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Contenido
Presentacin del manual ................................................................................................. 2
Seguridad en el laboratorio de Bioqumica ................................................................... 4
Reactivos en el laboratorio de Bioqumica .................................................................... 5
Equipos en el laboratorio de Bioqumica ....................................................................... 8
Modalidades de conduccin del proceso de enseanza-aprendizaje .................. 13
Prctica 1. Purificacin de lactato deshidrogenasa (LDH) ........................................ 14
Prctica 2. Medicin de actividad enzimtica de la LDH .......................................... 23
Prctica 3. Cuantificacin de protenas por el mtodo de Bradford ........................ 29
Prctica 4. Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes ................. 35
Prctica 5. Cromatografa de intercambio inico ...................................................... 45
Prctica 6. Cromatografa de afinidad ........................................................................ 50
Prctica 7. Cintica enzimtica .................................................................................... 55
Bibliografa ....................................................................................................................... 59
Anexo A. Rbricas y lista de cotejo .............................................................................. 61
Anexo B. Tabla de sulfato de amonio ......................................................................... 64
Anexo C. Propuestas de organizacin de las prcticas en el trimestre .................. 65
o
repetida
en
caso
de
ingestin.
Puede
ser
mortal
si
se
absorbe
por
la
piel.
Evite
respirar
los
vapores.
Llevar
guantes
y
lentes
de
proteccin.
Metanol.
Lquido
inflamable,
es
txico
por
inhalacin,
txico
por
ingestin,
txico
por
absorcin
de
la
piel.
Afecta
ojos,
rin,
hgado,
corazn,
sistema
nervioso
central.
NAD.
Su
ingesta
produce
irritacin
en
el
hgado
y
los
riones,
provoca
irritacin
ocular
grave.
Sulfato
de
amonio.
Su
ingestin
es
txica.
N,
N,
N,
N-Tetrametiletilendiamina
(TEMED).
Extremadamente
destructivo
para
mucosas
y
tracto
respiratorio
superior,
ojos
y
piel.
Su
inhalacin
puede
ser
fatal.
El
contacto
prolongado
puede
causar
severa
irritacin
y
quemaduras.
Utilizar
guantes
apropiados
y
lentes
de
proteccin
y
manipular
en
campana
de
extraccin.
Altamente
inflamable,
mantener
lejos
del
calor,
chispas
y
flamas.
Persulfato
de
amonio.
Extremadamente
destructivo
para
mucosas
y
tracto
respiratorio
superior,
ojos
y
piel.
Su
inhalacin
puede
ser
fatal.
El
contacto
prolongado
puede
causar
severa
irritacin
y
quemaduras.
Utilizar
guantes
apropiados
y
lentes
de
proteccin
y
manipular
en
campana
de
extraccin.
Reactivo
de
Bradford.
Muy
txico
por
inhalacin.
Txico
por
ingestin.
Txico
por
absorcin
de
la
piel.
Afecta
el
hgado,
la
sangre,
la
mdula,
los
ojos,
los
riones,
el
corazn
y
el
sistema
nervioso
central.
Fuentes
de
poder
La
fuente
de
poder
es
un
aparato
que
tiene
por
funcin
proveer
de
energa
elctrica
a
la
cmara
de
electroforesis.
El
voltaje,
el
amperaje
y
el
tiempo,
pueden
ser
regulados
de
acuerdo
a
las
necesidades
del
investigador.
Esta
fuente
de
poder
provee
voltaje,
corriente
o
poder
constante
para
la
electroforesis
(funcionando
con
el
valor
especificado
para
el
parmetro
constante).
Micropipetas
Las
micropipetas
son
instrumentos
que
permiten
medir
pequeos
volmenes
de
lquidos.
Los
volmenes
que
pueden
ser
tomados
por
las
micropipetas
dependen
de
la
marca,
pudiendo
ser
de
volumen
fijo
o
de
volumen
variable
(entre
0.1
y
1000
L).
En
todos
los
casos
el
principio
es
a
travs
de
pistones
que
generan
vaco,
lo
que
permite
que
el
volumen
de
lquido
deseado
ingrese
a
la
punta
desechable.
El
uso
correcto
de
las
micropipetas
permite
medir
con
exactitud,
en
forma
repetida
y
tomar
de
distintas
soluciones
simplemente
cambiando
las
puntas
de
plstico,
que
habitualmente
se
utilizan
en
forma
estril.
El
tipo
de
puntas
empleadas
depende
del
tipo
de
micropipeta
y
por
lo
general
se
sigue
un
cdigo
de
colores
entre
el
instrumento
y
la
punta,
siendo
de
color
azul
para
el
rango
de
200-1000
L,
de
color
amarillo
para
el
de
2-200
L
y
blancas
para
el
de
0.1
a
10
L.
Como
recomendaciones
11
generales
de
uso
se
sugiere
no
mover
el
ajustador
de
volumen
por
arriba
o
por
abajo
del
intervalo
especificado,
no
usar
la
micropipeta
sin
la
punta
desechable
y
no
invertir
la
posicin
de
la
micropipeta
cuando
haya
lquido
en
la
punta
desechable.
Para
evitar
contaminar
las
soluciones
es
importante
utilizar
puntas
nuevas
y
diferentes
para
cada
solucin.
12
13
entre
las
propiedades
fisicoqumicas
de
protenas
y
algunas
metodologas
bsicas
que
suelen
ser
usadas
para
su
purificacin.
Propiedad
Consideraciones
Metodologas de purificacin
Fisicoqumica
*
Solubilidad
Cromatografa
de
intercambio
hidrofbico.
Dilisis.
Carga
Proporcin de aminocidos
Estabilidad
fibrosas, protenas
estructurales.
centrifugacin al equilibrio.
Termoestabilidad, pH.
Unin
especfica
Tabla
1.
Resumen
de
las
principales
propiedades
fisicoqumicas
de
las
protenas
que
se
ocupan
para
purificar
protenas.
*
Las
metodologas
de
purificacin
suelen
considerar
ms
de
una
propiedad
fisicoqumica.
msculos
con
trabajo
activo,
como
las
clulas
del
corazn.
La
LDH
tambin
permite
la
reposicin
del
suministro
de
NAD+
facilitando
una
produccin
continua
de
ATP
en
la
ruta
de
la
gliclisis.
En
el
hgado,
la
LDH
lleva
a
cabo
la
reaccin
inversa,
convirtiendo
el
lactato
a
piruvato,
en
donde
provee
una
fuente
de
carbono
para
la
sntesis
de
la
glucosa.
Finalmente,
la
glucosa
producida
por
el
hgado
repone
la
fuente
de
carbohidratos
almacenados
en
las
clulas
musculares,
completando
el
ciclo
de
Cori
(Fig.
1).
Figura
1.
Esquema
del
ciclo
de
Cori.
Las
flechas
en
rojo
muestran
el
sentido
de
las
reacciones
metablicas
que
tienen
lugar
en
el
ciclo
en
un
estado
de
esfuerzo
fsico.
Las
verdes
indican
las
reacciones
que
tienen
lugar
en
reposo.
Existen
cinco
isoenzimas
con
diferentes
puntos
isoelctricos.
Las
isoenzimas
se
obtienen
de
una
combinacin
de
subunidades
que
forman
un
tetrmero
cuya
expresin
en
diferentes
tejidos
produce
distintos
conjuntos
de
isoenzimas.
La
determinacin
de
la
actividad
LDH
en
suero
tiene
una
gran
variedad
de
aplicaciones
clnicas.
Por
ser
una
enzima
intracelular,
su
elevacin
es
ndice
de
dao
tisular
con
la
consecuente
liberacin
de
sta
a
la
circulacin.
La
determinacin
de
la
isoenzima
predominante
en
suero
posibilita
la
identificacin
del
rgano
comprometido
(4).
16
1 Balanza granataria
1 Parrilla de agitacin
1 Probeta de 100 mL
1 Balanza de 2 platos
1 Liga y cedazo
1 Barra magntica
1 Micropipeta P-1,000
1 Esptula
1 Bistur
6 Tubos cnicos de 50 mL
1 Pincel
6 Microtubos de 1.6 mL
Agua destilada
de dimetro)
PROTOCOLO
Utilice
bata
y
guantes
en
todo
momento.
Consiga
un
corazn
bovino.
Es
primordial
que
el
rgano
haya
sido
extrado
el
mismo
da
de
la
prctica
y
se
haya
mantenido
a
4
C.
1.
17
4.
Medir el volumen y tomar una alcuota de 500 L (homogenizado crudo, alcuota 0).
5.
Despus de equilibrar los tubos, centrifugar a 17,000 g, 4C, 20 min (Fig. 5-6).
6.
9.
18
11. Precipitar
al
65%
de
sulfato
de
amonio
(0.166
g/mL).
Agregar
el
reactivo
lentamente,
estando
la
muestra
en
hielo,
con
agitacin
ligera.
12. Incubar
15
min
en
hielo
(sin
agitacin).
Debido
a
la
duracin
de
la
clase,
habitualmente
en
este
punto
se
termina
la
sesin
y
la
muestra
se
almacena
a
4
C
hasta
su
procesamiento
posterior.
13. Despus
de
equilibrar
los
tubos,
centrifugar
a
15,000
g,
4
C,
15
min.
14. Decantar
sobrenadante,
medir
el
volumen
y
tomar
una
alcuota
de
500
L
(sobrenadante
del
65%,
alcuota
3)
(Fig.
11).
15. Resuspender
la
pastilla
suavemente
con
5
mL
de
amortiguador
Bicina
0.03
M,
pH
8.5,
4
C,
con
ayuda
de
un
pincel.
Tomar
una
alcuota
de
200
L
(pastilla
del
65%
resuspendida
y
sin
dializar,
alcuota
4).
(Fig.
12).
16. Introducir
el
resto
del
resuspendido
en
la
bolsa
de
dilisis,
previamente
hidratada
en
agua
destilada
por
al
menos
10
min.
(Fig.
13).
19
17. Dializar
contra
1.5
L
de
amortiguador
Bicina
0.03
M
pH
8.5
a
4
C,
en
agitacin.
Realizar
2
cambios
de
amortiguador
con
intervalos
de
al
menos
1.5
h
(Fig.
14)
18. Al
da
siguiente,
recuperar
el
dializado,
agregar
DTT
a
una
concentracin
final
de
1
mM
y
pasarlo
por
un
filtro
de
0.4
m.
Tomar
una
alcuota
de
200
L
(Pastilla
del
65%
resuspendida
y
dializada,
alcuota
5).
(Fig.
15)
19. Agregar
glicerol
a
una
concentracin
final
de
10%
y
almacenar
a
4
C
junto
con
las
alcuotas
tomadas
durante
el
procedimiento.
Las
alcuotas
recolectadas
deberan
ser
evaluadas
en
busca
de
actividad
enzimtica
(ver
Prctica
2)
el
mismo
da
de
su
obtencin,
pero
debido
a
la
duracin
de
cada
clase,
este
procedimiento
se
realizar
ms
adelante.
RESULTADOS
Observe
y
documente
los
cambios
fsicos
de
la
muestra
durante
todo
el
proceso.
Describa
la
diferencia
entre
las
pastillas
obtenidas
despus
de
cada
centrifugacin.
Para
cada
paso
de
su
purificacin,
proporcione
toda
la
informacin
recolectada
(mL
del
homogenado
crudo
utilizado,
mL
de
cada
sobrenadante
obtenido,
gramos
de
sulfato
de
amonio
usado).
CUESTIONARIO
a. Si
se
sabe
que
la
temperatura
ptima
de
actividad
de
la
LDH
bovina
es
de
37
C,
por
qu
es
importante
purificarla
a
4
C?
20
21
22
Prctica
2.
Espectrofotometra.
Medicin
de
actividad
enzimtica
de
la
LDH
OBJETIVOS
1. Conocer
y
manejar
correctamente
el
espectrofotmetro,
ajustarlo
a
diferentes
longitudes
de
onda,
fijar
la
absorbencia
en
cero
y
medir
la
absorbencia
de
diferentes
soluciones.
2. Definir
los
reactivos
que
se
deben
utilizar
en
los
ensayos,
as
como
los
que
se
deben
utilizar
como
blanco.
3. Determinar
espectrofotomtricamente
la
actividad
enzimtica
de
la
LDH.
INTRODUCCIN
La
espectrofotometra
es
el
estudio
de
la
interaccin
de
la
radiacin
electromagntica
con
molculas,
tomos
y
iones.
Cuando
un
haz
de
energa
radiante
monocromtica
(luz
con
una
longitud
de
onda
definida)
incide
sobre
una
sustancia,
parte
de
la
energa
es
absorbida
y
el
resto
transmitida.
La
mayora
de
los
compuestos
tienen
una
o
varias
longitudes
de
onda
caractersticas
a
las
que
absorben
la
luz.
As,
una
solucin
puede
contener
muchos
compuestos
que
absorben
a
diferentes
longitudes
de
onda,
sin
embargo,
si
el
compuesto
de
inters
absorbe
a
una
determinada
longitud,
es
posible
determinar
su
concentracin
an
en
mezcla.
La
ley
de
Lambert-Beer
expresa
la
relacin
entre
la
transmitancia
y
la
concentracin
de
una
sustancia,
es
decir,
explica
que
la
transmitancia
disminuye
en
progresin
geomtrica
cuando
la
concentracin
aumenta
en
progresin
aritmtica
(5):
-log
T
=
ac
Donde
T
es
transmitancia,
c
es
la
concentracin
y
a
la
absortividad
La
ley
de
Beer
permite
calcular
la
concentracin
de
una
sustancia
en
solucin.
Uno
de
los
usos
ms
comunes
de
la
espectrofotometra
es
el
ensayo
de
enzimas,
ya
sea
calculando
la
cantidad
de
protenas
presentes
en
una
muestra
o
midiendo
el
cambio
de
concentracin
de
sustratos
o
productos
en
una
reaccin
enzimtica.
La
determinacin
de
la
actividad
de
la
LDH
23
C
HO
C
H
C
O
CH3
Lactato
CH3
Piruvato
LDH
O
NH2
NH
2
N
H
O
O
H
O
O
O
H
H
OH
OH
N
O
NH2
O
N
O
H
H
OH
H
O
H
OH
OH
NH2
O
O
N
N
H
OH
OH
H
H
OH
NAD+
NADH
actividad =
cantidad de producto
tiempo
1 Tubo cnico de 50 mL
1 Espectrofotmetro
200 a 1000 L)
CAPS 0.15 M, pH 10
NAD+ 6 mM
Lactato 0.3 M
PROTOCOLO
Utilice
bata
y
guantes
en
todo
momento.
1.
NAD+ 6 mM
3 mL
Lactato 0.3 M
3 mL
2.
3.
Colocar una de las celdas en el espectrofotmetro y fijar el blanco a 340 nm (Fig. 5).
4.
5.
Repetir los puntos 3 y 4 para el resto de las alcuotas obtenidas en la prctica previa.
RESULTADOS
Grafique
la
absorbencia
contra
el
tiempo.
La
velocidad
inicial
de
la
reaccin
es
el
cambio
de
absorbencia
en
el
primer
minuto.
Reporte
la
actividad
de
la
LDH
en
las
6
alcuotas
en
mol/min
utilizando
la
siguiente
frmula:
26
28
Prctica
3.
Espectrofotometra.
Cuantificacin
de
protenas
por
el
mtodo
de
Bradford
OBJETIVOS
1. Definir
una
muestra
blanco;
decidir
qu
reactivos
deben
estar
presentes.
2. Construir
las
curvas
de
calibracin
por
el
mtodo
de
Bradford
y
determinar
la
concentracin
de
protena
de
las
fracciones
enzimticas
a
partir
de
ellas.
3. Decidir
cundo
se
deben
hacer
diluciones
y
hacer
las
diluciones
adecuadas
4. Determinar
la
actividad
especfica
de
las
fracciones
enzimticas.
INTRODUCCIN
El
ensayo
de
Bradford,
es
un
mtodo
colorimtrico
para
la
determinacin
de
la
concentracin
de
protena,
se
basa
en
un
cambio
de
absorbencia
del
colorante
Coomassie
Azul
Brillante
G-250
que
bajo
condiciones
cidas
convierte
su
forma
roja
en
la
forma
azul
que
se
une
a
la
protena
que
se
est
ensayando.
Durante
la
formacin
de
este
complejo,
dos
tipos
de
enlaces
tienen
lugar:
la
forma
roja
de
Coomassie
dona
primero
su
electrn
libre
a
los
grupos
ionizables
en
la
protena,
lo
que
provoca
una
desnaturalizacin
del
estado
nativo
de
la
protena,
por
consiguiente,
permite
la
exposicin
de
las
zonas
hidrofbicas.
Los
residuos
de
los
aminocidos
hidrofbicos
que
se
exponen
en
estas
condiciones,
se
unen
de
forma
no
covalente
a
la
regin
no
polar
del
colorante
a
travs
de
fuerzas
de
van
der
Waals.
Esta
situacin
permite
el
reacomodo
de
los
grupos
amina
que
son
positivos
en
proximidad
con
la
carga
negativa
del
colorante.
Finalmente
se
realiza
una
interaccin
inica.
La
unin
con
la
protena
estabiliza
la
forma
azul
del
colorante
Coomassie,
por
lo
que
la
cantidad
de
complejo
presente
en
la
solucin
es
una
medida
de
la
concentracin
de
protena,
y
se
puede
estimar
mediante
el
uso
de
una
lectura
de
absorbencia
(7).
A
la
forma
unida
del
colorante
a
la
protena
se
le
asigna
un
mximo
de
absorcin
de
595
nm.
Las
formas
del
colorante,
son
catinicas
y
de
color
verde
o
rojo.
La
unin
del
colorante
a
la
29
Figura
1.
A
la
izquierda
se
muestra
al
reactivo
de
Bradford,
a
la
derecha
se
muestra
al
reactivo
de
Bradford
pero
en
presencia
de
70
g
de
albmina
srica
bovina
(BSA,
del
ingls
bovine
serum
albumine).
1 Espectrofotmetro
Agua destilada
L y 200 a 1000 L)
BSA 1 mg/mL
BioRad)
13
Tubos
de
ensayo
30
PROTOCOLO
Utilice
guantes
en
todo
momento
1.
Rotular los 13 tubos de ensayo y colocar los volmenes necesarios en cada uno de ellos,
segn
la
siguiente
tabla.
Primero
adiciona
el
agua,
despus
la
BSA
o
las
alcuotas
(Fig.
2)
y
finalmente
el
reactivo
de
Bradford
(Fig.
3).
Para
determinar
la
concentracin
protenica
en
las
alcuotas,
se
sugiere
iniciar
con
90
L
de
agua
y
10
L
de
la
alcuota.
Sin
embargo,
considere
que
podra
ser
necesario
realizar
diluciones,
o
bien,
utilizar
hasta
100
L
de
alguna
alcuota.
10
11 12
13
100
90
80
60
50
30
20
10
20
40
50
70
80
Alcuota
(L)
(del
0
al
5)
Bradford
(mL)
1.1
1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1 1.1
2.
31
3.
4.
Fijar la absorbencia cero a 595 nm con el blanco (mezcla en el tubo de ensayo #1). El
6.
Con los datos obtenidos, primero elabora la curva patrn, graficando cantidad de
Despus, interpola cada uno de los datos de absorbencia de las alcuotas y realiza los
32
RESULTADOS
Para
la
correcta
determinacin
de
la
concentracin
de
la
protena,
se
debe
contar
primero
con
los
clculos
de
los
volmenes
a
considerar.
Luego
es
muy
importante
que
la
precisin
en
el
pipeteo
sea
de
la
mejor
calidad,
para
con
esto
minimizar
los
errores.
El
experimento
es
muy
simple,
por
lo
que
depende
de
que
las
cuentas
y
la
agregacin
de
los
volmenes
que
de
ellas
proviene
sean
correctas.
En
todos
los
casos
se
debe
agregar
un
volumen
de
agua,
un
volumen
de
la
solucin
muestra,
agregar
el
reactivo
de
Bradford,
incubar,
calibrar
el
espectrofotmetro,
cuantificar
y
calcular
las
concentraciones
de
las
muestras
problema.
Para
saber
la
concentracin
de
una
muestra
problema,
se
debe
realizar
una
curva
patrn
a
partir
de
una
solucin
de
protena
con
una
concentracin
conocida.
Los
valores
de
absorbencia
a
partir
de
este
experimento,
se
grafican
como
funcin
de
su
concentracin
(previamente
conocida
a
partir
de
los
clculos
realizados
para
la
construccin
de
la
curva
patrn).
Esos
valores
deben
ser
ajustados
por
una
recta
(8).
A
partir
de
esa
informacin
grfica
es
posible,
despus
de
interpolar
los
valores
de
absorbencia
de
la
muestra
problema,
conocer
su
concentracin.
Debe
ser
evidente
que
para
la
misma
solucin,
agregar
ms
volumen
de
la
muestra
protenica
del
calculado,
resultar
en
una
lectura
de
absorbencia
mayor
y
viceversa,
por
lo
que
se
recomienda
ser
extremadamente
cautos
a
la
hora
de
realizar
la
cuantificacin
de
la
concentracin
de
protena.
CUESTIONARIO
a. De
qu
otras
formas
se
puede
obtener
la
concentracin
de
una
solucin
de
protena?
Mencione
por
lo
menos
4.
b. Qu
es
un
mximo
de
absorbencia,
para
qu
se
usa
en
bioqumica?
33
SOLUCIONES
34
35
stacking
gel,
de
poro
grande,
en
la
parte
superior
de
un
gel
separador
o
resolving
gel,
de
poro
pequeo,
y
diferentes
amortiguadores
en
los
geles
y
cmaras.
En
la
electroforesis
en
gel,
ste
se
solidifica
con
un
peine
que
genera
pocillos
en
los
que
se
aplican
las
muestras,
y
las
protenas
que
estn
ms
cercanas
al
gel
entran
primero.
En
un
sistema
continuo,
la
separacin
uniforme
de
la
matriz
produce
bandas
proteicas
que
son
difusas
y
con
pobre
resolucin,
pero
en
sistemas
discontinuos,
las
protenas
primero
migran
rpidamente
a
travs
del
gel
concentrador
y
luego
se
enlentecen
conforme
entran
al
gel
separador,
permitiendo
que
se
apilen
una
encima
de
otra
para
formar
bandas
estrechas,
con
mejor
resolucin.
El
sistema
discontinuo
tambin
usa
iones
de
diferente
movilidad
electrofortica
en
el
amortiguador,
que
forman
una
frontera
mvil
cuando
se
aplica
un
voltaje:
el
ion
anterior
o
leading
(cloruro)
y
el
ion
posterior
o
trailing
(glicinato).
Las
protenas
tienen
una
movilidad
intermedia,
por
lo
que
se
apilan
y
concentran
en
una
zona
estrecha
al
inicio
de
la
electroforesis.
A
medida
que
la
zona
se
mueve
a
travs
del
gel,
el
efecto
de
tamizado
de
la
matriz
del
gel
hace
que
las
protenas
de
diferentes
pesos
moleculares
se
muevan
a
diferentes
velocidades.
El
sistema
discontinuo
provee
mayor
resolucin
que
el
sistema
continuo
y
es
el
que
emplearemos
en
esta
prctica.
El
sistema
discontinuo
original
(9,
10)
fue
desarrollado
para
la
separacin
de
protenas
sricas
de
manera
que
preservaran
su
conformacin
nativa
y
actividad
biolgica,
por
lo
que
las
protenas
son
preparadas
en
amortiguador
de
muestra
no
desnaturalizante
ni
reductor
y
la
electroforesis
se
realiza
en
iguales
condiciones.
Los
datos
de
PAGE
nativos
son
difciles
de
interpretar
porque
la
movilidad
proteica
es
determinada
por
una
compleja
combinacin
de
factores,
y
como
la
carga
nativa
est
conservada,
las
protenas
pueden
migrar
hacia
cualquier
electrodo,
dependiendo
de
su
carga.
Para
superar
las
limitaciones
del
sistema
PAGE
nativo,
Laemmli
(11)
incorpor
el
detergente
aninico
SDS
dentro
del
sistema
discontinuo,
ahora
desnaturalizante
(SDS-PAGE).
Cuando
las
protenas
se
someten
a
electroforesis
en
presencia
de
SDS,
se
encuentran
completamente
desnaturalizadas
y
disociadas
una
de
otra.
Adems,
el
SDS
se
une
no
covalentemente
a
las
36
protenas
de
forma
que
les
confiere
una
carga
negativa
global;
la
carga
por
unidad
de
masa
es
prcticamente
constante
para
todas
las
protenas
porque
el
SDS
se
une
a
una
estequiometra
cercana
a
una
molcula
de
SDS
por
cada
2
residuos
de
aminocidos.
Como
resultado,
la
tasa
a
la
cual
la
protena
unida
al
SDS
migra
en
un
gel,
depender
principalmente
de
su
tamao,
permitiendo
la
estimacin
del
peso
molecular
(Fig.
1).
Adems
del
SDS
en
el
amortiguador
de
muestra,
se
utilizan
agentes
reductores
de
grupos
tiol,
como
el
2-mercaptoetanol,
que
rompen
puentes
disulfuro
intermoleculares
e
intramoleculares,
para
alcanzar
un
completo
desplegamiento
proteico
y
mantener
a
las
protenas
en
estado
reducido.
Figura
1.
Ejemplo
de
un
gel
de
poliacrilamida
al
10%,
teido
con
azul
de
Coomassie,
donde
las
bandas
estn
bien
resueltas.
En
el
carril
MW
se
encuentra
el
marcador
de
peso
molecular
(New
England
BioLabs,
no.
de
catlogo
P7708),
en
el
carril
1
se
cargaron
30
g
de
protenas
totales
de
clulas
en
cultivo,
mientras
que
en
el
carril
2
se
cargaron
15
g
de
las
mismas
protenas.
El
porcentaje
de
poliacrilamida
nos
da
una
idea
del
tamao
de
poro
y
se
define
como
%T
(concentracin
total
del
monmero
en
g/100
mL).
Un
mayor
%T
significa
un
mayor
radio
polmero-agua
y
por
lo
tanto,
poros
ms
pequeos.
En
cambio,
el
cross-linker
tiene
un
porcentaje
ptimo,
el
cual
est
entre
el
3
y
el
5%
del
total.
MATERIAL
Y
EQUIPO
NECESARIO
1
Cmara
de
electroforesis
Mini-Protean
Agua destilada
protenas
Acrilamida/bis-acrilamida 30:0.8
1 Agitador horizontal
1 Termoblock a 95 C
N,N,N,N-tetrametiletilendiamina
1 Tubo cnico de 50 mL
(TEMED)
1 Tubo cnico de 15 mL
Solucin Laemmli 2X
Amortiguador de corrida 1X
Solucin de Coomassie
Solucin desteidora
38
PROTOCOLO
Utilice
guantes
en
todo
momento
1.
Colocar los vidrios en el mdulo de ensamble, acomodar el peine y hacer una marca
sobre
el
vidrio
a
0.5
cm
por
debajo
de
los
dientes
del
peine
(Fig.
2)
2.
separador:
Agua
destilada
4.045 mL
Acrilamida/bis-acrilamida 30:0.8
3.3 mL
2.5 mL
0.1 mL
PSA 10%
50 L
TEMED
5 L
Agregar
el
PSA
y
el
TEMED
hasta
el
final,
volver
a
mezclar
y
continuar
inmediatamente
con
el
siguiente
paso.
3.
Agregar la mezcla lentamente en el espacio entre los vidrios, hasta la marca previamente
4.
Agregar agua destilada con una micropipeta sobre el gel separador, para evitar que la
6.
Secar con papel filtro el agua aadida en el paso 4. Cuida de no daar el gel.
7.
concentrador:
Agua
destilada
3.02 mL
Acrilamida/bis-acrilamida 30:0.8
0.65 mL
1.25 mL
50 L
PSA 10%
25 L
TEMED
5 L
Agregar
el
PSA
y
el
TEMED
hasta
el
final,
volver
a
mezclar
y
continuar
inmediatamente
con
el
siguiente
paso.
8.
Agregar la mezcla lentamente en el espacio entre los vidrios, hasta llegar al borde.
9.
40
16. Apagar
la
fuente
de
poder
cuando
el
colorante
se
encuentre
en
el
borde
inferior
de
los
vidrios
(tardar
aproximadamente
60
min
en
migrar
hasta
ah)
17. Sacar
el
gel
de
la
cmara
y
teirlo
con
la
solucin
de
Coomassie
durante
30
min
en
agitacin
(usa
un
volumen
suficiente
para
cubrir
el
gel)
18. Retirar
la
solucin
de
Coomassie
y
cubrir
el
gel
con
la
solucin
desteidora.
Despus
de
30
min
en
agitacin,
renovar
la
solucin
desteidora
y
dejar
en
agitacin
por
otros
30
min.
19. Retirar
la
solucin
desteidora
y
cubrir
el
gel
con
agua
destilada.
Visualizar
las
protenas
en
la
luz
blanca
del
transiluminador.
41
RESULTADOS
Evale
el
gel
comparando
el
patrn
de
bandas
de
cada
carril
de
acuerdo
a
lo
esperado
para
cada
alcuota.
Describa
el
efecto
del
porcentaje
de
poliacrilamida
sobre
la
separacin
de
bandas
en
el
carril
del
marcador
de
peso
molecular
y
relacinelo
con
el
peso
molecular
de
la
protena
LDH.
Intente
identificar
la
banda
a
la
cul
podra
corresponder
la
protena
LDH.
Discuta
si
hay
alcuotas
en
las
que
no
se
esperara
tener
protena
LDH.
CUESTIONARIO
1. Cunto
de
cada
una
de
las
soluciones
stock
debes
mezclar
para
preparar
un
gel
separador
al
15%?
2. Cules
son
las
funciones
del
glicerol
y
del
azul
de
bromofenol
en
el
amortiguador
de
carga
para
protenas?
3. Cul
es
el
peso
molecular
de
la
enzima
LDH
bovina?
SOLUCIONES
Tris base
3.025 g
Glicina
14.4 g
SDS
1 g
Coomassie
Acido actico
0.25
g
7
mL
43
Metanol
50 mL
cido actico
7 mL
Etanol
30 mL
44
Las
protenas
de
una
mezcla
portan
distintas
cargas
netas
a
un
pH
determinado.
As,
cuando
la
mezcla
de
protenas
eluye
a
travs
de
una
columna
que
presente
una
superficie
positiva,
slo
las
de
carga
neta
negativa
se
adhieren,
las
neutras
y
bsicas
eluyen
sin
impedimento.
Posteriormente,
las
protenas
con
carga
negativa
se
eluyen
selectivamente
mediante
un
gradiente
de
concentraciones
crecientes
de
una
sal
a
travs
de
la
columna
(Fig.
1).
Figura
1.
Esquema
de
la
cromatografa
de
intercambio
inico.
A
bajas
concentraciones
de
sal,
las
protenas
y
la
resina
se
encuentran
unidas
mediante
las
atracciones
generadas
por
tener
cargas
opuestas.
A
concentraciones
de
sal
ms
elevadas,
los
iones
salinos
negativos
se
unen
a
la
superficie
positiva,
por
lo
que
las
protenas
con
cargas
negativas
son
desplazadas.
En
un
gradiente
de
concentraciones
salinas
crecientes,
las
protenas
cargadas
dbilmente
son
eluidas
primero
y
las
que
tienen
cargas
ms
grandes
pueden
ser
utilizadas
para
retener
y
fraccionar
protenas
con
carga
positiva
(13).
46
1 Pinza de Hoffman
1 Colector de fracciones
1 Micropipeta P-1,000
1 Propipetero
1 Pipeta serolgica de 25 mL
1 Soporte universal
NaCl 1 M
No. 1
PROTOCOLO
Utilice
bata
y
guantes
en
todo
momento.
1.
debajo
del
extremo
superior)
y
verificar
que
la
llave
de
flujo,
ubicada
en
la
parte
inferior
de
la
columna,
se
encuentra
cerrada
(Fig.
2).
2.
Colocar la columna en el soporte universal, utilizando la pinza para bureta con nuez.
3.
Dejar asentar la resina por gravedad. Verificar que llegue a la marca realizada en el paso
1 (Fig. 4).
47
5.
Colocar en la manguera una pinza de Hoffman y abrir la llave a un flujo mnimo (usar un
8.5,
desgasificado.
10. Agregar
1
mL
de
la
muestra
dializada
obtenida
en
la
prctica
No.
1
(es
muy
importante
que
calcule
el
nmero
total
de
Unidades
de
actividad
enzimtica
que
est
cargando
en
la
columna,
Fig.
6).
11. Continuar
el
flujo
de
goteo
a
2
mL/min
de
amortiguador
Bicina
0.03
M
y
colectar
fracciones
de
3
mL
(Fig.
7).
12. Cuando
la
absorbencia
a
280
nm
en
el
cromatograma
sea
estable,
iniciar
el
gradiente
continuo
de
NaCl
de
0
a
1
M
en
el
amortiguador
Bicina
0.03
M
a
2
mL/min.
13. Identificar
las
fracciones
que
correspondan
a
los
picos
cromatogrficos
para
medirles
la
actividad
enzimtica
relativa
y
la
actividad
enzimtica
especfica.
14. Continuar
el
flujo
de
NaCl
1
M
para
regenerar
la
Q
Sepharose
(hasta
que
en
el
cromatograma
se
aprecie
conductividad
estable).
48
RESULTADOS
Documentar,
analizar
y
discutir
el
cromatograma
obtenido.
De
acuerdo
a
los
resultados
obtenidos,
predecir
la
localizacin
de
la
LDH.
Determine
la
actividad
enzimtica
relativa
y
especfica
de
las
fracciones
en
las
que
podra
estar
presente
la
LDH.
Determine
el
porcentaje
de
recuperacin
de
la
actividad
enzimtica
de
la
columna.
CUESTIONARIO
a. Una
solucin
que
contiene
acido
asprtico,
glicina,
treonina,
leucina
y
lisina,
se
aplica
a
una
columna
de
intercambio
inico
Dowex
50
a
un
pH
de
3.0.
Si
los
aminocidos
se
eluyen
con
un
gradiente
de
incremento
de
pH,
en
qu
orden
eluirn?
b. Explica
de
qu
est
compuesta
una
resina
de
intercambio
inico
y
cmo
se
pueden
clasificar.
c. Cul
es
la
relacin
entre
el
punto
isoelctrico
de
la
biomolcula
y
el
pH
de
los
amortiguadores
que
se
utilizan
en
la
cromatografa
de
intercambio
inico?
SOLUCIONES
49
Figura
1.
Esquema
de
la
cromatografa
de
afinidad.
En
A
se
muestra
la
mezcla
heterognea
a
separar;
en
B
se
observa
la
fase
estacionaria
del
experimento,
en
este
caso
en
una
bureta;
en
C
se
observan
los
componentes
del
gel,
que
tienen
unida
a
la
molcula
diana
en
la
cual
se
unen
las
molculas
rojas
que
son
las
de
inters;
en
D
se
muestra
la
mezcla
heterognea
que
al
pasar
por
la
fase
estacionaria,
se
queda
sin
la
molcula
de
inters.
La
cromatografa
de
afinidad
se
basa
en
la
interaccin
especfica
de
la
molcula
de
inters
con
un
componente
de
la
fase
estacionaria.
Esta
interaccin
es
ms
especfica
que
una
interaccin
inica,
como
la
que
se
utiliz
anteriormente
en
la
cromatografa
de
intercambio
inico.
En
este
protocolo,
la
enzima
LDH
de
corazn
de
res
interacta
con
una
molcula
de
colorante
azul
que
se
une
a
una
resina
y
se
empaca
en
una
columna.
La
molcula
de
colorante
est
diseada
para
tener
interacciones
similares
a
las
coenzimas
dinucletidos
con
sus
enzimas.
El
colorante
Cibacron
Blue,
es
un
ejemplo
de
un
compuesto
biomimtico.
51
1 Colector de fracciones
1 Micropipeta P-1,000
1 Propipetero
1 Pipeta serolgica de 25 mL
desgasificado
1 Soporte universal
NaCl 1 M
1 Pinza de Hoffman
Empacar la columna con Blue Sepharose Fast Flow como se describi en la prctica 5.
2.
0.02
M
pH
7,
desgasificado.
6.
prctica
previa
(es
muy
importante
que
la
fraccin
haya
sido
dializada
previamente
con
amortiguador
Fosfato
de
sodio
0.02
M
pH
7).
7.
52
9.
actividad
enzimtica
relativa
y
la
actividad
enzimtica
especfica.
Visualice
su
pureza
con
SDS-
PAGE.
10. Continuar
el
flujo
de
NaCl
1
M
para
regenerar
la
Blue
Sepharose
Fast
Flow
(hasta
que
en
el
cromatograma
se
aprecie
conductividad
estable).
RESULTADOS
Aunque
antes
de
agregar
el
NaCl
a
la
columna
se
harn
evidentes
picos
cromatogrficos,
corresponden
a
las
protenas
que
no
se
unieron
a
la
columna,
por
lo
que
no
contienen
a
la
protena
de
inters.
No
as
despus
de
aplicar
el
gradiente
de
sal
a
la
columna.
En
esta
parte,
deben
existir
algunas
regiones
con
alta
absorbencia
a
280
nm.
Debe
investigar
cul
de
estas
fracciones
tiene
la
mayor
actividad
de
LDH.
Una
vez
determinadas
las
fracciones
con
mayor
actividad
enzimtica,
se
deben
reunir
en
un
solo
tubo.
No
olvide
que
esta
es
la
enzima
purificada,
por
lo
que
debe
guardar
esta
muestra
adecuadamente,
es
decir
tapada
con
parafilm
M
y
almacenada
en
el
refrigerador
(nunca
congelarse
o
dejar
a
temperatura
ambiente,
transportar
en
hielo).
Verifique
su
pureza
por
medio
de
electroforesis
en
gel.
En
la
siguiente
prctica
de
laboratorio
se
verificarn
los
parmetros
cinticos
de
la
enzima
purificada.
CUESTIONARIO
a.
Cmo
funciona
el
Cibacron
blue?
Por
qu
se
usa
para
purificar
a
la
LDH
bovina?
b.
Qu
pasara
si
la
muestra
con
mayor
actividad
enzimtica
obtenida
en
la
prctica
No.
5
fuera
cargada
en
la
columna
con
Blue
Sepharose
Fast
Flow
sin
ser
dializada
previamente?
b.
Se
podra
usar
el
mismo
protocolo
para
purificar
LDH
de
otras
fuentes?,
si
es
as,
explique
qu
cambios
tendra
que
realizar.
53
SOLUCIONES
54
55
1 Espectrofotmetro
200 a 1000 L)
pH 9
NADH 4 mM
Piruvato de sodio 30 mM
1 Tubo cnico de 50 mL
PROTOCOLO
Utilice
bata
y
guantes
en
todo
momento.
El
tubo
que
contiene
a
la
enzima
debe
estar
siempre
en
hielo.
Verifica
que
las
celdas
para
espectrofotmetro
estn
limpias.
1.
celda
debe
ser
exactamente
1.5
mL;
es
decir,
que
si
despus
de
agregar
el
piruvato
hace
falta
un
volumen
para
completar
los
1.5
mL
finales,
debers
agregar
amortiguador
de
fosfato
de
sodio
50
mM
para
llegar
a
esa
cantidad.
La
concentracin
final
de
NADH
ser
de
0.13
mM.
Fosfato
de
sodio
50
mM,
pH
7.5
1400 L
NADH 4 mM
50 L
Piruvato 30 mM
? L
56
Debes
calcular
los
L
de
la
solucin
de
piruvato
que
debes
agregar.
Para
conocer
los
parmetros
cinticos
de
la
LDH,
la
concentracin
inicial
de
piruvato
en
la
celda
debe
variar
entre
0.05
mM
y
1.0
mM.
Aunque
se
debe
abarcar
todo
este
intervalo,
los
datos
tiles
para
los
clculos
estn
por
debajo
de
0.2
mM,
por
lo
que
no
se
debern
considerar
demasiados
puntos
por
encima
de
esta
concentracin.
2.
Cubre cada celda con parafilm M, mezcla bien y colcala en el portaceldas del
espectrofotmetro.
3.
adicin
de
la
enzima,
para
generar
la
lnea
base
inicial.
En
este
momento,
la
absorbencia
debe
ser
muy
cercana
a
uno
y
constante.
Si
esto
no
pasa,
lava
la
celda
y
repite
el
protocolo
nuevamente.
4.
Para verificar el efecto del pH cido en la actividad de la LDH, realiza los pasos del 1 al 4
Para verificar el efecto del pH bsico en la actividad de la LDH, realiza los pasos del 1 al 4
Para verificar el efecto de la temperatura en la actividad de la LDH, realiza los pasos del 1
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60
Requisitos para MB
Apariencia
y
organizacin
Redaccin
Introduccin
Objetivos
Material
y
mtodos
Resultados
Discusin
61
Conclusiones
Perspectivas
Cuestionario
Referencias
Requisitos para MB
Vocabulario
Contenido
Estructura
Dominio
del
tema
Material visual
Voz
Tiempo
Actitud
SI NO
Es solidario con las decisiones del equipo y se adapt a los cambios del equipo
63
64
Seguridad
en
un
laboratorio
de
bioqumica,
introduccin
a
los
procedimientos
experimentales
en
bioqumica.
Introduccin
a
los
procedimientos
experimentales
en
bioqumica.
5
6
65
Propuesta
B.
Semana
Teora
(2
h)
Prctica (4 h)
Seguridad
en
un
laboratorio
de
bioqumica,
introduccin
a
los
procedimientos
experimentales
en
bioqumica.
Dilisis
y
determinacin
de
la
concentracin
de
protenas
por
el
mtodo
de
Bradford
Electroforesis
en
geles
de
poliacrilamida
en
condiciones
desnaturalizantes.
Purificacin
de
LDH,
primera
parte.
Licuacin,
separacin
por
centrifugacin
y
precipitacin
de
protenas
con
sulfato
de
amonio.
Purificacin
de
LDH,
segunda
parte.
Dilisis,
cuantificacin
de
protenas,
medicin
de
actividad
enzimtica.
Purificacin
de
LDH,
tercera
parte.
Electroforesis
en
geles
de
poliacrilamida
en
condiciones
desnaturalizantes.
3
4
Principios
de
separacin
de
biomolculas:
Tablas
de
rendimiento.
*Obtencin
de
casenas
por
precipitacin
cida
1. Ajustar
el
pH
a
4
con
HCl
2
M
a
10
mL
de
leche
lquida.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Almacenar a 4 C.
67