se pueden aplicar, en su mayora,
a la cromatografa en capa fina, pero se debe agregar el factor de retraso o R F.
Factor de retraso
En la Figura anterior, el cromatograma muestra dR y dM , distancias lineales que permiten determinar el RF de
un soluto.

RF

dR
dM

donde dR y dM son las distancias lineales medidas desde la lnea de aplicacin. Los valores de RF varan de
cero a uno.

Factor de capacidad
Los parmetros de la cromatografa ya vistos se adaptan con facilidad a la cromatografa en capa fina.
Slo se debe relacionar dR y dM con tR y tM, que aqu corresponden a los tiempos necesarios para que la fase
mvil y el soluto recorran una distancia determinada, en este caso dR.
El tiempo de residencia del soluto en la fase mvil es igual a la distancia que recorre dividido por la velocidad
lineal del disolvente u,
tM = dR / u
pero, el soluto no alcanza este punto hasta que la fase mvil ha recorrido la distancia d M.
tR = dM / u
sustituyendo estas ecuaciones en k = (tR - tM) / tM , se obtiene

dM dR
dR

el factor de capacidad se puede expresar en funcin del RF:

1 dR / dM
dR / dM

1 RF
RF

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Alturas de plato
Alturas de plato aproximadas para un tipo de de relleno tambin se pueden deducir en cromatografa en capa
fina.
El nmero de platos tericos viene dado por la ecuacin:

d
N 16 R
w

donde dR y W se definieron en la Figura anterior

La altura de plato viene dada entonces por H = dR / N

Cromatografa en capa fina cualitativa

Los datos de un solo cromatograma no dan la informacin suficiente para identificar los distintos componentes
de una mezcla, debido a la variacin del RF con el tamao de muestra , el espesor de la placa y las
condiciones presentes durante el desarrollo.
Adems, existe la posibilidad que dos componentes diferentes tengan RF iguales en una condicin
determinada.
Variables que influyen en los RF
El grosor de la fase estacionaria
La humedad que contienen las fases mvil y estacionaria
La temperatura
El grado de saturacin de la cmara de desarrollo con los vapores de la fase mvil
El tamao de la muestra
Uso de patrones
No es posible un control absoluto de las variables del RF, pero se puede llevar patrones junto con las muestras
para ayudar en la identificacin.
La coincidencia de los valores RF entre alguna de las manchas en la muestra desconocida con el de alguna de
los patrones es una gran evidencia para la identificacin, pero siempre es necesario una confirmacin, repetir
la determinacin con diferentes fases mviles y estacionarias.

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Mtodos de elucin
La identificacin de los analitos separados tambin se puede confirmar raspando y disolviendo las manchas
en disolvente adecuado, se separa de la fase estacionaria por filtracin y se identifica por E.M., RMN o IR.
Anlisis cuantitativo
Comparando el rea de la mancha de patrones con el analito (semicuantitativo)
Raspar la mancha de la placa, extraer el analito de la fase estacionaria y determinarlo por mtodo fsico o
qumico adecuado.