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En los ltimos diez aos, los avances cientficos y tecnolgicos han establecido

biocatlisis como una prctica y


alternativa ecolgica a metalo- tradicional y organocatlisis en la sntesis qumica, tanto
en el
de laboratorio y a escala industrial. Avances clave en la secuenciacin del ADN y la
sntesis de genes son en la base de
enormes progresos en la adaptacin de biocatalizadores mediante ingeniera de
protenas y el diseo, y la capacidad de reorganizar
enzimas en nuevas rutas biosintticas. Para poner de relieve estos logros, aqu
hablamos de aplicaciones de
biocatalizadores protenas de ingeniera que van desde productos qumicos bsicos a
intermedios farmacuticos avanzados que
utilizar la catlisis enzimtica como un paso clave.

Biocatalysis es la aplicacin de enzimas y microbios en


qumica sinttica, y utiliza catalizadores de la naturaleza para los nuevos propsitos:
aplicaciones para las que no han evolucionado enzimas
15
. El campo de
biocatlisis ha alcanzado su nivel actual industrialmente demostrado a travs de
varias oleadas de la investigacin tecnolgica y la innovacin.
Durante thefirst biocatlisis waveof (Fig. 1), whichstarted ms de una
centuryago, scientistsrecognizedthatcomponentsoflivingcellscouldbe
aplicada a transformaciones qumicas tiles (en contraste con la fermentacin
procesos de, que haba sido habitual durante milenios ya). Por
ejemplo, Rosenthaler sintetizado (R) -mandelonitrile de benzaldehdo
y cianuro de hidrgeno a partir de un extracto vegetal
6
; hidroxilacin de esteroides
7
que ocurren dentro de las clulas microbianas tambin era conocido. Ejemplos ms recientes
son el uso de proteasas en los detergentes de lavandera
8
, Glucosa isomerasa a
convertir la glucosa a la fructosa ms dulce de sabor
9
Y penicilina G acilasa
para hacer antibiticos semisintticos
10
. El principal desafo para estos aplicacin
cationes es la limitada estabilidad del biocatalizador, y tales deficiencias
fueron superados principalmente por la inmovilizacin de la enzima, que tambin
facilitado la reutilizacin de la enzima
Durante la segunda ola de la biocatlisis, en los aos 1980 y 1990, inicial
proteinengineering tecnologas, normalmente basada estructura, extendedthe
rango de sustrato de las enzimas para permitir la sntesis de inusual sinttica
intermedios. Este cambio se expandi biocatlisis a la fabricacin de
productos intermedios farmacuticos y qumica fina. Los ejemplos incluyen el
resolucin catalizada por lipasa de precursores quirales para la sntesis de diltiazem
(un frmaco presin arterial), la sntesis de hidroxinitrilo-liasa catalizada de
intermedios para herbicidas
11
, La sntesis de carbonilo-reductasa catalizada
de alcoholes enantiopuros para reducir el colesterol medicamentos con estatinas, lipasa
sntesis catalizada de steres de ceras tales como miristato de miristilo o cetlico
ricinoleato para los cosmticos
12
, Y la hidratacin catalizada por nitrilo hidratasa-

de acrilonitrilo a la acrilamida para los polmeros


13
(donde nitrilo hidratasa
se obtuvo a partir de clulas enteras de Rhodococcus rhodochrous). Adems de
estabilizacin, los retos que ahora se incluyen la optimizacin del biocatalizador para
los sustratos no naturales.
El tercero, y el presente, ola de biocatlisis comenz con el trabajo de
Pim Stemmer y Frances Arnold a mediados y finales de la dcada de 1990. Ellos
mtodos de biologa molecular que fue pionero rpida y extensamente

Figura 1
|
La evolucin de descubrimiento de la enzima
y las estrategias de ingeniera de protenas utilizan para
identificar catalizadores deseados. Diseo racional
(B) identifica mutaciones puntuales distintas basado en
estructuras de protenas (A) o modelos de homologa,
mientras que la mutagnesis al azar (c) en combinacin con
cribado o seleccin es la base para dirigido
experimentos de evolucin. La combinacin de estos mtodos
hace que sea posible crear ms pequeo, pero ms inteligente,
bibliotecas (d). La proyeccin clsica de enzimas por
cultivos de enriquecimiento (e) ahora se sustituye por clave
bsquedas de bases de datos con motivos (f) para guiar la identificacin
de nuevas enzimas o aquellos con propiedades deseadas.
Todava en su infancia es la ab initio computacional (o
de novo) el diseo de enzimas (g). Las estructuras en
el fondo se refieren a productos de qumica fina accesibles
a travs de las diferentes oleadas de biocatlisis. (R) mandelonitrilo (izquierda) ya poda obtenerse
Hace 100yr de un extracto de la planta; (1 S, 3 S) -3aminociclohexanol (centro) es hecho por Novartis
utilizando una lipasa inmovilizada; y 6-cloro-2,4,6trideoxyD
-erythrohexapyranoside (derecha) se hace
por DSM en un proceso que requiere una ingeniera
aldolasa para soportar altas concentraciones de
acetaldehdo y para lograr una alta selectividad.

REVISIN DE INVESTIGACIN
odificar biocatalizadores travs de una versin in vitro de la evolucin darwiniana. Los
mtodos se denominan ahora comnmente evolucin dirigida, aunque esto
trmino ha estado en uso desde los experimentos de clulas enteras en 1972
14
. La inicial
versiones de esta tecnologa implican ciclos iterativos de amino- aleatoria
cambios de cidos en una protena, seguido por la seleccin o screening de la
resultante bibliotecas para las variantes con estabilidad mejorada de la enzima,
especificidad de sustrato y enantioselectividad. Los acontecimientos posteriores,
discutido aqu, se han centrado en la mejora de la eficiencia de las indicaciones
la evolucin para crear bibliotecas 'ms inteligentes'. Biocatlisis escala industrial
centrado principalmente en hidrolasas, unos ketoreductases (KREDs), y
regeneracin cofactor y estabilidad de la protena en disolventes orgnicos. En algunos
casos, las vas metablicas fueron optimizados; por ejemplo, combinando
genes de diferentes cepas naturales para producir 1,3-propanodiol (una
monmero de polisteres) en un nuevo husped que permiti pasar de
glicerol a la glucosa ms conveniente como materia prima
15
.
Como resultado de los avances logrados durante la actual ola de biocatlisis, nuevas capacidades notables ahora pueden ser diseados en
enzimas, tales como la capacidad de aceptar sustratos previamente inertes
(un KRED de montelukast
16
o una transaminasa para sitagliptina
17,18
) o para
cambiar la naturaleza del producto que se forma (variantes terpeno ciclasa
que favorecen diferentes terpenos
19
o el metabolismo de amino-cido que hace
alcoholes para biocombustibles
20
). Se necesitan enzimas Novel hoy para convertir
biomasa en biocombustibles de segunda y tercera generacin
21,22
, Materiales
23
y productos qumicos
24
. Las principales novedades que permitieron a esta tercera ola son
ingeniera de protenas avanzada
25-27
(incluyendo la evolucin dirigida), el gen
sntesis, anlisis de secuencias, herramientas bioinformticas
28
y el ordenador
modelado, y el avance conceptual que las mejoras en las enzimas
puede ser ms pronunciada de lo esperado. Enzimas Engineered
puede permanecer estable a 60 UC en soluciones que contienen disolventes orgnicos, puede
aceptar nuevos sustratos y puede catalizar nuevas reacciones no naturales. Esta
ingeniera puede ahora tomar slo unos pocos meses, por lo tanto en gran medida la expansin
las aplicaciones potenciales. En el pasado, un proceso a base de enzimas era
diseado en torno a las limitaciones de la enzima; Hoy en da, la enzima es
diseado para adaptarse a las especificaciones del proceso.

Hace unos diez aos, los artculos en la Naturaleza


29,30
y Ciencia
31
revisado el
ondas de primero y segundo de biocatlisis y proporcionaron un vistazo a lo que la
thirdwavemightbring.Todayitistimelytoassesstheimpactofthisthird
onda y especular lo que la prxima dcada podra traer (Recuadro 1).
Aunque biocatlisis implica la ingeniera metablica
22,32,33
y sintticos
biologa, esta revisin se centra en enzimticas y de clulas enteras reacciones.
Ingeniera de enzimas para encajar el proceso de fabricacin
Para minimizar los costos, fabricacin de productos qumicos requiere estable, selectiva y
catalizadores productivas que operan bajo las condiciones de proceso deseados.
Ingeniera de enzimas para un proceso de aperturas tales definiendo la ingeniera
ing objetivo, como el aumento de la estabilidad, la selectividad, rango de sustrato o, typcamente, una combinacin de los mismos. En 2000, antes de la tercera ola, slo unos pocos
estrategias estaban disponibles para cumplir con estos objetivos. Inmovilizacin de enzimas
podra aumentar la estabilidad de una protena, pero los aumentos en la estabilidad eran
moderada y a menudo insuficiente para las transformaciones qumicas ms.
La evolucin dirigida tambin era posible, pero an as era lento porque
construccin y proyeccin de las grandes bibliotecas se requiere que en su mayora concontenida variantes con la reduccin, o incluso ninguna, actividad. Ejemplos de drstica
mejoras rara vez eran de inters para la industria. El ritmo lento significaba
que las protenas evolucionado contenan slo unos pocos cambios y, por tanto, que los
las propiedades enzimticas cambiaron slo ligeramente. Aunque varios cientos
procesos enzimticos ya tenan usos industriales
4
, Ms involucrado
enzimas y clulas completas que haban sido marginalmente alteradas genticamente
29
.
En la ltima dcada, nuestra comprensin de las protenas y el nmero de
las estrategias de evolucin dirigida disponibles se han incrementado, lo que lo convierte
posible hacer grandes cambios en las propiedades de la enzima. En general,
ingeniera de enzimas sigue siendo una coleccin de estudios de caso que resulta
de la aplicacin de uno de los diversos enfoques posibles para el problema en
mano, en lugar de que exista un enfoque cuantitativo tales como los utilizados
en disciplinas como civiles, elctricas, software o ingeniera qumica.
La conversin de estos estudios de caso en los principios de ingeniera requerir
CAJA 1
Requisitos y ejemplos de
aplicaciones biocatlisis
En biocatlisis tradicional, productos naturales se convierten en otra
productos naturales utilizando reacciones naturales y caminos. Tcnico
requisitos: mantener cultivos de microorganismos; conceptual
requisitos: posibles para controlar biotransformaciones naturales;
ejemplos: el pan y la fabricacin de queso, el tratamiento del cuero, la cerveza y el
la fermentacin del vino, y la produccin de antibitico natural.
N
En biocatlisis de amplio sustrato de gama, productos qumicos intermedios (no
productos naturales) se convierten en otros productos qumicos intermedios
utilizando reacciones naturales y las vas. Requisitos tcnicos: uso de
enzimas definidas (sin interferir la actividad presentes); conceptual
requisitos: muchas enzimas tienen un rango amplio sustrato;
ejemplos: fabricacin de productos intermedios farmacuticos usando

lipasas y reductasas carbonilo (alcohol deshidrogenasas).


N
En biocatlisis de varios pasos, los productos naturales se convierten en combustibles,
materiales y materias primas qumicas (productos no naturales) utilizando no
reacciones naturales y caminos. Requisitos tcnicos: protenas
ingeniera para grandes cambios en la estabilidad, rango de sustrato y tipo de
reaccin catalizada; requisitos conceptuales: las enzimas pueden catalizar
reacciones no naturales y nuevas combinaciones de enzimas crean nueva
vas; ejemplos: molculas de combustible creado usando el isopreno
vas de biosntesis, la biosntesis de aminocidos desviados a combustible
alcoholes.
utilizando energa libre para conectar los objetivos de diseo a los cambios estructurales
sea necesario (Fig. 2). Grandes cambios en las propiedades requieren grandes cambios en los
libres
energa. Por ejemplo, los grandes cambios en la estabilidad requerirn grandes tad
cambios de energa en el equilibrio plegado-desplegado. (Incluso irreversible
protena desarrollo comienza con un despliegue parcial reversible.) Un molecucomprensin de nivel lar de las protenas sugiere estrategias que podran ser utilizados
para las mejoras. Por ejemplo, residuos en la superficie contribuyen a la
para plegar y desplegar el equilibrio y la adicin de un residuo de prolina en un bucle
reduce la entropa de la forma desplegada. Estas estrategias reemplazan grande
bibliotecas de variantes aleatorias (en su mayora con propiedades ms pobres) con
, bibliotecas de protenas ms especficas ms pequeas que contienen una alta proporcin de
variantes activas y potencialmente mejoradas (Fig. 1). Por ltimo, mediante la estimacin
la fuerza de diversas interacciones (pares de iones en la superficie o entrpica
contribuciones de la adicin de un residuo de prolina), los investigadores pueden estimar la
cambios necesarios para alcanzar la meta. Pocos investigadores utilizan explcitamente el de
libre
medidas para planificar estrategias de protenas de ingeniera de hoy basada en la energa,
pero
la conversin de los estudios de caso en los principios de ingeniera requiere un quantitatenfoque ive.
Metodologas nuevas y mejoradas
En los ltimos diez aos, los grandes avances en las tecnologas de ADN y en
bioinformtica han proporcionado un apoyo crtico al campo de la biocatlisis.
Estas herramientas han promovido el descubrimiento de nuevas enzimas en naturales
recursos y han acelerado considerablemente el rediseo de existentes
biocatalizadores.
Tecnologas de ADN avanzada
La tecnologa de secuenciacin de ADN de prxima generacin ha permitido paralelo
anlisis de secuencias a gran escala y el costo al reducido drsticamente.
Mientras que el costo de un anlisis de la secuencia del genoma humano en 2002 fue
estima en US $ 70 millones, el precio en el ao 2012 se ha reducido ms de
1.000 veces a menos de US $ 10.000 (ref. 34), y Life Technologies,
Illumina y Oxford Nanopore Tecnologas han anunciado que
mquinas de secuenciacin que estn diseados para secuenciar todo el humana
genoma en cuestin de horas estar disponible ms adelante en 2012 y bajar
el costo por genoma a menos de US $ 1.000. Las secuencias de genomas enteros
a partir de organismos de diferentes entornos, as como del medio ambiente
Las muestras de ADN que incluyen unculturableorganisms (metagenomes), han
createdarichresourceinwhichtosearchfornovelbiocatalysts
35
,y la voluntad
continuar hacindolo. Massive secuenciacin de alto rendimiento (.10,000,000
sequencereads) usingtheIlluminatechnologyalso facilitatedtheexploracin y la comprensin de las relaciones secuencia-funcin de protenas
36
.

La sntesis de ADN de bajo coste ha sustituido el aislamiento de ADN genmico como


el punto de partida para la ingeniera de protenas. La sntesis de ADN de todo el gen
permite adems los codones para ser optimizado para el organismo husped y
estructuras arquitectnicas moleculares tales como promotores, terminadores,
potenciadores, sitios de restriccin y as sucesivamente para ser introducidos en prctica
sitios. Esta sntesis de ADN utiliza qumica de la fosforamidita tradicional,
pero las condiciones de reaccin optimizadas han mejorado la eficiencia de acoplamiento,
el aumento de la calidad global y la cantidad del polmero para hacer
incluso secuencias de 200-250 nucletidos. La sntesis de ADN paralelo usando
tcnicas de fotolitografa y de impresin de inyeccin de tinta cortan an ms los costos y
a sntesis de la velocidad
37
. La sntesis de ADN se ha utilizado para hacer secciones enteras
de ADN cromosmico y genomas completos, incluso para camino- metablica
ingeniera de manera
38
. Sntesis Whole-gen tambin puede ser utilizado para hacer alto
bibliotecas de ADN de calidad que van desde pequeo, centrado, sitio de saturacin
bibliotecas a grandes y completas colecciones de genes. Genes personalizados
e incluso bibliotecas de genes se estn convirtiendo en productos qumicos bsicos similares a
reactivos y disolventes encuentran en los laboratorios de investigacin de hoy en da.
Herramientas novedosas en bioinformtica
Como complemento de los avances experimentales, herramientas bioinformticas tienen
convertido en una parte integral de la moderna ingeniera de protenas
39
. Mltiplo
alineamientos de secuencias a travs de las grandes familias de enzimas y homologa
bsquedas han identificado genes con actividades catalticas similares, lo que lleva
a la novela, biocatalizadores potentes
40
. La misma informacin de la secuencia permite
la reconstruccin de biocatalizadores ancestrales
40
, Que pueden tener ms amplio
gama sustrato y la promiscuidad cataltica (vase ms adelante). Mltiples secuencia
alineaciones identificar los aminocidos ms comunes en cada posicin (la
secuencia de consenso) y amino-cidos que producen sustituciones estable
enzimas de funcin. Estos datos ayudan en el diseo de pequeas bibliotecas con
una alta proporcin de variantes con actividad cataltica. Estas bibliotecas tienen
ha utilizado para descubrir biocatalizadores con estabilidades mejoradas, cataltica
funciones y estereoselectividades alterados
41
.
Paralelamente theadvances en ingeniera de protenas basado en la secuencia, estructura
enfoques tura guiada se han beneficiado de un rpido aumento de la protena
coordenadas estructurales deposita en el RCSB Protein Data Bank (h ttp: //
www.pdb.org). Durante la ltima dcada, el repositorio ha crecido ms
450% tocontainmorethan77,000proteinstructures.Thisfacilitatesboth
diseo de protenas racional y evolucin dirigida, porque alineacin estructural
cin de protenas relacionadas que ayuda a identificar similitudes distintas y diferencia
cias guiar el diseo ms confiable de bibliotecas mutantes.
La utilidad de las bibliotecas ms pequeas se demostr en dos diferentes
enfoques para incrementar la enantioselectividad de una esterasa de resonancia
lucin de metilo del cido 3-bromo-2-metilpropinico, un sintn quiral
42
.
El uso de mutagnesis aleatoria y cribado 200 de miles de
variantes, el E-valor para la enzima (la selectividad de la enzima para la

un enantimero sobre el otro) se aument de 12 a 19 (ref. 43).


Reconociendo que un aumento relativamente pequeo (0.5kcalmol
21
) En el diConferencia en la energa de activacin (DDD G
{
) Para los dos enantimeros fue
practicalenzyme neededtogeneratea (E 0,30), mutagnesis se centr
en el sitio activo. Una biblioteca que contiene mutaciones individuales allpossible a las cuatro
posiciones (76 variantes) produjo una enzima con E 561 (DDD G
{
50,96).
Understandingthenatureoftheproblemtobesolvedfocusestheenzyme
enfoque de optimizacin de las bibliotecas ms pequeas y da mejora grande
mentos. En este contexto, vale la pena mencionar tambin un nuevo mtodo para
evolucin dirigida continuo usando una combinacin de una infeccin por fagos
sistema y un plsmido mutador en Escherichia coli
44
.
Ejemplos de enzimas modificadas en biocatlisis industrial
Como se predijo por Schmid et al., En su revisin de futuro en 2001
29
,
regeneracin continua de cofactores y una gama ms amplia de enzimas tienen
ha informado en los ltimos diez aos. Aplicaciones Sin embargo, el predichos
de biochips y biocatlisis combinatoria an no se han materializado.
El uso de no metabolizacin de clulas para la biocatlisis ha demostrado ser ms
difcil de lo previsto y la preferencia de lugar se ha desplazado hacia
enzimas modificados utilizados en forma cruda y semipurificado. Mientras que
histricamente clulas enteras ofrecen una opcin sencilla y eficaz para cofactor
regeneracin y una mayor estabilidad de la enzima, la ingeniera de protenas y
el uso de enzimas individuales se considera ahora ms econmico y
prctico. El uso de enzimas aisladas tienen otras ventajas: son
ms fcil de quitar (menos se aade porque tienen ms actividad por unidad
masa), toleran las condiciones ms duras, eliminan potencial dilimitaciones causadas por fusin de las membranas celulares y son ms fciles de transportar
alrededor del mundo. Por ejemplo, los procesos basados en KRED tienen ahora
reducciones de clulas enteras reemplazados y chemocatalysis basada metal-ligando,
que eran los estndares de la industria durante la ltima dcada
45,46
. Uno
excepcin es un proceso de clula completa para convertir hidantonas racmicas en