Prctica No.

3
Amplificacin de fragmentos de ADN por la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tecnologa que involucra la sntesis
enzimtica in vitro de millones de copias de un segmento especfico de DNA. El trmino reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR, por su siglas en ingls) se aplica al proceso bioqumico in vitro,
mediante el cual las cadenas individuales de DNA blanco son duplicadas por la DNA polimerasa en
cada uno de los ciclos (generalmente entre 20 y 30) que integran la reaccin, al final de cada uno
de los cuales las nuevas cadenas vuelven a ser duplicadas por la misma enzima, logrndose una
produccin exponencial de millones de copias del gen o segmento de DNA especfico sometido al
proceso. En general, los componentes requeridos para una PCR son: a) DNA; b) un par de
oligonucletidos sintetizados artificialmente que son utilizados como iniciadores o cebadores y
que delimitan una secuencia de ADN de la doble cadena que se desea amplificar; c) mezcla de
desoxirribonucletidos (dNTPs); d) solucin amortiguadora de reaccin (tampn de reaccin 10x
con MgCl2 sin MgCl2); e) la DNA polimerasa (enzima termoestable conocida como Taq DNA
polimerasa que se asla a partir de la bacteria Thermus acuaticus). Cada uno de los ciclos de
reaccin, consta de tres pasos determinados por temperaturas y tiempos especficos, que son:
1) Desnaturalizacin (92-98 C, 30 a 90 segundos), en el cual se separan o desnaturalizan las dos
cadenas complementarias del DNA blanco.
2) Alineamiento (50-60 C, 30-60 segundos), en el que se realiza el apareamiento o hibridizacin
especfica entre los iniciadores o primers y las cadenas simples del segmento de DNA blanco
desnaturalizado. La temperatura est determinada principalmente por la temperatura media de
fusin (tm) de los oligonucleotidos.
3) Extensin ((70-74 C, 30-90 segundos), en el que la enzima DNA polimerasa extiende la longitud
de los iniciadores apareados al DNA blanco, al ir polimerizando los desoxirribonucleotidos libres,
resultando en nuevas cadenas complementarias a las dos cadenas sencillas presentes al inicio de
la reaccin.
El ciclo siguiente se inicia en el mismo tubo, con los mismos componentes de la mezcla de
reaccin, pero contiene ahora el doble de cadenas sencillas de DNA blanco que el anterior y
finaliza convirtiendo stas en cadenas dobles. Con la sucesin de ciclos se logra una sntesis
exponencial (2n) del segmento de DNA blanco, cuyo tamao se define desde los primeros ciclos de
la reaccin. La longitud del segmento amplificado por PCR es el resultado de la suma de la longitud
de los dos iniciadores ms la distancia del DNA blanco flanqueado por estos.
La tecnologa de PCR es de suma utilidad para amplificar DNA a partir de fragmentos
clonados en distintos vectores. La PCR tiene mltiples aplicaciones en diferentes campos de la
biomedicina: en el diagnstico clnico de enfermedades hereditarias, en la inmunologa, en
predisposicin gentica para el desarrollo de enfermedades autoinmunes, en la oncologa, en la
microbiologa se usa para el diagnstico rpido y preciso de infecciones producidas por bacterias,

hongos y virus. En la medicina legal para el anlisis de pruebas de paternidad. En el proyecto del
genoma humano se ha usado para la identificacin de nuevos genes, sus secuencias y mutaciones.
Puede amplificarse DNA de material embebido en parafina por varios aos, de material
momificado, de restos fsiles, etc. La arqueologa lo usa para el anlisis gentico de muestras
biolgicas antiguas, en proceso de evolucin la aplicacin de PCR para el estudio de secuencias
conservadas ha acelerado la reconstruccin de rboles filogenticos. En los campos de la biologa
molecular, la ingeniera gentica y la biotecnologa la PCR se utiliza en el aislamiento de genes que
posteriormente son clonados para conservarlos o para conocer su secuencia de nucletidos, para
facilitar manipulaciones gnicas encaminadas a la produccin de protenas recombinantes y para
el anlisis y cuantificacin de la expresin gnica.
Competencia de la prctica
El alumno obtendr el conocimiento para entender la utilidad de la reaccin en cadena de
la polimerasa as como las habilidades de uso y funcionamiento de un termociclador. El alumno
lograr obtener un fragmento amplificado de un gen el cual estar listo para secuenciarse.
Materiales, Instrumentacin y Equipos de Laboratorio requeridos

Taq polimerasa y Amortiguador para la PCR

Mezcla de los cuatro didesoxinucletidos (dNTPs).
Oligonucletidos cebadores para la amplificacin de un gen.
Agua destilada desionizada estril
ADN genmico
TE buffer
Tubo para microcentrfuga de 1.5 mL ( tubos eppendorf o similares)
Tubo para PCR de 0.2 mL
Termociclador
Micropipeta de 1000 L con puntas
Micropipeta de 200 L con puntas
Micropipeta de 10 L con puntas
Bao de hielo

Procedimiento
1. En un tubo para microcentrifuga de 1.5 mL, mezclar en el siguiente orden (los volmenes
indicados son para una reaccin de 20 microL):
10X PCR Buffer sin Mg
50 mM MgCl2
10 mM dNTP
Primer F 10 mM (10 pmol/l)
Primer R 10 mM (10 pmol/l)
Templete ADN (10 ng/l)
H2O dest. Est.
Taq Polimerasa 5 U/l
Volumen Total

VOLUMEN
2 l
0.48 l
0.4 l
0.4 l
0.4 l
1 l
15.02 l o lo que falte para el
volumen total
0.3 l (o 0.2 l)
20 l

CONCENTRACION FINAL
1X
1.2 mM
0.2 mM
0.2 mM (0.2 pmol/l)
0.2 mM (0.2 pmol/l)
100 ng

1.5 Unidades (o 1 U)

2. Una vez realizado el clculo para el nmero de muestras necesarias, dosificar las muestras
con el volumen adecuado y depositar en el termociclador utilizando el PROGRAMA con las
siguientes condiciones (amplificacin del gen 18S):
Temperatura (C)
94C
94C
60C
72C
72C
4C

Tiempo
30 seg
30 seg
20 seg
30 seg
7 min

No. de ciclos
1 ciclo
20 ciclos
1 ciclo
1 ciclo

3. Al trmino de la PCR se prepara un gel de agarosa al 1% en TAE 1X y de la misma manera

se analiza la calidad del ADN. Se aplica la muestra amplificada por la PCR y se corren a 70
volts por 30 minutos, al trmino de sta se visualiza en un transiluminador de luz UV para
su anlisis. El gel puede ser teido o se puede incorporar bromuro de etidio (0.5g/ml de
concentracin final en el gel) en la preparacin del gel de manera que pueda ser
visualizado inmediatamente despus del corrimiento o en cualquier momento durante la
corrida, mediante luz UV. El colorante se intercala entre las bases de los cidos nucleicos y
fluoresce de color rojo-naranja (560 nm) cuando es iluminado con luz UV de longitud de
onda entre 260 y 360 nm.