UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA

SELVA

FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE CIENCIAS AMBIENTALES

TRABAJO ENCARGADO

Espectrofotometra UV-Visible y la ley de Lambert-Beer

Curso:

Anlisis Instrumental

Alumno:

Rodrguez Zevallos, Renzo Gilbert

Profesor:

Ing. Dionisio Montalvo, Franklin

Ciclo:

2015-I

Fecha:

04/05/15

TINGO MARA

I.

INTRODUCCION

La mayora de los problemas analticos reales comienzan con una compleja

mezcla a partir de la cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno o ms
componentes de la misma.

Se pueden plantear las siguientes cuestiones: una, de carcter cualitativo (de

qu componente se trata?), y otra de carcter cuantitativo (cunto hay de ese
componente?).

Para ello, se puede utilizar el mtodo instrumental de anlisis, como es la

espectrofotometra para medir la absorcin de radiacin ultravioleta y visible
que interacta con la materia (tomos y molculas), la misma es considerada
una tcnica cuali y cuantitativa basndose en la medicin del color o de la
longitud de onda de una radiacin e intensidad de la misma.

Se har una descripcin del mtodo espectrofotomtrico para dar al lector una
idea del empleo del mismo y su utilidad en los ensayos de sustancias.

II.

II.1.

REVISIN DE LITERATURA

Fundamento Tcnico.
Como es sabido, las tcnicas espectroscpicas se basan en la
interaccin de la radiacin electromagntica con la materia. A travs de
esta interaccin las molculas pueden pasar de un estado energtico, m,
a otro estado energtico distinto, l, absorbiendo una cantidad de energa
radiante igual a la diferencia energtica existente entre los dos niveles:
El - Em. Para conseguir esto, las molculas absorben un fotn de una
radiacin tal que:

E = h=hc/k
h = Constante de Planck= 6.63.10-34 J.s
n = Frecuencia de la radiacin=c/k
c = velocidad de la luz=3.1010 cm.s-1
= longitud de onda
Estos trnsitos energticos son los que dan origen a los espectros que,
en definitiva, no son ms que el registro de las distintas m(o k) a las que
se producen estos trnsitos energticos movimientos vibracionales de
las molculas, de la rotacin del mismo etc. Las molculas pueden
interaccionar con radiaciones electromagnticas de un rango muy amplio
de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopias
segn las diferentes regiones. Un esquema podra ser el siguiente:

La espectroscopia UV-Visible (espectros electrnicos), se debe a la

transicin de los electrones ms externos de los tomos de las
molculas, desde niveles fundamentales a niveles ms altos de energa.
II.2.

Ley de Lambert-Beer.
Si se hace incidir radiacin monocromtica sobre una muestra con una
concentracin C de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda
, la intensidad de la radiacin que la atraviesa, I, est relacionada con
la intensidad incidente

I0 y con el espesor de la muestra,l , por la

expresin:

Habitualmente, el cociente I/I0 se denomina transmitancia de la

muestra y se suele expresar como porcentaje de luz transmitida : I/I0
100. Por otra parte, se define la absorbancia de la muestra como:

log1/T. Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes

que se obtienen directamente en el espectrofotmetro.

Segn estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresin que

se conoce con el nombre de la ley de Lambert-Beer:

Donde

es

la absortividad molar (una medida de la radiacin

absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada

longitud de onda y en unas condiciones experimentales determinadas;
tambin se denomina coeficiente de extincin molar si, como es
frecuente, la concentracin se expresa en moles por litro.
Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta
de un determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente,
es proporcional a la concentracin molar de la muestra, c, lo que
constituye el fundamento del anlisis espectrofotomtrico cuantitativo.
Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de
la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por
ello antes de proceder al anlisis de una muestra es preciso comprobar
experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se
cumple,

obteniendo

la

curva

de

calibrado

que

relaciona

las

absorbancias con las concentraciones.

La ley de Lambert-Beer puede tambin aplicarse al anlisis cuantitativo
de mezclas de dos o ms sustancias, siempre que sus respectivos
espectros

de

absorcin

sean

lo

suficientemente

distintos.

El

procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva,

de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada
uno de los componentes. As, para una mezcla de dos componentes, 1 y
2, que absorben radiacin de una misma longitud de onda, se cumplir
que:

Supongamos, entonces, que nuestro problema es el anlisis de una

mezcla de dos sustancias. En primer lugar se habr de registrar el

espectro de absorcin de cada una de ellas por separado, con lo que

nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones siguientes:
a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes
de onda de trabajo. El problema se reduce, entonces, a sendos anlisis
por separado, cada uno en la zona del espectro en donde cada
componente de la mezcla se presenta como nico absorbente.
b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de
longitudes de onda. En este caso se han de seleccionar dos longitudes
de onda diferentes, 1 y 2, y obtener, con disoluciones de las
sustancias puras, las respectivas absortividades molares a cada longitud
de onda: 1

, 1

, 2

, 2

. Con estos datos se pueden determinar

las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a partir de las

medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de
trabajo seleccionadas, A1y A2. El clculo se realiza resolviendo el
siguiente sistema de 2 ecuaciones con 2 incgnitas:

II.3.

Instrumento de la Luz UV-Visible (espectrofotmetro).

La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un

espectrofotmetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma
o red de difraccin) que controla la longitud de onda de la radiacin que
se hace incidir sobre la muestra. La radiacin no absorbida se detecta y
mide convenientemente. La absorbancia de la muestra se compara con
la de una referencia que consta estrictamente de disolvente.
Las instrucciones generales de manejo de un espectrofotmetro seran:
1.- Encendido de lmparas:
1.1. Lmpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido
instantneo.
1.2. Lmpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita
un calentamiento previo.
2.- Adaptacin del espejo a la lmpara adecuada, atendiendo al rango
de longitud de onda de trabajo (slo en los espectrofotmetros no
automticos).

3.- Seleccionar el valor de longitud de onda

con el mando

correspondiente.
4.- Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del
mando Ajuste del cero, hasta que aparezca CERO en la pantalla.
5.- Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la
referencia, que normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando
para ello el mando A-T.
6.- Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra.
Las cubetas empleadas en el espectrofotmetro (1.00 cm de espesor)
deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus
caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas
con papel ordinario por el carcter abrasivo de ste sino con un papel
suave.
II.4.

Aplicacin

de

la

ley

de

Lambert-Beer

con

el

uso

del

Espectrofotmetro.
Una

de

las

aplicaciones

prcticas

de

mayor

inters

de

la

espectrofotometra de absorcin UV-Visible es la del anlisis cuantitativo,

basada en la aplicacin de la ecuacin de Lambert-Beer.
II.4.1. Materiales a usar.
- Espectrofotmetro UV-Visible y 6 cubetas de plstico.
- Matraces aforados de 10 mL
- Vasos de precipitados de 100 mL
- Pipetas graduadas de 10 mL y de 5 mL.
- 4 Frascos de almacenamiento.
- Disolucin de Azul de Bromotimol en medio cido (HA) de
-

concentracin 5.10-5 M
Disolucin de Azul de Bromotimol en medio bsico (A-) de

concentracin 5.10-5 M
Disolucin diluyente cida: HCl 10-2M.
Disolucin diluyente bsica: NaOH 10-2 M.

II.4.2. Procedimiento Experimental.

a) Preparacin de disoluciones de la forma cida del Azul de

Bromotimol:
Tomando como base una disolucin de partida, facilitada por el
profesor, de Azul de Bromotimol 5.00.10-5 M en medio cido (HCl),
preprense por dilucin las siguientes disoluciones:
Disolucin A: En un matraz de 10 mL pipetear 8 mL de disolucin de
partida y En rasar con diluyente cido (HCl).
Disolucin B: En un matraz de 10 mL pipetear 6 mL de disolucin de
partida y enrasar con diluyente cido.
Disolucin C: En un matraz de 10 mL pipetear 4 mL de disolucin de
partida y enrasar con diluyente cido.
Disolucin D: En un matraz de 10 mL pipetear 2 mL de disolucin de
partida y enrasar con diluyente cido.

b) Preparacin de disoluciones de la forma bsica del Azul de

Bromotimol:
Tomando ahora como base una disolucin de partida, facilitada
por el profesor, de Azul de Bromotimol 5.00.10-5 M en medio
bsico (NaOH 10-2M), preprense por dilucin las mismas
disoluciones que en el apartado anterior pero ahora enrasando
con diluyente bsico (NaOH).
c) Obtencin de los espectros de la forma cida y bsica del
indicador:
Para ello vamos a utilizar las disoluciones A respectivas
preparadas anteriormente.
En cada caso, llenaremos una cubeta con la referencia adecuada
y otra con la muestra a medir. A continuacin, iremos midiendo el
valor de la absorbancia de la muestra a distintas longitudes de
onda entre 400 y 680 nm, haciendo las medidas a intervalos de 10
nm. Es importante tener en cuenta que, cada vez que se
modifique el valor de la longitud de onda, hay que ajustar de
nuevo el cero de absorbancia con la referencia.

Finalmente, se representan los datos en papel milimetrado, de

manera que figure la absorbancia A en ordenadas frente a
longitud de onda en abcisas:

c) Obtencin de las rectas de calibrado para las formas cida

y bsica del Azul de Bromotimol:
A la vista de los espectros de absorcin de la forma cida y
bsica del indicador, se apreciar un mximo para la forma
bsica en torno a 620 nm y un mximo para la forma cida

alrededor de 440 nm. Elegidos estos valores de longitud de

onda como los ms idneos, se mide la absorbancia de cada
una de las disoluciones preparadas en el apartado a)
(disoluciones de la A a la D), ajustando previamente el cero de
absorbancia a cada longitud de onda con la referencia
adecuada. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos
tablas correspondientes, una para la forma cida y otra para la
forma bsica, que sern del tipo:

Las rectas que se obtienen son del tipo y ax, de forma que al
compararlas con la ley de Lambert-Beer se deduce que:

De donde:

Como la longitud de la cubeta es de 1.00 cm se obtiene el valor de

en M cm .
-1

-1

Por tanto habremos determinado las cuatro absortividades molares que

estbamos buscando:

III.

CONCLUSIONES

Se ha llegado a la conclusin de que la espectrofotometra es un mtodo

analtico indirecto porque se basa en la medicin de la absorbancia o
transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la actualidad para la
identificacin de un analito en una muestra problema.
La espectrofotometra es el mtodo ms usado, debido a que es sencillo,
especfico y sensible

IV.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Skoog, Douglas A. West, James F. QUMICA ANALTICA, Editorial Mc

Graw Hill.

Morrison Boyd. QUMICA ORGNICA

Abril N. Paper espectrofotometra y sus aplicaciones [ EN LINEA]

http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETR%C3%8DA.pdf