Distribuidora de Reactivos y Agentes

de Diagnstico para Laboratorio

Blvd. J. Alonso de Torres 312 PTE. Col. San Jernimo Len Gto.
(477) 718-5948 ventasleon@microelisas.com

Inserto Inmuno-globulina E (IgE) Elisa

MONOBIND, INC.
Inmunoglobulina E (IgE)
Cdigo de Producto: 2525-300
Intencin de Uso: L a determi nacin cuantitativa de la concentracin de
In munoglobulina E (IgE) en suero human o por i nmuno-ensayo de
enzi ma en micr op laca.

Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs de la alta afinidad

con la reaccin del streptavidin y el anticuerpo biotinilado.
Esta interaccin es ilustrada como sigue:

RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA

Las reacciones alrgicas, las cuales se estn expandiendo ms, son usualmente
diagnosticadas basadas en el historial de sntomas mdicos y clnicos. Sin
embargo, en pruebas In Vitro e In Vivo, juegan un papel importante en la
confirmacin de s ospechas clnicas y un tratamiento adec uado. La medicin de la
inmunoglobulina E (IgE) en suero es utilizada ampliamente en los diagnsticos de
reacciones alrgicas e infecciones parasitarias. Muchas alergias son c ausadas por
las inmunoglobulinas de subclase IgE actuando como punto de contacto entre el
alergeno y clulas especializadas. Las molculas IgE (MW 200,000) se enlaza a la
superficie de clulas mastoflicas y basoflicos granulocitos. Subsec uentemente la
unin entre el alergeno a limite de la clula IgE causa que estas clulas segreguen
histaminas y otras sustancias vaso activas. La segregacin de histaminas en el
cuerpo ocasiona el inicio de lo que comnmente es conocido c omo una reaccin de
alergia.
Antes de hacer alguna determinacion terapeutica es importante saber si la reaccion
alergic a, es mediante IgE, o no-IgE. La medicion del IgE total en una muestra de
suero, juanto con otra informacion de diagnostico de soporte pueden ayudar a
hacer esta determinacion. Medir el total del IgE circulante puede ser muy valioso
para la deteccion de alergias tempranas en infantes, asi como predecir futuras
manifestaciones atopicas. Antes de decidir por cualquier terapia, es importante
tomar en consideracion toda la informacion clinica relevante, asi como la
informacion arrojada por las pruebas alergicas especific as. Los niveles de IgE,
muestran un ligero incremento durante la niez, alcanzando niveles adultos en la
segunda decada de su vida. En general los niveles de IgE total se incrementan con
alergias a personas dependiendo de los tiempos de exposicion a alergenos
relevantes. Incrementos significativos pueder reflejarse en personas sensibilizadas,
pero tambien en casos de mieloma, aspergilosis pulmonar y durante etapas activas
de infecciones paras iticas.
En este mtodo, el calibrador IgE, la muestra del pac iente o el control, primero se
agrega al pozo previamente impregnado con streptavidin. El Anticuerpo monoc lonal
biotinlado (espec ifico para IgE) sera agregado y los reactivos mezclados. La
reaccion entre los anticuerpos IgE y los nati vos de IgE, forman un complejo que se
unira a los pozos impregnados con streptavidin. El exceso de suero y proteinas
seran lavadas mediante pasos de lavado. Otra enzima etiquetada con anticuerpo
monoclonal es pecifico de IgE, es agregado a los pozos, esta enzima etiquetada
con anticuerpo, se liga al del IgE actualmente inmovilizado en el pozo a travs del
cual se une al anticuerpo monoclonal biotinlado. El exceso de enzima es lavada por
medio de un paso de lavado. Un c olor es generado al aadir el sustrato. La
intensidad de la generacin de ese color es directamente proporcional a la
concentracin de la IgE en la prueba.

PR INCI PIO
Anlisis de Secuencia Inmunoenzimomtrico (TIPO 4):
Los reactivos esenciales requieren de un ensayo Inmunoenzimomtrico que
contenga anticuerpos de alta afinidad y especificidad (enzima e inmovilidad), con
reconocimiento diverso y distinto del epitome, en exceso y antgeno de origen. En
este procedimiento, la inmovilizacin se lleva acabo durante el ensayo en la
superficie de un pozo de la microplaca a travs de la interseccin del pozo
recubierto con Streptavidin y anticuerpo anti-IgE monoclonal biotinilado exgeno.
Al mezclarse el anticuerpo monoclonal biotinilado un suero que contenga antgeno
de origen, la reaccin se produce ente el antgeno de origen y los anticuerpos,
formando un complejo antgeno-anticuerpo.
La interaccin es ilustrada por la siguiente ecuacin.

Despus de un periodo apropiado de incubacin, la fraccin ligada al antgenoanticuerpo es separada por medio de la decantacin o aspiracin. Otro anticuerpo
(dirigido a un eptome diferente) etiquetado con una enzima es aadido. Otra
interaccin ocurre para formar una enzima etiquetada antgeno-anticuerpo
complejo de anticuerpo biotinlado en la s uperficie de los pozos. El exceso de
enzima es lavada por medio de un paso de lavado. Un sustrato adecuado es
aadido para que el color pueda ser cuantificable con el uso de un
espectrofotmetro de microplacas. La actividad de la enzima en el pozo es
direc tamente proporcional a la concentracin del antgeno de origen. Al utilizar
varios y diferentes sueros de referencia de concentracin de antgeno c onocido,
una curva de dosis de respuesta puede ser generada desde la cual la
concentracin del antgeno de un desconocido puede ser comprobada.

REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO
A. Suero Humano Refer encias ---1.0 ml/frasco Iconos A-F
Seis (6) frascos de suero humano con calibradores de referencia establecida a
concentraciones de 0 (A), 5 (B), 25 (C), 50 (D), 150 (E) y 400 (F) IU/ml. Almacenar
a 2-8C. Un preservati vo ha sido aadido.
(Los calibradores estn estandarizados contra el WHOs 2ndlRP 75/502 para IgE).
B. IgE Reactivo Biotin -13ml/frasco ?
Un (1) fras co de biotinlado anti-humano IgE mlgG reac tivo presentado en un matriz
de protena-estabilizada. Un preservativo ha sido aadido. Almacenar a 2-8C
C. IgE Reactivo Enzima- 13 ml/frasco Icono
Un (1) fras co de anti-humano IgE- HRP complejo incorporado en un matriz de
protena-estabilizada. Un preservativo ha sido aadido. Almac enar a 2-8C
D. Microplaca Cubierta de Streptavidin - 96 pozos - Icono ?
Un microplato de 96 pozos cubierto con streptavidin y empaquetado en un bolso de
aluminio con un elemento deshidratador. Almacn en 2-8C.
E. Concentrado de Solucin de lavado - 20 ml - icono
Un (1) fras co que contiene un surfactante en salino protegida. Se ha agregado un
preservativo. Almacn en 2-30C.
F. Substrato A -- 7ml/vial - botella del icono SA
Un (1) fras co que contiene tetrametilbenzidina (T MB) solucin. Almac n en 2-8C.
G. Substrato B -- 7ml/vial - botella del icono SB
Un (1) fras co con perxido de hidrgeno (H2O2) en solucin. Almacn en 2-8C.
H. Solucin de paro -- 8ml/vial - icono
Un (1) bote que contiene un cido fuerte (1N H Cl). Almacn en 2-8 C.
Nota 1: No utilice los reactivos ms all de la fec ha de vencimiento del kit.
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) das cuando estn
almacenados en 2-8C.
Nota 3: Los reactivos son para una solo microplaca de 96-pozos
MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:
1. Pipeta capaz de entregar los volmenes de 25l y 50l con una precisin mejor
de 1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volmenes 0.100ml y 0.300ml
con una precisin de mejor de 1.5%.
3. Lavador de Microplacas o una botella del apretn pizeta (opcional).
4. Lector de Micro placa con capacidad de absorbancia con una longitud de onda
de 450nm y 620nm.
5. Papel absorbente para retirar los excesos de los pozos de la microplaca.

6.
7.
8.
9.

Plstico envolvente o tapa para la microplaca para los pasos de la incubacin.

Aspirador de vaco (opcional) para los pasos de lavado.
Contador de tiempo.
Materiales del control de calidad

PR ECAUCIONES
Para el uso de diagnstico in Vitro no para el uso interno o externo en seres
humanos o animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antgeno superficial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia de la FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer el aseguramiento de que los agentes infecciosos estn
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como
potenc ialmente peligrosos y capac es de transmitir enfermedad. Los buenos
procedimientos del laboratorio para manejar productos de la sangre se pueden
encontrar en el centro para el control de enfermedad/el instituto nacional de la
salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiolgic os y biomdicos," 2da Edi cin,
1988, publicacin No. (CDC) 88-8395 de HHS.

RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION

Los espec imenes sern la sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente
en la coleccin de muestras de veni-puntura deben ser observados. Para la
comparacin exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno
del suero de la maana debe ser obtenida. La sangre se debe recoger en un tubo
llano de venipuntura de tapn rojo sin los aadidos o anticoagulantes. Permita que
la sangre coagule. Centrifugue el espcimen para separar el suero de las clulas.
Las muestras se pueden refrigerar en 2-8C. por un perodo mximo de cinco (5)
das. Si el espcimen no s e puede probar dentro de este tiempo, la muestra se
puede almacenar en las temperaturas de -20C. por hasta 30 das . Evite congelar y
deshelar. Cuando est probado en duplic ado, 0.050ml del espcimen s e requiere.

PR EPARACION DE LOS REACTIVOS

1. Solucin Lavadora (Wash)
Diluya el contenido de la solucin de lavado en 1000ml con agua des tilada o
desionizada en un envase adecuado de almacenaje. Almacnese a temperatura
ambiente 20-27C. hasta por 60 das.
2. Solucin de Trabajo sustrato
Vierta los contenidos del frasco mbar dentro del frasco etiquetado con Solucin
A dentro del frasco transparente que diga Solucin B. Coloque la tapa amarilla
en el frasco para una fcil identificacin. Mezcle y etiquete acordemente.
Almacnese a 2-8C. Nota: No utilice el sustrato de trabajo si parece azul.

lector de microplaca. Los resultados se deben leer en el plazo de treinta (30)

minutos de agregar la solucin de paro.

CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe probar controles en los niveles de rango bajo, normal y
elevado para supervisar el funcionamiento del anlisis. Estos controles se deben
tratar como desc onocidos y valores determinados en cada mtodo de prueba
realizado. Las cartas del c ontrol de calidad se deben mantener para seguir el
funcionamiento de los reactivos provis tos. Los mtodos estadsticos pertinentes se
deben emplear para comprobar tendencias. La desviacin significativa del
funcionamiento establecido puede indicar el cambio inadvertido en c ondiciones o la
degradacin experimental de los reactivos del kit. Los reactivos frescos se deben
utilizar para determinar la razn de las variaciones.

RESULTADOS
Una curva de la reaccin a cierta dosis se utiliza para comprobar la concentracin
de IgE en especimenes desconocidos.
1. Registre la absorbenc ia obtenida del listado del lector del micro placas conforme
al ejemplo 1.
2. Trace la absorbancia para cada referencia duplicada del suero contra la
concentracin correspondiente de IgE en IU/ml en el papel de grfico linear (no
haga un promedio de los duplicados de las referencias del suero antes de trazar).
3. Dibuje la curva a travs de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentracin de IgE para un desconocido, localice la
absorbancia media de los duplicados para cada desconoc ido en el eje vertical del
grfico, encuentre el punto que se interseca en la curva, y lea la concentracin (en
IU/ml) del eje horizontal del grfico (los duplic ados del desconoc ido se pueden
promediar segn se indica). En el ejemplo siguiente, la absorbencia media (1.323)
interseca la curva de la reaccin a cierta dosis en (142 IU/ml) la concentracin de
IgE (vase el cuadro 1).
Nota: El software de la reduccin de datos de la computadora diseado para los
anlisis de ELISA se puede tambin utilizar para la reduccin de datos.

PR OCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Antes de proceder con el anlisis, tenga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a temperatura ambiente (20 - 27C.).
1. Ajuste el formato de los pozos de las microplac as para c ada referencia del
suero, control y espcimen del pac iente sean probados en duplicado. Coloque
cualquier tira sin usar de micro pozo nuevamente dentro del bolso de aluminio,
sllela y almacnela en 2-8C.
2. Mida con una pipeta 0.025 ml (25l) de la referencia, del control o del espcimen
apropiado del suero en el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100l) del reactivo de enzima de PSA en cada pozo. Es muy
importante dispensar todos los reactivos c erca del fondo del pozo cubierto.
4. Agitar la mic roplaca suavemente por 20-30 segundos. Mezcle y cubra.
5. Incube 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido de la microplaca por la dec antacin o la aspiracin. Si
decanta, cubra, voltee y golpee ligeramente la placa con el papel absorbente.
7. Agregue 300l del buffer lavador (vase la seccin de la preparac in el reactivo),
decntelo (golpee contra el papel absorbente o asprelo). Repita dos (2) veces
adicionales para un total de tres (3) lavadas. Un lavador automtico o manual de
placas puede ser utilizado. Siga la instruccin del fabricante para el uso apropiado.
Si se emplea una botella del apretn o pizeta, llene cada pozo presionando el
envase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada. Decante la lavada y
repita dos (2) veces adicionales.
8. Agregue 0.100 ml (100l) del anticuerpo de enzima IgE a todos los pozos (vase
la seccin de la preparacin el reactivo). Agregue siempre los reactivos en el
mismo orden para reducir al mnimo diferencias del tiempo de reaccin entre
los pozos.
9. Cubra e incube a temperatura ambiente por quince (15) minutos.
10. Desec he el contenido de la microplaca por la decantacin o la aspiracin. Si
decanta, cubra, voltee y golpee ligeramente la placa con el papel absorbente.
11. Agregue 300l del buffer lavador (vase la seccin de la preparacin el
reactivo), decntelo (golpee contra el papel absorbente o asprelo). Repita dos (2)
veces adicionales para un total de tres (3) lavadas. Un lavador automtico o
manual de placas puede ser utilizado. Siga la instrucc in del fabricante para el uso
apropiado. Si se emplea una botella del apretn o pizeta, llene cada pozo
presionando el envase (que evita burbujas de aire) para dispensar la lavada.
Decante la lavada y repita dos (2) veces adic ionales.
12. Aadir 0.100 ml (100l) de solucin de sustrato de trabajo a todos los pozos.
(Ver sec cin de preparacin de reacti vos) Siempre aadir los reactivos en el mismo
orden para minimizar el tiempo de reaccin. NO AGITE EL PLATO DESPUES DE
AADIR EL SUSTRATO.
13. Inc ube a temperatura ambiente por 15 minutos.
14. Agregue 0.050ml (50l) de la solucin de paro a cada pozo y mzclese
suavemente por 15-20 segundos.
15. Lea la abs orbancia en cada pozo a los 450nm (con una longitud de onda de
referencia de 620-630nm para reducir al mnimo imperfecciones del pozo) en un

Los datos presentados en el ejemplo 1 y el cuadro 1 son ilustrativos s olamente y no

se deben utilizar en lugar de una curva de la reaccin a cierta preparacin de c ada
ensayo.

PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD

En orden de que los resultados del anlisis sean considerados vlidos, deben s er
resueltos los siguientes criterios:
1. La absorbancia (OD) del calibrador A debe ser ? 0.1
2. La absorbancia (OD) del calibrador F debe ser ? 1.3
3. Cuatro fuera de seis pools del control de calidad deben estar dentro de rango.

LIMITACIONES DEL PROCEDI MIENTO

1. Es importante que el tiempo de reaccin en cada pozo sea llevado a cabo
constante para la reproducc in de resultados. El medir con una pipeta de muestras
no debe extender ms de diez (10) mins para evitar deriva del anlisis. Si se utiliza
ms de una (1) placa, s e recomienda repetir la curva de la reaccin a cierta dosis.
2. La adicin de la solucin del sustrato inicia una reaccin cintica, que es
terminada por la adicin de la s olucin de paro. Por lo tanto, la adicin del sustrato
y de la solucin de paro debe agregarse en la misma secuencia para eliminar en
cualquier momento la des viacin durante la reaccin.
3. Los lectores de la placa miden verticalmente. No toque el fondo de los pozos.
4. La falta de remover la solucin adherida adec uadamente en los pasos de la
aspiracin o de la decantacin puede dar lugar a la rplica pobre y a resultados
falsos.
5. Muestras que estn contaminadas microbiolgicamente, no se debe utilizar en el
anlisis . Lipemica alta o hemolizada del espcimen(es) no debe ser utilizado.
6. La concentracin del suero IgE, depende de una multiplicidad de factores.
Incluyendo si el paciente es sensible, cuantas veces el paciente ha sido expuesto a
una alergia especfica etc. La concentracin total IgE por si sola no es suficiente
para aquilatar su estatus clnico. Todas los posibilidades clnicas especialmente
pruebas de alergia especifica deben ser tomadas en consideracin en lo que
determinan el estatus clnico del paciente.
7. Dado que no todas las reacc iones atpicas son medidas por IgE, toda la
informacin clnica relevante debe ser tomada en c onsideracin antes de cualquier
determinacin para pac ientes que puedan estar dentro del rango normal.

RANGOS ESPERA DOS Y VALORES

Un estudio de poblacin de diferentes grupos y edades fueron llevados a evaluar el
IgE Acc uBind sistema de prueba ELISA. Los res ultados son presentados a
continuacin en la Tabla 1.

TABLA I
Edad
(Aos)
0-3
3-16
Adulto

Valores Esperados para la Prueba de IgE de ELI SA.

(En IU/ml)
Nmero
Promedio
Rango
(n)
Absoluto
31
6.4
ND 46%
43
25.0
ND 280
145
43
0 200

Es importante tener en mente que el establecimiento del un rango de valores los

cuales pueden ser esperados para encontrarse por un mtodo dado para una
poblacin de personas normales es dependiente a una variedad de factores: la
especificidad del mtodo, la poblacin analizada y la precisin del mtodo en las
manos de los analistas. Por estas razones cada laboratorio debe depender solo de
los rangos de valores esperados establecidos por el fabricante s olo hasta que un
rango local pueda ser determinado por los analistas usando el mtodo con un
poblacin indgena al rea en la que el laboratorio est localizado.

CA RACTERISTICAS DE ACTUACION
A. Precisin
Para poder validar las precisiones del intra-ensayo de la IgE AccuBind sistema
de prueba ELISA, veinte replicas de cada uno de tres sueros (rangos medio bajo y
alto de la curva) fueron probados en el mismo ensayo. Un intra-ensayo con
precisin del 1.95 a 5.87% fue obtenido.
TABLA 2
Precisin dentro de la prueba (En IU/m l)
Bajo
Mediano
Alto
Nmero
20
20
20
Significado
48.9
160.5
297.6
1 S.D.
2.87
6.47
5.81
% CV
5.87
4.03
1.95
Para poder validar la precisin del inter-ensayo de la IgE con el sistema de prueba
ELISA AccuBind, un duplicado de cada tres sueros (rangos medio, bajo y al to de
la curva) fueron probados 10 ensayos terminados durante el periodo de 6 meses
que involucran 5 sets diferentes de reac tivo y tres diferentes tcnicas. Una
precisin de Inter-ensayo de 3.52 a 8.42% fue obtenido. Ver tabla 3 a continuacin.
TABLA 3
Precisin Inter de la prueba (En IU/ml)
Bajo
Mediano
Alto
Nmero
10
10
10
Significado
46.3
157
301
1 S.D.
3.9
7.3
10.6
% CV
8.42
4.64
3.52
B. Exactitud
El s istema de prueba por ELISA AccuBind IgE fue comparada con un mtodo de
tubo cubierto de radio inmunoens ayo (RIA) Muestras biolgicas con niveles de IgE
en bajo, mediano y altos rangos fueron usados (Los rangos de los valores fueron
de 0.8 a 3100IU/ml). El nmero total de muestras fue 219. La mnima ecuacin de
regresin cuadrada y la correlacin coeficiente fueron computadas para esta IgE
AccuBind mtodo de ELISA en comparacin con el mtodo predicho.

Mtodo
Monobind EIA X
Predicado RIA Y

TABLA 4
Regresin
Significado
Anlisis
179
x=-12.9 + 1.21(Y)
157

Correlacin
Coeficiente
0.967

Solamente las pequeas cantidades diagonales entre el procedimiento de

Monobind ELISA IgE en Microplaca y el mtodo de referencia son indic adas por la
proximidad de los valores medios . La ecuacin del ltimo cuadro de regresin y el
coeficiente de correlacin indica un acuerdo exc elente del mtodo.
C. Linearidad
Dos pacientes comunes fueron ensayados diluyendo (un calibrador A) y
concentrado con la IgE AccuBind sistema de prueba ELISA. Los valores
observados y esperados es tn listados en la Tabla 5 a continuacin:
TABLA 5
Muestra
Observado
Esperado
%Recuperacin
Pool 1
106.8
Pool
50.8
53.4
95.1
Pool
25.3
26.7
94.8
Pool 1/8
13.4
13.3
100.6
Pool 1/16
6.6
6.7
98.5
Pool 2
395.9
Pool 2/2
189.5
197.9
95.8
Pool 2/4
106.1
98.9
107.2
Pool 2/8
48.0
49.5
96.9
Pool 2/16
25.8
24.7
104.2
D. Sentividad
La IgE AccuBind prueba de ELISA tiene una sensibilidad de 1.0 IU/ml. La
sensibilidad fue asegurada por la determinacin de la variabilidad del suero
calibrador 0 IU/ml y usando el 2(95% de certeza) estadstica para calcular la
dosis mnima.
E. Especificidad
La especificidad del sistema de prueba ELISA AccuBind IgE, para relacionar las
inmunoglobulinas fue evaluada aadiendo aquellos dos veces las concentraciones
fisiolgicas al suero matriz. Ninguna reaccin cruzada entre los anticuerpos fue
usada y las molc ulas relacionadas fueron detectadas.
F. Recuperacin
Dos pacientes comunes fueron picados con cantidades conocidas de IgE y
ensayado con la IgE AccuBind sistema de prueba ELISA. Los valores
observados y esperados es tn listados en la Tabla 6 a continuacin:
TABLA 6
Muestra
Observado (O)
Esperado (E)
%Recuperacin
IU/ml
IU/ml
(O/E)
Pool 1
25.7
Pool 1+25
50.7
50.7
100.0
Pool 1+50
74.8
75.7
101.2
Pool 1+100
122.7
125.7
97.6
Pool 1+200
232.0
225.7
102.7
Pool 2
12.3
Pool 2+25
41.7
37.3
111.2
Pool 2+50
62.6
62.3
100.6
Pool 2+100
109.4
112.3
97.4
Pool 2+200
197.2
212.3
92.8
G. Efecto de Dosis Alta
Dado que el ensayo diseado secuencial, las concentraciones altas de IgE no
demuestran el efecto gancho. Muestras de pacientes con Mieloma IgE con
concentraciones mas de 8 millones IU/ml demuestran altos niveles de absorbancia
extremos.

REFERENCIAS